RELACIN SIMBITICA ENTRE RHIZOBIUM Y LEGUMINOSAS

Andrs Arbey Giraldo- 1325177

Mayra Alejandra Meja-1324306
Joana Villada Gmez-0942558
Informe de laboratorio de Fisiologa Vegetal
Escuela de Recursos Naturales (EIDENAR), Universidad del Valle, Campus
de Melndez
Elizabeth Ampudia Mesas
Biloga
Noviembre 13 del 2013
RESUMEN
La fijacin biolgica de Nitrgeno (FBN) es un proceso llevado a cabo por
organismos procariticos, en donde el N2 es reducido a amonio e incorporado a la
biosfera. Estos organismos pueden realizar la FBN independientemente o
estableciendo relaciones simbiticas con otros organismos. El propsito de esta
prctica consisti en reconocer la relacin simbitica entre Rhizobium y
leguminosas, a travs de los ndulos fijadores de nitrgeno presentes en las
leguminosas y los cuales fueron formados por la interaccin bacteria-planta en la
zona radicular de la planta. Para esto se emple una leguminosa de nombre
comn man forrajero (Arachis pintoi), la cual tena varios ndulos en sus races,
resultado de la simbiosis con Rhizobium. A continuacin, cortes muy delgados de
dichos ndulos se observaron al microscopio en los cuales se pudo ver que existe
gran cantidad de bacterias dentro de un ndulo.
De esta manera fue posible, adems de identificar los ndulos, observar algunas
bacterias presentes en ellos, que ayudan a la FBN y las cuales han perdido su
capacidad de auto-reproducirse convirtindose en bacteroides.

1. INTRODUCCIN
La fijacin de Nitrgeno puede ser abitica o biolgica. Por la primera se
forman xidos como consecuencia de la combustin de compuestos
orgnicos, descargas elctricas, etc., que son arrastrados al suelo por la
lluvia. Por la segunda, el N2 es reducido a amonio. En la FBN, participan
varios organismos, entre ellos bacterias Rhizobium, las cuales establecen

cierta relacin entre leguminosas para llevar a cabo el proceso de fijacin.

Estas bacterias llevan a cabo ciertas interacciones con la planta, originando
una serie de reacciones en la misma, lo que desencadena la formacin del
ndulo simbitico. Pero antes de la formacin del ndulo, se da intercambio
de seales de naturaleza qumica entre la planta y el microorganismo,
activacin del ciclo celular en clulas del crtex e iniciacin del nuevo
rgano en la planta, infeccin por parte de la bacteria, formacin del canal
de invasin de los tejidos recin formados y diferenciacin de la bacteria a
forma especializada 1.
De esta manera, el objetivo de esta prctica es lograr identificar los ndulos
que ayudan a la FBN en las leguminosas, en este caso el man forrajero.
2. OBJETIVOS
Objetivo general
Identificar los ndulos presentes en la zona radicular de las leguminosas, los
cuales actan como ayudantes de la FBN.
Objetivos especficos
Realizar uso adecuado del microscopio para cada una de las placas
preparadas.
Identificar y reconocer las bacterias presentes en los ndulos.
Realizar esquemas de lo observado al microscopio al montar las placas con
los pequeos cortes longitudinales de los ndulos.
3. MATERIALES Y METODOLOGA
Materiales
Portaobjetos
Navaja/Bistur
Pinzas
Pala o cuchillo de campo
Microscopio estereoscpico
Microscopio ptico
Agua
Reactivos
Metodologa
Se busc una leguminosa: Arachis pintoi (man forrajero) para identificar los
ndulos presentes en ella. Este tipo de leguminosa, ayuda a mejorar la fertilidad
del suelo.
Una vez encontrada la planta se la llev al laboratorio para realizar observaciones,
con ayuda del microscopio, de cortes longitudinales de los ndulos (antes de la

observacin se lav la raz de la planta con mucho cuidado). Al montar las placas
de los distintos cortes longitudinales teidos con cristal violeta, se observaron las
bacterias presentes en los mismos; esto se realiz con el ocular de 4X, 60X y para
mejor visibilidad, con el de 100X.

4. RESULTADOS

OBSERVACIN DEL NDULO A TRAVS DEL MICROSCOPIO

ESTEREOSCPICO
Inicialmente se observ la estructura que presentaba un ndulo extrado de
la raz de la leguminosa Arachis pintoi (man forrajero) utilizando para ello
el microscopio estereoscpico, apreciando su forma redondeada y su color
blanco lechoso y la forma en que este nuevo rgano se haba unido a la
planta en la zona de las races (Figura 1).

Figura 1. Esquema de los ndulos observados en la raz de la leguminosa Arachis pintoi, utilizando el
microscopio estereoscpico.

OBSERVACIN DE UN CORTE LONGITUDINAL DEL NDULO A

TRAVS DEL MICROSCOPIO PTICO
Se observ la muestra previamente preparada de un corte longitudinal del
ndulo presente en las races de Arachis pintoi. Con anterioridad al corte
longitudinal del ndulo se le realizo la tincin usando cristal violeta
eliminando los excesos de este con agua destilada.
En la observacin realizada a la muestra se pudo apreciar la zona
bacteroide del ndulo en donde estaban presentes los bacteroides de
Rhizobium en forma de bacilos y cocos, estos se encontraban fijos y no
presentaban ningn movimiento (figura 2).

Figura 2. Esquema del corte longitudinal de un ndulo observado con el objetivo de 100X en el microscopio
ptico.

5. DISCUSIN DE RESULTADOS
Al realizar la observacin del ndulo con el microscopio estereoscpico se
observ la estructura externa que este presentaba. Los ndulos son masas
de tejidos altamente organizados, derivados de la multiplicacin de las
clulas de la corteza, que albergan en su interior las bacterias fijadoras de
N2. Estas bacterias estn en forma de fijar el N2 cuando se transforman en la
forma bacteroide4.
Los ndulos observados presentan al igual que todos los ndulos
caractersticas anatmicas bien definidas: corteza, endodermis, corteza
interna y la regin central donde se localizan los bacteroides. Los haces
vasculares de la corteza interna estn conectados con aquellos de la raz de
la planta, lo cual facilita el transporte bidireccional de sustancias entre
ndulo y la planta husped4.
Al realizar la preparacin de la muestra del corte longitudinal realizado al
ndulo extrado de la raz de la leguminosa Arachis pintoi (man forrajero) se
realiz la tincin del gram usando como colorante el cristal violeta que se
adhiere a la pared bacteriana para as a la hora de observar la muestra
poder ver de manera ms clara los bacteroides presentes en ella.
Al observar la muestra del corte preparado utilizando el microscopio ptico
con el objetivo de 4X ubicado en la zona en la cual estaban presentes los
bacteroides se fue aumentando el tamao del objetivo 10X, 40X hasta llegar
al objetivo de 100X en el cual se utiliz el aceite de inmersin que se utiliza
colocando una gota en el objetivo para facilitar la visin del microscopio al
entrar en contacto con el cubre-objetos; se pudo contemplar que los
bacteroides presentaban forma de bacilos y cocos, y en algunas secciones
se encontraban estos conglomerados entre s.

Basados en el desarrollo del experimento se puede comprender la relacin

que presenta la planta hospedera en este caso Arachis pintoi con la
bacteria con la cual realiza el proceso de simbiosis.

El proceso de simbiosis entre el microsimbionte-macrosimbionte se puede

sintetizar en tres pasos generales, en los cuales se describe la relacin que
se establece entre las bacterias fijadoras de nitrgeno y las plantas
hospederas, dicho proceso se enuncia a continuacin:
1. La bacteria se encuentra presente en el suelo, en forma de pequeas
varillas las que pueden penetrar los pelos radicales de la leguminosa.
2. Luego los organismos son transformados a formas mviles. A su vez,
una proporcin crece a travs de un filamento infectado y penetra en
ciertas clulas parenquimatosas de la corteza, ocasionando su
hipertrofia e hiperplasia para formar un ndulo.
3. En el interior del tejido de la planta las clulas son transformadas en
bacteroides donde se realiza el mecanismo de fijacin.

Asociacin leguminosa microsimbionte

La simbiosis entre leguminosas y las bacterias fijadoras de nitrgeno es
especifica por lo cual se estudia dicha especificidad para as con los datos
analizados en el desarrollo de la prctica de laboratorio poder determinar las
bacteria con la cual hace simbiosis la leguminosa Arachis Pintoi.
o Especificidad de la simbiosis
Los gneros de bacterias que forman ndulos en las leguminosas de
mayor importancia agrcola son Rhizobium y Bradyrhizobium,
principalmente, y en orden de menor importancia, Azorhizobium4.
Teniendo en cuenta los datos planteados en la tabla 1, y el nombre
de la leguminosa recolectada para la realizacin del laboratorio se
plantea el hecho de que la bacteria fijadora de N 2 presente en la
zona bacteroide del ndulo es Bradyrhizobium sp. Por lo cual la
simbiosis observada era Bradyrhizobium sp.-Arachis pintoi.

Tabla 1. Bacterias fijadoras de nitrgenos que forman ndulos en

algunas leguminosas tropicales4
Leguminosa
Frijol comn (Phaseolus vulgaris)
Arvejas (Pisum sativum)

Frijol de costa (Vigna unguiculata)

Soya (Glycine max)
Gandul (Cajanus cajan)
Man(Arachis
hypogaea)
y
Manicillo (Arachis pintoi)
Leucaena (Leucaena sp.)
Kudz (Pueraria phaseoloides)

Bacteria fijadora de N2
Rhizobium leguminosarum
bv.phaseoli
Rhizobium leguminosarum
bv. leguminosarum
Bradyrhizobium sp.
Bradyrhizobium japonicum
Bradyrhizobium sp.
Bradyrhizobium sp.
Rhizobium tropici
Bradyrhizobium sp.

La asociacin que establecen las leguminosas con las bacterias

fijadoras de nitrgeno tiene un alto grado de especificidad. Especies
de Rhizobium o Bradyrhizobium que forman ndulos en una especie
de leguminosa no logran infectar otra especie. La especificidad de la
simbiosis
se ha demostrado que existe entre genotipos de una
misma especie, (i.e. interaccin cultivar de soya x raza de
Bradyrhizobium)4.

As como hay organismos fijadores de nitrgeno que realizan

simbiosis con una planta hospedera (tabla 2), tambin hay aquellos
que son independientes (tabla 3)5.
Tabla 2. Bacterias fijadoras de nitrgeno que realizan simbiosis con
una planta hospedera5
ORGANISMOS FIJADORES SIMBIOTICOS
MICROSIMBIONTE
MACROSIMBIONTE
CAPACIDAD
FIJADORA DE
NITROGENO
Rhizobium
Angiospermas:
Bradyrhizobium
Leguminosas (20000
especies):
-90% de
Prom. 200 Kg N/ha/ao
Papilionoideae y 90%
de Mimosoideae
500 Kg N/ha/ao para
-30% de
algunas asociaciones
Cesalpnoideae
Rhizobium (caup)
Angiospermas

Actinomycetos
Frankia

Cianobacterias
Anabaena
Nostoc

Parasponia (tropical)
(Zigophyllaceae)
Angiospermas
Casuarina (tropical)
Coriaria
Alnus, Purshia
Myricaceae (120
especies templadas)

40 a 200 Kg N/ha/ao
(C. equsetifolia: 5-105)
(A. Rubra: 200-300)

Angiospermas
2 a 5 Kg N/ha/ao
Gimnospermas:
Cycas,
Bowenia(tropical100-200 Kg N/ha/ao
subtropical)
Lquenes,
musgos,
Helechos: Azolla

Tabla 2. Organismos fijadores de nitrgeno independientes5

FIJADORES LIBRES DE NITROGENO
Caractersticas
Genero
Capacidad fijadora
Fisiolgicas
de nitrgeno
Bacterias heterotrficas
Azobacter, Beijerinckia,
Aerbicas
Fijan en presencia de
Pseudomonas, Azospirillum,
O2 pero con muy baja
Methylococcus, Methylobacter eficiencia: 0,5 a 1 Kg
N/ha/ao
Bacillus, Escherichia,
Aerobios facultativos
Fijan solo en ausencia
Klebsiella, Enterobacter,
de O2: 1 Kg N/ha/ao
Clostridia
Bacterias
Autotrficas
Fotosintticas

Rhodopseudomonas,
Chromatium, Rhodospirillum

Thiobacillus
Quimioautotrficas
Cianobacterias (antes
algas azul verdosas)
Anabaena, Nostoc
Filamentosas con
heterocistos
Filamentosas heteroscitos Plectonema, Trichodesmiun

Unicelulares

Gloeocapsa

Fijan solo en
ambientes pobres en
O2

10 a 50 Kg N/ha/ao
Fijan
solo
en
ambientes pobres en
O2
Fijan en presencia de
O2

Fijacin asociativa
Rizsfera de paspalim Azobacter paspali
notatum
Digitarias decumbens
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasilense
Azobacter,
Beijerinckia,
Arroz
Pseudomonas, Arthrobacter
Filsfera de plantas

5 a 10 Kg N/ha/ao
Hasta 30 Kg N/ha/ao
20 a 50 Kg N/ha/ao
Parece ser muy baja

La simbiosis en general tiene dos componentes el Macrosimbionte y el

Microsimbionte, el papel del Macrosimbionte lo realiza la leguminosa en el caso
estudiando en el laboratorio Arachis pintoi y el de el microsimbionte lo realiza
Bradyrhizobium sp.
Es importante aclarar que existen tres tipos de simbiosis: mutualismo,
comensalismo y parasitismo, cada una de ellas con caractersticas especficas; la
primera es una relacin simbitica en la que se benefician ambas partes, en la
mayora de los casos, el beneficio del mutualismo es esencial para ambas partes,
la segunda es una relacin simbitica en la cual una de las partes ni se perjudica
ni se beneficia, mientras que la otra se beneficia y en el parasitismo el hospedador
es daado por su compaero simbitico y el parasito se beneficia6.
De acuerdo a lo anterior podemos decir que el tipo de simbiosis que se genera
entre Bradyrhizobium-Arachis pintoi
es mutualista debido a que ambos
organismos se estn beneficiando con esta relacin, por una parte la bacteria
entega amonio o aminocidos a la planta y recibe cidos orgnicos
(principalmente como cidos dicarboxilicos malato y succinato) como fuentes
carbonadas de energa.
6. DESARROLLO DEL CUESTIONARIO
a. La relacin leguminosa Rhizobium es muy especfica, qu
mecanismos median esta relacin?
La especificidad de la simbiosis leguminosa-microsimbionte es
controlada por un mecanismo extraordinario y complejo, donde las
molculas, probablemente flavonoides o isoflavonoides liberadas de
las races de la leguminosa activan la transcripcin de los genes nod
del microsimbionte compatible. En forma muy general y simplificada,
los genes nodD del microsimbionte producen una protena que, de
alguna forma no conocida aun, es modificada al entrar en contacto
con los flavonoides e isoflavonoides exudados por la raz de la
leguminosa, convirtindola en un activador transcripcional de otros
genes nod presentes en el microsimbionte. Estos genes comprendes
aquellos conocidos como genes comunes y otros que proveen la

especificidad en el reconocimiento de la planta husped y que se

conocen como genes husped-especficos. A diferencia del gen
nodD, los genes comunes y hsn no se transcriben libremente en un
producto (como la protena codificada por los genes nodD, que
aparece incluso en los medios de cultivo de Rhizobium y
Bradyrhizobium) y requieren del activador para su transcripcin. La
activacin de los genes comunes y hsn en Rhizobium y
Bradyrhizobium produce unos lipo-quito-oligosacridos que funcionan
como seal para la iniciacin del proceso de nodulacin4.
b. Cul es la importancia econmica de rhizobia y sus plantas
hospederas?
La simbiosis entre la bacteria Rhizobium y las leguminosas tiene una
gran importancia en el aspecto de la agricultura, la economa y en el
medio ambiente. En cuanto a la agricultura, se dice que se ve
beneficiada ya que causa un aumento significativo de nitrgeno
combinado en suelos desnudo y que carecen de este. Adems las
leguminosas, parte esencial de la agricultura, se ven favorecidas al
poder crecer en zonas donde otras plantas no podran. Por otro lado,
ya que el nitrgeno es uno de los nutrientes esenciales limitados para
el crecimiento de las plantas, esta simbiosis aumenta el nivel de
fijacin del nitrgeno atmosfrico, aumentando as la produccin
agrcola. Tambin beneficiaria a la agricultura econmicamente, pues
debido a que muchas industrias agrcolas dependen de la cosecha de
leguminosas, el hecho de que estas puedan crecer sin abonos
nitrogenados (pues la bacteria los remplazara) hace que sea posible
el ahorrarse millones en abonos. En cuanto a la parte ambiental, los
fertilizantes son uno de los principales causantes del deterioro
ambiental, pues causan la eutrofizacin de masas de aguas, la
erosin de suelos y generacin de lluvias cidas. Estas bacterias
fijadoras de nitrgeno pueden ser utilizadas en remplazo de los
fertilizantes nitrogenados para incrementar el crecimiento de las
leguminosas, acabando con los problemas ambientales que se han
venido causando.

c. Qu efecto sobre la nodulacin radical tiene la fertilizacin con

compuestos nitrogenados en las leguminosas?
Puesto que el amoniaco producido por la nitrogenasa no reprime la sntesis
de la enzima debido a que en el mismo momento en que se forma, se
incorpora a forma orgnica y se usa en la biosntesis; pero cuando hay
exceso de amoniaco, es decir, cuando hay niveles altos en el medio, la
sntesis de nitrogenasa se reprime rpidamente. De esta fmanera, se evita
el desperdicio de ATP en la elaboracin de un producto que ya est
presente en gran cantidad. En algunas bacterias fijadoras de nitrgeno, la

actividad de la nitrogenasa tambin esta regulada por el amoniaco, un

fenmeno llamado efecto (interruptor) del amoniaco. En donde el exceso de
amoniaco da lugar a una modificacin covalente de la nitrogenasa
reductasa, la cual produce una prdida de la actividad enzimtica. Cuando
el amoniaco vuelve a ser factor limitante, esta protena modificada se
convierte en la forma activa y se reinicia la fijacin de N2; por ello se dice
que la regulacin por amoniaco es un mtodo rpido y reversible de control
del consumo de ATP por la nitrogenasa. Nco. Todas las bacterias fijadoras
de nitrgeno poseen el sistema conmutador, aunque est bastante
extendido en ciertos grupos tales como las bacterias fototrficas, donde fue
descubierto.
Se inhibe la simbiosis debido a la presencia de algunos compuestos
orgnicos e inorgnicos de nitrgenos en el suelo, inhibe la fijacin de N2.
Esta inhibicin puede tener tres niveles, en el primero, se inhibe la actividad
de la enzima nitrogenasa presente, en el segundo tambin se inhibe la
sntesis de nueva enzima en el producto final de la reaccin, el NH3, y por
otros compuestos nitrogenados: y, en el caso de la simbiosis con la
leguminosa, ocurre un tercer nivel de inhibicin, ya que la presencia de
nitrgeno mineral inhibe la formacin de los ndulos radicales, es decir, se
ve afectada la presencia de ndulos; es por eso que las races no los
forman sino que por el hecho de estar el Nitrgeno disponible producto de
la fertilizacin la planta utiliza dicho insumo el cual ya se encuentra en
forma asimilable para ella6.
7. CONCLUSIONES
La fijacin simbitica de Nitrgeno es el resultado de un delicado balance
entre la planta superior y una bacteria especfica. Es importante conocer las
condiciones ptimas para esta fijacin de manera que se pueda obtener los
mayores beneficios para la planta.

La relacin simbitica bacteria-planta, para la fijacin biolgica de Nitrgeno

es muy importante, ya que permite disminuir la aplicacin de abonos o
fertilizantes nitrogenados, contribuyendo, de esta forma, a una mejor
calidad de suelo y reduciendo la contaminacin de los recursos hdricos (en
el caso de ros, aguas subterrneas, etc.).

La FBN es uno de los principales mecanismos de aportacin de Nitrgeno

en los ecosistemas naturales, y muy importante en la agricultura; en este
sentido, el contenido de Nitrgeno est estrechamente relacionado con la
cantidad de materia orgnica en el suelo (MO), es decir, la mineralizacin
de la MO aumenta las prdidas en forma de N2 a la atmsfera.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] Redondo, M., Bonilla, I., Bolaos, L. Fijacin Biolgica de Nitrgeno. [En lnea].
[Fecha de consulta: 01 Noviembre 2013]. Disponible en Internet:
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/fijacionN.htm
[2] Pelayo, H., Lizrraga, M. y Vargas, C. 2009. Manual de Prcticas de Fisiologa
Vegetal. Universidad Autnoma de Ciudad de Jurez, Chihuahua. 164p.
[3] Baca, B., Soto, L., Pardo, M. (2000). Fijacin Biolgica de Nitrgeno.
Elementos 38, pp. 43-49.
[4]Enrique Villalobos Rodrguez. Fijacin Simbitica del Nitrgeno. Editorial
Universidad de Costa Rica
[5] John L. Ingraham, Catherine A. Ingraham. Introduccin a la microbiologa,
Volumen 2. Pp. 335
[6] Madigan M, Martinko, J. M, Parker J. Biologa de los microorganismos. Editorial
Pearson Prentice hall SA, Madrid 2004. Pp. 359,598, 603, 677 681.