MARCO TERICO.

La cromatografa en columna es la tcnica de

separacin e identificacin de sustancias qumicas, por
la diferente retencin que experimentan los
componentes de una mezcla, al ser ms o menos
adsorbidos por los componentes de una fase fija situada
en una columna, cuando son arrastrados por un fluido
(fase mvil).
Si la fase mvil es lquida hablamos de cromatografa
lquida y si es gas ser cromatografa de gases.
El adsorbente, suele ser gel de slice o almina, pero
pueden ser otros.
Intervienen los fenmenos de adsorcin y disolucin, por
consiguiente es fundamental tener en cuenta la
polaridad, tanto de las sustancias a arrastrar como del
disolvente, si queremos tener una buena separacin.
El disolvente al descender arrastra las sustancias a
distinta velocidad segn la mayor o menor retencin que
experimenten, y salen de la columna a distinto tiempo.
La tcnica, en forma generalizada, comprende:

Preparacin del disolvente.

Preparacin de la columna.
Desarrollo del cromatograma.
Estudio del tiempo de retencin.
Revelado de las sustancias separadas, si no son
visibles.

El tiempo de retencin es un parmetro til porque es constante cuando se

reproduce el experimento en todas las condiciones, se pone en tablas y sirve para
identificar compuestos; es fundamental en Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC) y en Cromatografa de Gases. (Mndez ngeles. 2011).
Se usan todos los tipos de cromatografa lquida. Lo habitual es que la fase mvil
se deje percolar a travs de la columna por gravedad. No se usa mucho en el
anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la separacin cromatografa de
mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en da existe un sistema cromatogrfico
completo y 12 automtico diseado para el anlisis bioqumico que se conoce
como cromatografa lquida rpida para protenas. Estos instrumentos emplean un

rango de fases en columnas de plstico de 5 o 10 cm que operan bajo presin

moderada.
Se revolucion el uso de la cromatografa en columna para la purificacin de
soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones,
debido a la introduccin de cartuchos cortos de plstico y desechables de
minicolumnas, preempacados con una variedad de fases de separacin con
partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut
y Sep-Pak.
Las soluciones de prueba, de lavado o extraccin pasan rpidamente a travs de
los cartuchos con un poco de vaco generado a travs de una bomba de agua. La
mayora de los mtodos de purificacin tales como la extraccin lquido-lquido, la
TLC y la cromatografa en columna de vidrio que se usan antes de la
espectrofotometra, la GLC, la HPLC etc., pueden ahora realizarse en forma ms
eficiente usando estos cartuchos.
En la cromatografa lquida los componentes de una mezcla son llevados travs
de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una
mvil lquida. Las separaciones estn basadas en las diferencias de la velocidad
de migracin entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por
la naturaleza de los analitos y su interaccin con las fases.

Se lleva a cabo una cromatografa lquida en fase normal cuando la fase

estacionaria es relativamente polar y la fase mvil es relativamente apolar. Se
realiza una cromatografa en fase inversa cuando la fase estacionaria es
relativamente apolar y la fase mvil es relativamente polar.
Hay cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido:
Cromatografa de reparto, para especies poco polares pero no inicas de
masa molecular < 104 g/mol.
Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido, para especies
no polares, ismeras estructurales y grupos de compuestos de masa
molecular< 104 g/mol.

 Cromatografa de intercambio inico, para especies inicas de masa

molecular < 104 g/mol.
Cromatografa de exclusin por tamao o cromatografa en geles, para
solutos con masa molecular >104 g/mol.
La elucin de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte
de la muestra disuelta en la fase mvil a travs de una columna de fase
estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porcin de muestra se
introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se
distribuyen por s mismos entre las dos fases segn la naturaleza qumica de
stos con respecto a las fases mvil y estacionaria. Adicciones posteriores del
disolvente llevan a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que
salen de ella en una tiempo determinado (tx).
Columna cromatogrfica:

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha

necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta
velocidad ser pequea para solutos fuertemente retenidos por la fase
estacionaria, y ser grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase
mvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en
una grfica en funcin del tiempo, un cromatograma, que consta de una serie de
picos simtricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar
tanto cualitativa (posicin en el eje) como cuantitativamente (rea bajo los picos)
los componentes de la muestra.
La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del
rea del pico de un analito con el de uno o ms estndares. Ambos parmetros
varan linealmente con la concentracin.
La cromatografa cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de los
picos (tiempos determinados de retencin) con cromatogramas estndares.

Ejemplo de cromatograma con un detector de Absorbancia:

La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos

depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La
eficiencia mxima para la cromatografa lquida ocurre a muy bajas velocidades de
flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamao
de la partcula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase
mvil o se incrementa la temperatura.
En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas
de vidrio con dimetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partculas de
la fase estacionaria no superaban las150-200 m de dimetro a fin de asegurar
unos caudales razonables.
Adsorbentes empleados:
El adsorbente que constituye la fase estacionaria es de naturaleza variada
dependiendo del tipo de cromatografa que se lleve a cabo. Por ejemplo, en los
casos de cromatografa en placa y en columna se emplean como adsorbentes
almina (Al2O3) y gel de slice (SiO2), siendo este ltimo el ms usado (empleado
en este curso). El gel de slice o slica gel, es un slido blanco que puede
encontrarse pulverizado en diferentes tamaos (nmero de mallas) que de
acuerdo al tipo de cromatografa en placa o en columna, es el gel de slice que se
emplea. (Snchez Ma. Dolores.2004).
En cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende
a travs de la columna.
La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un
tubo capilar o la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la

columna. Alternativamente, las mismas partculas slidas pueden ser la fase

estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el reparto de
solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.

Fig. 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto

A, que tiene una mayor afinidad que el soluto B para la fase estacionaria,
permanece en la columna ms tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna
empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y los
materiales ms usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y
de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil. Para el caso
de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase
estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran
rea superficial, inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos
empleados para empaquetamiento varan, entre los cuales podemos encontrar:
tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de intercambio
inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de
someterse a un tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser
empleado sin problemas.
Es caracterstico que el tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms
uniforme posible.
El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos
siguientes pasos:
1. Colocacin de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de
manera uniforme y compacta en la columna (longitud y dimetro apropiados).

2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los

picos del cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.
Procedimientos de elucin
La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado
soluto es prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede
describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria
por un disolvente.
Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de
los disolventes de acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un
determinado adsorbente, llamada serie eluotrpica. La fuerza eluyente es una
medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valor cero para el
sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su
fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin.
Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se
eluirn los solutos de la columna.
La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa
de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un
eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La
cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la
fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un
disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente.
La cromatografa de fase inversa elimina las colas de los picos porque la fase
estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto
originando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a
impurezas polares (como el agua), que pueda haber en el eluyente.
Elucin isocrtica y gradiente.
La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de
disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de
todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso, se
van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo
un gradiente contino.

Fig. 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s
en su reaccin con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la
fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.
Cromatografa de absorcin y de particin de columna.
Estas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que
la retencin del analito en la columna depende de la naturaleza de su interaccin
con la fase estacionaria.
En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el
soluto, nuestro analito, con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de
pega a la superficie, mientras que en la de particin de columna, el analito se
disuelve dentro de la fase estacionaria.

Cromatografa de adsorcin.

La absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas

sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en
una determinada superficie interfacial, formndose una pelcula del material
retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea slido o lquido, aunque este
proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas o
qumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que
retienen al material es solo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica
enlaces con el adsorbente.
As pues, en la cromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del
analito que queremos separar, dado que si es en una mezcla, cada componente
de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se
retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se
eliminen.
Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de
adsorbente, que es la fase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase
estacionaria slida, formando una cama de partculas que se dividen de modo
que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largo del slido
para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de
absorcin.
El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si
vemos la ilustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la
mancha gris con protuberancias es la fase slida, los huecos en ella son los sitios
de absorcin, donde el analito interacciona con la fase estacionaria y se retiene.
Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque generalmente
encontramos la Hidroxiapatita (Ca3 (PO4)2.Ca (OH)2), almina (Al2O3) y
carbonato de magnesio.

Cromatografa de particin de columna.

Esta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como
granos de fibra o cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay
distribuida una capa fina de un disolvente afn al analito; y una fase mvil liquida o
gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el equilibrio entre esta
y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda
al final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas,
que son el flujo de la fase mvil y que llevan el analito, pasan por la fase
estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una capa donde se quedan
retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,
donde este se disuelve.

Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto
se le llama particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de
la fisicoqumica del sistema, entre las dos fases.
La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente
adherida a la matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir,
en el dibujo de abajo, vemos como el analito, los puntos negros, se quedan
disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa de solvente
adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la
capa de solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se
le llama reparto, y como est sobre una columna, por ello se le llaman particin de
columna.

La solubilidad en ambas fases est dada por el coeficiente de particin, KD: =

( o / ). Eso se debe a que el analito
tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene diferentes

preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito
de la mezcla se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que
tiene el analito pro el disolvente de la columna, el reparto en esta ser mayor que
en la fase mvil.
Cromatografa en gel.
La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en
sustancias sin carga durante una migracin osmtica a travs de geles. La
filtracin en gel es el mtodo de separacin que consiste en la separacin de
molculas basado en el tamao relativo de las mismas.
En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica
cuyos poros se llenan con el solvente que se usar en la fase mvil.
El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la
columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms
pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan
sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo
a masa molecular relativa.

Cromatografa de intercambio inico.

El intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone
en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina
son remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Ocurre un
intercambio de iones de signo igual entre una solucin y un slido esencialmente
insoluble en contacto con la solucin.
Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional
de cadenas polmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos
funcionales ionizables. Se tiene una fase insoluble con sitios inicos fijos de una
sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a

su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin de

que se mantenga la electro neutralidad. Una resina tpica se prepara por
polimerizacin de estireno y divinilbenceno.
Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir
fcilmente, tienen el protn disociado, pero no libres para abandonar la resina,
excepto cuando se sustituyen por otros iones positivos.
Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina
intercambia aniones. Los cambiadores aninicos se preparan con aminas
obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un medio bsico. (Prez C. Ruth.2007)

Fuentes consultadas.
Mndez ngeles. (2011). Cromatografa en columna. 2016, De la gua Sitio web:
http: //quimica.laguia2000.com/general/cromatografa-en-columna.[EN LINEA 10:
00 P.M]
Prez C. Ruth. (2007). Tcnicas Cromatografas. 2016, de Universidad Nacional
Autnoma de Mxico Sitio web:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf. [EN
LINEA 11:29 P.M]
Snchez Ma. Dolores. (2004). Cromatografa en columna. 2016, de scribd Sitio
web: https://es.scribd.com/doc/102368930/Cromatografia-de-columna.[EN LINEA
1:11 A.M ]