ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BILOGICA

Bioqumica General
Reporte de Prctica N4 Determinacin de Aminocidos terminales con grupo alfa amino
libre Mtodo se Sanger Fonseca Camero Karina, Garca Torres Alba Patricia Grupo:
4QM1 Sec: 2 Fecha de realizacin: 25/09/2015

Objetivos
Identificar el aminocido alfa-amino terminal de las
cadenas de la molcula de hemoglobina mediante el
mtodo de Sanger

Introduccin
El mtodo de 1-fluoro-2,4,dinitrobenceno (DNFB) para la
determinacin en pptidos y protenas de los
aminocidos con el grupo alfa amino libre fue
introducido por F. Sanger La determinacin cosnsite en
la dinitrofnilacin del aminocido N-terminal de la
protena, la eliminacin del DNFB que no reaccion,
hidrlisis de la DNP-protena y de la identificacin del
residuo N-terminal por cromatografa en papel.
Qu hicimos?
Hemolobina+Bicarbonat
o de Sodio+DNFB

Agreamos HCl al 3 N
Agregamos ter
saturado con solucin
acusosa de FeSO4
Colocar en la protena
dinitrofenilada en bao
maria y agitar
Centrifugamos a
3000rpm a 15 minutos
Aadimos HCl al 6N

Despus se calent en
autoclave a 3 horas y 15
libras
Agregamos ter
saturado, en 3 porciones
En papel Whatman, se
realiz una
cormatografa en papel
Utilizando cido ctrico,
citrato de sodio
Se coloc dicho
cromatograma, en una
cmara previamente
saturada con el solvente

Se realz el mismo
procedimiento de
cromatografa para DNPphe, DNP-Asp. Dnp-Val
Despus de 5 horas,
sacamos los
cromatogramas de la
cmara, y se marc el
frente del solvente
Por dicha cromatografa
se identific el residuo Nterminal de la protena
hemoglobina

Para qu?
Para que reactivo de DNFB
reaccione con la protena, se
tiene que llevar a cabo en
condiciones alcalinas
Para detener la reaccin
Para obtener la fase acuosa
de la solucin

Para comparar los resultados

obtenidos de Rf, para cada
aminocido
Para obtener los datos
necesarios para realizar los
clculos de rRf

Que en este caso el ms

cercano es el de la valina ,
debido a que el Rf DNP-val
fue de 0.88 y el de nuestro
problema se obtuvo de Rf
problema= 0.84

Resultados:

1.- DNP- Phe

2.-DNP- Val
3.-DNP-Ala

Para eliminar cualquier

residuo de la fase etrea que
pudo haber quedado
Para eliminar el
sobrenadante
Para que la protena se
hidrolizara en condiciones
cidas.
Para que la hidrolisis se
llevara a cabo se necesitaban
de stas condiciones de
temperatura y presin
Para obtener el hidrolizado
Para la identificacin del
residuo N-terminal de la
hemoglobina
Como solvente

4.-DNF
5.-Poblema

Fig 1. Representacin del cromatograma realizado

en la prctica

Distancia recorrida de la fase mvil: 32 cm

(Fd)
Distancia recorrida del problema: 26.9

Conclusiones

Frmula

Rf (Relacin de frentes)=

Centro del Soluto(Fs)

Frente del solvente( Fd)

Compuesto

Fs

Rf

DNP- Phe

24 cm

24
32=0.75

DNP- Val

28.3 cm

28.3
32=0.88

DNP-Ala

24.5 cm

24.5
32=0.76

DNF

19 cm

19
32=0.59

Problema

26.9 cm

26.9
32=0.84

Anlisis de resultados:
Mediante el mtodo de Sanger se determin
experimentalmente el grupo amino libre de la molcula
hemoglobina mediante una cromatografa en papel para
su identificacin con aminocidos dinitrofenilados como
referencia junto con nuestro producto hidrolizado, de
acuerdo con la bibliografa la hemoglobina est
conformada por cuatro polipptidos: dos cadenas alfa y
dos cadenas beta. Cada cadena alfa est constituida por
141 aminocidos y la valina es el aminocido con el
grupo alfa amino libre, es decir el amino terminal y la
cadena beta contiene 146 aminocidos tambin con la
valina con el el grupo alfa amino libre..(3)
Lo que se obtuvo en los valores de Rf que en
comparacin con nuestro problema el valor ms alto fue
el de la valina lo que indica que mediante este mtodo
se pudo llegar a la determinacin el amino libre de la
hemoglobina, no se necesit de un indicador debido a
que el reactivo de Sanger es de color amarillo por lo que
se distinguen bien.

Se identific el grupo N-terminal de la

hemoglobina, mediante el mtodo de Sanger, a
pesar de ser un proceso largo, y muy laborioso,
es muy til para la identificacin de ste grupo
N-terminal
En la prctica solo se identific al grupo alfaamino libre, aunque el reactivo de sanger
tambin reacciona con los grupos imidazol,
fenlicos y psilon amina, de cualquier protena,
as que ste es un buen mtodo para la
identificacin de dichos grupos.
Los aminocidos que reaccionan con el reactivo
de 1-fluoro-2,2-dinitrobenceno se quedan en la
fase etrea, mientras que los aminocidos que
no reaccionan con este reactivo quedan en la
fase acuosa, por eso es la fase que se elimina.
Si la hidrolisis no se llevara a cabo a las
condiciones necesarias de temperatura y
presin, no se obtendra el hidrolizado
esperado, y los resultados pudieran variar en
cuanto a la identificacin de los grupos que
queremos obtener.
La identificacin del residuo N-terminal por
cromatografa es uno de los principales
procesos, ya que en l se identifica al grupo que
nosotros esperamos, y quien fue el objetivo de
la prctica para su identificacin.

Bibliografa
1. http://themedicalbiochemistrypage.org/es/pr
otein-structure-sp.php, Estructura de las
protenas , consultado 29 septiembre 2015
2. https://www.clubensayos.com/Ciencia/Pr
%C3%A1ctica-No-1-Determinaci%C3%B3nDe-Amino%C3%A1cidosTerminales/1101801.html Determinacin de
aminocidos

terminales.

septiembre 2015

Consultado

29

3. Pea, Arroyo, Gmez, Tapia, Gmez.

(2004). Bioqumica. Mxico: LIMUSA.
(pg 84-85)