Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA:
CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN
CLNICO
CLINICAL MICROBIOLOGY LABORATORY: BASIC KNOWLEDGE TO A PHYSICIAN
RESUMEN
El principal objetivo de la microbiologa clnica es identicar
el agente etiolgico de una infeccin y determinar la susceptibilidad a determinados antimicrobianos. Para obtener los
mejores resultados clnicos, es necesario tener asociaciones
slidas entre el mdico tratante y el especialista tcnico de
laboratorio, fomentando una comunicacin abierta.
El ciclo diagnstico de una enfermedad infecciosa inicia con
una etapa pre-analtica, en la cual el mdico tratante realiza un diagnstico presuntivo y solicita la recoleccin de una
muestra para realizar un diagnstico microbiolgico. Esta
etapa es crtica para obtener resultados vlidos. Una vez recibida la muestra en el laboratorio, comienza la etapa analtica
o de diagnstico microbiolgico, en la cual la muestra es procesada mediante diferentes metodologas, obtenindose un
resultado nal. Luego, en la etapa post-analtica, se prepara
un informe con el resultado nal que es enviado al mdico o
al servicio de donde provino dicha muestra.
Palabras clave: Diagnstico de laboratorio, pruebas microbiolgicas, procesamiento de la muestra, comunicacin mdicolaboratorio, laboratorio de microbiologa clnica.
SUMMARY
The main objective of clinical microbiology is to identify
the etiologic agent of an infection and determine the
susceptibility to certain antibiotics. For best clinical outcomes,
it is necessary to have a close communication between the
treating physician and the laboratory technical specialist.
INTRODUCCIN
La microbiologa clnica es una ciencia de juicio interpretativo que responde a las necesidades clnicas del mdico tratante, con el n de identicar el
agente etiolgico de una infeccin y establecer la actividad in vitro de las
drogas antimicrobianas contra el (los) microorganismo (s) identicado (s).
Para maximizar el valor clnico de las pruebas diagnsticas microbiolgicas,
es crucial que exista una estrecha colaboracin entre el mdico tratante, la
enfermera y el laboratorio de microbiologa, para lo cual, es necesario que
los mdicos tratantes confen en los resultados que entrega el laboratorio
de microbiologa y as mismo el laboratorio, debe garantizar resultados
exactos, signicativos y clnicamente relevantes (1-4). Una de las funciones principales del laboratorio de microbiologa es garantizar un rpido
resultado al clnico, que contribuya a la toma de decisiones en aquellas
situaciones que as lo requieran. Para ello, la gran mayora de los labora
569
ETAPA PRE-ANALTICA:
SELECCIN, RECOLECCIN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Para obtener resultados que avalen el diagnstico de enfermedades infecciosas, es esencial realizar una apropiada recoleccin y manipulacin
de la muestra (3, 5-7). Por este motivo las recomendaciones descritas en
el manual de toma de muestras del laboratorio del lugar donde trabaja
el clnico, deben tenerse presentes y cumplirse cabalmente. El manual de
toma de muestras debe estar actualizado en base a las ltimas evidencias
disponibles (3, 6, 7) y debe detallar:
I) El tipo de muestra apropiado para cada caso.
II) La forma de recoleccin de la muestra.
III) Las condiciones de transporte hacia el laboratorio (tiempo de transporte
ideal, tipo de envase para la recoleccin de la muestra y temperatura de
transporte).
IV) Conservacin de la muestra.
V) Las polticas del laboratorio (por ejemplo: nmero de muestras que pueden ser sometidas a una determinada prueba y el tiempo de respuesta de
cada una).
Idealmente este manual debe estar disponible en el sistema informtico de
la institucin, junto con el men de pruebas que ofrece el laboratorio de
microbiologa (4). En todo momento el personal de microbiologa puede
asistir al equipo mdico que lo requiera, para asegurar una buena calidad
de la muestra (3, 5).
Las muestras enviadas al laboratorio de microbiologa deben ser idealmente obtenidas en el perodo donde haya mayor excrecin del agente
infeccioso, desde un sitio representativo de la infeccin y en una cantidad
suciente que garantice su buen procesamiento en el laboratorio, usando
tcnicas apropiadas que eviten la contaminacin. Se debe procurar obtener la muestra antes de instaurar una terapia antimicrobiana o bien antes
de introducir cualquier modicacin del tratamiento antimicrobiano, debido a que disminuye el rendimiento de la prueba (3, 5, 7).
Por otro lado, los sistemas de recoleccin utilizados deben ser estriles,
hermticos y apropiados al tipo y volumen de muestra que se desea obtener (3, 5, 7). Las torundas o hisopos de Dracon rayon o algodn, no son
un buen mtodo para recolectar una muestra, debido a que recolectan
microorganismos contaminantes, mantienen un volumen de muestra extremadamente pequeo (0,05 mL), sus bras dicultan la recoleccin de
bacterias u hongos y el inculo de la torunda a menudo no es uniforme
cuando es sembrada en diferentes placas de agar. Es por este motivo que
se utilizan principalmente para la recoleccin de muestras nasofarngeas.
Actualmente existen las torundas ocadas, las cuales han mostrado ser
ms efectivas que los otros tipos de torundas, debido a que sus bras de
nylon perpendiculares mantienen un campo electrosttico que crea una
delgada capa altamente absorbente, con una estructura abierta que permite mantener la muestra cercana a la supercie, para una completa y
rpida elucin de la muestra. Son utilizadas principalmente para recolectar
muestras que son analizadas por metodologas basadas en cido nucleico
(2, 3, 8, 9).
[LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN CLNICO - DRA. MARGARETA MHLHAUSER P. Y COL.]
CICLO DIAGNSTICO
Paciente consulta al mdico
con signos y sntomas de una
enfermedad infecciosa
Etapa Pre-Analtica
Etapa Post-Anlitica
La orden de examen
y la(s) muestra(s) son
transportadas al laboratorio
El laboratorio puede o
no emitir un informe
preliminar
Recepcin de la muestra
y orden de examen en el
laboratorio. Ingreso de
datos de la orden en sistema
informtico o en libro de
registro
Resultados de la identicacin
sistemtica son analizados
Despus de la incubacin
los cultivos son examinados
y posteriormente los
microorganismos son identicados
a travs de diferentes tcnicas
Etapa Analtica
Las muestras pueden ser
sometidas a diferentes tipos de
metodologas
(segn orden mdica).
-Dg. microbiolgico Directo
(Dg. tradicional/Dg no
tradicional)
-Dg. Microbiolgico
indirecto
Modicacin de Konemans Color Atlas and Text Boock of Diagnostic Microbiology, 6th Edition, United Stated, Lippincott Williams & Wilkins, 2006:1-61.
571
Las condiciones de transporte de las muestras deben ser mantenidas cuidadosamente, desde su recoleccin hasta su recepcin en el laboratorio,
ya que permiten mantener su integridad. stas deben llegar rotuladas perfectamente y con la informacin completa, idealmente con una etiqueta
adherida al envase, conteniendo los mismos datos de la orden de examen.
Se deben incluir en la orden o solicitud de examen, todos aquellos datos
del paciente, que permitan elegir el mejor procedimiento para el aislamiento del patgeno. Algunos de estos datos son:
I) Antecedentes personales del paciente.
II) Diagnstico presuntivo.
III) Sitio especco de recoleccin y tipo de muestra.
IV) Administracin previa de antimicrobianos.
V) Datos de mdico tratante.
VI) Alerta en caso de sospecha de un microorganismo altamente
patognico (por ejemplo: Neisseria meningitidis) (2-5, 7).
Flagelo
Hifas
Gemas
A) Flujo vaginal con abundantes hifas de levaduras y levaduras en gemacin (Lente 40X). B) Flujo vaginal con Trichomonas (Lente 60X). Modicado de Anderson M.,
Klink K. and Cohrssen A. Evaluation of Vaginal Complaints. JAMA. 2004; 291(11): 1368-1379.
572
[LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN CLNICO - DRA. MARGARETA MHLHAUSER P. Y COL.]
tivo), morfologa (cocos, bacilos, cocobacilos) y agrupacin (racimo, cadena, diplo, empalizada). La tincin de Gram tambin permite observar
clulas y levaduras (2, 7, 11-13).
573
travs de la aplicacin de pruebas manuales (pruebas directas, bateras bioqumicas, galeras bioqumicas y medios de cultivo cromgenos) (guras 6) o
automatizadas (equipos que realizan las pruebas bioqumicas y metablicas
de manera miniaturizada) (gura 7); pruebas de requerimiento nutricional y
pruebas diagnsticas no tradicionales, tales como, pruebas inmunolgicas,
espectrometra de masa y pruebas basadas en cidos nucleicos (2, 4, 11, 12).
574
[LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN CLNICO - DRA. MARGARETA MHLHAUSER P. Y COL.]
b. Susceptibilidad Antimicrobiana
Posterior al aislamiento e identicacin de un microorganismo clnico
signicativo, se realiza la prueba de susceptibilidad antimicrobiana,
con el objetivo de guiar al clnico a elegir una terapia antimicrobiana
adecuada. El estudio de susceptibilidad antimicrobiana (antibiograma o
antifungigrama), es un mtodo que determina, in vitro, la susceptibilidad
de las bacterias y hongos, respectivamente, a los antimicrobianos, bajo
condiciones especcas y estandarizadas de laboratorio.
La susceptibilidad antimicrobiana puede ser obtenida a travs de tres tcnicas:
I) La difusin con disco (mtodo de Kirby-Bauer) es una tcnica econmica, que entrega informacin cualitativa de la sensibilidad de un microorganismo a un determinado antimicrobiano (sensible, intermedio o resistente). Esta prueba consiste en la difusin de un antimicrobiano impregnado
en un disco de papel, sobre la supercie de una placa de agar sembrada
previamente con el microorganismo en estudio. Si el microorganismo es
sensible al antimicrobiano, sufre una inhibicin de su crecimiento alrededor
del disco, formando un halo de inhibicin que es visible y medible luego
de 18 hrs. de incubacin. El dimetro de la zona de inhibicin determina si
existe sensibilidad o resistencia al antimicrobiano (gura 8) (2, 7, 14, 15).
II) La Epsilometra o E-test, entrega informacin cuantitativa de la sensibilidad del microorganismo, determinando la Concentracin Inhibitoria
Mnima (CIM) de un antimicrobiano, es decir, la concentracin mnima del
antimicrobiano que es capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo determinado. Este mtodo consiste en una tira plstica impregnada con
concentraciones crecientes del antimicrobiano, la cual es puesta en una
placa de agar sembrada previamente con el microorganismo en estudio. El
agente antimicrobiano difunde en el agar produciendo inhibicin del crecimiento bacteriano alrededor de la tira. La CIM corresponde al punto donde
el crecimiento bacteriano alcanza la tira (gura 9) (2, 7, 14, 15).
575
III) La Dilucin es la metodologa estndar de oro para obtener la susceptibilidad antimicrobiana. Esta metodologa entrega informacin cuantitativa, determinando la CIM. Se basa en la dilucin seriada de un antimicrobiano en un medio lquido o slido, los cuales se ponen en contacto
con una concentracin estndar del microorganismo en estudio. Luego
de incubarlos por 18 hrs. se observa el crecimiento del microorganismo
y se establece la CIM, la cual corresponde a la mnima concentracin del
antimicrobiano donde no se observa crecimiento del microorganismo. En
la actualidad existen equipos automatizados que efectan una dilucin en
caldo en forma miniaturizada, permitiendo obtener resultados de CIM en
forma rpida (gura 10) (2, 7, 14, 15).
s Inmunocromatografa
Otra tcnica muy utilizada es la inmunocromatografa (por ejemplo
el test pack farngeo Streptococcus pyogenes), la cual permite detectar el agente etiolgico directamente desde la muestra. Consiste
en una membrana porosa de nitrocelulosa, ten o nylon, que por
debajo presenta una almohadilla de material absorbente, la cual
contiene un primer anticuerpo especco contra el antgeno, ligado a
partculas de ltex o metal coloidal (reactivo detector). La membrana
en su parte superior contiene inmovilizado un segundo anticuerpo
especco contra el antgeno, que est ligado a un reactivo de captura.
Generalmente la membrana y la almohadilla estn unidas a un envase
plstico desechable, que en su parte inferior presenta un pequeo
oricio donde es depositada la muestra. Al depositarla en la parte
inferior del envase, la muestra toma contacto y se difunde por la almohadilla absorbente, encontrndose el antgeno de la muestra con el
primer anticuerpo. Este complejo se difunde por capilaridad a lo largo
de la membrana hasta encontrarse y unirse (en su parte superior) al
segundo anticuerpo. As el reactivo detector y el reactivo de captura
se encuentran, producindose una lnea de color en la zona superior
de la membrana (gura 12) (14, 16, 17).
s El Enzimoinmunoensayo (EIA), el cual es una metodologa utilizada para detectar antgenos directamente desde la muestra. Una de
las tcnicas ms utilizadas en microbiologa es el ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA) de captura, donde se utiliza un
anticuerpo especco del antgeno, el cual es jado a una fase slida
(placa). El antgeno presente en la muestra se une al anticuerpo especco. Posteriormente se aade un segundo anticuerpo especco contra
el antgeno, el cual est unido covalentemente a una enzima. Luego
de un periodo de incubacin y varios procesos de lavado, el complejo
Droga
(g/mL)
50
25
12,5
6,2
3,1
1.5
0.75
Sin
Droga
Sin
Bacteria
Levinson W., Antimicrobial Drugs: Resistance, Levinson W., Review of Medical Microbiology and Inmunology, 20th Edition, United Stated, Mc Graw Hill, 2012: 86-94.
576
[LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN CLNICO - DRA. MARGARETA MHLHAUSER P. Y COL.]
Antgeno
Fase
Slida
Anticuerpo
Marcado
Anticuerpo
Biotinilado
Prueba de inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA) de captura, para detectar un antgeno. Modicacin de Koivunen M. and Krogsrud R. Principles of Immunochemical
Techniques Used in Clinical Laboratories. LabMedicine. 2006; 37 (8): 490-497.
Resultado positivo
Anticuerpo
inmobilizador en
la membrana
Anticuerpo unido
a las partculas
de oro
Anticuerpo
especie especco
Resultado nagativo
Modicacin de Paek S., Lee S., Cho J. and Kim Y. Development of Rapid One-Step Immunochromatographic Assay. Methods. 2000; 22 (1):53-60.
s La inmunouorescencia es una tcnica que permite detectar el antgeno presente en una muestra. Esta tcnica tiene dos modalidades. La
primera es la modalidad de anticuerpo uorescente directo (Direct Fluorescent Antibody, DFA) que consiste en una lmina con la muestra del
paciente previamente jada, a la cual se le aplica un anticuerpo especco. Luego de un perodo de incubacin y de varios procesos de lavado,
Control negativo
Anticuerpo AntiAnticuerpo
Anticuerpo Anti-Antgeno
B
B
FIGURA 14. PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA O DE ANTICUERPO FLUORESCENTE
DIRECTO
Fluorescena
Anticuerpo
Anti-Antgeno
B
B
A
Lmina
A
B
A
Lmina
A
B
de tcnicas para detectar esta amplificacin, tales como la RPC convencional (deteccin de la amplificacin una vez finalizada la RPC,
en un gel de agarosa con un intercalante inespecfico fluorescente) y
la RPC en tiempo real (identificacin inmediata de la amplificacin,
principalmente a travs de hibridacin con sondas marcadas con un
fluorocromo y posterior lectura de la fluorescencia emitida por la
sonda, en el equipo de amplificacin). Se obtienen resultados dentro
de 30 minutos a dos horas (14, 15, 18, 19).
La secuenciacin de productos de RPC, permite la identicacin de bacterias a travs de la comparacin del resultado de la secuenciacin con
secuencias ya conocidas en bases de datos. Una de las tcnicas ms
utilizadas para este n, es la secuenciacin del ARN ribosomal 16S, la
cual permite detectar e identicar microorganismos no cultivables, fastidiosos o de lento crecimiento (20).
La epidemiologa molecular consiste en el estudio de la diseminacin de
un microorganismo entre pacientes, personal de salud y el entorno ambiental (brote), a travs de la comparacin de genomas de un microorganismo aislado desde diferentes sitios, mediante mltiples tecnologas
tales como, la Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) y el Multilocus
Sequence Typing (MLST) (17).
III. La espectrometra de masa es una metodologa recientemente incorporada al diagnstico microbiolgico. sta permite una rpida deteccin (pocos minutos) de un microorganismo aislado desde
un cultivo (18, 21) a travs del anlisis de sus protenas y posterior
bsqueda y comparacin de su espectro de protenas en una base
de datos, donde se identica el microorganismo a nivel de gnero
y especie. Recientes estudios han probado utilizar esta metodologa
directamente desde la muestra con resultados promisorios (21).
[LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: CONOCIMIENTOS BSICOS PARA UN CLNICO - DRA. MARGARETA MHLHAUSER P. Y COL.]
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Raoult D., Fournier P, Drancourt M. What does the future hold for clinical
microbiology? Nat Rev Microbiol. 2004;2(2):151-159.
2. Washington J., Principles of Diagnosis, Baron S., Medical Microbiology, 4th
edition, Galveston (Texas), University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996:
Disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7627/.
3. Baron E., Miller M.,3 Weinstein M., et al. A Guide to Utilization of
the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013
Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the
American Society for Microbiology (ASM)a. Clin Infect Dis. 2013;57(4):e22-e121.
4. Murray P., and Witebsky F., The Clinician and the Microbiology Laboratory.
Mandell D., Bennett J., Dolin R., 7th Edition, United Stated, Elsevier, 2010: 233-276
5. Kalenin S., Budimir A. The role of the microbiology laboratory in healthcareassociated infection prevention. Int J Infect Control. 2009; 5:1-6.
6. Cantn R. Role of the microbiology laboratory in infectious disease surveillance,
alert and response. Clin Microbiol Infect. 2005; 11: 3-8.
7. Montiel F. y Guzmn A. Laboratorio de Microbiologa Clnica. Diagnostico
de las Enfermedades Infecciosas. Boletn Escuela de Medicina. Ponticia
Universidad Catlica de Chile.1997;26:140-145.
8. Faoagali J. Swabs then and now: cotton to ocked nylon. Microbiology
Australia. 2010; 3:133 - 136.
9. Scansen K., Bonsu B., Stoner E., et al. Comparison of Polyurethane Foam to
Nylon Flocked Swabs for Collection of Secretions from the Anterior Nares in
Performance of a Rapid Inuenza Virus Antigen Test in a Pediatric Emergency
Department. J Clin Microbiol. 2010; 48 (3): 852-856.
10. Isenberg H., Specimen, Collection, Tansport and Acceptability. Isenberg
H., Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2th Edition, United Stated,
ASM Press 2004:2.1.1-2.1.25.
11. Washington C., Allen S., Janda W., et al., Introduction to Microbiology:
Part I, Washington C., Allen S., Janda W., et al., Konemans Color Atlas and
Text Boock of Diagnostic Microbiology, 6th Edition, United Stated, Lippincott
Williams & Wilkins, 2006:1-61.
12. Levinson W., Laboratory Diagnosis, Levinson W., Review of Medical
Microbiology and Inmunology, 20th Edition, United Stated, Mc Graw Hill,
2012: 61-68.
579