Objetivos

Los objetivos de este trabajo de investigacin son los siguientes:

Establecer los procedimientos necesarios para llevar a cabo el anlisis de cido
benzico mediante la descripcin de la metodologa que permita conocer cmo se debe
de realizar el muestreo, la separacin, la identificacin y la cuantificacin del analito, en
este caso, en productos lcteos.
Realizar la validacin del mtodo instrumental propuesto (HPLC) para la determinacin
cuantitativa del cido benzico en los productos lcteos.

Antecedentes del analito

Primero que nada se presentan los antecedentes del cido benzoico con el fin de poder
entender la importancia de analizarlo. El cido benzico tiene el No. CAS: 65-85-0, su
frmula es: C7H6O2, su peso molecular es: 122.13 g/mol y su apariencia fsica es la de
un slido blanco. Esta molcula est compuesta por 3 enlaces C=C y 3 enlaces C-C
que forman el anillo de benceno; adems, debido a que tiene un grupo carboxlico,
estn presentes un enlace C=O, un enlace C-OH y otro enlace C-C tal como se puede
observar en la siguiente imagen:

El cido benzoico, debido a la composicin qumica antes mencionada, tiene

diferentes usos o aplicaciones, a continuacin se enlistan algunos de los ms
importantes:
Como intermediario o reactivo para la sntesis de: fenol, caprolactama, steres
dibenzoatos de glicol, y compuestos de benzoatos y de benzoilos.
Para conservar o preservar alimentos, grasas, jugos de frutas, soluciones alcaloides,
lquidos orales farmacuticos, entre otros.
Como aditivo antimicrobiano en alimentos, generalmente en su forma de sal de sodio
debido a su poca solubilidad acuosa del cido libre
Como regulador del crecimiento de las plantas
Como estndar para anlisis volumtricos y calorimtricos
Para curaciones del tabaco

Como agente de taponamiento temporal en formaciones subterrneas

Para absorber rayos UV en los plsticos
Como inhibidor del crecimiento de mohos (fungicida)
Para impresiones de calic
Para tintes, perfumes, desodorantes, cremas corporales o cremas dentales
Sin embargo, aunque tenga varias aplicaciones en diferentes industrias, es
importante considerar los aspectos txicos que puede llegar a tener. El cido benzico
puede entrar por contacto con el ojo, por inhalacin o por ingestin. En los animales se
ha determinado que el LD50 de la toxicidad oral aguda es de: 1700 mg/kg (en ratas),
1940 mg/kg (en ratones) y de 2000 mg/kg (en perros); mientras que para la toxicidad
dermal aguda el LD50 es de 10000 mg/kg (en conejos). Con respecto a humanos, estar
expuesto de forma prolongada o repetida puede resultar en dao a los pulmones, el
sistema nervioso y las membranas de la mucosa; asimismo, es peligroso si entra en
contacto con la piel o los ojos, si se ingiere o si se inhala debido a que provoca
irritacin, erupciones, enrojecimiento y sensacin de ardor al contacto; y, en caso de
contacto cutneo es un permeabilizador.
Es importante considerar que al entrar en contacto con otras sustancias puede
resultar contraproducente por los efectos secundarios que pueda causar. Un ejemplo
es la combinacin de cido benzico con cido ascrbico (vitamina C) ya que resulta
en la formacin del benceno el cual puede causar leucemia, dao en el ADN y en las
mitocondrias, muerte celular o el Transtorno de Dficit de Atencin con Hiperactividad
(ADHD).

Debido a los aspectos txicos que puede llegar a tener esta molcula fue que se
establecieron lmites mximos permisibles en los productos que contienen cido
benzico. A lo largo de la investigacin realizada, se hizo un enfoque en la industria de
alimentos, en especial, en los productos lcteos. De acuerdo con la NORMA Oficial
Mexicana NOM-185-SSA1-2002, para los derivados de la leche se tienen los siguientes
lmites mximos:
50mg/kg para la elaboracin de productos lcteos fermentados aromatizados y
acidificados preparados con vegetales y con adicin de otros ingredientes.
1000mg/kg para la elaboracin de los dulces a base de leche

A manera de cierre sobre la importancia del cido benzoico se puede observar

que la molcula tiene beneficios tales como prevenir el crecimiento de bacterias, mohos
u hongos por lo que puede ser utilizado para la conservacin de alimentos o lquidos
orales farmacuticos. De igual manera, se puede utilizar para tratar infecciones de
leves a severas en humanos o tejidos animales como la dermatofitosis y el pie de atleta
bajo un uso controlado. Es importante mencionar que los resultados son mejores a un

pH igual o menor a 5; por ejemplo, en el caso de la fermentacin anaerbica se reduce

en ms del 90%.
Finalmente, al utilizar el cido benzico para la fabricacin de plaguicidas e
insecticidas, tambin resulta beneficioso para la industria agro al poder mantener en
mejores condiciones las plantas, los cultivos, entre otros. En pocas palabras, la
utilizacin de esta molcula reduce la probabilidad de que la poblacin tenga
problemas de la salud relacionados con alimentos caducados lo que a su vez puede
mejorar la economa de la poblacin al ser menor la cantidad de dinero destinado a
problemas de la salud; de igual forma, resulta beneficioso para las industrias
(alimentaria, farmacutica, agrcola, entre otras) ya que sus materias primas o
productos se conservan en buen estado en un periodo de tiempo mayor.

Seleccin de los procedimientos analticos

La cromatografa de lquidos (HPLC) fue por primera vez usada en el siglo XX por el
botnico ruso llamado Mikhail S. Tswett quien intentaba separar los pigmentos de las
hojas. l llen una columna con una cama de partculas, introdujo su muestra en la
columna y la dej pasar a travs de ella seguido por un solvente puro. Conforme
pasaba por la columna, la muestra se separ en colores. Por esta razn Tswett decidi
llamarlo cromatografa, que significa escritura de colores.
En 1970 se empez a usar el acrnimo HPLC que significa cromatografa de
lquidos de alta presin debido a que en ese entonces la presin ms alta alcanzada
por las bombas era de 35 bares. Con el tiempo la tecnologa permiti una mejora en la
presin alcanzada por estas bombas y mejor decidieron cambiarle el nombre usando
las mismas siglas a cromatografa de lquidos de alto desempeo.
Hoy en da la cromatografa de lquidos (HPLC) es una de las herramientas ms
poderosas en la qumica analtica debido a su rapidez y efectividad. Gracias a ella se
puede dar por hecho que se puede tener tres pesticidas mezclados homogneamente y
ser capaz de separarlos en menos de seis minutos. Es incluso capaz de detectar
compuestos traza aun estando en una concentracin tan baja como partes por trilln de
manera perceptible. Por esa razn, tiene diversas aplicaciones en las industrias
farmacutica, alimentaria, cosmtica y qumica, adems de tener impacto en la
ecologa e inclusive en la investigacin forense
Para concluir la idea antes mencionada se muestran a continuacin algunas de
las ventajas que tiene HPLC:
Tiene una difusin mnima en la fase mvil, debido a la rapidez del anlisis.

 No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza a temperatura

ambiente o ayudado por un calentador de columnas a temperaturas menores de 100C.
La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso posterior.

Muestreo
Muestreo en leche lquida o cremas
La muestra tiene que ser representativa de la masa del material siendo examinado.
Debe de ser recolectado de tal forma que no se contamine de manera microbiolgica o
qumica. Se debe de proveer proteccin a la muestra contra cambios durante el
proceso de recoleccin y el anlisis.
a. Equipo requerido para la toma de muestras:
1. Termmetro
Puede ser de mercurio o electrnico, con graduacin que no pase de 1,
adems, el termmetro debe de verificarse comparndolo con uno
certificado por el Bur Nacional de Estndares.
2. Instrumentos de transferencia de muestras.
Empacados de manera individual
Esterilizados
Tubos para muestras de un solo uso
3. Contenedores para muestra
1) Contenedores de uso mltiple:
i. Contienen un mnimo de 15mL
ii. Suficiente capacidad para permitir mezclar los contenidos que van a ser
utilizados
iii. Deben ser esterilizados por medio de calor seco o vapor
iv. Tapas hermticas contra fugas que deben ser consideradas no txicas.
2) Equipo para muestreo estril puede ser utilizado para recolectar porciones
de al menos 10 mL.
3) Equipo esterilizado antes de polietileno o cualquier otro material no txico
y adecuado puede ser utilizado.
4. Contenedor de muestras
De construccin dura, puede ser de metal o plstico. Completamente
aislada, con una tapa bien cerrada y con suficiente espacio para hielo o
cualquier otro refrigerante. Para poder mantener las muestras tomadas

entre 0 y 4.4C hasta ser removido en el laboratorio. Deber de tener

rejillas que mantengan las tapas de las muestras arriba del lquido
refrigerante.
b. Limpieza, esterilizacin y sanitizacin del equipo.
1. Por medio de aire caliente se debe de mantener el equipo a no menos de
170C por no menos de 1 hora
2. Esterilizacin por Autoclave: Cristalera y equipo de metal puede ser
esterilizado por medio de vapor mantenindolo a 121C por no menos de
15 minutos. El equipo debe de estar seco antes de usarse.
c. Procedimiento de recoleccin de leche bronca:
a) Antes de empezar los procedimientos, se deben lavar y secar las manos,
mantenerlas limpias durante toda la operacin. No abrir el tanque grande
hasta que la leche ha sido medida y muestreada.
b) Observar y no muestrear partes congeladas o estancadas.
c) Secar el objeto de medicin y guardarlos afuera del tanque (deben ser
sanitados antes de ser utilizados)
d) Agitar el tanque que ser muestreado al menos por 5 minutos.
e) Checar la temperatura de la leche.
A) Informacin necesaria para cada muestra:
a) Determinar y apuntar la temperatura de todos los lugares muestreados.
b) Apuntar el tiempo y da en cada muestra tomada.
B) Transportacin y Guardado de la muestra
a) Usar hielo u otro refrigerante para mantener las muestras de 0 a 4.4C.
No congelar las muestras lquidas.
b) Proteger las muestras contra contaminacin. Contaminacin por agua de
hielo se puede prevenir utilizando rejillas o compartimientos y
manteniendo el agua un poco debajo de las muestras de leche.
c) Mandar las muestras rpidamente al laboratorio. Las muestras que tienen
que ver con procesos microbiolgicos debern de ser analizadas en
menos de 36 h.
d) Las muestras transportadas por alguien ajeno al laboratorio debern ser
mandadas con una marca anti manipulaciones o un candado.
d. Procedimiento de recoleccin para cajas o tanques de leche
Despus de agitar, muestrear la leche con un cucharn esterilizado; despus
enfriar la muestra y mantenerla en 0-4.4C. Poner la muestra en una caja para

muestras y mndala al laboratorio lo ms rpido posible.

e. Procedimiento de recoleccin para leche pasteurizada.
Seleccionar una muestra representativa de todos los productos sin tomar en
cuenta la edad, mientras an estn en posesin del productor. Apuntar el da de
procesamiento junto con el cdigo y enviarlo al laboratorio. Si necesario
despus de mezclar el producto en su contenedor transferirlo a un contenedor
estril de muestreo. Guardar las muestras a temperatura de 0-4.4C y mandarlas
lo ms rpido posible al laboratorio, los anlisis debern de empezar en menos
de 36 horas.
f. Procedimiento de recoleccin de queso
Se recolectan muestras de los contenedores originales sin abrir. Se envan estos
a los laboratorios en los contenedores originales excepto cuando el tamao de
los contenedores lo vuelve imprctico. Como los nmeros de coliformes
disminuye con el tiempo en productos como el queso debido al ambiente cido,
las muestras debern de ser examinadas en menos de 24 horas despus de que
estos son manufacturados. Mantener las muestras entre 0-4.4C.
Tratamiento de muestra
Para el tratamiento previo de la muestra se llevaron a cabo 2 mtodos, un primer
mtodo por medio de la desproteinizacin cida y un segundo mtodo de ultrasonido.
El mtodo I de desproteinizacin cida consiste en tomar 100ml o 100g de
muestra, posteriormente homogenizar en un mortero y someter a desproteinizacin con
15 ml de H2SO4 al 10% ms 10mL de K4Fe(CN)6 al 15% y 10mL de Zn(C2H3O2)2 al 30%,
la mezcla se somete a reflujo por 30 minutos y finalmente se filtra al vaco en embudo
Buchner empleando papel filtro #40 Wathman para recuperar el filtrado y aforar a un
volumen conocido.
El mtodo II de ultrasonido consiste en tomar 20mL o 20g de muestra bien
homogenizada, agregar 25mL de NaOH 0.1M y someter a ultrasonido por 15 minutos,
enfriar y ajustar el pH a 8 con HCl al 50%, someter a desproteinizacin por 15 min con
2mL de K4Fe(CN)6 al 15% y 2mL de Zn(C 2H3O2)2 al 30% agitando despus de cada
adicin, posteriormente filtrar al vaco sobre papel filtro Wathman #40 y finalmente
aforar a 50mL con agua destilada.
Los filtrados obtenidos por ambos mtodos previos se someten a extraccin en
fase slida empleando cartuchos Sep-pack C18. El proceso consiste en activar los

cartuchos con 3mL de metanol (grado HPLC), lavar con 5mL de agua (grado HPLC),
posteriormente pasar los filtrados obtenidos, volver a lavar con 5mL de agua y
finalmente eluir los componentes retenidos con AcN.

Resultados
En la interpretacin de los resultados del HPLC se debe tener dos cromatogramas, uno
con la informacin de la muestra que se esta analizando y otro con informacin
obtenida de un estndar, esto sirve para calcular la concentracin de un componente
presente en una mezcla.
En cada cromatograma se encuentran uno o varios picos, cada pico tiene dos
caractersticas: el tiempo en el cual se registr, llamado tiempo de retencin, y el rea
del pico. Dado esto para calcular la concentracin del compuesto usamos la siguiente
relacin:
Concentracin del compuesto A en la mezcla= (rea del pico del compuesto A /
rea del pico del compuesto A en el estndar) * concentracin del compuesto A
en el estndar.

Calidad de resultados
Para validar el mtodo desarrollado para el anlisis de cido benzoico en productos
lcteos se emplearon los siguientes parmetros: linealidad, precisin, lmite de
deteccin y de cuantificacin, exactitud y robustez.
Linealidad
Se emple el coeficiente de variacin de los factores de respuesta. Se prepararon
estndares de cido benzoico en la fase mvil seleccionada en el rango de 4 a 200
ppm. Se realiz el anlisis cromatogrfico y con los datos obtenidos se elabor una
curva de calibracin, graficando la respuesta del detector en funcin de la
concentracin. Se calcularon los factores de respuesta (FR) para cada uno de los
puntos de la curva empleando la ecuacin:
FR=respuesta del detector /concentraci n del estandar

Para este caso, la respuesta del detector corresponde al rea del pico. Una vez
obtenidos los FR de cada uno de los puntos de la curva de calibracin se calcul el

coeficiente de variacin, con la ecuacin:

CV =( SD100)/ X de los FR

Precisin
La precisin se evalu tanto para el sistema como para el mtodo desarrollado.
Precisin del sistema.
Para la precisin del sistema se emple el estndar de cido benzoico de 60ppm
el cual se inyect en el cromatgrafo bajo las condiciones cromatogrficas
previamente seleccionadas, en 5 ocasiones consecutivas y en tres diferentes
das. De los cromatogramas se tomaron los datos de tiempo de retencin y rea
del pico cromatogrfico. Con los datos obtenidos se calcula el promedio, la
desviacin estndar y el coeficiente de variacin.
Precisin del mtodo.
Se tomaron en cuenta 5 muestras de un producto lcteo en donde no se observ
efecto de matriz y se procesaron de acuerdo con el mtodo de tratamiento
previo y extraccin seleccionados. stas se inyectaron en el aparato y de los
cromatogramas resultantes se tomaron los datos de tiempo de retencin y rea
del pico. Con los datos, se calcula el promedio, desviacin estndar y el
coeficiente de variacin.
Lmite de deteccin
Se determin basndose en el mtodo descrito por Quattrochi que consiste en:
considerar tres veces el error estndar en el eje de las y que corresponde a la
desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero empleando la ecuacin:
L mitede detecci n=YM +3( Sb/b)

Lmite de cuantificacin
Fue obtenido considerando 10 veces el error estndar en el eje de las y que
corresponde a la desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero, empleando
la ecuacin:
L mite de cuantificaci n=Yb+(10 Sb /b)

Exactitud
Se obtuvo en base al porcentaje de recuperacin. Se tomaron 8 muestras, 3 directas y
5 se contaminaron con 1mL del estndar de cido benzoico de 100ppm. Se corri el
estndar de 10ppm para con los datos obtenidos de las reas de los picos poder

calcular el porcentaje de recuperacin aplicando la ecuacin:

recuperaci n=( AMC AMSC)100/ A . St

Las muestras fueron tratadas por el mtodo de tratamiento previo y extraccin

desarrollado y corridas bajo las condiciones cromatogrficas seleccionadas.
Robustez
Para medir la robustez se realizaron pequeos cambios tanto en la composicin de la
fase mvil como en el pH del HAc. Se realizaron modificaciones en las composiciones
de las fases mviles y en el pH de las mismas, se inyect el estndar bajo los
diferentes cambios realizados, en las condiciones ya establecidas. En cada pico
resultante se calcul el factor de capacidad, el nmero de platos tericos y el factor de
asimetra.
Los nuevos parmetros se compararon con los obtenidos bajo las ya
anteriormente establecidas empleando una prueba t de Student y se midi si los
pequeos cambios en las variables, causaban diferencias estadsticamente
significativas.

Principio de la tcnica analtica

La cromatografa de lquidos (HPLC) se basa en la separacin de una muestra que
est entre dos fases en una cama cromatogrfica que puede ser un plano o columna.
Las fases se dividen en estacionaria y mvil. La fase estacionaria puede ser un slido
poroso o un soporte cubierto por una pequea filmina de lquido. En la cromatografa
de lquidos, la fase mvil es siempre un lquido y pasa por la cama cromatogrfica. El
mtodo se conoce por ser muy eficiente porque da muy buenas separaciones en muy
poco tiempo.

Hay tres diferencias importantes entre la cromatografa de gases y la

cromatografa de lquidos HPLC:
El coeficiente de difusin en la muestra en la fase mvil es mucho ms pequea en la
HPLC que en la de cromatografa de gases lo cual es una desventaja.
La viscosidad en la fase mvil es mayor en la HPLC que en la cromatografa de gases,
esta tambin es otra desventaja.
La compresibilidad en la fase mvil bajo presin es casi despreciable en HPLC
mientras que no es as en la cromatografa de gases y esto es una ventaja.
El procedimiento consiste en bombear la fase mvil a la cual se le inyect a la
muestra hasta la cama cromatogrfica. Los compuestos eluyentes son transportados

por la fase mvil hasta el detector que los registra como una curva de Gauss. A travs
de la calibracin de la grfica con la de soluciones cuyos picos ya se conocen, se
puede estimar la concentracin de una muestra desconocida.
A manera de resumen, se observa a continuacin un diagrama que muestra la
forma en la que se lleva a cabo el anlisis dentro del instrumento:

Figura 1. Diagrama del HPLC.

(1)Depsitos de disolvente,
(2)Solvente desgasificador,
(3)Vlvula de control de gradiente,
(4)Recipiente de mezcla de la fase mvil,
(5)Bomba de alta presin,
(6)Vlvula en inject position, (6)Vlvula en load position ,
(7)Bucle para inyeccin de muestra,
(8)Pre-columna de seguridad,
(9)Columna analtica,
(10)Detector UV,
(11)Interpretacin de datos,
(12)Recipiente colector de residuos,

El costo de un aparato para HPLC vara en funcin de su capacidad de

acoplamiento a diferentes instrumentos analticos entre otros. Hablando
especficamente del HPLC localizado en el Centro de Biotecnologa y Alimentos, su
costo fue de aproximadamente 5 millones de pesos.
A continuacin, se explicar un poco ms acerca del uso del HPLC en el Centro
de Biotecnologa para lo cual se presentarn diferentes imgenes tomadas por uno de

los integrantes del equipo.

En la visita realizada se le coment al integrante del equipo que el HPLC es un
aparato que separa compuestos que son sensibles a la temperatura, esto quiere decir,
que si se desea separar un compuesto sensible en un cromatgrafo de gases, el
compuesto se descompondra por lo que se recomienda en estos casos recurrir al
HPLC.
El HPLC, como ya se mencion, cuesta alrededor de 5 millones de pesos;
adems, en los detectores, el de UV es un poco menos costoso que el fluorescente.
Existen diferentes tipos de aparatos que pueden ayudar a separar compuestos de
acuerdo a lo que se desea hacer. Por ejemplo, los aparatos de las fotografas 1) y 2)
son muy parecidos entre s mientras que el aparato 4) es un modelo ms reciente
aunque todos cumplen exactamente la misma funcin y las mismas partes.

1)

2)

3)

4)

De igual forma, se tuvo la oportunidad de conocer ms a fondo las partes que

compone al HPLC tal como se explicar a continuacin con ayuda de unas fotografas
tomadas dentro del mismo Centro de Biotecnologa.
Detallando un poco ms sobre la composicin de este aparato, se
puede observar en la fotografa de la izquierda la bomba donde se
encuentran los cables que vienen de los 4 solventes que se separarn
posteriormente.
En la imagen de la izquierda se puede observar como se inyecta la
muestra que se mezclara con el solvente.

En esta fotografa se puede ver la columna. Es en esta parte donde se

realiza la separacin del compuesto dado.

A la izquierda estn los detectores. En esta parte

se tienen dos tipos de detectores, el UV que es el que separa
compuestos mediante la absorcin de luz, en este caso la
separacin es de gran importancia ya que no detecta si un
compuesto no perteneciente se ha mezclado con otro y esto hace
que se tenga una interferencia. El segundo detector localizado en la
parte de abajo es el fluorescente, este emite una luz que no es la misma que la del
compuesto, en este punto no es tan importante la separacin ya que si se encuentra
algo no perteneciente en la muestra emite otra luz.
En el segundo aparato (mostrado en la fotografa 2) ) se tiene el HPLC de
masas. Este es de gran calidad y con un costo mayor, ya que en l se puede meter
cualquier tipo de elemento y se puede distinguir claramente si algn compuesto est
mezclado ya que depende del peso molecular.
En el tercer aparato (localizado en la fotografa 3) ) se encuentra el HPLC de
aniones. Este HPLC contiene las mismas partes que los mostrados en las fotografas 1)
y 2) con la diferencia de que en este se distinguen los compuestos por su
conductividad. Es de vital importancia la separacin ya que en los datos que
proporciona la grfica no se puede ver si hay algn anin no perteneciente en otro.
Todos estos aparatos son de gran ayuda y ninguno es mejor de otro,
simplemente depende del objetivo que se quiere seguir. Cada uno tiene sus beneficios
pero si se desea brindar un servicio y se tienen los medios econmicos, es de gran
facilidad conseguir un HPLC con un detector UV o fluorescente; si se requiere de una
investigacin a fondo el mejor aparato podra ser el HPLC de masas.

Materiales, reactivos y patrones de referencia

1.
2.
3.
4.
5.

Los equipos utilizados en el desarrollo de la prctica son:

Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin Beckman system gold, con bomba modelo
168 y detector UV visible con arreglo de diodos.
Bao de ultrasonido Fisher Scientific FS20
Potencimetro Orion EA 940
Balanza analtica Mettler H80
Bomba de vaco Welch Thomas modelo 2534B-01

6. Plancha de calentamiento Thermolyne

Los materiales necesarios son:
1. Cartuchos Sep-pack C18
2. Columna fase reversa C18 de dimensiones 150mm x 4.6mm x 5micrometros
3. Matraces de aforacin de 10,50,100 y 1000mL
4. Matraz Kitasato de 250 y 100mL
5. Embudo Buchner
6. Tubos de ensaye de 13x100
7. Refrigerantes
8. Mangueras de plstico
9. Pipetas automtica de 100 a 1000 microlitros
10. Agitadores de vidrio
11. Vasos de precipitados de 150, 250 y 500mL
12. Papel parafilm
13. Papel hidrin rango de pH de 1 a 14
14. Papel filtro Whatman No. 40
15. Matraz bola de 250mL
16. Tapones de hule monohoradados
17. Mortero y pistilo
18. Pipetas lineales de 10 y 5mL
19. Sistema de filtracin Millipore
20. Balanza granataria Sartorius

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Los reactivos usados son:

Estndar de cido benzoico marca Fisher 99.9%
cido actico (HC2H3O2) 1M pH 4.5
cido sulfrico (H2SO4) al 10% (v/v)
Ferrocianuro de potasio (K4Fe(CN)6) al 15%
Acetato de zinc (Zn(C2H3O2)2) al 30%
cido clorhdrico (HCl) al 50%
Hidrxido de sodio (NaOH) al 0.1M
Buffer de fosfatos (NaH2PO4) 0.05M pH 2.3

Los solventes utilizados para realizar la elucin de columna son:

1. Acetonitrilo (AcN) grado HPLC
2. Metanol (MeOH) grado HPLC
3. Agua grado HPLC

Fundamentar argumentos para la toma de decisiones

Los resultados de las pruebas realizadas con los diferentes tipos de fase mvil y de
velocidad de flujo, demostraron que la mayor eficiencia se logr empleando como fase

mvil HAc (1M pH 4.5) - AcN 80:20 a una velocidad de flujo de 1.3mL/min, como fase
estacionaria una columna de fase reversa C18 y deteccin a 230nm.
Para el mtodo de desproteinizacin cida no se requiri equipo especial para
llevarla a cabo, pero su recuperacin fue baja (menor al 20%) para este tipo de
alimentos, debido que el H2SO4 y el calor pudieron haber destruido en cido benzoico.
El mtodo de ultrasonido result ser rpido, sencillo y reproducible, de 4 a 6 veces
mejor que la desproteinizacin cida en recuperacin. As, se comprueba que el mejor
mtodo de tratamiento de la muestra fue el mtodo de ultrasonido, acidificando el
filtrado de la muestra a pH 1 y utilizando 1mL de AcN para la extraccin.
Para la extraccin en fase slida se acidific el filtrado de la muestra probando
pH 1 y 3, en base al pH del cido benzoico (pH=4.2) buscando as tener la mayor
proporcin del cido benzoico en su forma no disociada y as aumentar la recuperacin
durante la elucin que result mejor a pH 1.

Bibliografa
Imagen del Diagrama del HPLC:
Mrabet, Yassne. Schematic Diagram of a High Performance Liquid Chromatograph.
[Diagrama/Grfico ilustrativo]. Obtenida el 4 de Mayo, 2013 de
http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_2%3A_High_
Performance_Liquid_Chromatography
Libros utilizados para el apartado de desarrollo:
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Meyer, Veronika R. (1988). Practical high-performance liquid chromatography. New
York: Wiley.
Richardson, Gary H (1985). Standard Methods for the Examination of Dairy Products.
Washington, D.C.: American Public Health Association.

Otras fuentes para los apartados de antecedentes y desarrollo:

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lnea]. Obtenido el 5 de Mayo, 2013 de:
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=243
Garza Jurez, Aurora de Jess (2001). Niveles de cido benzico en productos lcteos.
Trabajo de Grado, Maestra, Universidad Autnoma de Nuevo Len, Monterrey, Mxico.
Obtenido el 4 de Mayo, 2013 de: http://eprints.uanl.mx/3088/
Sciencelab.com, Inc. (n.d.) Material Safety Data Sheet. Benzoic acid MSDS [En lnea].
U.S. Obtenido el 2 de Mayo, 2013 de: http://www.sciencelab.com/msds.php?
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Secretara de Salud. (2002). NORMA Oficial Mexicana NOM-185-SSA1-2002,
Productos y servicios. Mantequilla, cremas, producto lcteo condensado azucarado,
productos lcteos fermentados y acidificados, dulces a base de leche. Especificaciones
sanitarias. [En lnea] Mxico. Obtenido el 2 de Mayo, 2013 de:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/185ssa12.html
U.S. National Library of Medicine. (n.d.) Hazardous Substances Data Bank. HSDB.
Benzoic Acid. [En lnea]. U.S. Obtenido el 2 de Mayo, 2013 de:
http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/search/r?dbs+hsdb:@term+@DOCNO+704
Verde Campo, J., Escamilla Hurtado , M., Reyes Dorantes , A., & Malpica Snchez, F.
(1999). Manual de prcticas de qumica analtica. Universidad Autnoma Metropolitana.
Obtenido el 3 de Mayo, 2013 de:
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