CINETICA ENZIMATICA

CINTICA ENZIMTICA
A continuacin, se describirn los siguientes
conceptos:
Cintica enzimtica
Modelo cintico de Michaelis-Menten
Clculo de la KM y la Vmax de un enzima
Actividad enzimtica

CINETICA ENZIMATICA
La cintica enzimtica estudia la velocidad de
las reacciones qumicas que son catalizadas por
las enzimas.
El estudio de la cintica de una enzima
permitir elucidar los detalles de su mecanismo
cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es
controlada su actividad en la clula y cmo
puede ser inhibida su actividad por drogas o
venenos o potenciada por otro tipo de
molculas.

CINTICA ENZIMTICA

Principios generales
Mecanismo de nico sustrato: Los estudios
cinticos llevados a cabo en enzimas que solo
unen un sustrato, como la triosafosfato
isomerasa, pretenden medir la afinidad con la
que se une el sustrato y la velocidad con la que
lo transforma en producto.
Mecanismo de mltiples sustratos: al estudiar
una enzima que une varios sustratos, como la
dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica
puede mostrar tambin el orden en el que se
unen los sustratos y el orden en el que los
productos son liberados.

Principios generales
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma
cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de
producto que una reaccin no catalizada.
Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas
no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre
sustrato y producto.
Al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se
saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato,
mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo
que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el
momento en que todos los sitios posibles estn ocupados.
En ese momento se habr alcanzado el punto de
saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato,
no aumentar ms la eficiencia.

Principios generales
Las dos propiedades cinticas ms importantes
de una enzima son:
el tiempo que tarda en saturarse con un
sustrato en particular y su punto mximo de
saturacin.
El conocimiento de estas propiedades hace
posible hipotetizar acerca del comportamiento
de una enzima en el ambiente celular y predecir
cmo responder frente a un cambio de esas
condiciones.

Principios generales

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que

aumenta la concentracin de sustrato hasta que la enzima se
satura.

Enzyme Kinetics

Score

Student B
Student C

1
2
3 4
Exam Chapters

Enzyme activity

Student A

0 1
2
3 4
Substrate concentration

Increase the substrate concentration,

observe the change of enzyme activity

ENZIMAS CINTICA ENZIMTICA

Cintica Enzimtico
Determinar las constantes de afinidad de S y
los inhibidores;
Conocer las condiciones ptimas de catlisis;
Ayuda a dilucidar los mecanismos de
reaccin;
Determinar la funcin de una determinada
enzima en una ruta metablica.

CINTICA ENZIMTICA
Estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas
La velocidad de una reaccin catalizada por una
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que
en muchos casos no es necesario purificar o
aislar el enzima.
La medida se realiza siempre en las condiciones
ptimas de pH, temperatura, presencia de
cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato. En estas condiciones, la
velocidad de reaccin observada es la velocidad
mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse
bien midiendo la aparicin de los productos o la
desaparicin de los reactivos.

Ensayos enzimticos
Un ensayo enzimtico es un
procedimiento de laboratorio, para medir
la velocidad de una reaccin enzimtica.
Como las enzimas no se consumen en la
reaccin que catalizan, los ensayos
enzimticos suelen medir los cambios
experimentados bien en la concentracin
de sustrato (que va decreciendo), bien en
la concentracin de producto (que va
aumentando).

Metodos de Ensayos enzimticos

espectrofotometra permite detectar cambios en la
absorbancia de luz por parte del sustrato o del
producto (segn la concentracin de estos)
radiometra implica incorporacin o liberacin de
radiactividad para medir la cantidad de producto
obtenido por tiempo.
Los ensayos espectrofotomtricos son ms utilizados,
ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de
forma continua. Los ensayos radiomtricos requieren
retirar las muestras para medirlas, por lo que son
discontinuos.
estos ensayos son sensibles y permiten detectar
niveles muy bajos de actividad enzimtica.
espectrometra de masas para detectar la
incorporacin o liberacin de istopos estables cuando
el sustrato es convertido en producto.

80

60

20

(in a fixed period of time)

40

Product

S
+
E

P
Increase Substrate Concentration

Substrate (mole)

8
6
4
2
0

8
7
6
5
4
3
2
1
0

Ensayos enzimticos

Curva de saturacin de una reaccin enzimtica. La pendiente

representa, en el perodo inicial, la velocidad de la reaccin. La
ecuacin de Michaelis-Menten describe cmo va variando la
pendiente con la concentracin de sustrato o de enzima.

Essential of Enzyme Kinetics

Steady State Theory

E +P

In steady state, the production and consumption of

the transition state proceed at the same rate. So the
concentration of transition state keeps a constant.

Constant ES Concentration at Steady State

S

Concentration

ES
Reaction Time

Concepto de velocidad inicial

[ ]

d[ ]
v = dt , t -> 0

s
t

CINTICA ENZIMTICA
Al seguir la velocidad de aparicin de
producto (o de desaparicin del sustrato)
en funcin del tiempo se obtiene la
llamada curva de avance de la
reaccin, o simplemente, la cintica de
la reaccin.
A medida que la reaccin transcurre, la
velocidad de acumulacin del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo
el sustrato de la reaccin. Para evitar esta
complicacin se procede a medir la
velocidad inicial de la reaccin (v0).

Inicialmente, la enzima transforma el

sustrato en producto siguiendo un
comportamiento lineal.
A medida que avanza la reaccin, se va
agotando la cantidad de sustrato y va
disminuyendo la cantidad de producto
que se genera por unidad de tiempo
(disminuye la velocidad de la reaccin), lo
que se manifiesta en forma de curva
asinttica en la grfica.

Dependiendo de las condiciones del

ensayo y del tipo de enzima, el perodo
inicial puede durar desde milisegundos
hasta horas.
Los ensayos enzimticos suelen estar
estandarizados para que el perodo inicial
dure en torno a un minuto, para llevar a
cabo las medidas ms fcilmente.
Los modernos equipos de mezcla rpida
de lquidos permiten llevar a cabo
medidas cinticas de perodos iniciales
cuya duracin puede llegar a ser inferior a
un segundo.

La mayora de los estudios de cintica

enzimtica se centran en el perodo inicial,
es decir, en la zona lineal de la reaccin
enzimtica.
tambin es posible medir toda la curva de la
reaccin y ajustar estos datos a una
ecuacin no lineal. Esta forma de medir las
reacciones enzimticas es denominada
anlisis de la curva de progreso.
Esta aproximacin es muy til como
alternativa a las cinticas rpidas, cuando el
perodo inicial es demasiado rpido para ser
medido con precisin.

Variables que influyen en la velocidad de una

reaccin enzimtica

1. Concentracin de enzima
2. Concentracin de substrato
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)