Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Bioqumica General
Practica 1.- Determinacin de aminocidos terminales
con grupo alfa-amino terminal. Mtodo de Sanger.
Aguilar Resndiz Araceli
Hernndez Ruiz Juan Vctor
Introduccin
Las protenas son polipptidos con secuencia
de enlaces propia. Los grupos -amino y carboxilo, de todos los aminocidos no
terminales, estn unidos covalentemente en
forma de enlaces peptdicos que no se ionizan
por lo que no contribuyen al comportamiento
acido base de la estructura. No obstante, los
grupos R de algunos aminocidos, pueden
ionizarse y contribuyen a las propiedades
cido- base globales de la molcula.

Grupo: 3FV1
Seccin 2
protena es cero, este punto es conocido como
Punto Isoelctrico.
-Precipitacin por metales pesados. Los iones
de metales pesados, hacen precipitar las
protenas por que forman sales insolubles con
ellos.
Objetivos
Analizar el efecto que produce la
modificacin de factores fisicoqumicos sobre
la solubilidad de las protenas.

Por
tanto,
puede
predecirse
el
comportamiento acido base a partir de sus
grupos -amino y -carboxilo libres y de la
naturaleza y numero de sus grupos R
ionizables.

Determinar el punto isoelctrico de la

insulina, basndose en sus propiedades de
solubilidad a diferentes valores de pH.

La solubilidad de la mayora de protenas se

debe a la interaccin hidrofilia de las
molculas polares del agua y los grupos
ionizados de las protenas.

1.- Salting Out

Resultados

Por tanto, al modificar factores como La

fuerza inica, el pH, temperatura y constante
dielctrica del disolvente, se permite purificar
las protenas en virtud de su diferente
solubilidad.
Algunos de los mtodos para aumentar la
concentracin de protenas:
-Salting Out. Mtodo en el cual las altas
concentraciones salinas, permiten que la
protena precipite al disminuir su solubilidad.
-Precipitacin por efecto del Ph.
Las
protenas experimentan un mnimo de
solubilidad cuando la carga neta de la

Imagen 1.- Tubos de ensaye.

Sobrenadante

Pastilla

Filtrado1

Precipitado 1

1
2
Biuret Tubo Interpretacin
3
No.
PresentaTubo Presencia
de
4
5
6
de
1.0
1.0
color Clara
No. protenas
huevo
moradoCloruro
(+)
0.25
filtrada
1.0
Presenta
de BarioPresencia de
dil. 1:3
color
5% protenas
(mL)
Cloruro
0.25
moradoCloruro
(+)
2 gotas
de
sodio
Presenta
mercri Libre de
color co5%
5% protenas
Agua
0.25
moradoNitrato
(+)
2 gotas
Presenta
de plataAusencia
Observa
- de
2%
color azul
cin protenas
No
No
No
Observa precipita
+
+
+
precipita
precipita
(-)
cin

Tubo No.

Clara de huevo filtrada

dil. 1:3 (mL)

3.0

Los
ron
metales
favorece
n la
2
3
precipita
3.0
3.0
cin

HCl 0.1 N (mL)

NaOH 0.1 N (mL)

1.0
-

1.0

Regulador de acetatos
0.1 M pH 4.7 (mL)

1.0

Tabla 1.- Resultados

2.- Efecto del pH

Agua
Observaciones

Tabla 2.- Resultados

3.- Precipitacin por metales pesados

Los
ron
metales
favorece
n la
precipita
cin

Los
ron
metales
favorece
n la
precipita
cin

Tabla 3.- Resultados

4.- Punto Isoelctrico de la
Insulina

Tu
bo
n

1
2
3
4
5

Punto isoelctrico de la insulina

Ac.
Acetato
Insulina
pH
Acti de sodio
co
0.2M
0.2M
(mL)
(mL)
0.06
0.23
0.02
3.63
mL(6U)
0.06
0.15
010
4.52
mL(6U)
0.06
0.05
0.20
5.30
mL(6U)
0.06 mL
0.01
0.24
6.08
(6U)
0.06 mL
0.00
0.25
(6U)
Tabla 4.- Resultados

Obse
rvaci
ones

+
-

Discusin
En la primera parte de separacin por
precipitacin con sales, se observ, al realizar
la prueba del biuret, la presencia de protenas,
mientras que en el filtrado no, lo que significa
que se aislaron correctamente las protenas, y
que la sal de amonio, consumi toda el agua,
lo que propicio la precipitacin de las
protenas produciendo que estas precipiten.
En la precipitacin por efecto del pH y de
solventes en los tubos 1 y 3 con muestra de
clara de huevo se les agrego HCl y regulador
de acetatos respectivamente, observando que
las protenas precipitaron al obtener una
solucin turbia. Esto sucedi por que las
protenas presentaron un mnimo de
solubilidad (Punto isoelctrico) donde la
carga neta es cero y no migra en un campo
elctrico presentando por tanto mxima
solubilidad. En el tubo 2 con clara de huevo e
NaOH la clara de huevo se solubilizo
completamente esto es debido a que estas
protenas se encontraban alejadas de su punto
isoelctrico. Al agregar el etanol se pretenda
que las protenas se solubilizaran menos
conforme a la teora esto fue cierto ya que al
aadir solventes orgnicos como etanol a una
solucin acuosa de protenas, se redujo la
constante dielctrica del agua, as como la
interaccin protena-agua, y aumentando la

interaccin protena-protena favoreciendo as

la precipitacin. Por otro lado la precipitacin
con metales nos dio positivos con las sales de
mercurio, plata y plomo pues al haber iones
positivos y negativos que interacten con las
molculas de agua, se pierde la interaccin
protena-agua, por lo que la protena
precipita, sin embargo las sales de bario y
sodio no precipitaron a la protena estas las
solubilizaron, pues se present el fenmeno
de salting in ya que ahora hay una
interaccin entre la protena y los iones de la
sal, la interaccin con el agua es ms fuerte.
En la determinacin del punto isoelctrico de
la insulina, se realiz agregando diferentes
cantidades de cido y base (CH3COOH y
Acetato de Sodio respectivamente) solo se
observ precipitacin en el tubo 3, lo que nos
indica que es el punto de menor solubilidad,
obteniendo as los datos para el clculo del
punto isoelctrico de la insulina.
Conclusin
A travs del desarrollo de la prctica se puso
en evidencia que en efecto al modificar la
interaccin de las protenas con molculas
polares (soluciones heterogneas proteicas)
con factores como fueron la fuerza inica
(salting out), el ph y la constante dielctrica
del disolvente es posible su purificacin en
virtud de su diferente solubilidad.
Teniendo as el conocimiento de estos
factores que alteran la solubilidad Tambin es
posible calcular el punto isoelctrico de las
protenas al someterlas a diferentes
cantidades de concentracin de acido y base
como fue el caso de la insulina.
Bibliografa
Queseda Mora Silvia. Manual de
experimentos para bioqumica. San Jose.
EUNED 2007
Matthwes, Van Holde, Ahern. Bioqumica.
Pearson, Madrid. 2002.
Clculos

Ec. Henderson-Hasselbach para determinar el

pH y el punto isoelctrico.