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FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
TESIS DOCTORAL
A Esther
NDICE
ndice
OBJETO DE LA TESIS
INTRODUCCIN
1.
2.
APLICACIONES
INDUSTRIALES
DE
LOS
BISFENOLES
COMPUESTOS
ndice
IV
I
2.
ndice
MATERIAL DE LABORATORIO E INSTRUMENTACIN...........................................................62
2.1. Material de laboratorio.................................................................................................................62
2.2. Instrumentacin............................................................................................................................64
2.2.1. Espectrofluormetro..........................................................................................................64
2.2.2. Sistema acoplado cromatgrafo de gases-espectrmetro de masas..................................64
2.2.3. Espectrmetro de RMN....................................................................................................65
2.2.4. Lector de densidad ptica para placas de 96 pocillos.......................................................65
2.2.5. Equipo para la extraccin lquido-lquido.........................................................................65
2.2.6 Otros aparatos e instrumentos............................................................................................66
3.
CALIBRACIN..................................................................................................................................71
1.1. Modelos univariantes....................................................................................................................72
1.1.1. Establecimiento y verificacin del modelo.......................................................................73
1.1.2. Parmetros de calidad del mtodo analtico......................................................................75
1.1.2.1. Rango dinmico lineal y linealidad....................................................................75
1.1.2.2. Lmites de deteccin y cuantificacin...................................................................76
1.1.2.3. Precisin.............................................................................................................81
1.1.2.4. Sensibilidad..........................................................................................................81
1.2. Mtodos multivariantes................................................................................................................82
1.2.1. Regresin por mnimos cuadrados parciales (PLS).......................................................... 84
1.2.1.1. Seleccin de la matriz de calibrado....................................................................85
1.2.1.2. Tratamientos previos de los datos del calibrado.................................................86
1.2.1.3. Seleccin del nmero ptimo de factores...........................................................87
1.2.1.4. Calidad en el ajuste del modelo..........................................................................88
2.
ndice
IV
2.1.1. Test de comparacin de dos rectas de regresin.................................................................. 91
2.1.1.1. Comparacin de las varianzas de ambos calibrados..............................................91
2.1.1.2. Comparacin de pendientes..................................................................................92
2.1.1.3. Comparacin de los trminos independientes.......................................................94
2.1.2. Ensayos de recuperacin.....................................................................................................95
ndice
DE
BISFENOL
ESPECTROFLUORIMETRIA
DERIVADA,
EN
PRESENCIA
PREVIA
DE
FENOL
MICROEXTRACCIN
MEDIANTE
LQUIDO-
LQUIDO..........................................................................................................................................154
3.1. Comportamiento fluorescente de bisfenol A y fenol en ter etlico. Establecimiento de los
parmetros instrumentales..........................................................................................................154
3.1.1. Espectros fluorescentes de bisfenol A y fenol en ter etlico..........................................154
3.1.2. Establecimiento de las longitudes de onda analticas. Derivacin de los espectros
fluorescentes...................................................................................................................156
3.1.3. Rendijas de excitacin y emisin....................................................................................158
3.2. Optimizacin de variables experimentales.................................................................................159
3.2.1.Influencia del volumen de disolvente................................................................................159
3.2.2.Estudio de la agitacin del sistema....................................................................................161
3.2.2.1.Tipo de agitador................................................................................................161
3.2.2.2.Tiempo de agitacin..........................................................................................163
3.2.2.3.Velocidad de agitacin......................................................................................165
3.2.3. Tiempo de separacin de las fases..................................................................................166
ndice
IV
3.2.4. Influencia del pH sobre el rendimiento del proceso de extraccin.................................167
3.2.5. Influencia de la temperatura..............................................................................................168
3.2.6. Resumen de la optimizacin de variables..........................................................................170
ndice
INTRODUCCIN..............................................................................................................................219
1.1. Parmetros instrumentales............................................................................................................220
1.1.1. Parmetros instrumentales del cromatgrafo de gases.......................................................220
1.1.1.1. Parmetros instrumentales que afectan al sistema de inyeccin..........................220
1.1.1.2. Parmetros instrumentales que afectan a la separacin cromatogrfica...............221
1.1.2. Parmetros instrumentales del espectrmetro de masas.....................................................223
1.1.2.1. Anlisis en modo SCAN...................................................................................223
1.1.2.2. Anlisis en modo SIM (Selected Ion Monitoring)............................................226
1.2. Derivatizacin de compuestos hidroxilados. Silanizacin.............................................................227
1.3. Propuesta de trabajo....................................................................................................................230
2.
ndice
IV
4.
EN
SALIVA HUMANA
MEDIANTE
CROMATOGRAFA
DE
GASES-
ESPECTROMETRA DE MASAS...................................................................................................302
4.1. Caracterizacin de los compuestos mediante cromatografa de gases-espectrometra de masas.
Establecimiento del mtodo cromatogrfico..................................................................................303
4.1.1. Cromatogramas y espectros de masas de los compuestos...............................................305
ndice
ndice
OBJETO DE LA TESIS
Objeto de la Tesis
El objetivo de esta Memoria es por tanto doble. Por una parte proponer
metodologa de buenas caractersticas analticas para la determinacin de estos
compuestos, y por otra estudiar su comportamiento en las matrices objeto de estudio.
Introduccin
INTRODUCCIN
1.
Introduccin
BISFENOLES
COMPUESTOS
RELACIONADOS.
SNTESIS
Los bisfenoles son compuestos aromticos constituidos por dos anillos fenlicos
que se unen a travs de un grupo puente. Su frmula general es Y(C 6H5O)2 donde "Y"
que es el grupo puente, vara segn el compuesto considerado.
HO
OH
epoxi, importantes empresas como Bayer (Alemania), The Dow Chemical Company
(USA), y Honshu Chemical Industries (Japn), entre otras, comenzaron a fabricar esta
sustancia a mayor escala. Desde esa dcada hasta la actualidad, se han introducido
nuevos compuestos de estructura similar como el bisfenol F, experimentando tanto la
demanda como la produccin de estos compuestos un fuerte incremento, debido a su
incorporacin como materiales de uso habitual en el mundo desarrollado.
Esta Memoria se centra en el estudio de los bisfenoles A y F, por ser stos los
ms ampliamente utilizados, y algunos compuestos relacionados con ellos, como el
fenol, empleado como reactivo en su sntesis, los diglicidilteres de ambos, bisfenol A
diglicidilter (BADGE) y bisfenol F diglicidilter (BFDGE), empleados en la
fabricacin de las denominadas resinas epoxi y finalmente compuestos como el bisfenol
A dimetacrilato (bis-DMA) y bisfenol A diglicidil dimetacrilato (bis-GMA) que, junto al
trietilenglicoldimetacrilato (TEGDMA), se emplean en la fabricacin de selladores y
composites dentales.
En la tabla 1.1 se recogen las estructuras de estos compuestos junto con su peso
y frmula molecular y su nomenclatura.
US. Tariff Commission, "Synthetic Organic Chemicals: US Production and Sales" (1970).
Nomenclatura
Fenol;
Hidroxibenceno
OH
-1
OH
CH2
Bisfenol F; 4,4-metiliden
difenol, 4,4-bis
(hidroxifenil)metano;
difenilolmetano
OH
-1
Bisfenol A;
4,4-isopropiliden difenol;
4,4-bis(hidroxifenil)
propano;
difenilolpropano
CH3
OH
C
CH3
OH
-1
O
H2C CH CH2O
CH2
C
H
Bisfenol F diglicidilter;
BFDGE; Bis(4-glicidil
oxifenil)metano
O
OCH2CH
-1
C21H24O4
CH3
C
(340C.4H03
Bisfenol A diglicidilter;
BADGE; Bis(4-glicidil
oxifenil)propano
O
OCH2CH CH2
-1
gmol )
O
H2C C C O
CH3
CH3
C
CH3
O
O C C CH2
CH3
-1
Bis-DMA, Bisfenol A
dimetacrilato
O
C
H C
2
OH
OCH2 CH CH2O
CH3
CH3
C
OH
OCH2
CH
O
CH2O
CH3
CH
CH3
-1
Bisfenol A diglicidil
dimetacrilato; bis-GMA;
resina Bowen; 2,2-bis[4(2-hidroxi-3-metacriloiloxi
-propoxi) fenil]propano;
bisfenol A glicerolato
dimetacrilato.
TEGDMA; Trietilenglicol
H2C
C C O
CH3
(CH2)2 O
(CH2)2 O
(CH2)2 O
-1
CH2 dimetacrilato
CH3
10
Aunque se han propuesto a lo largo de los aos numerosos mtodos con distintas
variantes para la obtencin de estos compuestos a escala industrial, an hoy da se
utiliza el primero de ellos, propuesto a finales del siglo XIX y que se basa en la
condensacin de fenol con el reactivo correspondiente.
una molcula que presenta un grupo carboxlico (C=O) con dos de fenol . La reaccin
que transcurre es la que se muestra a continuacin:
hasta que aparezcan los cristales de bisfenol. La reaccin transcurre mediante una
4,5
sustitucin electroflica, con una cintica de primer orden para ambos reactivos ;
aunque hay autores que indican un segundo orden para el fenol cuando la reaccin es
catalizada por HCl. Se trata de una reaccin reversible cuyo producto final est
6
-3
de Jong E. and Dethmers F.H.D. Recicled Trav Chimica Pays-Bas, 84, 460 (1965).
Takenaka T., Yamamoto Y., Hirano E., Nishi S., Kodaka T. and Yoshida T. Kogyo Kagaku Zasshi, 70,
2081 (1967); Chemical Abstract, 69, 18759 (1968).
6
Egorova N.F. and Sokolov A.V. Journal of Analytical Chemistry U.R.S.S, 23, 1112 (1968).
7
Kato T. Nippon Kagaku Zasshi, 84, 458 (1963). Chemical Abstracts, 59, 13781 (1963).
5
12
CH3-CClCH2
CH3-C(OCOCH3)CH2
C15H16O2
base
2 CH2-CH-CH2Cl
C13H12O2
OH
(CH3)2C(C6H4OCH2-CH-CH2Cl)2
OH
CH2(C6H4OCH2-CH-CH2Cl)2
Takenaka T., Yamamoto Y., Hirano E., Nishi S., Kodaka T. and Yoshida T. Kogyo Kagaku Zasshi, 70,
2081 (1967); Chemical Abstract, 69, 18759 (1968).
9
Staples C.A, Dorn P.B, Klecka G.M and Oblock S.T. Chemosphere, 36, 2149 (1998).
OH
(CH3)2C(C6H4OCH2-CH-CH2Cl)2 -HCl
(CH3)2C(C6H4OCH2-CH-CH2)2 BADGE
OH
(CH2(C6H4OCH2-CH-CH2Cl)2
O
CH2(C6H4OCH2-CH-CH2)
BFDGE
En este caso, el catalizador es una base muy fuerte que se aade lentamente y con
agitacin constante a la mezcla epiclorhidrina-bisfenol. En esta modalidad, la segunda
etapa, es decir la deshidrohalogenacin, es la que controla la reaccin. Normalmente es
necesaria una relacin epiclorhidrina: bisfenol elevada con objeto de maximizar la
produccin de bisfenol A y bisfenol F diglicidilter. Cuando la relacin entre ambos
reactivos es 10:1, se obtiene un 90 % de estos compuestos en el reactor.
En este caso, las bases empleadas como catalizadores, al ser ms dbiles que el
hidrxido sdico no son lo suficientemente fuertes como para producir la
deshidrohalogenacin del producto intermedio. Por tanto, para terminar la reaccin, se
elimina el exceso de epiclorhidrina y se aade la cantidad estequiomtrica de una base
fuerte como hidrxido sdico. Este mtodo proporciona un rendimiento de reaccin ms
elevado que el primero.
A partir de estos dos mtodos, han surgido nuevas variantes que han tratado de
mejorar el rendimiento del proceso y obtener as resinas lquidas de mayor pureza y de
mejores propiedades fsicas y qumicas.
C15H16O2
-(O-C6H4C(CH3)2(C6H4OCH2CHOHCH2)n-
CH2-CH-CHCl
C13H12O2
-(O-C6H4CH2(C6H4OCH2CHOHCH2)n-
stos, son compuestos derivados del bisfenol A de gran importancia hoy da a nivel
industrial, y se producen por reaccin del bisfenol A con compuestos como cloruro de
carbonilo (fosgeno, O=CCl2) o difenilcarbonato (O=C(OPh)2).
10
COCl2
C15H16O2
- (O-C6H4C(CH3)2C6H4OCO)n-
CO(OPh)2
El difenilcarbonato se obtiene por reaccin del fosgeno y la sal sdica del fenol
en disolucin acuosa con exceso de hidrxido sdico. Este proceso es el ms econmico
de los existentes, aunque en la actualidad no se utiliza pues los tipos de policarbonatos
obtenidos son muy limitados y adems es muy difcil obtener productos incoloros,
propiedad principal de este tipo de derivados.
Otros derivados de gran importancia por su aplicabilidad actual, son los resultantes
de la reaccin del bisfenol A con cido metacrlico empleados as mismo en la fabricacin
Esta sntesis fue realizada por primera vez en 1965 por Bowen. Consiste en la
reaccin del bisfenol A con el cido metacrlico y el glicidil alcohol en dos etapas:
CH3
CH2=C-COOH CH-CH2-OH
CH3
CH2-CH-CH2-O-CO-C=CH2 + H2O
CH3
bis-GMA
C15H16O2
2 CH2=C-COOH
bis-DMA + H2O
a partir del bis-GMA mediante la prdida del grupo diglicidilo , aunque no se conoce
el mecanismo de esta reaccin. Ambos procedimientos dan lugar a la aparicin de
resinas menos rgidas y viscosas que las derivadas del bis-GMA.
Solubilidad a 25 C
(3)
(2)
(2)
(2)
(2)
(2)
(1)
(1)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(5)
(3)
(3)
(3)
(3)
(3)
(3)
(3)
(5)
(3)
(3)
(3)
(4)
(4)
(3)
(3)
(5)
Pfusin
(C)
Densidad
3
(g/cm )
41
150-155
162-164
45
15
72-74
ND
<< 0
1.058
1.130
----1.190
--1.160
1.092
*(1) Insoluble, (2) Poco soluble, (3) soluble, (4) muy soluble, (5) miscible.
fusin
prximos a la temperatura habitual del laboratorio, y por tanto en estas condiciones son
fluidos altamente viscosos. Por su parte el TEGDMA, presenta un punto fusin muy por
debajo de 0 C, siendo lquido a temperatura ambiente y adems muy fluido.
comportamiento intermedio y por ltimo los alcoholes y teres son los mejores .
Los bisfenoles reaccionan con una gran variedad de compuestos y presentan una
reactividad anloga a los fenoles p-sustituidos, pudiendo sufrir modificaciones en uno o
los dos anillos, en los grupos hidroxilo, e incluso ser atacados en el carbono central que
une ambos anillos. Entre las reacciones ms importantes destacan:
C15H16O2
(CH3)2C(C6H4OCH2CH=CH2)2
2 CH2=CHCH2Cl
C13H12O2
CH2(C6H4OCH2CH=CH2)2
1.3.2. Reaccin de cianometilacin catalizada por bases para originar dinitrilos que
pueden ser hidrogenados hasta la formacin de diaminas.
C15H16O2
C13H12O2
12
(CH3)2C(C6H4O-CH2CH2CN)2
2 CH2=CHCN
CH2(C6H4O-CH2CH2CN)2
Korenman I. and Gorokhov A.A. Zh. Fiz Khim., 47, 2058 (1973); Journal of Applied Chemistry U.R.S.S,
46, 2751 (1973).
20
(CH3)2C(C6H4OCH2-CH2)2
C15H16O2
O
2 CH2-CH2
C13H12O2
OH
(CH2(C6H4OCH2-CH2)2
1.3.4. Reaccin con dihaluros como el bis-(2-cloroetilter) o el 1,4-bis(clorometil)benceno que en proporcin menor a la estequiomtrica (1:1) da lugar a
polmeros con grupos fenlicos terminales, empleados en la fabricacin de
polmeros de mayor tamao. Si la reaccin transcurre en medio bsico con bis(414
C15H16O2
- (O-C6H4C(CH3)2C6H4SO2C6H4)n
(ClC6H4)2SO2
C13H12O2
- (O-C6H4CH2C6H4SO2C6H4)n-
13
Doyle E.N. "The Development and Use of Polyester Products", Ed. McGraw Hill, New York (1969).
21
14
Introduccin
"Encyclopedia of Polymer Science and Technology", Ed. Wiley-Interscience, 11, 447, New York (1969).
C15H16O2
(CH3)2C(C6H4X2)2
4 X2
C13H12O2
+ 4 HX
CH2(C6H4X2)2
C15H16O2 R-COOH
(CH3)2C(C6H4O-CO-R)2
C15H16O2
(CH3)2C(C6H10OH)2
6 H2
C13H12O2
CH2(C6H10OH)2
2.
APLICACIONES
COMPUESTOS
INDUSTRIALES
RELACIONADOS.
22
DE
LOS
FUENTES
BISFENOLES
DE
EXPOSICIN
HUMANA.
Demanda (Kg)
1990
450 millones
1992
650 millones
1996
670 millones
1997
970 millones
1998
820 millones
2000
1050 millones
15
www.chemexpo.com/news/profile99014.cfm (2000).
aplicaciones
industriales de los derivados tanto del bisfenol A como del bisfenol F y por tanto las
fuentes de exposicin por parte del ser humano.
Las resinas epoxi son prepolmeros que contienen una media de dos o tres
16
agresin fsica .
16
cloro, refinado de metales, produccin de pulpa de papel, etc . Qumicamente este tipo
de resinas son modificaciones de las epoxi de manera que pueden ser sometidas a
reacciones de curacin mediante los mismos mtodos utilizados para las resinas de
polister insaturado tradicionales (UP), es decir, a travs de un mecanismo radical con
estireno como agente de curado.
conservera , siendo por tanto numerosos los mecanismos de exposicin del ser humano
a este tipo de polmeros.
20
21
22
23,24,25
de
que
Se aaden por otra parte estabilizadores de color que suelen ser benzofenonas,
benzotiazoles o fenilsalicilatos, e incluso el BHT puede contribuir en este
aspecto.
Por tanto, dada la gran cantidad de componentes qumicos presentes en este tipo
29
Sderholm K.J. and Mariotti A. Journal of American Dental Association, 130, 201 (1999).
31
de vida medio. Este parmetro se puede definir como el tiempo que tarda en
descomponerse el 50% de la sustancia. Un estudio de bioacumulacin del bisfenol A
31
* En aire
* En tierra
De 1 a 180 das.
* En aguas superficiales
De 1 a 150 das.
* En aguas subterrneas
De 21 a 360 das.
Actividad biolgica
3.
30
32 ,33
Colborn T. and Clement C. Advances in Modern Environmental Toxicology, Vol XXI, Princenton
Scientific, New Jersey (1992).
33
Institute for Environmental and Health, assessment A1, Environmental Oestrogens: Consecuences to
Human Health and Wildlife, IEH, Leicester (1995).
34
Kavlock R.J., Dston G.P., de Rosa C., Fenner-Crisp P., Gray L., Kaatari S., Lucier G., Luester M., Mac
M.J., Maczka C., Miller R., Moore J., Rolland R., Scott G., Sheehan D.M., Sinks T. and Tilson H.A.
Environmental Health Perspectives, 104, 715 (1995).
35
US Environmental Protection Agency. Special Report on Environmental Endocrine Disruption: An
Effects Assessmente and Analysis, EPA/630/R-96/012, Washington (1997).
funciones endocrinas .
Queda claro que esta definicin puede ser aplicada a individuos jvenes, adultos
o a los descendientes de estos. Adems en este trabajo de la Unin Europea, se establece
que aunque existan evidencias de este tipo de actividad en numerosos compuestos
qumicos empleando slo modelos in vitro como ensayos de afinidad hormonales, estos
compuestos deberan ser considerados solamente como potenciales disruptores
endocrinos frente a los demostrados mediante ensayos in vivo. Para aquellos
compuestos que son considerados como potenciales disruptores endocrinos, la UE
propone una definicin alternativa, segn la cual, un compuesto de este tipo, ser una
sustancia que posee propiedades que podran originar disrupcin endocrina en un
organismo sano.
Adems de esta definicin proporcionada por la Unin Europea, son varias las
definiciones propuestas para este concepto y que se emplean hoy da. As, para la US
Enviromental Protection Agency (EPA) Risk Assessment Forum
35
un disruptor
38
qumico o mezcla que altera la estructura o funciones del sistema endocrino, y causa
efectos adversos a nivel del organismo, en su descendencia, en poblaciones
Es fundamental por tanto conocer los efectos toxicolgicos producidos por este
tipo de compuestos y detectarlos por medio de tests de toxicidad. Por ejemplo, en los
ltimos aos se ha demostrado que el estrgeno sinttico dietilestilbestrol (DES),
ampliamente utilizado en dcadas pasadas como medicamento para prevenir abortos y
ayudar en embarazos complicados, est implicado en el aumento del nmero de abortos
producidos, muertes de recin nacidos y nacimientos prematuros, as como en
determinadas anomalas en las mujeres tratadas con esta sustancia, como el incremento
39
38
Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee. Final Report, EPA, Washington
(1998).
39
Herbst A.L., Ulfelder H. and Poskanzer D.C. National English Journal of Medicine, 284, 878 (1971)
40
McLachlan J.A. "Estrogen in the Environment". Ed Elsevier, New York (1979).
33
Introduccin
OH
C
A
HO
Figura 3.1. Estructura qumica de un estrgeno natural.
42
separados por una cadena hidrocarbonada. Estudios cristalogrficos han demostrado que
estos estrgenos sintticos en configuracin trans son muy semejantes a estradiol 17. Posiblemente esta estereoqumica es obligada para la unin del estrgeno a sus
receptores especficos o protenas celulares de interaccin.
41
42
Allen E., Smith G.M. and Gardner W.U. American Journal of Anatomy, 61, 321 (1936).
Leclercq G. and Heuson J.C. Biochemical and Biophysic Acta, 560, 427 (1979).
Por otra parte, en las plantas y hongos se han descrito compuestos qumicos con
estructura no esteroidea que tienen actividad estrognica cuando son administrados a los
animales; a tales estrgenos naturales se les conoce con el nombre de fitoestrgenos y
micoestrgenos, dependiendo de su origen. La funcin de estos compuestos en las
propias plantas no es conocida y se especula con la idea de que actan en
mecanismos de defensa frente a herbvoros y agentes patgenos
los
43,44
. Se han descrito
45
fitoestrgenos con muy diferente filiacin qumica ; entre ellos destacan cumenstanos,
como el cumestrol, las isoflavonas, caso de la genistena, las dihidrochalconas, como el
floretn, las lactonas del cido resorclico como la zearalenona, y otros compuestos
como las saponinas de algunas plantas (diosgeninas), los esteroles (sitosteroles) y varios
cidos orgnicos (cido podocrpico y giberlico) que completan la lista de estrgenos
46
naturales .
47
48,49
. Con este
bis-
Soto A.M., Lin T.M., Justicia H., Silvia R.M. and Sonnenschein C.A. Advances in Modern
Environmental Toxicology, 23, 87 (1985).
51
Primo-Yufera E. Qumica agrcola, Ed. Alhambra, Madrid (1979).
52
Schafer T.E., Lapp C.A., Hanes C.M., Lewis J.B., Wataha J.C and Schuster G.S. Journal of Biomedical
Material Research, 45, 192 (1999).
GMA no presenta actividad estrognica per se. Sin embargo, cuando estos
compuestos derivados de bisfenol A y F son sometidos a tratamientos
hidrolticos en medio cido o bsico se produce la aparicin de dicha actividad.
El anlisis cromatogrfico de las muestras hidrolizadas demuestra la presencia
53
actividad
54,55,56
observndose por
previamente
Olea N., Pulgar R., Prez P., Ole Serrano F., Rivas A., Novillo A., Pedraza V., Soto A.M. and
Sonnenschein C. Environmental Health Perspectives, 104, 298 (1996).
54
Climie I.J.G. Xenobiotics, 1, 391 (1981).
55
Climie I.J.G. Xenobiotics, 6, 401 (1981).
56
Steiner S., Houper G. and Saglsdorf P. Carcinogenesis, 13, 969 (1992).
57
Korach K.S. and MacLachlan J.A. Environmental Health Perspectives, 103, 5 (1995).
1923 por Allen y Doisy , siendo el exmen microscpico del epitelio vaginal la forma
usual de evaluar la transformacin estrognica del animal receptivo. Habitualmente la
actividad de una sustancia se expresa en unidades internacionales, siendo la U.I. la
cantidad de estrgeno natural capaz de inducir el "estro".
sustancias con probada accin hormonal . Se ha defendido durante los ltimos aos la
hiptesis de que tras la unin del estrgeno al receptor estrognico se produce una
alteracin conformacional de ste ltimo, el cual queda capacitado para unirse al ADN
intranuclear desencadenando la expresin de ciertos genes relacionados con la sntesis
proteica y la proliferacin celular. El ensayo fue descrito para su uso "in vivo" pero fue
posteriormente adaptado al laboratorio.
58
de peces y reptiles .
Heppell S.A., Denslow N.D., Folmar L.C. and Sullivan C.V. Environmental Health Perspectives, 103, 9
(1995).
62
Teng G et all. Environmental Health Perspectives, 103, 17 (1995).
41
Introduccin
clulas de cncer mamario MCF7. Cuando las clulas son tratadas con estradiol-17, se
forma el complejo E-RE, ste se une a la secuencia ERE y se expresa el gen insertado.
En este caso el gen expresado es un enzima de origen bacteriano, acetiltransferasa del
cloranfenicol, cuya actividad puede ser mediada de muy diferentes maneras.
63
Soto A.M, Lin T.M., Justicia H., Silvia R.M. and Sonnenschein C. Ed. Princenton Scientific Publishing
295 (1992). Patente USA 4,859,585
64
64
Actividad biolgica
42
67
69,70
evidente que en determinados pases, la cantidad y calidad del semen producido por sus
habitantes varones ha descendido y, aunque la incidencia en el descenso de la fertilidad
en la poblacin es difcil de medir, se sabe que la calidad del semen es un factor
principal en la fertilidad del hombre.
71,72
estos pases .
67
Carlsen E., Giwercman A., Keiding N. and Skakkebaek N.E. Br. Medical Journal, 332, 281 (1995).
Pajarinen J., Laippala P., Penttila A. and Karhunen P.J. Bromatology Medical Journal, 314, 13 (1997).
69
Fish H., Goluboff E.T. Olson J.H., Feldshuh J., Broder S.H. and Barod D.H. Fertility and Sterlity, 64,
1009 (1996).
70
Fish H., Ikeguch I.F and Goluboff E.T. Urology, 48, 909 (1996).
71
Brow L.M., Pottern L.M. Hoover R.N., Devesa S.S, Aselton P. and Flannery J.T. International Journal
of Epidemiology, 15, 164 (1986)
72
Adami H.O., Bergstrm R., Mhner M., Zatonski W., Storm H., Ekbom A., Tretli S., Teppo L., Zeigler
H., Rahu M., Gurevicius R. and Stengrevics A. International Journal of Cancer, 59, 33 (1994).
73
Merril R.M. and Brawley O.W. Epidemiology, 8, 126 (1997).
74
World Health Organization, Editorial Elsevier, Oxford, pag 113 (1991).
68
mama en los pases citados con anterioridad . Estudios realizados en Finlandia, por
ejemplo, demuestran que la incidencia de este tipo de cncer aument en un 1 % anual
en los aos comprendidos entre 1953 y 1980.
Es un hecho demostrado que una de las partes del cuerpo humano ms afectada
por la accin de los esteroides es el cerebro. En los ltimos aos se est demostrando la
influencia de la presencia de disruptores endocrinos sobre el desarrollo y
comportamiento del cerebro, apareciendo efectos negativos sobre las funciones
neurolgicas e intelectuales (memoria y atencin). As mismo se especula que la
exposicin a contaminantes ambientales puede influir en el desarrollo sexual humano y
76
en el comportamiento sexual .
75
76
77,78
Atkinson y Roy
A para unirse, mediante enlaces covalentes, al ADN previa oxidacin hasta bisfenol oquinona dando lugar a la formacin de aductos. Esta actuacin hace pensar en los
bisfenoles como responsables de aberraciones genticas, alteraciones hepticas como el
cncer de hgado y otras disfunciones fisiolgicas.
77
78
Las matrices objeto de anlisis son de naturaleza muy diversa, destacando aguas
naturales de distinta procedencia, aguas residuales, fangos, aire, plsticos, resinas,
alimentos, composites y selladores dentales e incluso tejidos animales y fluidos
biolgicos como salivas y suero humano.
46
Matriz
FID
80
Bisfenol A
MS
Identificacin
---
TEGDMA
Bis-GMA
FID
Identificacin
Composites dentales
BADGE
BFDGE
MS
Identificacin
Barniz
83
Bisfenol A
MS
0.6 gl
84
MS
0.4 ngl
85
MS
1.0 gl
MS
0.1 ngg
-1
13.0 ngg
87
MS
2.0 ngg
88
MS
6.0 ngl
-1
50 ngg
89
MS
5.0 ngl
90
MS
20 ngl
91
MS
92
Bisfenol A
81
82
Bisfenol A
Bisfenol A
86
Bisfenol A
BADGE
Bisfenol A
Bisfenol A
Bisfenol A
Bisfenol A
Bisfenol A
Bisfenol A
93
Bisfenol A
Fenol
79
LD
79
-1
Aguas naturales
-1
Aguas naturales
-1
Revestimientos en latas de
conserva
-1
Comidas en conserva
-1
Plsticos
-1
-1
Aguas residuales
-1
Aguas
0.5 gl
-1
MS
0.5 gl
-1
Filtraciones de vertederos
MS
0.5 gl
-1
1.0 gl
-1
Aguas naturales
Detector
LD
Matriz
-1
94
BADGE
BFDGE
UV-vis
< 1.0 g l
-1
< 1.0 g l
95
Bisfenol A
EQ
0.25 gl
96
ED
25.0 ngm
Aire
BADGE
BFDGE
FD
Identificacin
Medios de comidas
envasadas
Bisfenol A
Bisfenol F
FD
6.0 gl
-1
4.0 gl
Bisfenol A
97
98
99
-1
-3
-1
-1
Degradacin de productos
derivados
BADGE
FD
Bisfenol A
ED
MS
0.2 gl
-1
0.1 gl
MS
0.20 mgl
-1
0.90 mgl
-1
0.40 mgl
-1
0.30 mgl
Composites y selladores
dentales.
UV-vis
Identificacin
Migracin a aguas,
disolventes orgnicos y
suero humano
ED
10.0 gl
104
QD
0.4 gl
105
MS
50.0 ngg
100
Bisfenol A
BADGE
Bis-DMA
bis-GMA
<2.0 gl
-1
102
TEGDMA
Bisfenol A
bis-GMA
103
Bisfenol A
Bisfenol A
Bisfenol A
Suero humano
-1
101
94
Aguas
-1
-1
-1
Aguas naturales
Suero humano
Biberones
Tejidos de peces
Chrathorne B., Palmer C.P. and Stanley J.A. Journal of Chromatography, 360, 266 (1986).
Tesarova E., Pacakova V. and Stulik K. Chromatographia, 23, 102 (1987).
96
Peltonen K. and Pukkila J. Journal of Chromatography A, 439, 375 (1988).
97
Paseiro P., Simal Lozano J., Paz Abun S., Lpez P. and Simal Gndara J. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 40, 868 (1992).
98
Simal J., Paz S., Paseiro P. and Simal Lozano J. Journal of Chromatographic Science, 31, 450 (1993).
99
Paseiro P., Prez C., Lpez M.F., Sanmartn P. and Simal Lozano J. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 45, 3493 (1997).
100
Sajiki J., Takahashi K and Yonekubo J. Journal of Chromatography B, 736, 155 (1999).
101
Pulgar R., Olea M.F., Novillo A., Rivas A., Pazos P., Pedraza V., Navajas J.M. and Olea N.
Environmental Health Perspectives. 108 (1), 21 (2000).
102
Shintani H. Journal of Liquid Chromatography. 18 (3), 613 (1995).
103
Inoue K., Kato K., Makino T. and Nakazawa H. Journal of Chromatography B, 749, 17 (2000).
104
Sun Y., Wada M., Al-Dirbashi O., Nuroda N., Nakazawa H. and Nakashima K. Journal of
Chromatography B, 749, 49 (2000).
105
Sun Y., Wada M., Al-Dirbashi O. and Nakashima K Journal of Chromatography B, 749, 49 (2000).
95
51
Introduccin
En este caso se observa una mayor variedad en los tipos de detectores y matrices
analizadas, siendo stas en general ms complejas que las analizadas mediante
Cromatografa de gases, incluyendo matrices biolgicas como suero humano o tejido
animal. Aunque al igual que en el caso anterior el compuesto ms estudiado es el
bisfenol A.
4.1.3. Cromatografa en capa fina (TLC).
106
107
absorcin
Tesarova E., Snopek J. and Smolkova-Keulemansova E. Journal of High Resolution Chromatography &
Chromatography Commun. 10 (7), 404 (1987).
107
Tikhonova T.Z., Vakhtina I.A., Kudim T.V. and Medvedeva T.A. Zh. Analytica Khimica, 44(3), 572
(1989).
Bisfenol A
109
Bisfenol A
Bisfenol F
110
Bisfenol A
Tcnica
LD
Matriz
Infrarrojo
Identificacin
Plsticos polisulfonato
Absorcin UV-vis
Identificacin
Resinas epoxi
Colorimetra
Identificacin
Latas de conserva
111
112
Plsticos policarbonato
Plsticos policarbonato
108
Motorina M, Metelkina E.I., Narkon A.L., Bolotina L.M. and Malyshev A.I. Plastic Massy, 10, 39 (1987).
Ye M. Huaxue Shijie, 32 (12), 553 (1991).
110
Iwanska S. and Leszczynska I. Polimery (Warsaw), 37 (11-12), 523 (1992).
111
Rufus I.B., Shah H. and Hoyle C.E. Journal of applied Polymer Science, 51, 1549 (1994).
109
112
52
CAPTULO I
55
1.
Captulo I: Experimental
1.1. Disoluciones.
de
Fenol
Bisfenol A
Bisfenol F
BFACl4
BADGE
BFDGE
TEGDMA
Bis-DMA
Bis-GMA
Pureza
Fabricante
99.0 %
99.0 %
98.0 %
98.0 %
95.0 %
95.0 %
95.0 %
99.0 %
95.0 %
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Ciba Geigy
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Rhm-Degussa
-1
C (mgl )
100
100
100
1000
1000
1000
100
1000
1000
Las disoluciones de trabajo se prepararon a partir de stas por dilucin con agua
desionizada, trabajando siempre dentro del intervalo de solubilidad acuosa
correspondiente a cada uno de los compuestos.
-1
de concentracin 5 gl .
)
las
por
Fabricante
g/100 ml
-ciclodextrina Sigma-Aldrich 0.973
-ciclodextrina Sigma-Aldrich 1.135
-ciclodextrina Sigma-Aldrich 1.297
-1
-1
CCDx (moll )
10-2
10-2
10-2
de concentracin en el ion
CO3 CO3H
SO4-2
SO3-2
NO3
NO2
PO4-3
-2
SiO3
Sal
(NH4)2CO3
NaHCO3
K2SO4
Na2SO3
KNO3
NO2Na
K2HPO4
K2SO3xH2O
Ion
ClO
Cl
Br
Pb+2
Cu+2
Mn+2
Cd+2
Zn+2
Sal
NaClO
NaCl
KBr
PbCl2
CuCl2
MnCl2
CdCl2
ZnCl2
Ion
+2
Ca
Hg+2
Be+2
Mg+2
Al+3
Fe+3
Cr+3
---
Sal
CaCl2
HgCl2
BeO
MgCl2
Al2O3
FeCl3
CrCl3
---
Fabricante
Diclone
Morestan
Bentazona
Warfarina
Benomil
Carbaril
o-fenilfenol
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
-1
C (mgl )
0.10
0.26
1.00
2.00
4.00
120.0
700.0
Otras disoluciones.
-1
-1
-1
-1
61
Captulo I: Experimental
Abreviatura
Fabricante
Sil-A
Sigma-Aldrich
TMCS
Sigma-Aldrich
TMSA
Sigma-Aldrich
BSTFA
Fluka
TMSI
Sigma-Aldrich
1.4. Resinas.
Slica gel 60 (35-70 mallas ASTM), MERCK, con tamao medio de partcula
entre 0.2 y 0.5 mm.
Aire seco.
1.6. Disolventes.
62
2.2. Instrumentacin.
Jeringa HP 5181-1267.
Agitador de vidrio.
Embudo de decantacin.
sdico anhidro).
)
Embudo de decantacin.
Tubo de tefln.
3.
3.1. Ordenadores.
CD-ROM 32X.
Ordenador Personal MITAC MPC 3000f 386 DX-25 con interface R-232C va
puerto serie para establecer la comunicacin con el espectrofluormetro.
3.2. Impresoras.
68
Alamn (1997).
2
Quimio (1994).
Garca Campaa A.M., Cuadros L., Als F., Jimnez C., Romn M and Sierra J.L. Trends in Analytical
Chemistry, 16, 381 (1997).
2
Cela R. Avances en Quimiometra Prctica, Servicio de Publicaciones e Intercambio cientfico de la
Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela (1994)
CAPTULO II
71
1.
CALIBRACIN.
Es por ello por lo que la calibracin, como etapa integrante del proceso analtico,
es de gran importancia y slo podremos obtener una buena exactitud en los resultados si se
aplican buenos mtodos de calibracin.
la
Los modelos de regresin univariante son los ms utilizados, dentro del campo de
la Qumica Analtica, para la realizacin de la etapa de calibracin. Estos modelos se
caracterizan por la existencia de una variable independiente (concentracin) que se
relaciona con una respuesta (seal instrumental) mediante una relacin lineal. La relacin
funcional que se establece entre ambas variables, se ajusta a un modelo matemtico del
tipo:
Y = a + bX
Para garantizar la validez del modelo de regresin univariante, las hiptesis bsicas
que deben cumplirse son cuatro: existencia de aleatoriedad en las muestras, normalidad,
linealidad y homogenidad de varianzas (condicin de homocedasticidad).
Y
Y=a+bX
Ordenada en el origen
at,n-2sa
Pendiente
bt,n-2sb
residuos, segn propone Boqu y Rius , definiendo como residuo la distancia vertical
desde cada punto experimental al valor que le correspondera mediante la recta de
regresin estimada por mnimos cuadrados. Normalmente se realizan
1
representaciones
grficas de los residuos frente a las respuestas calculadas por el modelo o frente a la
variable independiente concentracin-. En esta Memoria se ha hecho uso de esta
segunda opcin, es decir, la representacin grfica de los residuos frente a los valores de
concentracin. De la observacin de estas grficas, puede evaluarse el cumplimiento de
la condicin de homocedasticidad de los datos y detectarse la presencia de valores
anmalos, para ello se debe cumplir que sea igual el nmero de residuos positivos y
negativos encontrado, que haya aleatoriedad en la distribucin y se obtengan valores
similares entre los residuales.
El rango dinmico lineal viene definido por los lmites superior e inferior del
intervalo de concentraciones en el que se ha aplicado el mtodo analtico.
Por otra parte, la linealidad nos indica el grado de ajuste de los valores de la seal
2
(1)
DSR(b) 100
El valor mximo de linealidad ser por tanto del 100 %, de forma que cuanto ms
prximo est el valor calculado para este parmetro a dicho valor, mayor ser el ajuste de
los datos experimentales al modelo lineal propuesto.
XL XB Ks B
(2)
X
CL
(3)
CL
K sb
b
(4)
Este valor CL ser un fiel reflejo del lmite de deteccin del mtodo, siempre que b
est bien definida.
Como regla general, se suele usar el valor K=3 que proporciona un nivel de
confianza del 99.86%, asegurndose as que la magnitud analtica XL>XB+3SB sea debida a
la presencia de analito en la muestra problema y no a las fluctuaciones del blanco.
XQ XB Ks B
(5)
K sb
b
Gonzlez A., Cuadros L., Alonso E. and Vlchez J.L. Journal of Chromatography A, 726, 133 (1996)
10
11
Gaussiano .
1
e
2
1 ( ttR )2
2
(7)
s2
tR
h
h0.5
W0.5h/2
W0.5h
Wb= 6s = 2.5476 W0.5h
W
sh
(8)
0.5
2 ln
1
2h 0.5
donde W0.5h es la anchura a mitad de pico y h0.5 es la mitad de la altura del pico
Gausianno.
13
Wb para un 99.73% del rea de pico , vendr dada por un valor igual a 6s:
13
81
Wb 6 s 2,548W0.5
(9)
Para calcular la anchura de base a concentracin cero (W b0), dado que las
dimensiones del pico cromatogrfico, altura y anchura, dependen de la concentracin
del compuesto, se extrapola la curva resultante de representar grficamente los valores
medidos de W0.5h frente a la concentracin correspondiente. En la figura II.1.3 se
W0.5h
5
4
3
2
1
0
C0
C1
C2
C3
C4
C5
Concentracin
Figura II.1.3. Variacin de la anchura de pico con la concentracin.
El procedimiento a seguir es el siguiente: En primer se determina el valor de la
anchura a mitad de pico (W0.5h) correspondiente a concentracin "cero", extrapolando la
curva resultante de representar grficamente los valores medidos de W 0.5h de diferentes
picos frente a las correspondientes concentraciones de analito (figura II.1.3). A
continuacin se calcula el valor de Wb0 aplicando la ecuacin 9 y finalmente, se mide la
seal del blanco para cada compuesto por integracin sobre la lnea del cromatograma
del blanco en el intervalo tR0.5Wb0, donde tR es el tiempo de retencin correspondiente
a cada compuesto considerado. Para realizar rplicas se requiere una nueva inyeccin y
el establecimiento de un nuevo cromatograma.
1.1.3.3. Precisin.
s
D.E.R 100
y
(10)
1.1.3.4. Sensibilidad.
Sanalitica
14
b
RC
Mandel J. and Stiehler R.D. Journal of Res. Natl. Bur. Std., As 3, 155 (1964).
(11)
Calibracin
82
16,17
presentan, mediante un
18,19
20,21
22,23
Filtrado de Kalman
Redes neurales
24,25
26,27
28,29
24
Navarro-Villoslada, Prez-Arribas, Len and Polo-Dez L.M. Analytica Chimica Acta, 313, 93 (1995).
del Olmo M., Dez C., Molina A., de Orbe I. and Vlchez J.L. Analytica Chimica Acta, 335, 23 (1995).
26
Ni Y., KoKot S, Selby M and Hodgkinson M. Analytica Chimica Acta, 316, 233 (1995).
27
Martn M.E., Garca J.M, Jimnez A.I and Arias J.J. Qumica. Analtica, 14, 218 (1995).
28
Todeschini R., Galvani, J.L, Vlchez J.L. del Olmo M. and Navas N. Trends in Analytical Chemistry 18,
93 (1999)
29
Despagne F. and Massart D.L Analyst, 123, 157R (1997).
25
A continuacin se busca la relacin existente entre estas dos matrices con el fin
de que una vez conocida, pueda ser utilizada en la prediccin de las concentraciones de
los analitos en muestras problema de las cuales slo se tiene su espectro.
30,31
por H. Wold en 1975 y ha tenido desde entonces una gran aceptacin en el campo del
anlisis qumico.
Wold S., Rushe A., Wold H. and Dunn W. Journal of Science and Statistical Computering, 5, 735
(1984).
31
Otto M. and Wesgscheider W. Analytical Chemistry, 57, 63 (1985).
32
Geladi P. and Kowalski B.R. Analytica Chimica Acta, 185, 1 (1986)
33
Wold H. Research Papers in Statistics, Ed. Wiley, New York, London (1975).
distinto porcentaje de varianza, de manera que con cada factor se obtiene una varianza
inferior a la obtenida con el anterior.
Si se elige un nmero de factores pequeo para modelar los datos, dar lugar a
una prediccin pobre del modelo, ya que se usa un nmero de trminos insuficiente para
modelar variaciones espectrales importantes a la hora de calcular la concentracin. Si
por el contrario, el nmero de factores es demasiado elevado, es posible que estemos
utilizando informacin no deseada, como sera el ruido del sistema.
Datos sin tratar. Los datos no son modificados antes del proceso de modelado.
Datos centrados respecto de la media. En este caso, se calcula el valor medio
de cada variable del conjunto de calibracin y se resta a cada punto este
valor medio. El valor as hallado corresponde al centro del modelo, y los
valores de todas las variables estn ahora referidos a dicho centro. Es decir,
se resta el espectro medio a cada uno de los espectros correspondientes a
cada patrn. Este tratamiento permite
PRESS c i ci
n
i1 j1
(11)
34,35
, con el cual en cada ajuste se deja un patrn fuera del clculo del
modelo. A partir de la matriz de calibracin resultante con todas las muestras patrn
menos una, se predice la concentracin de la muestra no utilizada en la obtencin del
modelo. Seguidamente se calcula el valor de PRESS para esta muestra y para el primer
factor. Esta operacin se repite para cada muestra patrn, obtenindose un valor de
PRESS por cada nuevo factor aadido al modelo. Este valor da idea de la capacidad de
la matriz de calibracin para predecir la concentracin para cada nmero de factores
utilizado.
35
clculo del nmero de factores, la comparacin de los valores de PRESS obtenidos para
cada factor con el mnimo valor de PRESS encontrado. Esta comparacin se realiza
mediante la utilizacin del estadstico F, calculado como cociente entre los valores de
PRESS encontrados y el correspondiente mnimo. Este estadstico es funcin del
nmero total de patrones usados en la calibracin siendo este nmero totalmente
arbitrario. Por este motivo, Haaland y Thomas demuestran empricamente que el
nmero ptimo de factores deber ser aquel al que le corresponda un PRESS tal que
dividido entre el PRESS mnimo, proporcione un valor de probabilidad menor de 0.75.
Es decir, se selecciona como nmero de factores ptimo aquel primer modelo al que le
corresponde una probabilidad de la relacin de F menor o igual al 75%.
Dentro del mtodo PLS hay dos planteamientos diferentes en cuanto a los
algoritmos aplicables para el clculo del valor de PRESS. Cada uno de estos dos
algoritmos da lugar a una modalidad diferente de PLS, a los que se denomina PLS-1 y
PLS-2. En el primero, se asigna un factor para cada uno de los componentes de la
muestra y por tanto se calcula un valor de PRESS para cada uno de los componentes,
mientras que el algoritmo PLS-2, calcula un solo valor para todos los componentes de la
mezcla.
c
c c
n
i1
(12)
la
i
RMSD
1 n
c c
nil ii
(13)
ERP (%)
1001 n
ii c
c
n c
(14)
i1
etapa
el
91
2.
37
Martn Andrs A. y Luna del Castillo J. D. "Bioestadstica para Ciencias de la Salud". Ediciones
Norma, 3 Edicin (1990).
37
Cuadros Rodrguez L., Garca Campaa A., Als Barrero F., Jimnez Linares C. and Roman Ceba M.
Journal of AOAC International, 78, 471 (1995).
92
Varianzas iguales
s12=s22
Fcal<Ftab
Varianzas distintas
s12s22
FcalFtab
Este test compara un valor del estadstico F calculado segn la ecuacin 15 con un
valor tabulado para n1-2 y n2-2 grados de libertad, con un nivel de significacin del 5%,
siendo n1 y n2 el nmero de puntos experimentales de cada una de las funciones de
calibrado.
Fcal
s 12
; (s1 > s2)
s 22
(15)
donde s1 2y s2 representan las varianzas de los residuos para ambas rectas de calibrado
(con patrones y adicin de patrn).
Se realiza mediante un test de t-Student. Las hiptesis a tener en cuenta son las
siguientes:
Pendientes iguales
b1=b2
tcal<ttab
Pendientes distintas
b1b2
tcalttab
t cal
b 12 b
s2
b1 b2
(c 11c )
s2
(c 22c ) 2
(16)
f c c 2
c c 2
1
s 2 b1
c 11c
n1 2
sb12
(17)
c 22c
n2 2
cal
(18)
donde
2
b1, 2
n
1
2 s 2 n 2 s 2
b1
n1 n 2 4
b2
(19)
ordenadas iguales
a1=a2 zcal<ztab
ordenadas distintas
a1a2 zcalztab
z cal
a 12 a
sa1a
2s22
nn
12
i1
c
c
12
2
s2 a1
(20)
c
22c
sa22
ordenadas iguales
a1=a2 tcal<ttab
ordenadas distintas
a1a2 tcalttab
t cal
a 12 a
11
2
n
2
sa1,
12n
12
c
c i1 c
(21)
donde
n
s
2
a1, 2
2 s 2 n 2 s 2
a1
a2
n1 n 2 4
(24)
R(%)
Cpuesta Cencontrada
100
(23)
Cpuesta
37
b 12 b
1
1
2
c i1 c c c 22
2
La metodologa de adicin de patrn se puede aplicar para resolver diferentes
sb1, 2
problemticas:
En nuestro caso se emplea esta metodologa por la tercera razn descrita, ya que
no disponemos de ningn material de referencia adecuado.
Para verificar la exactitud del mtodo hay que desarrollar el clculo estadstico
que se esquematiza a continuacin:
Se realiza un ajuste por mnimos cuadrados de los tres calibrados (CP, CA y
CY). De todos los parmetros estadsticos derivados de este
ajuste
n 2
s 2 n 2 s
n 12n 4
1122
(24)
t(b)
b 12 b
1
1
sp
(c i c) 2 1 (c i2 c) 2
(25)
Una vez comprobado que la pendiente del calibrado con patrones es igual a la
pendiente del calibrado con adicin de patrn, se calcula la pendiente promedio
de ambas.
b
R) 2
p
(c i c)1 (R i R)1 (c i c) 2 (R i
(26)
Se calculan las nuevas alturas en el origen (a) para el calibrado con patrones
(a1) y para el calibrado con adicin de patrn (a2), a partir del valor de
pendiente promedio. A continuacin se compara la nueva altura en el origen del
calibrado con patrones con la altura en el origen del calibrado de Youden (aY), si
hay diferencia entre ambas ser debida a la existencia de error sistemtico por
efecto matriz de la muestra. En este caso no se puede realizar un test de
comparacin de a1 y aY porque ambas estn obtenidas a partir de variables
independientes distintas. Para compararlas se comprueba que aY est incluida en
el intervalo de confianza de a1. Se utiliza un valor de t-Student con (n1 - 2)
grados de libertad para un nivel de significacin del 5%. Si aY no est incluido
(27)
c i ,1
n (ci ,1 c) 2
2
a Y a 1 t s p
(28)
BY = aY - a1
(29)
11
nnb
12
(R 12 R ) 2
2
c ) 2 (c c )i2,
Pi
,,11(c
22
(30)
Estos parmetros fueron calculados en todos los casos con ayuda del programa
38
informtico Alamin .
38
Garca Campaa A.M., Cuadros L., Als F., Jimnez C., Romn M and Sierra J.L Trends in Analytical
Chemistry, 16, 381 (1997).
CAPTULO III
APLICACIONES
DE
LA
ESPECTROFLUORIMETRA
AL
101
1. INTRODUCCIN.
Simal Gndara J., Paz S., Paseiro P. and Simal Lozano J. Journal of Chromatographic. Science, 31, 450
(1993).
2
Rufus I.B, Shah H. and Hoyle C.E. Journal of Applied Polymer Science, 51, 1549 (1994).
3
www.chemexpo.com/news/profile99014.cfm (2000).
4,5,6
y/o surfactantes
7,8,9
II
Molcula de
surfactante
ciclodextrina
Molcula husped
Compuesto
que evita la desactivacin de la misma por vas no radiativas , que conducen a una
desaparicin total o parcial de la luminiscencia emitida por el analito.
4
Jules O., Scypinsky S. and Love L.J.C. Analytica Chimica Acta, 169, 355 (1985).
Mrquez J.C., Hernndez M. and Garca-Snchez F. Analyst, 115, 1003 (1990).
6
Averrin G. M., Rideau A., Agbaria R. A and Warner I. M. Talanta, 40, 599 (1994).
7
Compano R., Granados M., Leal C. and Prats, M.D. Analityca Chimica Acta, 302, 185 (1995).
8
Esteve J.S., Monferrer L., Ramis G. and Garca M.C. Talanta, 42, 737 (1995).
9
Alvarez L., Monferrer L., Esteve J.S., Ramis G. and Garca M.C. Analyst, 122, 459 (1997).
5
Las ciclodextrinas son oligosacridos cclicos que presentan una cavidad interna
11
11
Bisfenol A
Medio
exc
nm
225
Acuoso
276
225
-ciclodextrina
276
225
-ciclodextrina
276
225
-ciclodextrina
276
*
276
DDS
--TRITON
*
em
nm
306
306
306
306
306
306
306
306
306
---
Fenol
0.07
0.04
0.08
0.06
0.68
0.28
0.10
0.09
0.37
exc
nm
219
270
220
270
219
271
219
270
271
em
nm
300
299
300
299
300
302
300
299
300
Sat
---
---
BADGE
0.06
0.03
0.08
0.02
0.06
0.03
0.07
0.03
0.28
exc
nm
225
274
225
274
225
275
225
274
275
em
nm
303
305
304
305
304
303
303
305
304
0.05
0.02
0.04
0.02
0.03
0.02
0.04
0.02
0.15
sat
---
---
sat
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la posibilidad de utilizar ciclodextrina para la determinacin individual de bisfenol A en medio acuoso ya que,
adems de evitar la desactivacin no radiativa del bisfenol A, produce una exaltacin de
la seal doble a la experimentada en presencia de DDS, y adems no parece formar
complejos de inclusin con fenol ni BADGE y por tanto evita su interferencia.
exc
nm
225
Acuoso
276
225
Etanol
275
221
Metanol
274
Acetato de etilo 279
--CCl4
--CHCl3
--CHCl2
225
Eter etlico
278
225
Hexano
278
em
nm
306
306
306
306
297
298
305
------305
305
305
305
R
0.07
0.04
1.55
0.67
3.21
2.14
0.10
------0.53
0.40
0.26
0.18
Fenol
exc
nm
219
270
221
269
217
265
274
------212
275
217
272
em
nm
300
299
301
296
295
295
302
------302
302
299
297
BADGE
R
0.06
0.03
0.72
0.63
1.25
1.98
0.08
------0.65
0.36
0.15
0.20
exc
nm
225
274
225
276
223
275
277
------225
276
217
272
em
nm
303
305
299
302
300
301
305
------304
304
299
297
R
0.05
0.02
2.06
0.54
2.59
1.65
0.06
------0.29
0.16
0.14
0.09
El empleo de disolventes miscibles con agua como metanol o etanol en los que el
bisfenol A presenta un alto rendimiento de fluorescencia requerira una eliminacin previa
del medio acuoso, paso ste que redundara en un aumento considerable del tiempo de
preparacin de muestra. Por esta razn se pens en la posibilidad de emplear un disolvente
no miscible con el agua que, adems de permitir la medida directa de fluorescencia
emitida por el compuesto, pudiese constituir una etapa para su preconcentracin. El
disolvente seleccionado para tal fin fue el ter etlico ya que, como se observa en la tabla,
de los disolventes no miscibles con el agua que se ensayaron: los tres clorados ejercen un
efecto de atenuacin anulando totalmente la seal luminiscente emitida por los
compuestos, en
acetato de etilo la seal es prcticamente nula y en hexano y ter etlico los tres
compuestos muestran seal siendo el rendimiento de fluorescencia mayor en ste ltimo.
Por tanto, en este caso, los mtodos desarrollados para el anlisis de bisfenol A habrn de
considerar la presencia de los otros dos compuestos bien para su anlisis, bien para evitar
su interferencia.
Los problemas inherentes a la introduccin de esta etapa de extraccin lquidolquido en el mtodo analtico son los derivados de la peligrosidad e impacto
medioambiental por el uso de disolventes orgnicos. Es evidente que estos
inconvenientes se reducen cuando se opera con pequeos volmenes de disolvente, caso
de la microextraccin lquido-lquido cuyo fundamento y caractersticas se resumen a
continuacin.
12
12
13
(2)
(1)
Agua
Muestra
Disolvente orgnico
Agua
Muestra acuosa
Stan y colaboradores
14,15
14
15
Heyer R., Zapf A. and Stan H.J. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 351, 752 (1995).
Zapf A., Heyer R. and Stan H.J. Journal of Chromatography, 694, 453 (1995).
111
(1)
(2)
Agua saturada
en ClNa
Muestra
Pipeta Pasteur
Disolvente orgnico
Muestra acuosa
Agua
En otros trabajos
16
17
al uso de disolventes menos densos que el agua. Este consiste en un recipiente de vidrio
en el que se introduce la muestra acuosa que finaliza en un capilar, adems lleva
16
17
Thielen D.R., Olsen G. and Davis A.. Journal of Chromatographic Science, 25 (1987).
Cromlab S.L. Liquid-liquid Extracctor 310-1000.
acoplado otro tubo lateral que se introduce hasta el fondo del recipiente (1). A
continuacin, se adiciona un pequeo volumen de un disolvente orgnico menos denso
que el agua y se agita vigorosamente durante el tiempo necesario. Tras la separacin de
las fases, la fase orgnica es empujada hacia el capilar con agua introducida a travs del
tubo lateral (2) de forma que puede ser recogida con una jeringa o una pipeta Pasteur. El
dispositivo es mostrado en la figura III.1.4.
(1)
(2)
Agua
Tubo capilar
120 mm
Disolvente orgnico
Muestra acuosa
38 mm
Introduccin
112
Varilla de vidrio
Fase acuosa
Fase orgnica Na2SO4 anhidro
Fibra de vidrio
10 mm
5 mm 50 mm
Pipeta Pasteur
Fase orgnica
Agua
desionizada saturada en NaCl
Fase acuosa
10 cm
Tubo de tefln
Thielen D.R., Olsen G., David A., Bajor E., Stofanovski J. and Chodkowski J. Journal of
Chromatographic Science, 25, 12 (1987).
por purga y trampa, aunque algo menos que la extraccin convencional. En la tabla
III.1.3 se muestran algunos datos de recuperacin y reproducibilidad de compuestos
orgnicos obtenidos a partir de un vertido industrial.
Compuesto
Triclorobenceno
Hexaclorobutadieno
Tetraclorobenceno
Hexaclorociclopentadieno
Hexaclorociclohexano
Endosulfan
Tricloroetileno
Monoclorobenceno
Diclorobenceno
* Media de 44 determinaciones
gases .
Otra gran diferencia entre ambos mtodos radica en el tiempo y costo del
anlisis. Mediante la extraccin en fase slida una persona puede analizar entre 10 y 15
muestras en un da, mientras que con microextraccin se puede llegar a realizar ms de
50 extracciones. Por otra parte, el costo global de un anlisis con extraccin en fase
slida es aproximadamente de 4 a 5 veces mayor que el correspondiente al mismo
anlisis empleando microextraccin.
119
2.
-1
de
-1
IF
240
200
160
120
80
40
0
200
Excitacin
a
b
215
c
230
245
260
275
290
IF
240
200
160
120
80
40
0
290
Emisin
a
b
c
305
320
335
Longitud de onda (nm)
350
121
Rendijas
(exc/em)
IF*
Rendijas
(exc/em)
IF*
2.5/2.5
2.5/5.0
2.5/10.0
2.5/15.0
5.0/2.5
5.0/5.0
5.0/10.0
5.0/15.0
--35.54
172.99
388.75
--25.88
185.30
386.60
10.0/2.5
10.0/5.0
10.0/10.0
10.0/15.0
15.0/2.5
15.0/5.0
15.0/10.0
15.0/15.0
--32.49
166.89
396.40
--14.89
147.72
350.92
Para llevar a cabo esta experiencia se prepar una serie de disoluciones con una
-1
concentracin constante de bisfenol A de 50 gl y se modific la concentracin de ciclodextrina en el rango comprendido entre 0.00 M y 0.01 M. Paralelamente se prepar
otra serie de disoluciones blanco que contenan la misma concentracin de -ciclodextrina.
La intensidad de fluorescencia de cada una de las disoluciones se midi a exc=225 nm y
em=306 nm, con rendijas de excitacin y emisin de 5 y 10 nm respectivamente,
velocidad de barrido 240 nm/minuto y temperatura 20.00.5
C. Los resultados
122
IFBlanco
IF*
163.51
26.83
136.68
810
-5
190.51
31.79
158.73
202.48
30.52
171.86
42.39
10-4
-4
410
227.42
55.48
171.94
30.96
64.87
810
-4
250.82
79.54
171.28
28.51
89.58
10-3
0.00
26.97
20.01
6.96
410
10-6
-6
210
46.33
28.41
17.92
56.09
31.23
24.86
-6
83.25
35.86
810
-6
105.83
10-5
118.09
410
IF*
IF
200
150
100
50
0
0
200
400
600
[CDx] (106M)
800
1000
6,19
20
y Scatchard .
Benesi H.A and Hilderbrand J.H. Journal of American Chemical Society, 71, 2703 (1949).
123
20
Durn-Mers I., Muoz de la Pea A., Salinas F. and Rodrguez I., Analyst, 119, 1215 (1994).
BFA
K
CDx
BFA
CDx
(1)
El mtodo parte de la suposicin de que [-CDx] es mucho mayor que [BFACDx] en el equilibrio, por tanto se puede afirmar que [CDx]=[CDx] o. Operando sobre la
ecuacin (1) se llega a la expresin:
1
BFA CDx
1 K BFA0
(2)
K BFA0
CDx 0
1
(I ) (I
I0
I0
)K
CDx 0
(I 1
I0 )
(3)
Si se supone ahora una estequiometra 1:2, en este caso la constante de formacin del
complejo vendr dada por la expresin 4.
BFA CDx
BFA CDx 2
(4)
1
(I I0 )
(I
I0
)K
CDx
1
(I I )
0
(5)
vs 1/[-CDx] ser una lnea recta (figura III.2.3 (II)). Si se obtiene, por el contrario, una
curva se confirma que la estequiometra no es 1:2.
(I-Io)
1/(I-Io)
(I-Io)/[-CDx]
0
19.36
34.13
56.28
78.87
91.12
136.54
163.55
175.51
0
-2
5.2110
-2
2.9310
-2
1.7710
-2
1.2710
-2
1.1010
-3
7.3210
-3
6.1110
-3
5.7010
-7
1.9310
7
1.7110
7
1.4110
6
9.8610
6
9.1110
6
3.4110
6
2.0410
6
1.7510
75
-3
1/(I-I0) (10 )
50
25
0
0
25
50
75
1/[CDx] (10-4)
100
-3
1/(I-I0) (10 )
75
II
50
0
0
25
50
75
1/[CDx]2 (10-10)
100
Este segundo supone que si la estequiometra del complejo es 1:1, la relacin entre
la intensidad de fluorescencia observada (I-Io) y la concentracin de ciclodextrina vendr
dada por la expresin:
(I I )
0
CDx
(I I 0 ) (I I 0 )
(6)
-6
(I-Io)/[CDx] (10 M)
25
20
15
Figura III.2.4. Representacin de Scatchard.
10
5
0
0
50
100 (I-Io)
150
200
r (%)
-8
4.6310
-3
6.0410
99.9
Scatchard
5
-1.1510
5
2.0410
97.4
representacin I. Los valores calculados por ambos mtodos son 1.1510 y 1.3010
-1
lmol respectivamente.
2.2.2. Influencia del pH del medio. Clculo de la constante de acidez del complejo de
inclusin.
Para llevar a cabo esta experiencia se prepar una serie de disoluciones en matraces
aforados de 10 ml de capacidad que contenan 0.5 ml de disolucin acuosa de bisfenol A
-1
-3
IF
pH
IF
3.00
5.10
6.25
7.60
8.57
200.82
198.35
198.67
193.17
174.06
9.93
10.80
11.54
12.31
13.00
95.23
39.91
27.57
18.24
3.94
IF
250
200
150
100
50
0
3
11
pH
Figura III.2.5. Influencia del pH del medio.
13
21
AH
A +H
(7)
Ka
A H
AH
(8)
21
131
I m I AH I A
(9)
(I AH I )
(I I )
(10)
(11)
Log R = pH-pKa
Por tanto si se representa log R frente al pH se obtiene una recta, donde en el punto
log R=O, se cumple que pH = pKa, lo cual nos permite calcular el valor de Ka.
Log R
pH
Log R
3.00
---
---
9.93
1.156
0.630
5.10
0.012
-1.896
10.80
4.470
0.651
6.25
0.011
-1.957
11.54
7.330
0.865
7.60
0.040
-1.393
12.31
12.760
1.107
8.57
0.093
-1.031
13.00
---
---
IF
2
1
0
-1
-2
-3
-4
11
13
pH
Figura III.2.6. Determinacin de Ka del complejo.
El ajuste por mnimos cuadrados de los datos calculados permite obtener los
valores siguientes:
a (ordenada en el origen)
-4.086
b (pendiente)
0.491
0.9638
El valor de pH para el cual log R=0 es 9.8, por tanto este es el valor
9
-1
132
-3
-1
(moll )
0.00
0.10
0.20
0.40
0
Tabla III.2.7. Influencia de la fuerza inica del medio
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
[Sal]
M
IF
[Sal]
IF
NaCl
203.41
201.42
204.08
204.46
IF
[Sal]
50
133
Uno de los factores que ejerce mayor influencia sobre la emisin fluorescente es la
temperatura a la que se realiza la medida de fluorescencia de la muestra. Un incremento en
dicha variable puede llegar incluso a hacer desaparecer la seal ya que al aumentar la
temperatura se favorece la desactivacin no radiativa.
concentracin 10
Temperatura decreciente
T (C)
IF
T (C)
IF
T (C)
IF
T (C)
IF
10.1
271.16
40.0
170.21
66.7
110.58
35.0
181.70
15.0
243.83
45.0
156.68
60.1
123.10
27.6
200.86
20.0
226.48
49.9
147.71
54.8
136.67
25.0
206.39
25.1
210.93
55.5
134.40
50.1
145.16
20.0
224.32
30.0
194.37
60.6
124.07
45.2
157.0
15.1
241.54
34.9
181.52
66.7
110.58
40.2
169.41
10.2
269.02
IF
250
200
150
100
50
0
10
20
30
40
50
Temperatura (C)
60
70
En la siguiente tabla se incluyen los valores ptimos establecidos para las variables
experimentales e instrumentales en las experiencias desarrolladas a lo largo de los
apartados anteriores.
ptimo
Variable
ptimo
exc (nm)
225
em (nm)
Rend exc (nm)
306
[-CDx] (M)
pH
10-4
---
T (C)
Rend em (nm)
10
---
20.00.5
---
Valor
a (uf)
sa (uf)
1.82 0.84
1.833
-1
2.91 0.03
-1
0.016 l
b (lg )
sb (lg )
r (%)
99.94
sRC
5.035
5.0
800
600
IF
400
200
0
0
40
80
120
160
[bisfenol A](gl-1)
200
IF
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
0
40
80
120
[bisfenol A](gl-1)
160
200
-1
El rango lineal de trabajo seleccionado fue 10.0 a 200.0 gl . Por otra parte, la
linealidad calculada segn la expresin mostrada en el captulo II fue 99.45 %.
IF
Blanco
IF
20.59
20.57
21.57
20.50
20.25
19.96
21.26
21.23
21.05
10
21.08
estndar de 0.508; la pendiente de la recta de calibrado obtenida fue 2.91gl , por tanto
-1
el lmite de deteccin del mtodo analtico ser de 0.5 gl . Por tanto, si la seal
fluorescente encontrada en una muestra es IF > (20.830.506) = 22.3, podemos afirmar
con una certeza del 99.86% que el bisfenol A est presente en dicha muestra.
fue de 1.7 gl .
2.4.2.3. Precisin.
IF
Patrn
IF
421.07
427.90
424.30
418.25
418.25
418.56
427.90
426.38
423.09
10
425.41
2.4.2.4. Sensibilidad.
1.73 gl .
Valor
Parmetro
Valor
RDL (gl )
10.0-200.0
DER (%)
0.92
Linealidad (%)
99.45
Scalibrado (lg )
-1
0.5
Sanaltica (gl )
1.73
-1
1.7
---
---
-1
CL (gl )
CQ (gl )
-1
-1
2.91
141
Para evaluar las posibles interferencias ejercidas por las distintas especies inicas
presentes en las matrices objeto de estudio, se caracteriz previamente la composicin de
las mismas.
Especie
mgl
Especie
CO3-2 CO3H
19.6
25.6
69.5
28.3
62.4
12.2
SiO3
Cl
SO4-2
SO3-2NO3
PO4-3
-2
Ca+2
Mg+2
Zn+2
Cd+2
-1
mgl
Especie
0.10
--92.4
42.3
0.10
0.01
Pb+2
Cu+2
Mn+2
Cr+3
Fe+3
Al+3
-1
gl
10.0
20.1
19.5
< 1.00
90.5
18.9
Especie
mgl
Especie
CO3-2 CO3H
28.1
85.9
65.6
25.3
32.8
0.50
SiO3
Cl
SO4-2
SO3-2NO3
PO4-3
-2
Ca+2
Mg+2
Zn+2
Cd+2
-1
mgl
Especie
6.30
22.4
64.1
19.4
0.08
---
Pb+2
Cu+2
Mn+2
Cr+3
Fe+3
Al+3
-1
gl
1.1
0.3
1.3
< 1.00
0.20
13.6
Especie
mgl
Especie
CO3-2 CO3H
9.00
17.0
78.6
15.3
1.60
0.06
SiO3
Cl
SO4-2
SO3-2NO3
PO4-3
-2
Ca+2
Mg+2
Zn+2
Cd+2
-1
mgl
Especie
20.0
4
210
0.40
1.30
5.0 g
0.1 g
Pb+2
Cu+2
Mn+2
Cr+3
Fe+3
Al+3
-1
gl
0.03
0.50
0.20
0.30
2.00
2.00
-2
+3
+3
-2
-3
-2
Las especies seleccionadas fueron: CO3 , CO3H , SO4 , SO3 , NO3 , PO4 , SiO3 , Cl ,
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
Ca , Mg , Pb , Cu , Cd , Zn , Mn , Al , Fe
encontradas en las tres matrices caracterizadas.
+3
142
Para obtener las disoluciones de cada una de estas especies se parti de la sal
-1
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
222Tabla III.2.14.
Interferencia debida a CO3 , CO3H , SO3 y SO4
-20
(%)
-1
2,5
2,9
3,3
C/CBFA 2,1
CI (mgl )1,3 Log 1,7
-2
-2
CO
H
3
CO
SO
SO3-2
log [Int]/[Bisfenol
A]
3
4
1.30
0.15
-0.56
-0.80
1.81
1.0
2.30
0.51
-1,28
-0.59
-2.60
50.0
3.00
7.60
-1,31
0.26
2.02
100.0
3.30
9.20
-3,71
1.59
2.96
E (%)
E (%)
10.0
20
15
10
5
0
-5
Figura
III.2.11. Interferencia debida a los aniones
-10 CO -2 (o), CO H- (), SO -2 (x) y SO -2 ().
3
3
4
3
-15
-20
1,3
1,7
2,1
2,5
log [Int]/[Bisfenol A]
2,9
3,3
-3
-2
CI (mgl )
Log C/CBFA
0. 5
1.0
5.0
10.0
50.0
100.0
1.00
1.30
2.00
2.30
3.00
3.30
(%)
PO4-3
--0.30
-3.20
7.30
10.0
-2
SiO3
-2.96
-3.10
2.66
2.30
Cl
--0.01
0.04
-1.09
0.28
NO3
0.28
2.10
12.01
14.35
---
E (%)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
E(%)
2,3
2,5
2,7
2,9
log [Int]/[Bisfenol A]
3,1
3,3
20
15
10
5
0
-5
Figura
III.2.12. Interferencia debida a los aniones
-10 SiO3-2 (o), PO4-3 (), Cl- (x) y NO3- ().
-15
-20
1
1,4
1,8
2,2
log [Int]/[Bisfenol A]
2,6
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
2+
+2
+2
+2
+2
-20 Interferencia debida a Pb , Cu , Mn , Cd y Zn .
Tabla III.2.16.
-0,7
CI (gl )
Log C/C-0,5
BFA
10.0
50.0
100.0
150.0
200.0
-0.70
0. 00
0.30
0.48
0.60
E(%)
E(%)
-1
(%)
-0,3 -0,1
0,10,30,5
2+
logPb
[Int]/[Bisfenol
Cu+2 A]Mn+2
--0.33
1. 09
1.67
2.87
2.37
0.14
3.21
3.62
3.45
-1.89
-0.81
-0.26
-0.16
---
Cd+2
---1.91
-3.56
-3. 60
-2.79
Zn+2
---2.12
-3.87
-3.77
-3.82
20
15
10
5
0
-5
Figura III.2.13. Interferencia debida a los cationes
+2
+2
+2
+2
-10 +2
Pb (o), Cu (), Mn (x), Cd () y Zn (+)
-15
-20
0
0,2
0,4
log [Int]/[Bisfenol A]
0,6
20
15
10
5
0
-5
-10
-15 III.2.17. Interferencia debida a Al3+, Cr+3 y Fe+3
Tabla
-20
(%)
Log C/CBFA
+3
0,2
Al I 0,4Cr+3
log
0.00[Int]/[Bisfenol
0.09 A]-0.41
0.30
-0.03
-2.37
0.48
---2.16
0.60
---2.79
0.78
0.09
---
-1
+3
Fe0,6
2.15
2.10
2.58
2.76
---
E(%)
CI (gl )
0
50.0
100.0
150.0
200.0
300.0
2+
CI (mgl )
Log C/CBFA
10.0
(%)
2.30
Ca2+
1.48
Mg2+
2.28
50.0
3.00
-1.69
2.64
100.0
3.30
-2.74
1.72
E(%)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
2,3
2,5
2,7
2,9
log [Int]/[Bisfenol A]
3,1
3,3
Tabla III.2.19. Tolerancia para las especies ensayadas como posibles interferentes
Especie
mgl
CO3-2
CO3H
35
-1
-1
-1
-1
Especie
mgl
Especie
gl
Especie
gl
PO4-3
-2
SiO3
20
Pb+2
>200
Al+3
250
>100
Cu+2
>100
Fe+3
>100
>200
---
>100
SO4-2
>70
Cl
>50
Cd+2
>200
SO3-2
NO3
>70
Ca+2
>100
Zn+2
>200
Cr+3
---
1.5
Mg+2
>100
Mn+2
>200
---
---
-2
-2
+2
+3
+3
+2
+2
+2
+2
Mg , Zn , Mn y Cd .
3-
y la baja
tolerancia para NO3 , pues su concentracin en agua natural suele superar estos valores.
Ambas son especies aninicas, no habindose encontrado comportamientos analgos
entre las especies catinicas. Se hizo por tanto necesaria la eliminacin de los iones
nitrato.
una resina de cambio aninico en ciclo-Cl , Sephadex QAE-A 25. Esta resina retiene los
aniones que acompaan al compuesto en la muestra a analizar, introduciendo en su lugar
-
-3
IF
Pozo
Ro
Mar
199.79
94.35
150.23
192.25
194.98
195.31
199.79
107.29
147.07
194.28
195.30
195.39
199.79
99.86
160.22
200.81
201.02
201.98
Se observa que 0.3 g de resina aninica son suficientes para obtener una
recuperacin de seal cercana al 100 % respecto a la disolucin de referencia preparada en
agua desionizada, cuando se emplea un volumen de muestra de 50 ml de estos tres tipos
de agua.
Estudios previos mostraron que la seal de emisin obtenida para las primeras
fracciones de muestra recogida al pasar a travs de la resina de cambio inico era menor
que la mostrada por las ltima. Para optimizar la fraccin de disolucin tomada para las
medidas de fluorescencia, se diseo la siguiente experiencia: En un matraz aforado de 50
-1
V(ml)
IF
Fraccin
V(ml)
IF
0*
1
2
--0a9
9 a 18
208.56
161.66
202.86
3
4
5
18 a 27
27 a 36
36 a 45
213.20
210.39
215.28
151
Se concluye por tanto que la fraccin a emplear para la realizacin de las medidas
de fluorescencia es la tercera, ya que en esta fraccin la seal alcanza un valor cercano al
de la disolucin de referencia, permaneciendo estable para fracciones posteriores.
-3
M, de forma que las concentraciones finales de bisfenol A fueron 0.0, 10.0, 40.0, 80.0 y
-1
120.0 gl . Finalmente, se midi la seal emitida a exc=225 nm, em= 306 nm, rendijas
de excitacin y emisin 5 y10 nm respectivamente, velocidad de barrido 240 nm/minuto y
temperatura 20.00.5 C.
22
22
(r ). En todos los casos los datos experimentales se ajustan al modelo lineal. Los
parmetros del calibrado aparecen en la tabla III.2.25.
Pozo
Mar
Ro
5
2.900.60
0.020
5
2.830.14
0.045
5
2.920.16
0.049
43.24.1
1,270
1,895
99.98
39.39.5
3.001
4.474
99.92
45.410.6
3.301
4.919
99.91
-1
b (lg )
-1
sb (lg )
a (uf)
sa (uf)
sRC
2
r (%)
Fcal
Ftab
Conclusin
Pozo
Mar
Ro
7.06
1.26
1.04
8.66
8.66
8.66
Ho
Ho
Ho
En todos los casos se concluye por la hiptesis nula, es decir, no existe diferencia
significativa entre las varianzas de ambos calibrados.
153
tcal
Pendiente
Ordenada en el origen
ttab
tcal
Conclusin
ttab
Conclusin
Pozo
0.046 2.074
Ho
0.157 2.069
Ho
Mar
0.309 2.074
Ho
1.380 2.069
Ho
Ro
0.038 2.074
Ho
1.000 2.069
Ho
En los tres casos se concluye por la hiptesis nula, es decir, no existen diferencias
significativas entre las pendientes y las ordenadas en el origen de ambas rectas de
calibrado, ya que en todos los casos se cumple que tcal<ttab para el nivel de significacin
del 5%. Por tanto, se puede concluir que las rectas de calibrado con patrones y adicin de
patn son iguales en los tres casos considerados y consecuentemente el mtodo propuesto
conduce a resultados exactos.
-3
M, se midi la emisin
Ro
Mar
[bisfenol A] gl
-1
% Rec (CP)
40
101.1
80
97.9
120
95.0
40
105.0
80
102.0
120
99.5
40
96.0
80
97.9
120
95.0
3.
154
Excitacin
600
400
IF
c
b
200
IF
a
0
200215230245260275290
Longitud de onda (nm)
Emisin
600
400
c
b
200
a
0
290
305
320
335
Longitud de onda (nm)
350
fenol fue imposible. Para soslayar este problema se plante el empleo de espectros
derivados que permitieran seleccionar una longitud de onda a la cual la seal medida
fuera debida nicamente a la presencia de bisfenol A.
La tcnica seguida para la seleccin de las longitudes de onda analticas fue la del
24
zero crossing propuesta por Savitzky y Golay . Esta consiste en localizar aquellas
longitudes de onda del espectro derivado en las cuales la seal medida depende
nicamente de la concentracin del compuesto a determinar. Mediante esta tcnica, se
eligen las longitudes de onda adecuadas para realizar medidas proporcionales a
la
derivacin . Por ello, para usar como tcnica de trabajo la derivacin, es necesario llevar
a cabo un filtrado de la seal para controlar el incremento en el ruido que es un resultado
inevitable de la derivacin de un espectro. El ruido causado por el proceso de
diferenciacin es fundamentalmente debido a un incremento en el ruido de alta
frecuencia y es fcil de reducir mediante un proceso de filtrado de baja frecuencia.
En el proceso de filtrado se hace una convolucin de los datos con una funcin de
filtrado consistente en una serie de coeficientes proporcionales. Cada punto de la serie
de datos filtrados es una combinacin lineal de un grupo de puntos adyacentes de la serie
de datos sin filtrar, multiplicado cada uno por un coeficiente proporcional.
En esta Memoria, para la obtencin tanto del espectro derivado como para el
posterior suavizado del mismo, se emple el programa FL Data Manager suministrado por
la casa Perkin Elmer para controlar el espectrofluormetro LS-50. Este programa aplica el
mtodo de diferenciacin y filtrado de datos basado en el procedimiento de mnimos
27,28
Se pueden emplear factores comprendidos entre 5 y 149 puntos, que ajustan cada
punto a un polinomio cuadrtico o cbico a travs de sucesivas ventanas de datos que se
utilizan para determinar el mejor punto central. A medida que se aumenta el factor de
filtrado, el proceso de filtracin es ms efectivo, pero se pierde resolucin. El factor de
filtrado utilizado en esta Memoria fue de 12 puntos.
26
800
600
a
400
200
0
-200
b
2
-400
1
Finalmente -600
se seleccionaron las longitudes de onda de medida. En el caso del
espectro de emisin,-800
al obtener la derivada de cprimer orden no se observ ninguna longitud
200
de onda a la cual la seal dependiese nicamente de la concentracin de bisfenol A y fuese
215 230 245 260 275290
independiente de la de fenol. Sin embargo, cuando se obtuvo la primera derivada del
longitud de onda (nm)
espectro de excitacin se encontraron dos longitudes de onda que permitan la medida de
la seal correspondiente nicamente a bisfenol A, sin contribucin alguna por parte del
fenol. En la figura III.3.2 se muestran los espectros de excitacin en primera derivada de
1 Derivada
-1
2.0 mgl
las
resultados
IF
Rendija
(exc/em)
IF
2.5/2.5
2.5/5.0
2.5/10.0
2.5/15.0
5.0/2.5
5.0/5.0
5.0/10.0
5.0/15.0
225.61
700.26
Sat
Sat
125.69
490.25
Sat
Sat
10.0/2.5
10.0/5.0
10.0/10.0
10.0/15.0
15.0/2.5
15.0/5.0
15.0/10.0
15.0/15.0
198.56
590.09
Sat
Sat
98.35
280.36
Sat
Sat
161
100 ml
0.0 l
50.0 l
410.0 l
900.0 l
1.4 ml
2.0 ml
2.9 ml
3.8 ml
5.0 ml
Vrecuperado
250 ml
0.0 l
0.0 l
0.0 l
120.0 l
430.0 l
1.0 ml
2.3 ml
3.2 ml
4.1 ml
500 ml
0.0 l
0.0 l
0.0 l
0.0 l
0.0 l
20.0 l
160.0 l
400.0 l
1.8 ml
14,15
162
Agitacion
IF
DER (%)
Manual
502.0
8.36
Agitador I
506.8
1.64
Agitador II
493.0
1.82
Agitador III
548.4
1.45
600
400
200
Tabla III.3.4. Influencia del tiempo de agitacin.
Tiempo (s)
0
0
0
IF100 ml
IF250 ml
IF500 ml
54.26
120
300.02
30
486.05
435.53
450.24
60
490.28
549.99
563.23
90
486.70
555.11
575.20
120
487.96
546.43
571.35
IF
15
50.23
30
60 59.36 90
386.03
289.05
tiempo (segundos)
IF250 ml
IF500 ml
0
500
700
900
1300
1500
1700
2000
50.26
117.53
206.26
388.76
447.83
457.76
460.35
466.30
66.61
70.25
84.22
125.36
391.69
483.03
550.19
540.54
60.21
70.52
76.22
94.25
225.36
475.23
562.30
565.32
IF
Velocidad (r.p.m.)
600
400
Figura III.3.5. Influencia de la velocidad de agitacin:
100 ml (o), 250 ml () y 500 ml () de muestra acuosa.
200
0
0
400
2000
V100 ml (l)
V250 ml (l)
V500 ml (l)
30.0
330.0
190.0
160.0
60.0
400.0
400.0
400.0
90.0
400.0
410.0
405.0
120.0
410.0
405.0
410.0
Se observa que un minuto es suficiente en todos los casos para una adecuada
separacin de la fase orgnica y poder as recoger el volumen de 400 l, necesario para
la realizacin de las medidas de fluorescencia.
IF
pH
IF
2.04
511.70
10.32
506.39
4.28
503.03
10.66
492.24
7.55
509.95
11.15
362.13
8.50
507.50
11.39
236.24
9.06
510.38
11.80
156.23
9.50
503.66
12.52
142.08
9.91
505.62
13.00
138.83
600
400
200
0
3
11
13
IF
pH
Como ya se indic, uno de los factores que ejerce mayor influencia sobre la
emisin fluorescente es la temperatura de la muestra a la que se realiza la medida de la
seal. Un incremento en dicha variable puede llegar incluso a hacerla desaparecer. Adems
en este caso al emplear un disolvente altamente voltil, es fundamental el empleo de bajas
temperaturas para las medidas fluorescentes.
370.32
409.23
435.81
488.36
525.32
557.80
IF
5.1
9.9
15.0
20.1
24.9
30.0
170
En la siguiente tabla se incluyen los valores ptimos establecidos para las variables
instrumentales y experimentales en las experiencias desarrolladas a lo largo de los
apartados anteriores.
ptimo
exc (nm)
em (nm)
h (nm)
Factor de filtrado
Rend exc (nm)
Rend em (nm)
Vbarrido (nm/min)
278
305
239
12
5
5
240
ptimo
Variables
experimentales 100 ml 250 ml 500 ml
Vdisolvente (ml)
Tipo de agitador
tagitacin (s)
vagitacin (r.p.m.)
tseparacin de fases (s)
pH
T (C)
1.5
2.5
5.0
Agitador III
30
60
60
1300
1700
1700
60
--10.00.5
empleado. Por este motivo, se han obtenido las funciones de calibrado para diferentes
volmenes de disolucin acuosa 100 ml, 250 ml y 500 ml- en las condiciones operatorias
establecidas anteriormente y se han comparado los resultados obtenidos con objeto de
seleccionar el volumen adecuado.
para obtener las concentraciones finales 1.0, 4.0, 8.0, 12.0, 16.0 y 20.0 gl
1 derivada
1200
1000
800
600
400
Figura200
III.3.8. Funcin de calibrado para el bisfenol A (100 ml).
0
8
12
[bisfenol A](gl-1)
16
172
Residuale
figura III.3.9.
Se observa en el grfico que en los tres casos se cumplen las premisas fijadas en el
captulo II para el cumplimiento de la condicin de homocedasticidad segn el criterio
adoptado. Por tanto es posible afirmar que los datos son homocedsticos.
1 Derivada
20
15
10
5
0
-5
Los parmetros
-10 del calibrado son los mostrados a continuacin.
-15
-20
Tabla III.3.11. Parmetros del calibrado (250 ml).
0 Parmetro
2
4
Valor 6
[bisfenol A](gl-1)
15
n
14.9 1.0
a
0.376
sa
-1
135.0 2.5
b (lg )
-1
0.91
sb (lg )
2
r (%)
99.9
5.56
sRC
25,2
Plack of fit (%)
Residuale
1200
1000
800
600
400
200
0
3.3.1.3. Funcin de calibrado
para un volumen de 500 ml.
concentracin, para obtener las concentraciones finales de 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 y 8.0 gl .
Tras enrasar, se transvasaron a embudos de decantacin de 500 ml de capacidad donde se
disolvieron 150 g de NaCl y se extrajeron con 5.0 ml de ter etlico, agitando durante 1
minuto a 1700 r.p.m. A continuacin se registr el espectro de excitacin fluorescente en
las condiciones instrumentales habituales y, tras derivar con un factor de filtrado de 12
puntos, se midi la seal a exc=239 nm. Se realizaron tres rplicas experimentales de cada
concentracin.
1 Derivada
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
Tabla III.3.12. Parmetros del calibrado (500 ml).
-20
Parmetro
Valor
15
n
2
4
6
14.0 5.3
a
[bisfenol A](gl-1)
1.94
sa
-1
138 1.3
b (lg )
-1
0.47
sb (lg )
2
r (%)
99.9
2.86
sRC
32.27
Plack of fit (%)
0
Residuale
250 ml
500 ml
Pendiente
65.5
135.0
138.0
Rango lineal
1.0 20.0
0.5 10.0
0.5 10.0
S 250/100
2.03
S 500/250
1.03
-1
[Fenol] (gl )
n
-1
b (lg )
-1
sb (lg )
a
sa
2
r (%)
sRC
0.0
5.0
10.0
20.0
6
65.5 7.3
2.65
0.56 0.08
0.029
99.8
3.92
6
64.9 3.0
1.09
0.29 0.25
0.089
99.8
14.61
6
65.9 2.2
0.80
0.95 0.20
0.072
99.9
10.67
6
65.2 3.5
1.27
1.82 0.03
0.011
99.9
16.86
[Fenol] (gl )
0.0
5.0
10.0
20.0
Fcalc
Ftab
Conclusin
--13.89
7.37
18.49
--6.39
6.39
6.39
--H1
H1
H1
tcal
Pendiente
Ordenada en el origen
ttab
zcal
0.906 2.776
0.523 2.776
0.258 2.776
Conclusin
Ho
Ho
Ho
ztab
0.044 1.960
0.084 1.960
0.178 1.960
Conclusin
Ho
Ho
Ho
181
-1
100 ml y 0.5 a 10.0 gl para 250 y 500 ml de muestra acuosa. Por otra parte la
linealidad calculada result ser 96.0 % para el volumen de 100 ml, 99.32 % para 250 ml y
99.66 % para 500 ml. Se concluye por tanto que los rangos de trabajo seleccionados son
lineales.
100 ml
250 ml
500 ml
Seal media
63.20
72.9
80.29
Desviacin estndar
3.05
3.10
3.04
b (lg )
65.5
135.0
138.0
-1
0.14
0.07
0.07
-1
0.48
0.23
0.23
-1
CL (gl )
CQ (gl )
*Diez determinaciones
3.3.3.3. Precisin.
-1
-1
para los otros dos volmenes. Se registraron los correspondientes espectros de excitacin,
fijando las condiciones instrumentales habituales y tras obtener la primera derivada se
midi la seal a 239 nm. Finalmente se calcularon los parmetros mostrados en la tabla
III.3.18.
100 ml
250 ml
500 ml
Seal media
650.2
546.1
580.6
Desviacin estndar
15.4
15.94
16.60
DER (%)
2.37
2.92
2.86
*Diez determinaciones
3.3.3.4. Sensibilidad.
sRC
-1
Scalibrado (lg )
-1
Sanaltica (gl )
100 ml
250 ml
500 ml
3.92
5.56
2.86
65.5
135.0
138.0
0.06
0.04
0.02
182
100 ml
250 ml
500 ml
RDL (gl )
1.0-20.0
0.5-10.0
0.5-10.0
Linealidad (%)
96.0
99.3
99.7
-1
0.14
0.07
0.07
CQ (gl )
-1
0.48
0.23
0.23
DER (%)
2.37
2.92
2.86
-1
65.5
135.0
138.0
-1
0.06
0.04
0.02
-1
CL (gl )
Scalibrado (lg )
Sanaltica (gl )
-2
-2
-3
+2
+3
+3
-2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
Cd , Hg , Be , Mg , Ca , Al , Cr
+3
de concentracin 1 mgl
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
222Tabla III.3.21. Interferencia de los iones CO3 , CO3H , SO4 y SO3 .
3
-1
CI (mgl )
E (%)
E (%)
10.0
50.0
100.0
200.0
3,4
3,8 (%) 4,2
Log C/C
BFA
log [Int]/[Bisfenol
A] SO4-2
CO3-2 CO3H
3.00
0.98
1.42
0.49
3.70
-1.60
2.20
0.65
4.00
3.20
1.65
1.03
4.30
-2.20
2.72
1.65
SO3-2
1.02
2.36
2.65
2.86
20
15
10
5
0
-5
-10
Figura
III.3.14. Interferencia debida a la presencia de los iones
-15 CO3-2 (o), CO3H- (), SO4-2 (x) y SO3-2 ().
-20
3
3,4
3,8
log [Int]/[Bisfenol A]
4,2
E (%)
E (%)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15III.3.22. Interferencia de los iones NO3-, NO2- y ClO-.
Tabla
-20
(%)
-1
Log C/CBFA
CI (mgl )
NO
NO2 3,2ClO
1,7
2
2,3
2,63
2,9
0.70[Int]/[Bisfenol
--- A]
---4.60
0.05
log
1.70
1.81
0.80
-17.5
0.5
2.00
2.60
0.59
-35.0
1.0
2.70
2.02
1.03
-83.6
5.0
3.00
2.10
1.59
-94.1
10.0
0
-20
-40
Figura III.3.15. Interferencia debida a la presencia de los iones
-2
NO3 (o), NO2 () e ClO (x).
-60
-80
-100
0,7
1,1
1,5
1,9 2,3
log [Int]/[Bisfenol A]
2,7
3,1
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-3
-2
-Tabla III.3.23.
Interferencia de los iones PO4 , SiO3 , Cl y Br .
-20
(%)
-1
3,3BFA
CI (mgl ) 3 Log C/C
E (%)
E (%)
10.0
50.0
100.0
200.0
3.00
3.70
4.00
4.30
3,6
3,9 -2
-3
SiOA]
PO
3
4
log [Int]/[Bisfenol
0.35
2.20
2.90
3.20
0.96
0.58
1.23
2.56
4,2
Cl
2.96
3.10
2.66
2.30
4,5
Br
-0.30
2.00
3.20
3.60
20
15
10
5
0
Figura III.3.16.
Interferencia debida a la presencia de los iones
-5
-3
-2
-10 PO4 (o), SiO3 (), Cl (x) y Br ().
-15
-20
3
3,3
3,6
3,9
4,2
log [Int]/[Bisfenol A]
4,5
20
15
10
5
0
-5
-10
-15 Interferencia de los iones Mn+2, Cu+2, Pb2+, Zn+2 y Cd+2.
Tabla III.3.24.
-20
-1
(%)
50.0
0.70
100.0
1.00
0.56
0.42
0.56
1.26
3.87
150.0
1.18
0.92
2.21
1.02
1.95
3.77
200.0
1.30
2.53
2.00
1.98
2.69
3.82
E(%)
E(%)
CI (gl )
Log C/CBFA
0
+2
0,2
Mn
Cu+2 0,4
Pb2+
log
[Int]/[Bisfenol
A]
1.69
0.14
0.26
Zn+20,6 Cd+2
2.35
2.12
20
15
10
5
0
-5
Figura-10
III.3.17. Interferencia debida a la presencia de los iones
+2
+2
+2
+2
+2
-15
Mn (x), Cu (), Pb (o), Zn (+) y Cd ().
-20
0,7
0,9
1,1
log [Int]/[Bisfenol A]
1,3
20
15
10
5
0
-5
-10
2+
+2
+2
+2
Tabla-15
III.3. Interferencia de los iones Hg , Be , Mg y Ca .
-20
-1
(%)
E(%)
E(%)
20
15
10
5
0
Figura
debida a la presencia de los iones
-5III.3.18.+2Interferencia
+2
+2
+2
Hg (), Be (o), Mg (x) y Ca ().
-10
-15
-20
0,7
0,9
1,1
log [Int]/[Bisfenol A]
1,3
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20III.3.26. Interferencia de los iones Al3+, Cr+3 y Fe+3.
Tabla
(%)
0,7
0,9
1,1
Log
C/C
BFA
CI (gl )
log [Int]/[Bisfenol
A]Cr+3
Al+3
-1
1,3
0.70
-1.23
0.65
100.0
1.00
-2.22
1.36
2.36
200.0
1.30
-2.32
2.23
2.89
E(%)
50.0
Fe+3
1.65
CI (gl )
Log C/CBFA
50
(%)
Diclone
Morestan
Bentazona
0.70
2.25
-1.26
3.25
100
1.00
2.56
-2.25
3.44
260
1.40
---
-2.65
3.56
1000
2.00
---
---
3.21
20
15
10
5
Determinacin de bisfenol
A en presencia de fenol
0
-5
-10
-15
-20
1
1,3
1,6
1,9
log [Int]/[Bisfenol A]
2,2
E(%)
0,7
190
(%)
Warfarina
Benomil
1.0
2.00
1.65
-2.35
2.0
2.30
2.31
-1.96
4.0
2.60
---
-3.21
(%)
Carbaril
o-fenilfenol
50.0
3.70
2.56
-1.45
120.0
4.07
2.36
-1.26
700.0
4.84
2.56
-0.26
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
3,9
4,1
2,2
4,3
2,4
4,5
log [Int]/[Bisfenol A]
4,7
2,6
4,9
E(%)
E(%)
3,7
2
192
Especie
mgl
CO3-2
CO3H
>200
ClO
-1
-1
gl
Especie
gl
0.80
Cr+3
>200
>200
Pb+2
>200
Al+3
>200
SO4-2
>200
Cu+2
>200
>200
SO3-2
>200
Mn+2
>200
Fe+3
Diclone
>10
Cd+2
>200
Morestan
>260
NO2
>10
Zn+2
>200
Bentazona
>1.0 mgl
PO4-3
>200
Hg+2
>200
Warfarina
>2.0 mgl
SiO3
-2
>200
Be+2
>200
Benomil
>4.0 mgl
>200
Mg+2
>200
Carbaril
>120 mgl
>200
Ca+2
>200
o-fenilfenol
>700 mgl
NO3
Cl
Br
Especie
>100
-1
-1
-1
-1
-1
bisfenol A en agua potable, pues los niveles habituales de ClO en este medio son
considerablemente superiores al nivel de tolerancia establecido. Este hecho ser objeto de
estudios posteriores.
En todos los casos la metodologa empleada fue el calibrado por adicin de patrn
y comparacin de ste con el calibrado con patrones y estudios de recuperacin empleando
un volumen de muestra de 250 ml en todos los casos.
% R (BFA)
1:2
2.0
4.0
103.2
1.5
1:4
2.0
8.0
103.6
0.8
1:8
2.0
16.0
97.5
1.3
1:1
4.0
4.0
102.0
0.5
1:2
4.0
8.0
98.0
0.3
1:4
4.0
16.0
97.3
0.9
2:1
8.0
4.0
103.9
1.1
1:1
8.0
8.0
96.1
1.2
1:2
8.0
16.0
100.2
1.4
DSR (%)
concentraciones finales fueron 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 y 8.0 gl . A continuacin se transvasaron
estas disoluciones a embudos de decantacin de 250 ml de capacidad y, tras disolver 75 g
de cloruro sdico, se extrajeron con 2.5 ml de ter etlico agitando mecnicamente a
1700
r.p.m. durante un minuto a temperatura ambiente. A continuacin se registraron los
espectros de excitacin en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 245 y 290
nm fijando como em 305 nm, rendijas de excitacin y emisin 5 nm, velocidad de barrido
240 nm/minuto y temperatura en 10.0 0.5C. Finalmente se calcularon los espectros
derivados de orden 1 con un factor de filtrado de 12 y se midi la seal a de 239 nm.
CP (gL )
n
-1
b (lg )
-1
sb (lg )
a
sa
sRC
2
r (%)
Pozo
Mar
Ro
5
136,2 4.0
1.251
16.3 0.8
0.256
4.25
99,7
5
130.1 2.3
0.725
12.6 2.1
0.658
3.28
99,4
5
136.92.8
0.895
14.1 1.3
0.422
6.25
99,8
Fcal
Ftab
Conclusin
Pozo
1.710
8.73
Ho
Mar
2.87
8.73
Ho
Ro
1.263
8.73
Ho
En todos los casos se concluye por la hiptesis nula; es decir, no existe diferencia
significativa entre las varianzas de ambos calibrados para el nivel de significacin elegido
ya que Fcal<Ftab.
tcal
Pendiente
Ordenada en el origen
ttab
tcal
Conclusin
ttab
Conclusin
Pozo
0.127 2.120
Ho
0.488 2.110
Ho
Mar
1.657 2.120
Ho
0.294 2.110
Ho
Ro
0.165 2.120
Ho
0.252 2.110
Ho
En los tres casos se concluye por la hiptesis nula, es decir, no existen diferencias
significativas entre las pendientes y las ordenadas en el origen de las rectas de calibrado
con patrones y adicin de patrn, ya que en todos los casos se cumple que tcal<ttab para el
nivel de significacin del 5%. Por tanto se puede concluir que las rectas de calibrado con
patrones y adicin de patrn son iguales en todos los casos.
Mar
Ro
% R(BFA)
DSR (%)
93.0
1.2
103.0
0.3
8.0
97.9
0.9
1.0
112.0
1.1
97.7
1.7
8.0
101.1
0.5
1.0
105.0
1.2
101.5
1.5
98.6
0.8
4.0
8.0
4.0
8.0
4.0
8.0
8.0
* Promedio de tres determinaciones.
de
bisfenol
A en
aguas
de
distinta
procedencia
mediante
DE
El paso previo para abordar la resolucin de la mezcla de los tres compuestos, fue
el estudio individual del comportamiento fluorescente y extractante de cada uno de ellos.
En este apartado se recogen los espectros de excitacin y emisin fluorescentes de fenol,
bisfenol A y BADGE en ter etlico y se comparan entre s.
disoluciones de fenol, bisfenol A y BADGE en ter etlico de 2.0 mgl en cada uno de
los compuestos. A continuacin se registraron los espectros de excitacin y emisin en
los rangos 200 a 290 nm y 290 a 350 nm respectivamente, fijando como longitudes de
onda de excitacin 273, 278 y 276 nm y de emisin 302, 305 y 304 nm para fenol,
bisfenol A y BADGE respectivamente. Se emplearon las mismas variables
instrumentales utilizadas a lo largo del apartado III.3, es decir, rendijas de excitacin
199
Excitacin
1000
800
IF
600
400
c
200
IF
0
200215230245260275290
Longitud de onda (nm)
Emisin
1000
800
600
400
200
0
290
a
b
c
305
320
335
Longitud de onda (nm)
350
198
200
de concentracin de los
Tiempo
(segundos)
Fenol
Bisfenol A
BADGE
57.37
50.23
48.70
15
242.87
386.03
195. 53
30
330.68
486.05
259.82
60
359.99
490.28
289.12
90
372.85
486.70
292.89
120
381.64
487.96
310.44
IF
600
400
200
0
0
30
60
90
tiempo (segundos)
120
202
Velocidad
r.p.m.
Fenol
Bisfenol A
BADGE
0
500
700
900
1300
1500
1700
2000
57.03
66.32
73.47
100.78
295.31
359.99
368.41
375.86
50.26
117.53
206.26
388.76
447.83
457.76
460.35
466.30
49.32
58.92
90.48
155.50
215.37
273.46
290. 19
303.98
IF
600
400
200
0
0
400
2000
Fenol
pH
Bisfenol A
pH
BADGE
2.83
381.04
3.10
511.70
2.93
268.66
5.93
379.36
6.21
507.50
6.05
269.01
7.73
375.04
10.38
506.59
7.50
267.03
8.95
370.92
10.74
492.24
8.55
258.16
9.46
345.84
10.93
422.39
9.62
262.80
10.37
228.46
11.15
362.13
10.34
263.45
10.98
136.97
11.46
236.24
10.93
255.89
11.43
110.08
11.80
143.06
11.80
255.77
12.50
100.26
12.53
138.83
12.25
261.38
13.00
99.55
13.01
138.56
13.0
263.25
IF
600
400
200
0
3
11
13
pH
Figura III.4.4. Influencia del pH.
fenol (), bisfenol A (o) y BADGE
().
Se observa que la intensidad de fluorescencia emitida por el BADGE permanece
constante a lo largo de todo el intervalo de pH estudiado. Por su parte fenol y bisfenol A
muestran una seal constante hasta valores de pH prximos a 9 y 10 respectivamente,
mientras que para valores de pH superiores disminuye rpidamente hacindose casi
despreciable. Se puede concluir por tanto que es la forma protonada de estos compuestos
la que se extrae en ter etlico y muestra seal fluorescente, no hacindolo la forma
disociada.
+
En el caso del diglicidil ter la ausencia de H disociables hace que el pH del medio no
afecte al proceso de extraccin. El amplio intervalo de pH en el que permanece constante
la intensidad de fluorescencia emitida por los tres compuestos determina que no sea
necesario fijar el pH del medio.
Dado que una de las premisas establecidas para la aplicacin de este tipo de
calibracin es la existencia de linealidad entre las variables estudiadas, antes de abordar la
resolucin de la mezcla se establecieron, en primer lugar, los rangos en los que existe
relacin lineal entre la variable dependiente, intensidad de fluorescencia, y la variable
independiente, concentracin de cada compuesto, de forma individual para cada uno de los
componentes de la mezcla.
mgl de cada uno de los tres compuestos con objeto de obtener concentraciones finales
-1
-1
-1
comprendidas en los rangos 1.0 a 32.0 gl , 1.0 a 20.0 gl y 1.0 a 60.0 gl para fenol,
bisfenol A y BADGE respectivamente. A continuacin se transvasaron a embudos de
decantacin de 100 ml de capacidad y se extrajeron siguiendo el procedimiento operatorio
descrito con anterioridad. Finalmente se registraron los espectros de excitacin y emisin
correspondientes fijando las condiciones instrumentales empleadas a lo largo de este
apartado. Se realizaron tres rplicas experimentales de cada concentracin y se midieron
adems los blancos correspondientes.
1000
800
IF
600
400
200
0
0
10
20
3040
[bisfenol A] (gl-1)
50
60
n
-1
Rango lineal (gl )
a
sa
-1
b (lg )
-1
sb (lg )
2
r (%)
sRC
Plof (%)
Fenol
Bisfenol A
BADGE
21
1.0 32.0
0.310.84
0.403
26.080.49
0.234
99.85
11.01
17.22
21
1.0 20.0
-2.710.44
0.212
39.690.86
0.412
99.79
12.74
11.22
21
1.0 - 60.0
0.140.29
0.426
14.530.26
0.125
99.86
11.45
19.25
Patrn
29
[Compuesto] (gl )
Fenol Bisfenol A BADGE
-1
Patrn
[Compuesto] (gl )
Fenol
Bisfenol A BADGE
11
12
12
30
13
13
15
25
14
16
16
15
10
16
20
20
17
10
22
18
10
14
10
15
19
11
10
10
18
20
---
---
---
User Guide PLSplus for GRAMS/386, Galactic Industries, Salem, NH, (1993).
[BADGE]
(gl-1)
[BFA]
(gl-1)
[Fenol]
(gl-1)
excitacin en el rango del espectro comprendido entre 245 y 290, que contiene 91
puntos experimentales, ambos algoritmos dieron resultados adecuados.
Una vez seleccionados los espectros de excitacin y con objeto de mejorar los
parmetros estadsticos del modelo, se ensayaron distintos algoritmos para
el
tratamiento previo de los datos espectrales: datos sin tratar, datos centrados respecto de
la media y datos autoescalados y centrados respecto de la media. Los datos as tratados
se emplearon para establecer modelos de calibracin haciendo uso de PLS-1 y PLS-2
con objeto de comparar los valores de los parmetros estadsticos obtenidos en cada
caso y relacionados con la calidad en el ajuste del modelo.
Parmetro
(1)
(2)
(3)
Factores
RMSD
2
r (%)
Factores
RMSD
2
r (%)
Factores
RMSD
2
r (%)
PLS-1
PLS-2
BFA
Fenol
BADGE
BFA
Fenol
BADGE
4
0.337
0.995
5
0.216
0.998
5
0.192
0.998
5
0.415
0.995
3
0.328
0.997
7
0.363
0.996
3
2.599
0.952
6
0.417
0.998
4
0.526
0.997
4
0.344
0.995
8
0.223
0.998
5
0.232
0.998
4
0.336
0.997
8
0.395
0.995
5
0.425
0.995
4
1.194
0.986
8
0.419
0.998
5
0.479
0.998
* Pretratamiento de datos: (1) Datos sin tratar, (2) Datos centrados con respecto de la media y (3)
Datos autoescalados y centrados respecto de la media.
210
en ambos algoritmos, los valores tanto de RMSD como r , fueron muy desfavorables para
el BADGE. Seleccionamos por tanto a la vista de los resultados, los modelos establecidos
mediante los algoritmos PLS-1 y PLS-2 haciendo uso de datos centrados respecto de la
media en ambos casos, para evaluar la capacidad predictiva de los mismos.
4.3.4. Prediccin.
*
*
C0-1
Cf-1
(gl ) (gl )
**
R
(%)
Bisfenol A
BADGE
*
*
C0-1
Cf-1 **R
(gl ) (gl ) (%)
*
*
C0-1
Cf-1 **R
(gl ) (gl ) (%)
7.00
7.46
102.0
4.00
4.08
102.0
25.00
23.96
95.8
5.0
5.15
103.0
3.0
2.94
98.0
17.00
15.75
92.6
6.0
6.92
115.3
6.0
6.44
107.3
10.00
9.86
98.6
8.0
8.90
111.3
10.0
11.15
111.5
7.00
6.34
90.8
12.00
11.00
91.7
8.0
7.21
90.1
4.00
3.56
89.0
10.00
11.13
111.3
5.0
4.92
98.4
15.00
16.40
109.3
18.00
18.47
102.6
4.0
4.25
106.3
4.00
4.20
105.0
4.00
3.85
96.0
7.0
6.89
98.4
9.00
8.89
98.8
3.00
2.64
88.0
10.0
10.24
102.4
14.00
13.62
97.3
10
5.00
4.76
95.2
5.00
4.78
95.6
5.00
5.39
107.8
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
12.00
5.00
0.00
0.00
12.00
15.00
0.00
0.00
6.00
18.00
0.00
0.00
10.99
4.39
0.14
0.11
11.90
15.99
0.06
0.16
5.84
16.52
0.09
0.03
91.6
87.8
----99.2
106.6
----97.3
91.8
-----
7.00
12.00
5.00
10.00
0.00
0.00
4.00
12.00
0.00
0.00
0.00
0.00
6.70 95.7
11.67 97.3
4.59
91.8
9.19
91.9
0.37
--0.52
--4.06 101.5
12.02 100.0
0.04
--0.08
--0.23
--0.03
---
0.00
0.00
12.00
6.00
14.00
8.00
0.00
0.00
0.00
0.00
9.00
20.00
0.10
0.08
11.47
5.55
14.12
8.07
1.40
1.36
1.72
1.39
8.80
19.01
----95.6
92.5
100.9
100.9
--------97.8
95.5
**
212
*
C0-1
Cf-1
(gl ) (gl )
Bisfenol A
**
R
(%)
*
C0-1
Cf-1 **R
(gl ) (gl ) (%)
*
C0-1
Cf-1 **R
(gl ) (gl ) (%)
7.00
6.46
92.3
4.00
4.07
101.8
25.00
23.79
95.2
5.0
4.85
97.0
3.0
2.92
97.3
17.00
15.70
92.4
6.0
7.01
116.8
6.0
6.42
107.0
10.00
9.80
98.0
8.0
8.75
109.4
10.0
11.4
114.0
7.00
6.20
111.4
12.00
10.95
91.3
8.0
7.21
90.1
4.00
3.59
89.8
10.00
11.20
112.0
5.0
4.90
98.0
15.00
16.36
109.1
18.00
18.00
0.00
4.0
4.30
107.5
4.00
4.15
103.8
4.00
3.85
96.3
7.0
6.90
98.6
9.00
8.89
98.8
3.00
2.64
88.0
10.0
10.24
102.4
14.00
13.62
97.3
10
5.00
4.44
88.8
5.00
4.79
95.8
5.00
5.40
108.0
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
12.00
5.00
0.00
0.00
12.00
15.00
0.00
0.00
6.00
18.00
0.00
0.00
10.36
4.15
0.34
0.23
11.80
15.04
0.02
0.45
5.63
16.73
0.042
0.020
86.3
83.0
----98.3
100.3
----93.8
92.9
-----
7.00
12.00
5.00
10.00
0.00
0.00
4.00
12.00
0.00
0.00
0.00
0.00
6.70 95.7
11.66 97.2
4.57
91.4
9.10
91.0
0.37
--0.53
--4.10 102.5
12.00 100.0
0.04
--0.09
--0.24
--0.34
---
0.00
0.00
12.00
6.00
14.00
8.00
0.00
0.00
0.00
0.00
9.00
20.00
0.12
0.07
11.35
5.55
14.09
8.06
1.36
1.34
1.71
1.38
8.79
18.96
----94.6
62.5
100.6
100.8
--------97.7
94.8
**
BADGE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Fenol
*
C0-1
(gl )
7.00
5.00
12.00
6.00
8.00
10.00
12.00
0.00
14.00
0.00
6.00
0.00
Cf-1
(gl )
7.25
4.87
11.55
6.53
8.36
10.31
12.02
-0.40
14.72
0.27
6.83
0.04
Bisfenol A
**
*
*
R
C0-1
Cf-1
(%) (gl ) (gl )
103.5 4.00
2.82
97.4
3.00
2.41
96.3
8.00
7.45
108.8 6.00
6.38
104.5 10.00
9.70
103.1 5.00
4.84
100.2 7.00
6.82
--5.00
4.97
105.1 0.00
-0.32
--4.00
4.12
113.8 0.00
-0.07
--0.00
-0.07
BADGE
**
*
R
C0-1
(%) (gl )
70.5 25.00
80.3 17.00
93.1
4.00
106.3 10.00
97.0
7.00
96.8 15.00
97.4
0.00
99.4 12.00
--12.00
103.0 0.00
--0.00
--9.00
Cf-1
(gl )
25.31
18.42
3.50
10.23
5.75
15.85
0.34
12.23
12.28
-0.03
1.44
9.06
**
R
(%)
101.2
108.3
87.5
102.3
82.1
105.6
--101.9
102.3
----100.7
**
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Fenol
*
*
C0-1
Cf-1
(gl ) (gl )
4.00
3.85
3.00
2.69
8.00
7.42
6.00
6.59
10.00
9.92
5.00
4.63
7.00
7.04
5.00
5.28
0.00
-0.41
4.00
3.69
0.00
0.03
0.00
0.27
Bisfenol A
**
*
*
R
C0-1
Cf-1
(gl
)
(gl
)
(%)
96.3
7.00
6.73
89.7
5.00
5.34
92.7 12.00 11.45
109.8 6.00
6.70
99.2
8.00
8.08
92.6 10.00
9.87
100.6 12.00 12.47
105.6 0.00
0.19
--14.00 14.47
92.3
0.00
0.05
--6.00
5.99
--0.00
0.35
**
BADGE
**
*
R
C0-1
(gl
)
(%)
96.1 25.00
106.8 17.00
95.4
4.00
111.7 10.00
101.0 7.00
98.7 15.00
103.9 0.00
--12.00
104.1 12.00
--0.00
99.8
0.00
--9.00
Cf-1
(gl )
24.12
16.98
4.19
9.85
6.24
14.85
-0.17
11.16
11.28
0.16
0.13
9.30
**
R
(%)
96.5
99.9
104.8
98.5
89.1
99.0
--93.0
94.0
----103.3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Fenol
*
C0-1
(gl )
7.00
5.00
12.00
6.00
8.00
10.00
12.00
0.00
14.00
0.00
6.00
0.00
Cf-1
(gl )
7.87
4.85
11.72
6.07
8.09
9.34
12.95
-0.25
14.37
0.15
6.23
0.06
Bisfenol A
**
*
*
R
C0-1
Cf-1
(%) (gl ) (gl )
112.2 4.00
4.35
97.0
3.00
2.93
97.7
8.00
7.81
101.2 6.00
6.35
101.1 10.00
9.17
93.4
5.00
4.56
107.9 7.00
7.36
--5.00
4.75
102.6 0.00
0.09
--4.00
3.82
103.8 0.00
-0.08
--0.00
0.01
BADGE
**
*
R
C0-1
(%) (gl )
108.8 25.00
97.7 17.00
97.6
4.00
105.8 10.00
91.7
7.00
91.2 15.00
105.1 0.00
95.0 12.00
--12.00
95.5
0.00
--0.00
--9.00
Cf-1
(gl )
25.44
17.41
4.49
10.51
7.48
15.86
0.16
12.08
11.76
0.13
0.04
9.75
**
R
(%)
101.8
102.4
105.2
105.1
106.8
105.7
--100.7
98.0
----108.3
**
CAPTULO IV
APLICACIONES
DE
LA
CROMATOGRAFA
DE
MASAS
AL
ANLISIS
DE
COMPUESTOS RELACIONADOS
BISFENOL
219
1. INTRODUCCIN.
cromatografa lquida
de alta resolucin
del Olmo M., Gonzlez A., Navas N. and Vlchez J.L. Analytica Chimica Acta, 346, 87, (1997).
Gonzlez A., Navas N., del Olmo M. and Vlchez J.L. Journal of Chromatographic Science, 36, 565
(1998).
en
Flujo de purga del sptum. El sptum est fabricado con materiales muy
estables, pero no son totalmente inertes al proceso que ocurre en el bloque de inyeccin,
se debe por tanto proteger de la accin de la muestra volatilizada. Para ello se emplea
una fraccin de gas portador que circula continuamente en paralelo al sptum y que
impide que la muestra volatilizada llegue a contactar con ste produciendo algn
producto derivado que pueda ocasionar la aparicin de picos fantasma. Este flujo, que
depende exclusivamente de la presin en cabeza de columna, se fij en 3 ml/min para la
realizacin de todas las experiencias.
)
Flujo total de gas portador. Este es el flujo de gas portador que entra en el
221
)
Tiempo de purga. Es el tiempo que transcurre desde que se inyecta la
muestra
hasta que se purga el disolvente; es decir, el tiempo que se deja para que la muestra
vaporizada se preconcentre en la cabeza de la columna. Transcurrido ese tiempo, se
purga el vapor de disolvente y muestra contenida en el linear, desviando gran parte del
flujo de gas portador al deshecho junto con los restos de muestra vaporizada, mientras
que una pequea parte del gas portador pasa a la columna arrastrando la mayor parte de
la muestra que se encontraba preconcentrada en la cabeza de sta. En esta Memoria, se
ha empleado un tiempo de purga de 2 minutos.
)
)
Velocidad lineal y flujo volumtrico de gas portador. El flujo de gas
portador
utilizado en el cromatgrafo de gases acoplado a un detector de masas debe ser pequeo,
-6
ya que las condiciones de vaco extremo que requiere el detector (del orden de 10 Torr)
no son compatibles con un caudal elevado de gas portador. La velocidad lineal y el flujo
de gas a travs de la columna cromatogrfica dependen del flujo total, del flujo de purga
del
Introduccin
3
222
Por ltimo, la temperatura final del horno debe ser lo suficientemente elevada
para poder volatilizar y eluir al componente menos voltil de la muestra dentro de un
tiempo de anlisis no muy elevado. En esta Memoria se han empleado dos temperaturas
diferentes, 270 C y 300C.
Programacin II
Tinicial
150 C
Tinicial
150 C
Rampa
30 C/min
1 Rampa
30 C/min
Tfinal
Tfinal
---
---
2 Rampa
5 C/min
---
---
Tfinal
223
llamadas de entrada directa, ya que todo aquello que sale de la columna cromatogrfica
entra en el detector. En esta Memoria la temperatura de la interfase se ha mantenido en
aproximadamente 280 C.
M )
0.07P
1
(1)
m/z
donde
dentro del
rango de masa/carga
estudiado. Este nmero es mayor cuanto menor sea el valor prefijado como
umbral de deteccin.
Rango masa/carga del espectro de masas. Este parmetro viene dado por
valores superior e inferior del espectro de masas de trabajo. El rango a estudiar debe ser
seleccionado para hacerlo coincidir con la zona que genera mayor informacin analtica
sin ampliarlo innecesariamente ya que aumentara el tiempo de barrido y bajara la
calidad de la seal analtica. El lmite inferior a ser posible debe evitar las masas 18, 28,
32 y 34 correspondientes a H2O, N2, O2 y CO2, respectivamente, ya que la presencia de
trazas de humedad o de aire, producira un ruido de fondo en el cromatograma que
afectara a la reproducibilidad del mismo. Se seleccion para nuestro estudio un valor
mnimo de 50 m/z salvo en el caso de la aplicacin en salivas, donde se seleccion 40
como valor mnimo debido a la fragmentacin de los compuestos estudiados. El rango
superior fue seleccionado en cada caso en funcin de los pesos moleculares de los
compuestos estudiados.
)
Nmero de medidas de cada ion. Es el nmero de veces que el detector
mide la
abundancia de una masa particular con objeto de tener un valor medio ms exacto de las
N
Iones seleccionados para el anlisis. Se deben tener en cuenta dos factores: Por
una parte, se seleccionarn los fragmentos del compuesto que tengan una abundancia
relativa mayor, y en segundo lugar, si alguno de estos fragmentos seleccionados fuera
comn a un posible interferente, descartaramos el fragmento comn analito-interferente.
tiempo que se mide un ion antes de pasar al siguiente. Es aconsejable usar un tiempo de
100 ms para medidas de dos o tres iones, debindose disminuir ste al aumentar el nmero
de iones. En esta Memoria se ha utilizado un tiempo de 100 ms como tiempo de medida
para cada ion.
De la bibliografa consultada
4,5
muy fuerte con el tomo de silicio . Los primeros reactivos de silanizacin empleados
fueron el trimetilclorosilano y el hexametildisilizano y, aunque an se siguen utilizando,
en los ltimos aos se han desarrollado un gran nmero de nuevos reactivos.
McKallum N.K. and Armstrom R.J. Journal of Chromatography A, 78, 303 (1973).
Abreviatura
Estructura
Hexametildisilizano
HMDS
(CH3)3Si-NH-(CH3)3
Timetilclorosilano
TMCS
(CH3)3Si-Cl
N-metil-Ntrimetilsililacetamida
MSA
(CH3)3CO-N(CH3)-Si(CH3)3
N-trimetilsilil
dietilamina
TMSDEA
(CH3)3Si-NH-(C2H5)2
N-trimetilsilil
dimetilamina
TMSDMA
(CH3)3Si-NH-(CH3)2
N-metil-N-trimetilsilil
trifluoroacetamida
MSTFA
(CF3)CO- N(CH3)-Si(CH3)3
N,O-Bis(trimetilsilil)
acetamida
BSA
(CH3)-C-OSi(CH3)3=N-Si(CH3)3
N,O-Bis(trimetilsilil)
trifluoroacetamida
BSTFA
(CF3)-C-OSi(CH3)3=N-Si(CH3)3
N-trimetilsilil
imidazol
TMSI
(CH3)3-Si-Imidazol
La reaccin general que tiene lugar en el caso de compuestos con grupos OH,
como el bisfenol A y el bisfenol F, es la que se muestra en la siguiente ecuacin.
Compuesto-OH + R3Si-X
Compuesto-O-Si-R3 + HX
Introduccin
230
Hidroxil alcohol > OH fenlico > carboxilo > amina > amida
Por regla general, el empleo de este tipo de reacciones produce una mejora en las
caractersticas cromatogrficas de los derivados originados, ya que presentan una mayor
volatilidad, polaridad y estabilidad trmica, lo que hace ms fcil su determinacin
mediante cromatografa de gases.
2.
232
Gonzlez-Casado A., Navas N., del Olmo M. and Vlchez J.L. Journal of Chromatographic Science, 36
565 (1998).
-1
MS
Valor
100 ml/min
3 ml/min
Variable
Temperatura
Interfase GC-MS
Rango m/z del
espectro de masas
Valor
280C
45-510 m/z
10 psi
Modo
SCAN
200 C
1750-2100 eV
150 C
Dwell
100 ms
30C/min, 270C
(7 min)
---
---
2 l
---
---
Seal (%)
100
80
60
Patrn
Interno
1
Bisfenol A
40
20
4
0
4.05.06.07.08.09.0 10.0 11.0 12.0
13.0
tr (min)
Figura IV.2.1. Cromatograma en modo SCAN de los productos de reaccin.
En el cromatograma aparecen seis picos bien resueltos a tiempos de retencin
5.40 min (patrn interno) y 7.04, 7.72, 8.49, 9.52 y 10.78 minutos correspondientes al
bisfenol A y a cuatro nuevos compuestos, resultantes de la reaccin de ste con el cloro
libre presente en el agua.
Abundancia
Relativa (%)
100
357
73
75
50
358
25
372
0
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Abundancia
Relativa (%)
100
73
391
75
50
393
25
406
408
400500
100
200
300
Masa/Carga
Abundancia
Relativa (%)
100
73
425
75
427
50
25
0
440
442
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Abundancia
Relativa (%)
100
73
459 461
75
50
463
25
0
476
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Abundancia
Relativa (%)
100
73
75
495
50
493
25
0
497
508
100
200
300
400
Masa/Carga
500
tr (min)
ti (min)
Fragmento (m/z)
Patrn interno
5.40
4.00
176, 178
Bisfenol A
7.16
6.90
357, 372
Cl-Bisfenol A
7.92
7.50
391, 406
Cl2-Bisfenol A
8.65
8.00
425, 440
Cl3-Bisfenol A
9.73
9.00
459, 474
Cl4-Bisfenol A
10.82
10.00
493, 508
241
a las que se
-1
pH
BFA
11.52
11.27
10.62
4.827
2.350
1.421
1.018
0.000
3.01
4.69
5.50
6.52
7.50
8.40
10.00
12.00
BFA-Cl
0.182
0.192
0.579
1. 489
1.398
0.914
0.087
0.000
BFA-Cl2
0.002
0.028
0.087
0.321
0.900
1.600
0.131
0.000
BFA-Cl3
0.001
0.005
0.012
0.019
0.102
0.173
0.035
0.000
BFA-Cl4
0.013
0.015
0.017
0.025
0.075
0.103
0.009
0.000
Apico /Apatrn
12
10
8
6
4
2
0
pH
11
13
Apico /
2,000
1,500
1,000
Figura IV.2.7. Evolucin de la reaccin con el pH para
bisfenol A (o), BFA-Cl (), BFA-Cl2 (), BFA-Cl3 (x), y BFA-Cl4 (+).
0,500
0,000
3
pH
11
13
242
rango 100 a 2000 gl . Se fij pH=8 mediante adicin de NaOH y se dej reaccionar
durante tiempos crecientes, comprendidos en el intervalo 0 a 120 minutos.
Transcurridos los correspondientes tiempos de reaccin se extrajo cada disolucin
con
[Cl2]
-1
(mgl )
treaccin
(min)
Bisfenol A
BFA-Cl
BFA-Cl2
BFA-Cl3
BFA-Cl4
0.00
0.00
5
10
20
40
60
90
120
5
10
20
40
60
90
120
5
10
20
40
60
90
120
5
10
20
40
60
90
120
5
10
20
40
60
90
120
11.610
11.452
10.581
9.9200
9.8510
9.6200
9.6150
9.6010
9.9900
8.5010
7.7620
6.6270
4.4960
2.6150
3.0020
1.5440
0.3810
0.1790
0.0230
0.0140
0.0120
0.0110
0. 1960
0.0200
0.0160
0.0140
0.0010
0.0000
0.0000
0.0450
0.0150
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
--0.1960
0.2270
0.1790
0.2510
0.2280
0.2150
0.2130
0.9630
0.9700
0.9740
1.0120
0.8540
0.8350
0.8110
1.1980
0.5980
0.2650
0.0080
0.0060
0.0040
0.0030
0.2130
0.0087
0.0049
0.0034
0.0001
0.0000
0.0000
0.0353
0.0036
0.0001
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
--0.0090
0.0120
0.0130
0.0190
0.0240
0.0980
0.0080
0.0750
0.1000
0.1200
0.1730
0.2360
0.2400
0.2340
0.9730
0.7840
0.4490
0.0090
0.0070
0.0050
0.0030
0.5810
0.0157
0.0046
0.0036
0.0001
0.0000
0.0000
0.0280
0.0030
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
--0.0003
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
0.0006
0.0004
0.0001
0.0004
0.0004
0.0004
0.0004
0.0005
0.0005
0.0010
0.0013
0.0014
0.0012
0.0008
0.0006
0.0004
0.0017
0.0011
0.0007
0. 0006
0.0001
0.0000
0.0000
0.0010
0.0030
0.0010
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
--0.0001
0.0001
0.0002
0.0008
0.0012
0.0085
0.0023
0.0002
0.0003
0.0005
0.0008
0.0017
0.0019
0.0021
0.0560
0.0598
0.0972
0.0025
0.0009
0.0006
0.0004
0.0154
0.0141
0.0010
0.0003
0.0001
0.0000
0.0000
0.0015
0.0043
0.0001
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.10
0.25
0.50
1.00
2.00
t (min)
t (min)
120
120
(I)
(II)
40
40
00
t (min)
80
t (min)
80
120
00
120
(IV)
(III)
80
80
40
40
00
00
Se emple una placa de slice como fase estacionaria, y como fase mvil
disolventes orgnicos de polaridad variada: ter etlico, acetato de etilo, y mezclas en
distintas proporciones de diclorometano (DCM) y hexano (HEX). Los resultados
obtenidos se muestran en la figura IV.2.9.
Eter etlico
Acetato de etilo
3 DCM
1 HEX
6 DCM
1 HEX
10 DCM
1 HEX
DCM
BFA-Cl4BFA-Cl3BFA-Cl2BFA-ClBFA
-1
de
Abundancia
Relativa (%)
100
Seal
(%) 100
247
tR=7.29 min
80
Monoclorobisfenol A
60
40
75
50
249
262
20
0
4.0
6.08.010.012.0
Tiem po (min)
25
264
0
100
200
300
400
Masa/Carga
500
In
Cl
247
100 %
[C14H12O2Cl]
OH
+
OH
CH3
262
34 %
[C15H15O2Cl]
CH3
OH
C
CH3
Cl
+
OH
251
Seal
(%)tR=7.44 min 100
Abundancia
Relativa (%)
100
281
80
60
Diclorobisfenol A
40
75
20
50
283
296
0
4.06.08.010.012.0
Tiempo (min)
25
298
0
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Ion
Cl
281
100 %
[C14H11O2Cl2]
OH
CH3
CH3
296
31 %
2 +
[C15H14O2Cl ]
OH
C
Cl
OH
C
Cl
CH3
Cl
+
OH
Seal
(%) 100
Abundancia
Relativa (%)
100
80
315
75
tR=8.32 min
40
20
0
4.06.08.010.012.0
Tiempo (min)
50
330
332
25
0
Triclorobisfenol A
60
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Ion
Cl
315
98%
[C14H10O2Cl3]
OH
C
Cl
23 %
[C14H10O2Cl3]
OH
OH
CH3
CH3
330
Cl Cl
CH3
+
OH
C
Cl
Cl
252
Abundancia
Relativa (%)
100 Seal
351
(%) 100
75
Tetraclorobisfenol A
80
349
60
tR=9.49 min
50
40
20
364
366
0
4.06.08.010.012.0
25Tiempo (min)
0
100
200
300
400
Masa/Carga
500
Ion
Cl
351
366
100 %
26 %
[C14H9O2Cl4]
[C14H9O2Cl4]
OH
Cl
C
OH
Cl
CH3
Cl
Cl
CH3
Cl
OH
Cl
+
OH
C
CH3
Cl
37
(a + b)
(1)
donde a es la abundancia del istopo ms ligero y b la del ms pesado que en el caso del
cloro valen aproximadamente 3 y 1 respectivamente, y n vara en este caso entre 1 y 4.
Cl
Cl2
Cl3
Cl4
27
81
M+2
27
108
54
12
M+4
M+6
M + 12
nd
Los resultados experimentales obtenidos para los cuatro derivados clorados del
bisfenol A son los mostrados en la tabla IV.2.11.
BFA
BFA-Cl
BFA-Cl2
BFA-Cl3
BFA-Cl4
---
3.00
9.00
27.00
80.80
1.00
6.02
26.70
108.00
1.07
8.87
53.20
0.95
11.00
M+2
M+4
M+6
M + 12
0.98
OH
1
6
CH3
4C
4'
CH3
3'2'
1'
5'
OH
6'
Monoclorobisfenol A
2 = Cl
Diclorobisfenol A Triclorobisfenol A2, 2 = Cl
Tetraclorobisfenol A
2, 2, 6 = Cl
2, 2, 6, 6 = Cl
13
Multiplicidad
J (Hz)
Hidrgeno
identificado
1.58
4.70
5.40
6.72
6.89
7.00
7.07
7.17
Singlete
Singlete
Singlete
Multiplete
Doblete
Doble doblete
Multiplete
Doblete
--------9
2.3 y 9
--2.3
- CH3
- OH
- OH
H2 y H6
1.58
5.30
5.45
6.90
6.98
7.15
Singlete
Singlete
Singlete
Doblete
Doble doblete
Doblete
------9
9 y 2,3
2.3
(3)
1.58
5.30
5.45
6.92
6.98
7.07
7.13
Singlete
--Singlete
--Singlete
--Doblete
9
Doble doblete 2.2 y 9.0
Doblete
2.2
Doblete
2.2
(4)
1.58
5.75
7.10
(1)
(2)
Singlete
Singlete
Singlete
-------
H6,
H5,
H3 y H5
H3,
- CH3
- OH
- OH
,
H6 y H6
,
H5 y H5
,
H3 y H3
- CH3
- OH
- OH
H6,
H5,
H3 y H5
H3,
- CH3
- OH
,
,
H3 H H y H
3
13
(1)
(2)
(3)
(4)
Desplazamiento
qumico (ppm)
Carbono
Identificado
Desplazamiento
qumico (ppm)
Carbono
Identificado
31.01
-CH3
128.00
C3 y C5
41.70
C-gemdimetil
142.60
C4
115.0
C2 y C6
144.60
115.70
C4,
149.10
119.30
C6,,
C2
127.10
C3 y C5
C1,
C1
153.50
---
--,
C3,C3
30.90
-CH3
127.10
42.00
C-gemdimetil
143.70
,C5 y C5
,
C4 y C4
115.70
C6 y C6
149.30
C1 y C1
119.50
C2 y C2
---
---
30.75
-CH3
126.70
C3 y C5
42.10
C-gemdimetil
127.00
C3 y C5
116.00
C6
142.90
C4 y C4
119.60
C2
145.70
C1
120.70
C2 y C6
149.60
C1
30.60
-CH3
126.60
C3,C3 ,C5 y C5
42.10
C-gemdimetil
143.10
C4 y C4
120.70
C2,C2 ,C6 y C6
146.10
C1 y C1
,
,
,
,
,
,
13
C muestra una
13
en
qumico 7.10 ppm y el espectro de C-RMN presenta por su parte cuatro series de
carbonos aromticos, correspondientes a los cuatro carbonos unidos a los tomos
de cloro a desplazamiento 120.0 ppm, dos carbonos unidos a grupos hidroxilo a
146.10 ppm, dos carbonos con enlace C-C a desplazamiento 143.10 y finalmente a
cuatro carbonos ms asociados a enlaces C-H.
10
de la tcnica propuesta
por
11
celulares
Villalobos M., Brotons J.A., Olea M.F., Ruz de Almodvar J.M. and Pedraza V. Environmental Health
Perspectives, 103, 844 (1995).
11
Soto A., Lin T.M., Justicia H., Silvia R.M. and Sonnenschein C., Ed. T. Colborn and C. Clement, pag
295 (1992).
quedaron expuestos durante las 144 horas que dura el ensayo a idntico medio, pero
conteniendo adems estradiol-17 (10 nM - 1 pM), como control de proliferacin
positiva, o cualquiera de las sustancias a ensayar (10 M - 1 nM). Transcurrido este
tiempo se detuvo el ensayo, eliminando el medio de cultivo, fijando las clulas y
tiindolas con sulforhodamina B (SRB) al 0.4 % (peso/volumen) durante 10 minutos.
A continuacin las clulas fueron tratadas en fro con tricloroactico al 10 %, incubadas
a 4 C durante 30 minutos, lavadas cinco veces con agua desionizada. Finalmente tras
preparar los grupos celulares se cuantific el nmero de clulas existentes y se calcul
el valor relativo de crecimiento frente al grupo Control y al estradiol-17.
Compuesto
(2)
100
(EP 1) Estradiol
Cmin
PPR (%)
EP
EPR (%)
Estradiol
50 pM
100
5.91.0
100
Bisfenol A
1 M
0.005
5.00.5
82
Cl-bisfenol A
10 M
0.0005
4.50.4
71
Cl2-bisfenol A
10 M
0.0005
4.50.5
71
Cl3-bisfenol A
10 M
0.0005
3.90.4
59
Cl4-bisfenol A
10 M
0.0005
2.00.3
25
Crecimiento relativo
261
6
5
4
3
2
1
0
10-12
10-8
10-4
Concentracin (M)
3. DETERMINACIN
DE
BISFENOL
F,
BISFENOL
SUS
-1
-1
de antraceno
deuterado,
el
262
MS
Valor
100 ml/min
3 ml/min
Variable
Temperatura
Interfase GC-MS
Rango m/z del
espectro de masas
Valor
280C
45-510
10 psi
Modo
SCAN
200 C
1750-2100
150 C
Dwell
100
30C/min, 270C
(7 min)
2 l
Seal (%)
100
BFDGE
(II)
BADGE
80
Patrn
Interno
60
Bisfenol F BFDGE
(I)
Bisfenol A
BFDGE
(III)
40
20
0
4.05.06.07.08.09.010.0 11.0 12.0 13.0
tr (min)
Figura IV.3.1. Cromatograma en modo Scan.
12
8.30, 9.10 y 10.13 minutos para los tres ismeros del BFDGE y 11.12 minutos para el
BADGE.
utilizado como patrn interno, los fragmentos seleccionados para el establecimiento del
modo SIM, fueron los de relacin carga/masa 176 y 178, correspondientes al pico
molecular y a la prdida de dos H respectivamente.
)
7
12
Simal J., Paz S., Paseiro P. and Simal Lozano J. Journal of Chromatographic Science, 31, 450 (1993).
Abundancia
Relativa (%)
100
200
75
50
25
199
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
relativa
Ion
+
199
17 %
[C13H11O2]
OH
CH
OH
+
200
100 %
[C13H12O2]
OH
CH2
OH
Abundancia
Relativa (%)
100
213
75
50
25
228
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
relativa
Ion
+
213
100 %
[C14H8O2]
OH
C
OH CH3
228
24 %
[C15H16O2]
CH3
OH
C
CH3
OH
Abundancia
Relativa (%)
100
181
75
50
25
163
57
0
100
312
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
Relativa (%)
100
312
75
181
50
57
163
25
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
Relativa (%)
100
312
75
50
25
57
163
100
181
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
relativa (%)
I
163
181
312
16
100
10
II
27
62
Ion
III
16
14
100 100
[C10H11O2]
[C10H13O3]
[C19H20O4]
H +
C
H
O
H2C CH CH2O
OHOH
H2C CH CH2O
O
H2C CH CH2O
C
H
H
C
H
O
OCH2CH CH2
Abundancia
Relativa (%)
100
325
75
50
340
25
57
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
325
340
A*
100 %
23 %
Ion
[C20H21O4]
[C21H24O4]
O
H2C CH CH2O
O
H2C CH CH2O
C
CH3
CH3
C
CH3
O
OCH2CH CH2
+
O
OCH2CH CH2
El espectro de masas del bisfenol F obtenido en modo Scan presenta una lnea
caracterstica, correspondiente al pico molecular con una relacin carga/masa de 200, y
otra de menor abundancia con 199 m/z que corresponde a la prdida de un hidrgeno
(M-1). Por otra parte el bisfenol A muestra dos fragmentos caractersticos a 213
correspondiente a lA prdida de un grupo metilo, seleccionado como pico base (M-15),
y 228 m/z correspondiente al pico molecular. As mismo el BFDGE presenta tres
fragmentos caractersticos con m/z 163 y 181 y 312 correspondiente al pico molecular,
siendo las abundancias relativas de cada una de estos dos fragmentos diferentes para
cada uno de los tres ismeros posicionales correspondientes. Finalmente, el espectro de
masas del BADGE muestra un fragmento de mayor abundancia, pico base, a 325 m/z
correspondiente a la prdida del grupo metilo, mientras que aparece otro fragmento de
menor abundancia a 340 m/z correspondiente al pico molecular.
tr (min)
Fragmento (m/z)
Antraceno
5.20
176, 178
BFF
6.59
199, 200
BFA
6.70
213, 228
8.30
BFDGE
9.10
10.13
BADGE
11.12
325, 340
270
acetamida
(TMSA),
N-trimetilsilil
imidazol
(TMSI),
N,O-
-1
Bisfenol F
Bisfenol A
BFDGE
1.0
1.6
2.9
3.1
3.4
0.0
1.0
1.4
2.7
2.6
2.7
0.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
BADGE
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
*Cociente entre la seal obtenida con cada reactivo y la obtenida con TMCS.
TMCS
SIL A
TMSI
TMSTFA
TMSA
No silanizado
-1
272
Bisfenol F-Sil
Bisfenol A-Sil
0.0
0.001
0.003
15.0
0.025
0.102
30.0
0.092
0.215
45.0
0.135
0.365
60.0
0.195
0.486
90.0
0.209
0.478
120.0
0.201
0.489
Apico /Apatrn
0,6
0,4
0,2
0
0
30
60
90
tiempo (segundos)
120
273
Seal (%)
100
80 Patrn
Interno
BFDGE
(II)
BADGE
Bisfenol A-Sil
Bisfenol F
60Sil
BFDGE
40(I)
BFDGE
20(III)
0
4.05.06.07.08.09.010.0 11.0 12.0 13.0
tr (min)
Figura IV.3.9. Cromatograma en modo Scan.
Aparecen siete picos cromatogrficos con tiempos de retencin 5.20 minutos para
el patrn interno, 6.59 minutos para el bisfenol F-silanizado, 7.02 minutos para el
bisfenol A-silanizado, 8.30, 9.10 y 10.13 minutos para los tres ismeros del BFDGE y
11.12 minutos para el BADGE. Si se compara el cromatograma de los compuestos
silanizados (figura IV.3.9) con el obtenido en ausencia de derivatizacin (figura IV.3.1),
se observa que se ha producido un incremento notable tanto en la sensibilidad de los
picos cromatogrficos obtenidos para bisfenol F y bisfenol A, como en la resolucin de
los mismos, ya que el pico correspondiente a bisfenol A silanizado se retrasa 0.32
minutos, mientras que el bisfenol F silanizado aparece prcticamente en igual tiempo de
retencin. Los picos correspondientes a los diglicidilteres derivados no presentan
modificacin alguna.
Abundancia
Relativa (%)
100
344
75
50
73
25
0
345
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
Relativa (%)
100
357
75
50
73
25
0
372
100
200
300
Masa/Carga
400
500
mayor
tr (min)
ti (min)
Fragmento (m/z)
Antraceno
5.20
4.00
176, 178
Bisfenol F-Sil
6.59
6.00
343, 344
Bisfenol A-Sil
7.02
6.80
357, 372
8.00
10.50
325, 340
8.30
BFDGE
9.10
10.13
BADGE
11.12
tcnica de bajo coste y que nos permite minimizar el tiempo requerido para el anlisis;
as mismo, si se emplean cantidades pequeas de disolvente orgnico se reduce el
impacto medioambiental ocasionado. Por otra parte, el empleo de grandes volmenes de
muestra acuosa permite un notable aumento en la sensibilidad de los mtodos analticos
propuestos, como ya qued demostrado en el captulo dedicado a fluorescencia, donde
se emple microextraccin lquido-lquido con el mnimo volumen de disolvente
orgnico. En este apartado se emplea un procedimiento de extraccin lquido lquido en
el que no se ha limitado el volumen de disolvente, dando mayor relevancia a la
obtencin de metodologa sensible, sin la limitacin que introduce la posible saturacin
del disolvente. Por este motivo se emplea un volumen de muestra de acuosa de 500 ml,
y el volumen adecuado de disolvente orgnico para llevar a cabo la extraccin de los
compuestos.
-1
Bisfenol F-Sil
Bisfenol A-Sil
BFDGE
BADGE
CH2Cl2
0.384
0.933
0.268
0.184
CHCl3
0.270
0.870
0.281
0.325
CCl4
0.126
0.847
0.343
0.524
CH2Cl2:CCl4 (1:3)
0.360
0.912
0.286
0.220
CH2Cl2:CCl4(1:1)
0.230
0.881
0.304
0.345
CH2Cl2:CCl4(3:1)
0.140
0.870
0.318
0.428
Eter etlico
0.210
0.631
0.041
0.068
n-hexano
0.009
0.356
0.000
0.000
El volumen de disolvente orgnico y la fuerza inica del medio son dos variables
estrechamente relacionadas, por esta razn se llev a cabo la optimizacin simultnea
de ambas mediante el empleo de la metodologa de superficie de respuesta, de esta
forma se consigue obtener la mxima respuesta al variar ambas a la vez. Se aplic para
13
Box G.W.P, Hunter W.G. and Hunter J.S. Statistics for Experiments: An Introduction to Desing, Data
Analysis and Model Building, Ed. Wiley, New York (1978).
-1
Fuerza inica
(ml)
0g
75 g
150 g
3 ml
6 ml
0.1409
0.0226 0.2584 0.2849
0.2380
9 ml
BFF
Vdte
(ml)
3 ml
BFA
75 g
150 g
0.0706
0.4372
0.422
0.3230
0.7760
0.6410
0.6060
0.8960
0.3546
0.7158
0.5729
0g
75 g
150 g
0.0381
0.6121
0.2035
0.1702
0.5031
0.4802
0.5896
0.3210
0.1498
0.4154
0.2401
Fuerza inica
0g
75 g
150 g
0.7647
6 ml BFDGE 0.1980 0.5765 0.2290 BADGE
0.6666
9 ml
0g
A/Api
A/Api
0,8
0,6
0,4
0,2
0,25
BFF
0,15
0,05
0
40 80 120
160
g ClNa
9
5 7 VCHCl3
3
(ml)
BFA
40 80 120 160 3
9
5 7VCHCl3
g ClNa
(ml)
A/Api
A/Api
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0
0
0,6
0,4
BFDGE
7VCHCl3
40 80 120
3 5
160
(ml)
g ClNa
0,2
0
BADGE
5
40 80 120
160 3
g ClNa
9
7VCHCl3
(ml)
280
-1
0.000 30
0.000
0.0000
60
90
(segundos)0.1690
0.009 tiempo 0.335
0.015
0.584
0.3658
0.023
0.650
0.5563
0.224
0.635
0.5895
0.227
0.662
0.5799
0.231
0.641
0.5884
0.000
120
0.086
0.211
0.333
0.353
0.362
0.353
Apico /Apatrn
0.0
15.0
30.0
45.0
60.0
90.0
120.0
Para llevar a cabo este estudio se prepar una serie de cuatro disoluciones que en
-1
-1
BFDGE
BADGE
0.0
0.000
0.000
0.000
0.000
0.5
0.030
0.190
0.075
0.045
1.0
0.065
0.268
0.140
0.102
5.0
0.215
0.652
0.556
0.345
10.0
0.210
0.635
0.565
0.350
15.0
0.218
0.645
0.542
0.356
0,8
0,6
Determinacin de bisfenol F, bisfenol A, BFDGE y BADGE
282
0,4
0,2
0
5
10
tiempo (minutos)
15
Apico /Apatrn
Se observa que en todos los casos cinco minutos es tiempo suficiente para una
adecuada separacin de la fase orgnica y acuosa, alcanzndose la seal mxima a este
tiempo y mantenindose constante para tiempos mayores
1
0,8
0,6
Los resultados obtenidos, 0,4
se muestran en la tabla IV.3.15 y se representan en la
figura IV.3.15.
0,2
pH
0.154
0.153
0.132
0.101
0.025
0.016
0.002
0.001
0.000
0.000
0.787
0.783
0.778
0.761
0.563
0.369
0.157
0.072
0.036
0.004
0.596
0.590
0.583
0.585
0.575
0.579
0.586
0.589
0.593
0.595
0.361
0.372
0.365
0.362
0.375
0.37
0.364
0.368
0.365
0.372
Apico /Apatrn
3.20
6.25
9.56
10.42
11.00
11.21
11.56
11.90
12.35
12.95
0
Tabla IV.3.15.
Influencia del pH del medio.
3579
11
13
pH
Bisfenol F-Sil Bisfenol A-Sil BFDGE
BADGE
que se extraen en triclorometano, no hacindolo las formas disociadas, hecho que coincide
con las conclusiones alcanzadas en el captulo dedicado a fluorimetra. Por otra parte los
derivados diglicidilter presentan una seal constante a lo largo de todo el intervalo de pH
estudiado. Este hecho es atribuible a la no existencia de hidrgenos hidrolizables en sus
molculas y por tanto el pH no afecta sobre su extraccin. El amplio intervalo de pH en el
que permanece constante la seal hace que no sea necesario la adicin de una disolucin
tampn para fijar el pH siempre que la muestra tenga un pH inferior a 9.
ptimo
Agente derivatizante
tagitacin en silanizacin
Disolvente
Fuerza inica
Volumen de disolvente
tagitacion en extraccin
tseparacin de fases en extraccin
pH
TMSA
1.0 min
Triclorometano
80.0 g ClNa
5.0 ml
1.0 minuto
5.0 minutos
---
-1
-1
0.0005
0.0007
0.0311
0.0005
99.54
0.0015
42.26
0.0006
0.0004
0.1552
0.0014
99.93
0.0008
30.09
BFDGE
BADGE
0.0099
0.0223
0.0527
0.0009
99.78
0.049
20.58
0.0077
0.0136
0.0313
0.0053
99.76
0.032
30.33
1,0
3,0
1,0
2,0
0,8
2,0
0,6
0,8
1,5
1,0
0,4
0,4
0,5
0,2
0,0
0,00,0
0,51,01,52,0
10,020,0 30,0
[BFDGE](40,050,0
gl-1) 2,5
[bisfenol F](gl-1)
0,2
0,0
Apico/Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
Apico/Apatrn
0,00,0
10,020,0 30,0
0,10,20,30,4
[BADGE](40,050,0
gl-1) 0,5
[bisfenol A](gl-1)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,6
1,0
0,5
1
1,5
2
[bisfenol F](gl-1)
2,5
0,10,20,30,40,5
[bisfenol A](gl-1)
Apico /Apatrn
Apico /Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
1020304050
[BADGE](gl-1)
Apico /Apatrn
1020
304050
[BFDGE](gl-1)
Apico /Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
-1
0.01 a 0.50 gl para bisfenol A y 1.0 a 50.0 gl para ambos diglicidilter. Por otra
parte la linealidad calculada result ser 98.4 % para el bisfenol F
bisfenol A y
98.3 % y 98.4 % para los respectivos diglicidilteres.
99.1 % para el
W0.5h
Wb0
tr 0.5Wb0
Bisfenol F-Sil
Bisfenol A-Sil
BFDGE
BADGE
0.028
0.031
0.038
0.048
0.071
0.078
0.097
0.121
6.590 0.036
7.020 0.039
9.100 0.049
11.120 0.061
Con estos datos se midi la seal correspondiente al blanco para cada una de las
disoluciones empleadas. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla IV.3.19.
-4
5.7610
-4
4.5010
-4
4.7510
-4
8.5610
-4
3.2010
-4
4.0010
-4
5.9410
-4
2.0010
-4
3.8210
Bisfenol A-Sil
-4
1.1810
-4
1.1910
-4
1.2010
-4
1.2310
-4
1.2610
-4
1.2010
-4
1.1610
-4
1.2410
-4
1.2310
BFDGE
BADGE
-4
3.6210
-4
2.5110
-3
3.0810
-3
2.2110
-3
4.1810
-4
2.1510
-3
4. 3510
-4
2.1010
-3
4.3510
1.2810
-4
1.0010
-3
2.2510
-3
3.5310
-3
6.2410
-4
8.3510
-3
1.0810
-4
3.2510
-3
5.0110
-4
Sblanco
-4
Bisfenol F-Sil
Bisfenol A-Sil
BFDGE
BADGE
1.8810
-4
3.0910
-3
2.2810
-4
9.7110
b (lg )
0.0311
0.1552
0.0530
0.0310
-1
-1
CL (ngl ) CQ (ngl )
18.0
60.0
6.0
20.0
130.0
400.0
90.0
300.0
3.3.2.3. Precisin.
-1
-1
para los digilicidilter, que corresponde en cada caso al valor central del rango lineal de
concentraciones establecido con anterioridad. Las disoluciones fueron tratadas segn el
mtodo establecido y los extractos inyectados en el cromatgrafo de gases fijando las
condiciones instrumentales habituales. Finalmente se calcularon los
parmetros
0.041
-3
2.2610
5.54
0.059
-3
3.3610
5.60
1.377
-2
8.3510
6.06
BADGE
0.858
-2
5.4010
6.30
291
Las desviaciones estndar relativas son en todos los casos menores del 10 %. Puede
concluirse por tanto que el mtodo propuesto para la determinacin de los analitos es
reproducible en las condiciones de trabajo seleccionadas.
3.3.2.4. Sensibilidad.
aplic a muestras de agua residual urbana de las ciudades de Granada, Loja (Granada) y
Melilla. En todos los casos la metodologa empleada fue la de adicin de patrn, ya
desarrollada en el captulo II de esta Memoria de doctorado. Esta metodologa implica la
realizacin de tres experiencias de calibrado, un calibrado con patrones, un calibrado de
adicin de patrn y otro calibrado empleando porciones crecientes de muestra,
denominado de Youden.
292
-1
-1
-1
0.0 a 0.4 gl para el bisfenol A y 0.0 a 40.0 gl para los dos diglicidilter y se
extrajeron segn el procedimiento habitual. Finalmente se inyectaron los extractos
obtenidos en el cromatgrafo de gases fijando las condiciones instrumentales habituales.
Los resultados obtenidos se recogen en la tabla de validacin correspondiente a cada
compuesto.
Loja
Melilla
Vmuestra
Vm/Vtotal
Vm
Vm/Vtotal
Vm
Vm/Vtotal
20 ml
30 ml
40 ml
0.04
0.06
0.08
100 ml
150 ml
200 ml
0.20
0.30
0.40
200 ml
300 ml
400 ml
0.40
0.60
0.80
Para verificar la exactitud del mtodo, con ayuda del programa informtico
Alamn, se llev a cabo el clculo estadstico desarrollado en el captulo II de esta
Memoria. Los resultados obtenidos para cada uno de los compuestos y en cada una de
las muestras de agua residual consideradas para aplicar el mtodo son mostrados en las
tablas IV.3.25 a 28 y representados en las figuras IV.3.18 a IV.3.29.
Loja
Melilla
CP
CA
CY
CP
CA
CY
CP
CA
CY
10
10
10
0.077
0.0005
a
-1
b (lg )
sRC
Sp
0.0016
0.0013
0.0014
t (b)
0.6212 (P=54.70%)
0.6598 (P=52.28 %)
0.620 (P=51.40%)
0.0309
0.0309
0.0309
-1
bp (lmg )
a
0.0007 0.0078
BY
- 0.000
0.006
0.071
---
0.0006 0.0072
-0.001
---
0.0000
-1
0.246
---
---
0.228
---
---
0.241
---
---
-1
---
0.241
---
---
0.218
---
---
0.233
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
---
0.402 (P=69.60%)
0.300 (P=77.00%)
1,0
1,0
0,10
0,10
0,8
0,8
0,08
0,08
0,6
0,6
0,06
0,06
0,4
0,4
0,04
0,04
0,2
0,2
0,02
0,02
0,51,01,52,0
0,51,01,52,0
[bisfenol
[bisfenolF](
F](
gl
gl-1-1))
2,5
2,5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,10
0,02 0,20
0,04 0,30
0,06
ml/ml
ml/mlbisfenol
bisfenolFF
0,40
0,08
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,0
0,00,0
0,0
1,0
0,10
0,8
0,08
0,4
0,04
0,2
0,02
0,00,0
0,51,01,52,0
[bisfenol F]( gl-1)
2,5
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
ml/ml bisfenol F
0,80
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
Loja
Melilla
CP
CA
CY
CP
CA
CY
CP
CA
CY
10
10
10
a
-1
b (lg )
sRC
sp
0.0007
0.0009
0.0009
t (b)
0.4328 (P=67.40%)
0.0832 (P=93.40%)
0.1549
0.1544
0.1552
-1
bp (lmg )
a
0.0001 0.0077
BY
0.0001
0.0001 0.0078
---
0.0007 0.0079
-0.0002
---
0.0000
-1
0.046
---
---
0.051
---
---
0.047
---
---
-1
---
0.047
---
---
0.047
---
---
0.048
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
---
0.404 (P=69.40%)
1.409 (P=18.60%)
1.283 (P=78.20%)
1,0
0,10
0,8
0,08
0,6
0,06
0,4
0,04
0,2
0,02
0,10,20,30,4
[bisfenol A]( gl-1)
0,5
0,00
0,00
0,10
0,02
0,04
0,20
0,06
0,30
ml/ml bisfenol A
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,00,0
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,08
0,40
1,0
0,10
0,8
0,08
0,6
0,06
0,4
0,04
0,2
Figura
0,00,0
0,10,20,30,4
[bisfenol A]( gl-1)
0,5
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
ml/ml bisfenol A
0,80
Loja
Melilla
CP
CA
CY
CP
CA
CY
CP
CA
CY
10
10
10
a
-1
b (lg )
sRC
sp
0.0437
0.0573
0.0458
t (b)
0.7181 (P=48.80%)
0.0478 (P=96.20%)
1.0540 (P=31.40%)
0.0530
0.0527
0.0532
-1
bp (lmg )
a
0.0054 0.2874
BY
0.0041
0.0095 0.2841
---
0.0015 0.2878
0.0000
---
0.0085
-1
4.90
---
---
4.83
---
---
5.10
---
---
-1
---
5.07
---
---
5.25
---
---
4.91
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
---
0.363 (P=72.34%)
0.6850 (P=50.80%)
0.0.387 (P=70.60%)
3,0
0,30
2,0
0,20
1,0
0,10
0,0
0,00
0,00
3,0
0,08
0,40
0,30
Figura
2,0
1,0
0,10
0,0
20,030,040,0 [BFDGE](gl
-1)
0,010,0
50,0
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0,02
0,10 0,04
0,20 0,06
0,30
ml/ml
ml/ml BFDGE
BFDGE
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
20,030,040,0 [BFDGE](gl
-1)
0,010,0
50,0
0,00
0,00
0,20 0,40
0,60
ml/ml BFDGE
0,80
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
Tabla IV.3.28. Parmetros de los calibrados para el BADGE en las aguas residuales
de las ciudades de Granada, Loja y Melilla.
Granada
Loja
Melilla
CP
CA
CY
CP
CA
CY
CP
CA
CY
10
10
10
a
-1
b (lg )
sRC
sp
0.0323
0.0324
0.0306
t (b)
0.3330 (P=74.50%)
0.3946 (P=70.10%)
0.9546 (P=36.0%)
0.0312
0.0312
0.0310
-1
bp (lmg )
a
0.0094 0.1462
BY
0.0015
0.1000 0.1485
---
0.0085 0.1509
0.0021
---
0.0042
-1
4.72
---
---
4.97
---
---
5.08
---
---
-1
---
4.53
---
---
4.68
---
---
4.88
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
---
0.337 (P=74.20%)
0.180 (P=86.04%)
0.123 (P=90.40%)
2,0
0,20
1,5
0,15
1,0
0,10
0,5
0,05
0,0
0,00
0,00
0,02
0,10
0,04
0,20
0,06
0,30
ml/ml BADGE
2,0
0,20
1,5
Figura
1,0
0,0
0,00
0,00
Apico/Apatrn
0,5
Apico/Apatrn
0,08
0,40
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
300
0,20
0,40
0,60
ml/ml BADGE
0,80
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
301
)
la
4.
DETERMINACIN
DE
TRIETILENGLICOL
302
DIMETACRILATO
CROMATOGRAFA DE
GASES-ESPECTRO
METRA DE MASAS.
Como ya se dijo en la introduccin de esta Memoria, desde los aos 60 este tipo
de sustancias se han empleado en odontologa para la fabricacin de materiales
utilizados tanto en la restauracin de piezas dentales como en la fabricacin de
composites y selladores. Generalmente estas resinas se fabrican a partir de los
monmeros bis-GMA y/o bis-DMA y suponen una alternativa al uso de las amalgamas.
El primero de ellos es ms ampliamente utilizado hoy da en la fabricacin de este tipo
de resinas, debido a sus adecuadas propiedades mecnicas, estabilidad qumica y
trmica y su facilidad para simular el color natural de los dientes. En la fabricacin de
estas resinas se emplea adems el trietilenglicol dimetacrilato (TEGDMA) como
diluyente para disminuir la viscosidad inicial de las resinas.
4.1. Caracterizacin de los compuestos mediante cromatografa de gasesespectrometra de masas. Establecimiento del mtodo cromatogrfico.
-1
de cada analito que contenan 10 mgl de TEGDMA, 50 mgl de bisfenol A, 100 mgl
1
-1
MS
Valor
100 ml/min
3 ml/min
Variable
Temperatura
Interfase GC-MS
Rango m/z del
espectro de masas
Valor
280C
40-600
10 psi
Modo
SCAN
200 a 300 C
1750-2100
150 C
Dwell
100
Programacin
Temperatura del
horno
30 C/min, 270C
(7min)
5C/min, 300C
(1 min)
Volumen
Inyectado
2 l
200 C
225 C
250 C
275 C
300 C
TEGDMA
0.133
0.156
0.186
0.236
0.256
Bisfenol A
0.102
0.104
0.112
0.116
0.122
Bis-DMA
0.185
0.198
0.225
0.249
0.279
0.000
0.000
0.002
0.002
0.025
0.000
0.005
0.011
0.075
0.115
0.000
0.005
0.005
0.046
0.070
Bis-GMA
0,3
0,2
0,1
225
250
275
Tinyector (C)
300
Apico /Apatrn
0
200
-1
-1
mgl bis-DMA y 100 mgl de bisfenol F como patrn interno, fijando la temperatura del
inyector en 300 C y el resto de condiciones instrumentales mostradas en la tabla IV.4.1.
-1
Por otra parte se inyect una disolucin etanlica de 500 mgl de bis-GMA que contena
-1
as mismo 100 mgl de bisfenol F empleado como patrn interno pero fijando la
temperatura del inyector tambin en 300 C.
Seal (%)
100
Patrn
Interno
80
Bisfenol A
TEGDMA
60
Bis-DMA
40
20
0
4.05.0
14.0
tr (min)
Figura IV.4.2. Cromatograma y espectro de masas de
TEGDMA, bisfenol A y bis-DMA obtenidos a 300 C.
Seal (%)
100
Patrn
Interno
80
60
40
20
Bisfenol A
0
4.05.0 6.07.08.0
3
1
9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0
tr (min)
Figura IV.4.3. Cromatograma y espectro de masas de
Bis-GMA obtenido a 300 C.
Aparecen siete picos cromatogrficos con tiempos de retencin 5.65 minutos
para el TEGDMA, 6.42 minutos para el patrn interno, 6.70 minutos para el bisfenol A,
10.70 minutos para el bis-DMA y 9.43, 10.40 y 11.85 minutos para los tres compuestos
generados a partir del bis-GMA. Se observa adems en el segundo cromatograma un
pico correspondiente a bisfenol A y que procede de la degradacin trmica del bisGMA.
Abundancia
Relativa (%)
100
69
75
50
113
41
25
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
relativa
Ion
+
41
69
113
54 %
76 %
100 %
[C3H5]
H2C C
CH3
[C4H5O]
[C6H9O2]
O
H2C C C
CH3
O
H2C C C O CH2 CH2 O
CH3
Abundancia
Relativa (%)
100
213
75
50
25
0
228
100
200
300
Masa/Carga
400
500
Abundancia
relativa
Ion
+
213
20 %
[C14H8O2]
OH
OH
CH3
+
CH3
228
100 %
[C15H16O2]
OH
C
CH3
OH
310
Abundancia
Relativa (%)
100
69
75
50
41
349
25
364
0
100
200
300
Masa/Carga
400
500
A*
Ion
41
35 %
[C3H5]
69
100 %
[C4H5O]
349
364
H2C C
CH3
O
H2C C C
CH3
35 %
[C22H21O2]
8%
[C23H24O2]
O
H2C C C O
CH3
C
CH3
O
O C C CH2
CH3
O
H2C C C O
CH3
CH3
C
CH3
O
O C C CH2
CH3
Abundancia
Relativa (%)
(I)
100
75
325
41
50
25
340
0
0100200300400500
Masa/Carga
Abundancia
Relativa (%)
(II)
100
325
75
50
41
25
340
0
0100200300400500
Masa/Carga
Abundancia
Relativa (%)
(III)
100
325
75
50
25
41
340
0100200300400500
Masa/Carga
Tabla IV.4.6. Fragmentos relevantes del espectro de masas del bis-GMA (tres picos)
m/z
Abundancia relativa
I
II
III
Ion
41
83 %
46 %
17 %
325
[C3H5]
H2C C
CH3
[C20H21O4]
OH
CH2-CH-CH2-O
OH
O-CH2-CH-CH2
CH3
340
13 %
13 %
15 %
[C21H24O4]
OH
CH2-CH-CH2-O
CH3
C
CH3
OH
O-CH2-CH-CH2
312
tr (min)
ti (min)
Fragmentos (m/z)
Tiny (C)
TEDGMA
Patrn interno
Bisfenol A
Bis-DMA
5.65
6.42
6.70
10.70
9.43
10.40
11.85
5.00
6.00
6.60
10.60
9.00
9.00
11.00
300
200 y 300
200
300
325, 340
300
Bis-GMA
Corti P., Corbini G., Furlanetto S. and Pinzauti S. International Journal of Pharmaceutics, 111, 83
(1994).
Se estudian a continuacin cada una de las variables que afectan o pueden afectar
al tratamiento de la muestra, previo a su inyeccin en el cromatgrafo.
-1
-1
0.166
0.192
0.222
0.237
0.256
0.247
0.009
0.011
0.020
0.027
0.032
0.028
0.020
0.02
0.039
0.052
0.061
0.060
0,4
Apico /Apatrn
0,3
0,2
0,1
0
0
10
15
Vacetonitrilo (ml)
20
25
12.0
8.0
6.5
4.5
0.173
0.163
0.042
0.016
Bis-DMA
Bis-GMA
0.035
0.034
0.021
0.013
0.064
0.062
0.033
0.021
0.261
0.256
0.215
0.164
0,4
Apico /Apatrn
0,3
0,2
0,1
0
60
70
80
90
100110120
Tevaporacin (C)
Bisfenol A
Bis-DMA
Bis-GMA
0.162
0.119
0.122
0.243
0.148
0.147
0.032
0.026
0.026
0.056
0.019
0.010
(1)
(2)
(3)
1,00
Bisfenol A
0,80
0,60
0,25
TEGDMA
0,40
0,20
0,10
TEGDMA
0,05
0,00 0
Bisfenol A
Bis-DMA
Apico/Apatrn
Bis-GMA
t (min) 0 min
DCM
0.000
TCM
0.000
TCC
0.000
HEX
0.000
60
120
180
0.000
tDCM
agitacin (minutos)
TCM
0.000
TCC
0.000
HEX
0.000
DCM
0.000
TCM
0.000
TCC
0.000
HEX
0.000
DCM
0.000
TCM
0.000
TCC
0.000
HEX
0.000
5 min
0.070
0.002
0.023
0.003
240
0.061
0.100
0.017
0.002
0.002
0.004
0.002
0.000
0.007
0.008
0.005
0.000
300,00
min0
0.115
0.006
0.027
0.004
0.132
0.325
0.024
0.003
0.015
0.010
0.004
0.000
0.020
0.012
0.006
0.000
Apico/Apatrn
0,15
60 60
min 120
240 min
120 min180
240
t
agitacin
(minutos)
0.147
0.163
0.191
0.009
0.009
0.100
0.028
0.031
0.032
0.005
0.005
0.006
0.203
0.266
0.267
0.522
0.642
0.823
0.037
0.037
0.038
0.003
0.004
0.004
0.025
0.034
0.040
0.018
0.025
0.027
0.006
0.007
0.009
0.000
0.003
0.005
0.031
0.068
0.082
0.024
0.032
0.046
0.009
0.015
0.014
0.000
0.0004
0.004
Bis-DMA
Apico/
Apico/
0,05
0,10
0,04
0,08
0,03
0,06
Bis-GMA
0,02
60
120
180
tagitacin (minutos)
240
0,00 0
60
120
180
tagitacin (minutos)
240
Bis-GMA
0.000
0.000
0.000
0.000
0.113
0.215
0.004
0.031
10
0.151
0.235
0.048
0.073
15
0.163
0.241
0.059
0.080
20
0.169
0.230
0.066
0.082
0,3
0,2
0,1
0
5
10
15
Vdisolvente (ml)
20
Apico /Apatrn
Se observa que en todos los casos la seal aumenta hasta el volumen de 10 ml,
mantenindose prcticamente constante a partir de este valor. Se seleccion por tanto
este volumen como ptimo para experiencias posteriores.
ptimo
Volumen de acetonitrilo
20.0 ml
Temperatura de secado
80.0 C
Tiempo de secado
8.0 horas
Agitador de matraces
Disolvente
Diclorometano
Tiempo de redisolucin
120.0 minutos
Volumen de disolvente
10.0 ml
321
-1
-1
para TEGDMA, 10.0 a 1000.0 gl para bisfenol A y bis-DMA y 0.1 a 10.0 mgl para
bis-GMA. Se adicionaron 20 ml de acetonitrilo y una gota de KOH (2 M) para
precipitar protenas. Tras agitar vigorosamente se centrifug durante 10 minutos a 3000
r.p.m. y la fase acuosa fue decantada e introducida en una estufa a 80 C durante 8
horas. A continuacin se redisolvi el residuo seco originado con 10 ml de
diclorometano agitando mecnicamente durante 120 minutos y, transcurrido este
tiempo, se llev a casi sequedad en rotavapor y a sequedad absoluta en un vial
cromatogrfico de 200 l de capacidad; se adicion a continuacin 50 l de
-1
diclorometano que contena de 100 mgl de bisfenol F. Por ltimo se realizaron dos
inyecciones de cada patrn a temperaturas del inyector de 200 y 300 C, manteniendo
constantes el resto las condiciones instrumentales mostradas en la tabla IV.4.1. De cada
punto se realizaron dos rplicas experimentales.
1.5
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
2.0
1.2
1.5
0.9
1.0
0.6
0.5
0.3
0.0
0.000.02
0.040.060.08 [TEGDMA]( mgl
0.10
-1)
0.0
0.000.20
0.4
0.400.600.80
[bisfenol A]( mgl-1)
1.00
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
0.0
0.000.20
0.0
0.400.600.80
[bis-DMA]( mgl-1)
1.00
0.002.004.006.008.0010.00
[bis-GMA]( mgl-1)
TEGDMA
Bisfenol A
Bis-DMA
Bis-GMA
a
sa
-1
b (lmg )
-1
sb (lmg )
2
r (%)
sRC
Plof (%)
0.0287
0.0031
12.920
0.0662
99.97
0.0079
71.01
0.0517
0.0066
1.8265
0.0140
99.94
0.0168
32.80
0.0085
0.0018
0.2498
0.0035
99.84
0.0038
13.22
0.0084
0.0013
0.0227
0.0003
99.85
0.0033
54.09
esta Memoria. La representacin grfica de dichos residuales obtenida para los cuatro
compuestos es la mostrada en la figura IV.4.13.
Apico /Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
0200400600800 1000
[Bisfenol A](gl-1)
20406080100
[TEGDMA](gl-1)
Apico /Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
02004006008001000
[Bis-DMA](gl-1)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
Apico /Apatrn
Apico /Apatrn
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20 0
322
2
4
6
8
[Bis-GMA](mgl-1)
10
323
-1
TEGDMA, 10.0 a 1000.0 gl para bisfenol A y bis-DMA y 0.1 a 10.0 mgl para el bis-
GMA. Por otra parte, la linealidad calculada result ser 99.49 % para el TEGDMA, 99.23
% para el bisfenol A, 98.60 % para el bis-DMA y 98.69 % para el bis-GMA.
a
de
integracin para la obtencin de la seal del blanco correspondiente a cada uno de los
cuatro componentes de la mezcla. En el caso del bis-GMA, se consider nicamente la
seal correspondiente al ismero de mayor seal.
W0.5h
Wb0
tr 0.5Wb0
TEDGMA
0.015 min
0.038 min
Bisfenol A
0.035 min
0.089 min
Bis-DMA
0.042 min
0.107 min
10.679 0.054min
Bis-GMA
0.032 min
0.082 min
En la tabla IV.4.16 se muestran las seales del blanco obtenidas por integracin
de la lnea base en los intervalos mostrados.
3.9510
1.3210
10
-2
3.5410
1.5410
-2
3.9110
1.2510
-2
3.8510
1.4910
-2
3.9110
1.2010
-2
3.8210
1.5510
-2
3.9510
1.4510
-2
3.7510
1.1310
-2
4.0210
1.6010
-2
3.8010
1.0810
-2
Bis-DMA
-2
1.4910
-2
3.4310
-2
3.2710
-2
2.0010
-2
3.0510
-2
3.6010
-2
1.8510
-2
1.2810
-2
3.9310
-2
1.4010
Bis-GMA
-3
2.3210
-4
-3
2.2310
-3
2.2810
-3
3.0810
-3
4.1610
-3
3.9510
-3
3.6010
-3
1.5010
-3
1.0810
-3
09510
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
sblanco
TEGDMA
Bisfenol A
Bis-DMA
Bis-GMA
-1
-1
b (lmg )
CL (gl )
CQ (gl )
-3
12.92
0.3
1.0
-3
1.826
3.0
10.0
-3
0.250
12.0
40.0
--4
0.023
15.0
50.0
1.3510
1.8910
1.0710
1.1410
4.3.2.3. Precisin.
-1
para bis-DMA y 2.5 mgl de bis-GMA, que corresponden al punto central del
-1
rango
lineal de concentraciones establecido para cada uno de ellos. Las disoluciones fueron
tratadas segn el mtodo establecido y los extractos inyectados en el cromatgrafo de
gases fijando las condiciones instrumentales habituales.
Bisfenol A
Bis-DMA
Bis-GMA
Seal media
0.3578
0.4753
0.0745
0.0655
Desviacin estndar
1.6610
2.5210
3.5810
4.4910
DER (%)
4.65
5.30
4.80
6.85
-2
-2
-2
-2
Las desviaciones estndar relativas son en todos los casos menores del 10 %. Puede
concluirse por tanto que el mtodo propuesto para la determinacin de los analitos es
reproducible en las condiciones de trabajo seleccionadas.
4.3.2.4. Sensibilidad.
b (lmg )
-1
Sanaltica (gl )
0.0079
0.0168
0.0038
0.0033
12.920
1.825
0.250
0.023
0.6
9.0
15.0
145.0
TEGDMA
Bisfenol A
-1
RDL (mgl )
0.001-0.100
0.010-1.000 0.050-1.000
Linealidad (%)
99.49
99.23
98.60
98.69
-1
0.3
3.0
10.0
15.0
CQ (gl )
-1
1.0
12.0
40.0
50.0
DER (%)
4.65
5.30
4.80
6.85
-1
12.920
1.826
0.250
0.023
-1
0.6
9.0
15.0
145.0
CL (gl )
Scalibrado (lg )
Sanaltica (gl )
Bis-DMA
Bis-GMA
0.100-10.0
El mtodo analtico propuesto para la determinacin de TEGDMA, bisfenol A, bisDMA y bis-GMA fue aplicado a salivas humanas. La metodologa empleada fue la de
adicin de patrn, ya desarrollada en el captulo II de esta Memoria. Esta metodologa
implica la realizacin de tres experiencias de calibrado, un calibrado con patrones, un
calibrado de adicin de patrn y otro calibrado empleando porciones crecientes de
muestra y denominado calibrado de Youden.
-1
-1
-1
gl para TEGDMA, 0.0 a 500.0 gl para bisfenol A y bis-DMA y 0.0 a 5.0 mgl
-1
para bis-GMA. Por ltimo se realizaron dos inyecciones de cada muestra tras adicionar
el patrn interno a temperaturas del inyector de 200 y 300 C, manteniendo constantes
el resto las condiciones instrumentales mostradas en la tabla IV.4.1.
Vtotal
Vm/Vtotal
2.0
10 ml
0.2
4.0
10 ml
0.4
8.0
10 ml
0.8
1.5
1.2
0.9
CP
CA
CY
12
0.0287
0.1750
0.0273
b (lmg )
12.920
12.620
0.1395
sRC
0.0079
0.0124
0.0025
-1
0.6
sp
0.0094
0.3
t (b)
1.289 ( P=21.8 %)
-1
0.0 bp (lmg )
0.000.02
0.040.060.08
[TEGDMA](mgl
-1)
0.0299 0.10
a
0.1714
---
-0.0026
BY
-1
0.0102
---
---
-1
---
0.0112
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
12.887
1.713 ( P=16.2%)
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0.00
0.00
0.20
0.400.600.80
ml/ml TEGDMA
CP
CA
CY
1.5
12
1.0
0.0517
0.2390
0.0432
0.5
b (lmg )
1.8265
1.8010
0.1818
sRC
0.0168
0.0126
0.0068
-1
0.0200
sp
0.0
0.000.20 t (b)
0.400.600.80
-1
[bisfenol
A](mgl-1)
bp (lmg
)
0.0492
0.543 ( P= 59.4%)
1.8251
0.2359
---
0.0003
BY
-1
0.1012
---
---
-1
---
0.1056
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
1.00
0.795 ( P= 47.1 %)
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.00
0.200.400.60
ml/ml bisfenol A
0.80
330
0.3
0.2
0.1
CP
CA
CY
10
0.0085
0.0339
0.0081
b (lmg )
0.2498
0.2488
0.0229
sRC
0.0038
0.0041
0.0005
-1
sp
0.0040
t (b)
0.089 ( P= 93.2%)
-1
0.2497
0.0 bp (lmg )
0.002.00
8.0010.00
a 4.006.00 0.0085
[bis-GMA](mgl-1)
0.0338
0.0008
BY
-1
0.0971
---
---
-1
---
0.0979
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
---
0.0907 ( P=92.6%)
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0.03
0.02
0.01
0.00
0.000.20
0.400.60
ml/ml bis-GMA
0.80
CA
CY
12
0.4
0.0084
0.0310
0.0081
0.3
b (lmg )
0.0227
0.0223
0.0023
sRC
0.0033
0.0036
0.0005
0.2
0.1
-1
sp
0.0034
t (b)
0.5282 ( P=60.6%)
-1
0.0227
bp (lmg )
0.0
a
0.000.20
0.0086
0.400.60 0.801.00
--[bis-DMA](mgl-1)
BY
---
-0.0014
---
-1
1.00
---
---
-1
---
0.98
---
CX,S (mgl )
CX,A (mgl )
t (c)
0.0304
0.2383 ( P=92.2%)
Apico/Apatrn
Apico/Apatrn
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
0.000.200.400.600.80
ml/ml bis-DMA
332
El mtodo queda validado para la determinacin de TEGDMA, bisfenol A, bisDMA y bis-GMA en saliva humana.
CONCLUSIONES
335
Conclusiones
Valor
Parmetro
2.91 0.03
b (lg )
1.82 0.84
a (uf)
2
r (%)
99.94
5.035
sRC
-1
10.0-200.0
RDL (gl )
99.45
Linealidad (%)
-1
CL (gl )
-1
CQ (gl )
DER (%)
-1
Scalibrado (lg )
-1
Sanaltica (gl )
---
Valor
0.5
1.7
0.92
2.91
1.73
---
b (lg )
a (uf)
2
r (%)
sRC
-1
RDL (gl )
Linealidad (%)
-1
CL (gl )
-1
CQ (gl )
DER (%)
-1
Scalibrado (lg )
-1
Sanaltica (gl )
100 ml
250 ml
500 ml
65.5 7.3
0.56 0.8
99.8%
3.92
1.0-20.0
96.0
0.14
0.48
2.37
65.5
0.06
135.0 2.5
14.9 1.0
99.9 %
5.56
0.5-10.0
99.3
0.07
0.23
2.92
135.0
0.04
138 1.3
14.0 5.3
99.9%
2.86
0.5-10.0
99.7
0.07
0.23
2.86
138.0
0.02
(*)
Factores
RMSD
2
r (%)
PLS-1
Fenol
Bisfenol A
BADGE
3
0.328
0.997
5
0.216
0.998
6
0.417
0.998
5.- Se ha estudiado la reaccin que tiene lugar entre el bisfenol A y el cloro libre
presente en las aguas cloradas de abastecimiento pblico. Se ha comprobado que este
compuesto reacciona originando los correspondientes derivados mono, di, tri y
tetraclorados. Una vez estudiadas las variables experimentales que influyen sobre las
reacciones, se han sintetizado y aislado estos compuestos mediante cromatografa
lquida en columna y se han caracterizado mediante espectrometra de masas (EM) y
1
13
-1
b (lg )
a
2
r (%)
sRC
-1
RDL (gl )
Linealidad (%)
-1
CL (ngl )
-1
CQ (ngl )
DER (%)
-1
Scalibrado (lg )
-1
Sanaltica (gl )
BFDGE
BADGE
0.0311
0.1552
0.0527
0.0313
0.0005
99.76
0.002
0.05-2.50
0.0006
99.93
0.001
0.01-0.50
0.0099
99.78
0.049
1.00-50.00
0.008
99.77
0.030
1.00-50.00
98.40
18.0
60.0
5.54
0.031
99.10
6.0
20.0
5.60
0.155
98.30
130.0
400.0
6.06
0.053
98.40
90.0
300.0
6.30
0.0313
0.050
0.005
1.000
1.000
b (lg )
a
2
r (%)
sRC
-1
RDL (mgl )
Linealidad (%)
-1
CL (gl )
TEGDMA
Bisfenol A
Bis-DMA
Bis-GMA
12.920
1.826
0.250
0.023
0.029
0.052
0.009
99.97
99.94
99.84
0.0079
0.0168
0.0038
0.001-0.100 0.010-1.000 0.050-1.000
99.49
99.23
98.60
0.3
3.0
10.0
-1
CQ (gl )
DER (%)
-1
Scalibrado (lg )
0.008
99.85
0.0033
0.100-10.0
98.69
15.0
1.0
12.0
40.0
50.0
4.65
12.920
5.30
1.826
4.80
0.250
6.85
0.023
0.6
9.0
15.0
145.0
-1
Sanaltica (gl )
han
in
Water
by
Spectrofluorimetry".
International
Journal
of
"Determination of Bisphenol A (BPA) in the Presence of Phenol by FirstDerivative Fluorescence following Microliquid-liquid Extraction (MLLE)".
Talanta, 59, 1141-1148, 2000.