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Manual de Procedimientos de laboratorio

INDICE

TEMA

PGINA

Introduccin

Reglamento del Laboratorio

Material requerido para el Laboratorio

Prctica 1: Determinacin de GTP/ALT

Prctica 2: Determinacin de GOT/AST

11

Prctica 3: Determinacin de CK (Creatin Quinasa)

16

Prctica 4: Determinacin de CK-MB

21

Prctica 5: Determinacin de CK-MB Control

26

Prctica 6: Determinacin de LDH

31

Prctica 7: Determinacin cuantitativa de Protenas totales

36

Prctica 8: Determinacin de Albumina

41

Prctica 9: Determinacin de Bilirrubina Directa e Indirecta

46

Prctica 10: Determinacin de Fosfatasa Alcalina

52

Prctica 11: Determinacin de Lipasa

57

Prctica 12: Determinacin de Amilasa

62

Prctica 13: Determinacin de Fosfatasa Acida y Fraccin Prosttica

67

Prctica 14: Determinacin de Clculos Biliares

72

Prctica 15: Sndrome de Malabsorcin

77

Prctica 16: Perfil Heptico Completo

83

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INTRODUCCIN
El siguiente recopilado es un apoyo para el estudiante de Qumica Clnica dentro
del laboratorio de la experiencia de Bioqumica Clnica Enzimtica, con el objetivo
de proporcionar informacin y tcnicas en las pruebas de determinacin de las
enzimas importantes en el ser humano.

La Bioqumica Clnica Enzimtica es una parte de la Bioqumica clnica que


estudia la relacin semiolgica con los niveles de las actividades enzimticas en
funcin del diagnstico presuncional y diferencial para el control oportuno de las
enfermedades cardiovasculares, digestivas, seas y prostticas.
Todas las reacciones metablicas que ocurren en nuestro organismo se hayan
mediados por enzimas, estas en su mayora son de naturaleza proteica (algunas
son ARN).
Puede definirse a las enzimas (ez) como catalizadores, capaces de acelerar las
reacciones qumicas en ambos sentidos, sin consumirse en ella, ni formar parte
de los productos. La diferencia fundamental es que tienen gran especificidad de
reaccin o sea por el sustrato sobre el cual actan.
Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos orgnicos, termoestables para
poder cumplir con su funcin cataltica, estas
molculas se denominan
coenzimas, generalmente tiene bajo peso molecular y suelen ser claves en el
mecanismo cataltico. La
apoenzima unida a la coenzima constituye la
holoenzima. Estas molculas termoestables generalmente son vitaminas o
metales.
Segn el tipo de reaccin que catalizan las enzimas se dividen en 6 clases o
grupos: 1) Oxidorreductasas, 2) Transferasas, 3) Hidrolasas, 4) Liasas, 5)
Isomerasas, 6) Ligasas
En la actualidad, en el mbito de la salud los ndices de morbimortalidad y
prevalencia por este tipo de enfermedades, tanto en comunidades urbanas,
rurales y marginadas, demandan la formacin de profesionales que atiendan dicha
problemtica, de tal manera que se requiere que el estudiante de la qumica
clnica adquiera conocimientos del comportamiento en el organismo de las
enzimas y su valoracin por el laboratorio orientados a el diagnstico y pronstico
de las enfermedades, que le permitan intervenir en la preservacin, conservacin
y reestablecimiento de la salud, actuando con responsabilidad y respeto a la
integridad del individuo.
Cada prctica descrita de este manual proporciona la informacin esencial que
permitir al alumno llevar a cabo las determinaciones enzimticas que se incluyen
en el programa de esta experiencia educativa guindolo paso a paso en el
procedimiento de las tcnicas.

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO


I. PARA INGRESAR AL LABORATORIO.

Revise los antecedentes conceptuales y el protocolo de trabajo


experimental correspondiente a la sesin previa al inicio de la misma.

Llegue puntualmente a la sesin. Es sumamente importante aprovechar el


tiempo disponible para el trabajo en el laboratorio. Si llega tarde, reprtese
inmediatamente con el Profesor responsable.

Use zapatos cerrados, de piso y de preferencia con suela antiderrapante.


Use pantaln largo. Retrese todos los accesorios personales que puedan
comprender riesgos de accidentes mecnicos, qumicos o por fuego, como
son anillos, pulseras, collares, aretes. Las mujeres debern llevar el cabello
recogido. Evite el uso de lentes de contacto; use anteojos. Mantenga las
uas recortadas y limpias.

Use la bata cerrada durante toda la sesin y el uso de guantes. Colquese


la credencial a modo de gafete.

Llevar la tcnica impresa de la prctica a realizar, esta debe contener la


informacin sobre los reactivos y los clculos para su elaboracin. Revise
las medidas y el equipo de seguridad en el laboratorio.

Recoja con prontitud el material y los equipos para el trabajo


correspondiente. Se debe revisar el estado de la mesa de trabajo, del
material y de los equipos recibidos. Reporte cualquier falla o irregularidad al
Tcnico responsable del laboratorio. El material se debe lavar y secar antes
de ser usado. Consulte con el Profesor y con el Tcnico responsable y
revise la existencia de los reactivos a utilizar.

II. PARA PERMANECER EN EL LABORATORIO.

Siga las medidas de seguridad necesarias con los equipos, materiales y


reactivos de la sesin para prevenir accidentes. Esto incluye a los bancos
de trabajo; stos deben permanecer colocados junto a las mesas o a las
paredes.

Tome slo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo


experimental y colquelas en material de vidrio limpio y seco. Etiquete y
rotule todos los recipientes donde coloque reactivos, productos y residuos.
Siga las medidas de contingencia y mitigacin en caso de accidente.

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Mantenga slo el material requerido para la sesin sobre la mesa de


trabajo. Los dems objetos personales o innecesarios deben guardarse o
colocarse lejos del rea de trabajo, como en los anaqueles.

No ingiera alimentos ni bebidas en el interior del laboratorio.

No fume en el interior del laboratorio. Todas las fuentes de fuego o calor


deben estar controladas.

No reciba visitas en el interior del laboratorio. Evite las distracciones. As


puede evitar accidentes.

Informe al Profesor responsable cuando le sea necesario salir del


laboratorio durante la sesin. Reprtese al reincorporarse.

Antes de utilizar algn equipo de trabajo asegurarse de que estn en buen


estado y/o calibrados.

En caso de sufrir u observar cualquier accidente (cortadura, quemadura,


derrame de reactivos, etc.) deber informar inmediatamente al profesor
responsable y de esta forma activar los mecanismos planificados para
mitigar el accidente.

III. AL CONCLUIR LA SESION.

Disponga de los residuos y de los reactivos no utilizados de la manera


indicada por las normas. Los reactivos no usados no se devuelven a los
frascos. Los frascos de reactivos puros deben regresarse al almacn y/o su
adecuada conservacin.

Lave el material de vidrio, enjuguelo con agua destilada y devulvalo


limpio y seco. Retire las etiquetas de los materiales que contenan
reactivos, productos o residuos. Realice la entrega en orden y esperando su
turno.

Deje limpio y seco el lugar de trabajo. Coloque los bancos junto a las mesas
o invertidos sobre stas.

Antes de salir del laboratorio retrese la bata y dems equipo de seguridad y


gurdelo en una bolsa de plstico exclusiva para este uso. Los guantes
debern desecharse en las bolsas adecuadas.

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MATERIAL PERSONAL COTIDIANO OBLIGATORIO.

Bata larga de manga larga, con botones. Se recomienda que sea blanca.

Guantes de ltex

Escobillones de varios tamaos.

Detergente bajo en fosfatos.

Franela de algodn limpia.

Cinta masking tape

Toallas absorbentes de papel.

Marcador indeleble, preferentemente negro.

INFORMACION ADICIONAL
Referencias bibliogrficas generales:

Cole-Parmer 1999-2000. Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills,


IL. 1998.
Hackett, W.J. y Robbins, G.P. 1982. Manual Tcnico de Seguridad.
Representacionas y Servicios de Ingeniera, S.A., Mxico.
The Merk Catalogue. Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.
The Merk Index. 12th ed. Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.
http://www.galeon.com/scienceducation/bqreglas.html.
http://www.uv.mx/oferta/programas/DetalleMateria.aspx?Programa=QCLI02-E-CR&cur=48004&mat=QCLQ.
http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf.

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PRACTICA No.1
DETERMINACION DE GTP/ALT
1.- INTRODUCCIN
En el hgado se han detectado no menos de 60 reacciones de transaminacin,
pero las nicas transaminasas con valor clnico son la GOT (AST) y la GPT (ALT),
la GPT es exclusivamente citoplasmtica; es una enzima intracelular, se
encuentra principalmente en las clulas del hgado y el rin.
Se observan niveles elevados en enfermedades hepticas como la hepatitis,
enfermedades de los msculos y traumatismos. Cuando se emplean en
conjuncin con la GOT ayuda en el diagnstico de infartos de miocardio, ya que el
valor de la GPT se mantiene dentro de los lmites normales y aumenta en los
niveles de GOT.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles de la enzima GPT/ALT en suero de pacientes, mediante
lecturas de espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La alanina aminotrasferasa (ALT) inicialmente llamada transaminasa glutmico
pirvica (GPT) cataliza la transferencia reversible de un grupo amino de la
alanina al -cetoglutarato con formacin de glutamato y piruvato. El piruvato
producido es reducido a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) y
NADH. La velocidad de disminucin de la concentracin de NADH en el medio,
determinado fotometricamente, es proporcional a la concentracin cataltica de
ALT en la muestra ensayada.
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
**
5
**
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


TRIS pH 7,8
L-Alanina
Lactato deshidrogenasa (LDH)
-Cetoglutarato
NADH
** R2: Substrato

CONC.

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

CANTIDAD
100 mmol/L
500 mmol/L
1200 U/L
15 mmol/L
0,18 mmol/L

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4.3 Equipo
NUM.
1
2

CLAVE

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el Bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y se mide el blanco (en este caso
aire)
5.3. Se procede a preparar el reactivo de trabajo como se indica en la tcnica.
5.3.1. Mezclar: 1 vol. de (R2) Substrato + 4 vol. (R1) Tampn.
5.3.2. Estabilidad: 21 das a 2-8C o 72 horas a temperatura ambiente.
5.4. En un tubo de 12x75 colocar 1000 de reactivo de trabajo y 100 del suero
problema.
5.5. Se incuba la preparacin por espacio de 1 min en el bao mara (es
importante medir el tiempo adecuadamente)
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro, realizar la lectura de la absorbancia inicial
(longitud de onda a 340 nm).
5.7. Se tomara la lectura de la absorbancia (340 nm) cada minuto por tres minutos,
teniendo en total 4 lecturas.

6.- Reporte de resultados


Se procede a realizar los clculos. Calcular el promedio del incremento de

absorbancia por minuto (A/min):


A/min x 1750 = U/L de ALT

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica

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8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. Transaminasa Glutmico Pirvica. Disponible en: www.inmedeasimulator.net/med/data/doc/.../p319.html.
10.3. GTP/ALT disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT11%20GPT%20(ALT).pdf

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No.2
DETERMINACION DE GOT/AST

1.- INTRODUCCIN
La AST es una enzima intracelular, se encuentra en niveles altos en el msculo
del corazn, las clulas del hgado, las clulas del msculo esqueltico y en menor
cantidad en otros tejidos. La GOT est constituida por dos isoenzimas, una
citoplasmtica y otra mitocondrial.

En el infarto al miocardio la AST srica puede empezar a incrementarse


dentro de las 6-8 horas despus del ataque, con un pico de 2 das y vuelve
a la normalidad para el cuarto o quinto da despus del infarto. En
enfermedades como hepatitis, necrosis heptica, cirrosis y metstasis del
hgado, se ha encontrado tambin aumentado en las concentraciones
sricas de AST.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles de la enzima GOT/AST en suero de pacientes, mediante
lecturas de espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La aspartato aminotransferasa (AST) inicialmente llamada
transaminasa
glutamato oxaloactica (GOT) cataliza la transferencia reversible de un grupo
amino del aspartato al -cetoglutarato con formacin de glutamato y oxalacetato.
El oxalacetato producido es reducido a malato en presencia
de malato
deshidrogenasa (MDH) y NADH. La
velocidad
de disminucin de la
concentracin de NADH en el medio, determinada fotometricamente, es
proporcional a la concentracin cataltica de AST en la muestra ensayada.

4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
**
6
**
* R1: AST Buffer

NOMBRE DEL REACTIVO


TRIS Buffer, pH 7.5
L-Aspartato
MDH (musculo de porcino)
LDH (musculo de porcino)
2-Oxoglutarato
NADH (sal disdica)
** R2: Enzima AST

CONC.

CANTIDAD
80 mmol/L
240 mmol/L
600 U/L
600 U/L
12 mmol/L
0.18 mmol/L

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4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

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NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

4.3 Equipo
NUM.
1
2

CLAVE

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. En una proporcin de 5 partes de Buffer (R1) y 1 parte de enzima (R2),
(Ejemplo: 50ml de Buffer y 10ml de enzima).
5.4. Colocar en un tubo de 12x75, 1000 de buffer de trabajo, se echa a andar el
cronometro y se incuba la preparacin por espacio de 3 min en el bao Mara.
5.5. Transcurrido el tiempo se retira el reactivo del bao Mara y se agregan 100
del suero problema.
5.6. Agita levemente y leer la primera absorbancia a 1 minuto.
5.7. Se tomara la lectura de la absorbancia cada minuto por tres minutos, teniendo
en total 4 lecturas.
5.8. Realizar los respectivos clculos.
6.- REPORTE DE RESULTADOS
Se procede a realizar los clculos. Determinar el promedio del incremento de

absorbancia por minuto (A/min) y multiplicar por el factor 1746 para


obtener los resultados en U/L:
A/min x 1746 = U/L de ALT

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7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica

8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. GOT/AST disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT11%20GPT%20(ALT).pdf

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No.3
DETERMINACION DE CK (Creatin Quinasa)
1.- INTRODUCCIN
La creatn quinasa es una enzima intracelular. Se encuentra en mayor proporcin
en msculo esqueltico, msculo cardaco (incluyendo infarto al miocardio y
distrofia muscular) y cerebro. Su funcin fisiolgica esta asociada con la
adenosina trifosfato (ATP) producida cuando el msculo se contrae. Un aumento
en la actividad srica, es ndice de lesin celular. La extensin y gravedad de la
lesin determinarn la magnitud de la elevacin.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles sricos creatin quinasa en pacientes, mediante lecturas de
espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La creatina quinasa (CK) cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato de
la fosfocreatina al ADP. Esta reaccin se acopla con otras catalizadas por la
hexoquinasa (HK) y por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH).
La velocidad de formacin de NADPH, determinado fotometricamente, es
proporcional a la concentracin cataltica de CK
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
*
6
**
7

* R1: CK Buffer

NOMBRE DEL REACTIVO


Creatinafosfato
Glucosa
Acetato de Magnesio
EDTA
Buffer de Imidazol (pH 6.7)
ADP
AMP
Diadenosinpentafosfato
NADP
Hexocinasa (Levadura de Pan)
G6P-DH (Levadura de Pan)
N-acetilcistena
Buffer de Imidazol (pH 6.7)
** R2: Enzima CK

CONC.

CANTIDAD
30.0 mmol/L
20.0 mmol/L
10.0 mmol/L
2.0 mmol/L
100.0 mmol/L
2.0 mmol/L
5.0 mmol/L
10 mol/L
2.0 mmol/L
2.5 kU/L
1.5 kU/L
20.0 mmol/L
100.0 mmol/L

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4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

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NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

4.3 Equipo
NUM.
1
2

CLAVE

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. En una relacin de 1 parte de Reactivo de Enzima con 4 partes de
Reactivo de Buffer. (Ejemplo: 6ml de Enzima con 24ml de Buffer).
5.4. Colocar en un tubo de 12x75, 1000 de reactivo de trabajo y 40 del suero
problema.
5.5. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 1
min en el bao Mara
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.7. Se tomara la lectura de la absorbancia cada minuto por tres minutos, teniendo
en total 4 lecturas.
5.8. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos. Los valores se derivan en base al

coeficiente de extincin de absortividad micromolar de NADP a 340 nm


(0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad de CK es la cantidad de
enzima que oxida un mol/L de NADP por minuto.
A/min x 8095 = U/L CK (37 C)
A/min x 4127 = U/L CK (25 - 30C)

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7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. Determinacin cuantitativa de creatin quinasa (CK) disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEIS02%20CK%20NAC%202011.pdf

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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
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1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No.4
DETERMINACION DE CK-MB

1.- INTRODUCCIN
La creatn quinasa es una enzima intramuscular constituida por una subunidad M
(musculo) y otra subunidad B (brain=cerebro) que se combina dando lugar a las
isoenzimas CK-MM (muscular), CK-BB (cerebral) y CK-MB (miocrdica).

La elevacin serica de CK y de CK-MB constituye un indicador de injuria de


miocardio. Luego de un infarto agudo de miocardio, en aproximadamente el
55% de los casos, el pico mximo de elevacin de CK y CK-MB se produce
en forma simultnea, mientras que en el 45% de los casos la elevacin
mxima de CK-MB precede a la de CK total.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles sricos de CK-MB en una muestra problema, mediante
lecturas de espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La inhibicin especifica de las subunidades CK-MB con anticuerpos monoclonales
anti CK-M. Los anticuerpos inhiben tanto la isoenzima MM como las subunidades
M correspondientes a CK-MB. Las subunidades B se determinan mediante el
empleo de un sistema reactivo basado en una tcnica analtica con Nacetilcistena como activador, adicionado de anticuerpos monoclonales ante CKM.
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
**
6
**
7
**
8
**
9
**
10
**
11
**
12
**
13
**
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


Imidazol (pH 6.7)
Glucosa
Acetato de Magnesio
EDTA
Anti CK-M
ADP
AMP
di-Adenosina-5 pentafosfato
NADP+
Hexoquinasa (HK)
G6P- deshidrogenasa
N-acetilcistena
Fosfato de creatina
** R2: Anti CK-M

CONC.

CANTIDAD
100 mmol/L
20 mmol/L
10 mmol/L
2 mmol/L
2000 U/L
2 mmol/L
5 mmol/L
10 mmol/L
2 mmol/L
2500 U/L
1500 U/L
20 mmol/L
30 mmol/L

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4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

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NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

4.3 Equipo
NUM.
1
2

CLAVE

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. Agregar 2.5 ml de Buffer (R1) a un vial de Sustrato (R2). Tapar y mezclar
suavemente hasta disolver su contenido.
5.4. En un tubo de 12x75 colocar 1000 de reactivo de trabajo y 40 del suero
problema.
5.5. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 10
min en el bao Mara
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.7. Introducir la muestra nuevamente en el bao Mara durante 5 minutos.
5.8. Pasado el tiempo establecido (5 min.) realizar la lectura de la absorbancia.
5.9. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos. La unidad internacional (UI) es la cantidad

de enzima que convierte 1mol de substrato por minuto, en condiciones


estndar. La concentracin se expresa en unidades por litro (U/L).
A= A2-A1

A x 825 = U/L de CK-B

A x 1651 = U/L de CK-MB

Actividad de la CK-MB x 100 = % de la actividad de la CK-MB


Actividad de la CK Total

22

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7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. Determinacin cuantitativa de creatin quinasa-MB (CK-MB) disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT04%20CK%20-MB.pdf

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

25

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PRACTICA No.5
DETERMINACION DE CK-MB CONTROL
1.- INTRODUCCIN
En el infarto agudo de miocardio (IAM), la creatin quinasa (CK) Total empieza a
elevarse a las 3 a 6 horas despus del inicio de los sntomas, alcanza un valor
mximo entre las 18, 20, 30 horas y retorna a la normalidad hacia el tercer o
cuarto da (de 72 a 96 horas).
La molcula de creatin quinasa (CK) es un dmero compuesto por dos
subunidades monomricas, no idnticas: M y B. Cada una tiene u peso molecular
de 40000 daltons. Estas subunidades M y B, son el producto de dos genes
estructurales distintos, y puesto que la forma activa de la enzima es un dmero,
solamente pueden existir tres pares distintos de subunidades: BB: creatin quinasa
(CK) (Brain), MB: creatin quinasa (CK), MM: creatin quinasa (CK) (Muscle).
La creatin quinasa (CK)-BB, predomina en cerebro, prstata, estmago e
intestino, hgado, vejiga, tero, placenta y tiroides.
La creatin quinasa (CK)-MM, predomina en el msculo esqueltico y cardaco.
La creatin quinasa (CK)-MB, est presente en el msculo cardaco (de 25 a 46%
de la actividad de la creatinquinasa (CK) Total) y tambin, en menor grado, en el
msculo esqueltico (< 5%).
Las tres isoenzimas se encuentran en el citosol celular o asociada con estructuras
miofibrilares. La ventaja de la creatin quinasa (CK)-MB sobre la creatin quinasa
(CK) Total reside en su mejor especificidad de rgano.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles sricos de CK-MB en una muestra problema, mediante
lecturas de espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
El mtodo de determinacin de la creatin quinasa (CK) Total es enzimtico:
Utilizando como substratos, la fosfocreatina y el adenosindifosfato (ADP), y
mediante una serie de reacciones enzimticas acopladas, se mide la velocidad de
formacin de NADPH mediante el aumento de absorbancia, a 340 365 nm. Se
usa N acetilcistena para activar la creatin quinasa (CK).
Los valores normales son menores en la mujer que en el hombre.

26

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4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
**
6
**
7
**
8
**
9
**
10
**
11
**
12
**
13
**
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


Imidazol (pH 6.7)
Glucosa
Acetato de Magnesio
EDTA
Anti CK-M
ADP
AMP
di-Adenosina-5 pentafosfato
NADP+
Hexoquinasa (HK)
G6P- deshidrogenasa
N-acetilcistena
Fosfato de creatina
** R2: Anti CK-M

CONC.

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
100 mmol/L
20 mmol/L
10 mmol/L
2 mmol/L
2000 U/L
2 mmol/L
5 mmol/L
10 mmol/L
2 mmol/L
2500 U/L
1500 U/L
20 mmol/L
30 mmol/L

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. Reconstituir el contenido de un vial con 2 mL de agua destilada. Tapar y
esperar 5 minutos. Disolver el contenido completamente por inversin del vial. El
Suero Control de CK-MB reconstituido se trata de la misma manera que una
muestra desconocida.

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5.4. En un tubo de 12x75 colocar 1000 de reactivo de trabajo y 40 del suero


problema.
5.5. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 10
min en el bao Mara
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.7. Introducir la muestra nuevamente en el bao Mara durante 5 minutos.
5.8. Pasados los cinco minutos, realizar la lectura de la segunda absorbancia.
5.9. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.
5.10. El resultado se deber comparar con el que contiene la tcnica, esperando
que este no rebase el intervalo que marca el inserto.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos. La unidad internacional (UI) es la cantidad

de enzima que convierte 1mol de substrato por minuto, en condiciones


estndar. La concentracin se expresa en unidades por litro (U/L).
A= A2-A1

A x 1651 = U/L de CK-MB

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.
10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. Marcadores sricos bioqumicos cardiacos. Disponible en:

http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/715/1/Marcadoressericos-bioquimicos-cardiacos-Creatinfosfoquinasa-serica-total-CPKcreatinquinasa-CK-total-Lactodeshidrogenasa-LDH-Glutamico-oxalaceticotransaminasa-GOT-AST.html
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FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

Para la realizacin de esta tcnica se utiliza un suero con concentracin de CKMB conocida.

RESULTADO: _________

INTERVALO: ____________________

________________________________
Nombre y Firma de quien Reporta.

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

30

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PRACTICA No.6
DETERMINACION DE LDH
1.- INTRODUCCIN

La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima, distribuida por todo el


organismo humano. Las mayores concentraciones de LDH se encuentran
en el hgado, corazn, rin, msculo esqueltico y eritrocitos.
La elevacin de la deshidrogenasa lctica (LDH) en el suero, ocurre desde
infarto al miocardio, enfermedades del hgado, anemia perniciosa y
megaloblstica, embolia pulmonar, alteraciones renales y distrofia muscular.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles sricos de LDH en una muestra problema, mediante
lecturas de espectrofotometra y sus respectivos clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La LDH especficamente cataliza la oxidacin de lactato a piruvato con la
subsecuente reduccin del NAD a NADH. La velocidad a la cual se forma la NADH
es proporcional a la actividad de la LDH. Este evento determina el aumento de
absorbancia por minuto a 340 nm.
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
**
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


Imidazol
Piruvato
NADH
** R2: Enzima de LDH

CONC.

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

CANTIDAD
3
3
2

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
65 mmol/L
0.6 mmol/L
0.18 mmol/L

31

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5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal de la actividad enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. Disolver el sustrato en un vial de Buffer (se llevar a un volumen 4 veces
mayor).
5.4. En un tubo de 12x75 colocar 1000 de reactivo de trabajo y 15 del suero
problema, al aumentar 4 veces el volumen del reactivo se aumenta 4 veces el
volumen de la muestra (suero).
5.5. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 25
seg. en el bao Mara
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.7. Pasados 1.4 minutos, realizar la lectura de la segunda absorbancia.
5.8. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.
5.9. El resultado se deber comparar con el que contiene la tcnica, esperando
que este no rebase el intervalo que marca el inserto.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos. Los valores se obtienen en base al

coeficiente de excitacin de absortividad micromolar de NADH a 340nm


(0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad de LDH es la cantidad de
enzima que produce un mol/L de NADH por minuto.
A= A1-A2

A/min x 11496 = U/L LDH

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de enzimas propuestos
por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

32

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9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Universidad Nacional del Nordeste. Ctedra de Bioqumica. Enzimas.

http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
10.2. Determinacin cuantitativa de lactato deshidrogenasa (LDH). Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEIS43%20LDH-LQ%20(4-1)X.pdf

33

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REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

35

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PRACTICA No. 7
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS TOTALES

1.- INTRODUCCIN

Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente


distribuidos en el organismo. Actan como elementos estructurales y de
transporte. Se dividen en dos fracciones, albmina y globulinas. En el
plasma humano, la albumina representa del 50 al 60% del total de las
protenas, el resto lo conforman fracciones de globulinas (a1, a2, b y g). La
mayora de las protenas plasmticas son sintetizadas en el hgado,
exceptuando las inmunoglobulinas.
El incremento en el volumen plasmtico (sndrome de retencin de sal,
intoxicacin con agua) o su reduccin (deshidratacin por vomito o diarrea)
induce hipoproteinemia relativa o hiperproteinemia relativa respectivamente.
Los niveles de protena totalmente anormales solo se observan en caso de
desrdenes que afectan a la concentracin de albumina e
inmunoglobulinas. As, una insuficiencia proteica severa (mala absorcin,
mala digestin, insuficiencia diettica) enfermedades hepticas o renales
pueden provocar una hipoproteinemia. Si el total de la concentracin de las
protenas totales es menor de 40 g/L se pueden observar edemas. La
hiperproteinemia puede ser observada, por ejemplo, en casos de
hiperinmunoglobulinemia (mieloma mltiple, infeccin).

2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles sricos de protenas totales presentes en una muestra
problema, mediante reacciones de punto final.

3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN


En medio alcalino, las protenas dan un intenso color violeta azulado en presencia
de sales de cobre; contiene yoduro como antioxidante. La intensidad del color
formado es proporcional a la concentracin de protena total en la muestra
ensayada (reaccin de Biuret, Punto final).

36

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4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
**
* R1: Biuret

NOMBRE DEL REACTIVO


CONC.
Tartrato de potasio y sodio
Yoduro sdico
Yoduro de potasio
Sulfuro de cobre (II)
Patrn primario de Albumina Bovina
** R2: T Protein Cal

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
15 mmol/L
100 mmol/L
5 mmol/L
19 mmol/L
7 g/dL

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
temperatura ideal en la reaccin.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 540nm y medir el blanco con aire.
5.3. En tubos de 12 x 75 se procede a preparar el tubo del blanco, el tubo del
patrn y el de la muestra:

5.4. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 5


minutos en el bao Mara
5.5. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.6. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

37

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6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos correspondientes:

(A) Muestra / (A) Patrn x 7 (conc. Patrn)= g/dL de protenas totales.

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de proteinas
propuestos por la bibliografa se garantiza la confiabilidad analtica de esta
prctica

8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1. Determinacin cuantitativa de protenas totales. Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BSDTT30%20PROTEINAS%20TOTA
LES.pdf

38

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FACULTAD DE Bioanlisis
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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

39

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

40

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PRACTICA No. 8
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE ALBUMINA

1.- INTRODUCCIN

La albumina, principalmente sintetizada en el hgado, representa del 50 al


60% del total de las protenas en suero. Por su pequea y alta
concentracin plasmtica, la albumina es el mayor componente proteico de
la mayora de los fluidos extracelular del cuerpo, incluyendo el LCR, fluido
intersticial, orina y liquido amnitico. La funcin primaria de la albumina es el
mantenimiento continuo del equilibrio de la presin osmtica coloidal en los
espacios extravasculares y vasculares. La albumina tambin une y
transporta una gran cantidad de compuestos (iones, cidos grasos libres,
bilirrubina, frmacos, etc). La albumina es una reserva mvil de
aminocidos.
El incremento en los niveles de albumina se presenta nicamente en
deshidratacin aguda, critica especialmente en recin nacidos. La
hipoalbuminemia se observa en multitud de enfermedades vinculada a
diferentes estados patolgicos: 1) inflamacin aguda o crnica, 2)
disminucin de sntesis: insuficiencia heptica, malnutricin, analbuminemia,
3) aumento en la eliminacin: sndrome nefrtico, perdida gastrointestinal,
quemaduras grandes y graves, 4) incremento del catabolismo: fiebre,
hipertiroidismo.

2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles de albumina presentes en un suero problema, mediante
reacciones colorimtricas y sus respectivos clculos.

3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN


La albmina se combina con el verde de bromocresol a pH ligeramente cido,
producindose un cambio de color del indicador, de amarillo verdoso a verde
azulado proporcional a la concentracin de albmina presente en la muestra
estudiada.

41

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4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
**
* R1

NOMBRE DEL REACTIVO


Verde bromocresol pH 4,2
Patrn primario acuoso de Albmina
** R2: Albumin Cal

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CONC.

CANTIDAD
0.2 mmol/L
5 g/dL

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
incubacin adecuada de la determinacin de albumina.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 640nm y medir el blanco con aire.
5.3. En tubos de 12 x 75 se procede a preparar el tubo del blanco, el tubo del
patrn y el de la muestra:

5.4. Se echa a andar el cronmetro y se incuba la preparacin por espacio de 10


minutos en el bao Mara
5.5. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.6. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

42

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6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos correspondientes:

(A) Muestra / (A) Patrn x 5 (conc. Patrn)= g/dL de albumina en la muestra.


Factor de conversin: g/dL x 144,9 = mol/L
7.- CONFIABILIDAD ANALTICA
A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de albumina
propuestos por la tcnica del inserto y los procedimientos adecuados en la
preparacin de la muestra, se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica

8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Determinacin cuantitativa de albumina. Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BSDTT02%20ALBUMIN.pdf

43

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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

44

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

45

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PRACTICA No. 9
DETERMINACIN DE BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA

1.- INTRODUCCIN

La bilirrubina es un pigmento derivado del metabolismo de varias


hemoprotenas. El 80% de la bilirrubina procede de la hemoglobina de los
eritrocitos senescentes, destruidos por las clulas mononucleares
fagocticas del sistema reticuloendotelial del bazo, hgado y mdula sea.
La oxidacin del hem por la hem-oxigenasa produce biliverdina, y la
reduccin de sta por la biliverdina-reductasa origina la bilirrubina. El 20%
restante proviene de otras hemoprotenas como la mioglobina y de la
denominada eritropoyesis ineficaz (destruccin de clulas precursoras de
los eritrocitos en la mdula sea).
La bilirrubina libre o no conjugada, llamada tambin indirecta, circula en el
plasma unido a la albmina, lo que impide su paso a los tejidos. La
bilirrubina no conjugada es liposoluble, no siendo filtrada por el glomrulo
renal ni eliminada por la orina.
A travs del endotelio sinusoidal, el complejo albmina-bilirrubina pasa al
espacio de Disse, siendo captado y disociado por el hepatocito. En el
interior del hepatocito, la bilirrubina se une a protenas citoplasmticas y es
transportada al retculo endosplsmico.
En el retculo endoplsmico del hepatocito, la bilirrubina es conjugada con el
cido glucurnico mediante la uridin-di fosfato-glucuroniltransferasa (UDGPtransferasa), dando lugar a mono y diglucurnidos de bilirrubina. Mediante
este proceso de conjugacin, la bilirrubina pierde sus efectos txicos sobre
el organismo. La bilirrubina conjugada es excretada a travs de la
membrana del hepatocito al canalculo biliar, posteriormente se agrega a la
bilis y llega hasta duodeno a travs del rbol biliar. La bilirrubina conjugada
o directa es hidrosoluble y, por tanto, puede eliminarse por la orina.
La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en
plasma. Causas ms probables de la hiperbilirrubinemia:
Bilirrubina Total (T): Aumento de la hemlisis, alteraciones genticas,
anemia neonatal, alteraciones eritropoyticas, presencia de drogas.
Bilirrubina Directa (D): Colestasis heptica, alteraciones genticas y
alteraciones hepticas.

46

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2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles de Bilirrubina total y directa presentes en un suero
problema, mediante reacciones colorimtricas y sus respectivos clculos.

3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN


La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el cido sulfanlico diazotado
midindose fotomtricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubinglucurnido y bilirrubina libre ligada a la albmina, slo la primera reacciona en
medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilizacin con
dimetilsulfxido (DMSO) para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la
determinacin de la bilirrubina indirecta se determina tambin la directa,
correspondiendo el resultado a la bilirrubina total.
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO
CONC.
CANTIDAD
1
*
cido sulfanlico
30 mmol/L
2
*
cido clorhdrico (CIH)
150 mmol/L
3
**
cido sulfanlico
30 mmol/L
4
**
cido clorhdrico (CIH)
50 mmol/L
5
**
Dimetilsulfxido (DMSO)
7 mol/L
6
***
Nitrito de sodio
29 mmol/L
7
****
N-1-naftiletilendiamina diclorhdrico
0.346 mmol/L
* R1: Bilirrubina Directa ** R2: Bilirrubina Total
*** R3: Oxidante de Bilirrubina
**** Opcional: Estndar de Bilirrubina
4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
6
6
4

47

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Manual de Procedimientos de laboratorio

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Programar el espectrofotmetro a 555 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.2. Rotular correctamente 4 tubos de 12 x 75: Blanco de Bilirrubina total,
Bilirrubina total, Blanco de Bilirrubina directa y Bilirrubina directa.
5.3. Colocar los reactivos respectivamente en cada uno de los tubos rotulados de
la siguiente manera:

REACTIVO
R1 (D) mL
R2 (T) mL
R3 L
MUESTRA L

BILIRRUBINA TOTAL
BLANCO
MUESTRA
1.5
100

BILIRRUBINA DIRECTA
BLANCO
MUESTRA
1.5
1.5

1.5
50
100

100

50
100

5.4. Se mezcla perfectamente el contenido de los tubos y se deja incubar 5


minutos a temperatura ambiente.
5.5. Transcurrido el tiempo se realiza la lectura de las absorbancias de cada uno
de los tubos.
5.6. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se procede a realizar los clculos correspondientes:
CON FACTOR:
(A) MUESTRA X FACTOR= mg/dL de Bilirrubina en la muestra

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de bilirrubinas
propuestos por la tcnica y los procedimientos adecuados en la preparacin de la
muestra, se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.

48

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Manual de Procedimientos de laboratorio

9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Ictericia obstructiva,

Metabolismo

de

la

bilirrubina.

Disponible

en:

http://www.gastrocancerprev.com.mx/Documentos/ictericia/1.pdf
10.2 Determinacin cuantitativa de bilirrubina. Bilirrubina Total y Directa.
Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BSDTT36%20BILIRUBIN%20T-D.pdf

49

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Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


SEXO: ______________________

EDAD:

RESULTADO:
BILIRRUBINA TOTAL: ______________
BILIRRUBINA DIRECTA: _____________
BILIRRUBINA INDIRECTA: ____________

V.R. ___________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

50

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Manual de Procedimientos de laboratorio

HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

51

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Manual de Procedimientos de laboratorio

PRACTICA No. 10
DETERMINACIN DE FOSFATASA ALCALINA

1.- INTRODUCCIN
Las fosfatasas alcalinas (FAL) es una enzima ampliamente distribuida que
hidroliza el enlace ster fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico a pH
bsico (pH ptimo entre 9 y 10) liberando fosfato inorgnico. Est presente en
rin, hgado, intestino y hueso. La medida de niveles anormales de fosfatasa
alcalina en el suero indican la existencia de enfermedades seas degenerativas
(raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien
daos hepticos. El aumento fisiolgico de los niveles plasmticos de fosfatasa
alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se est formando tejido
seo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta). Esta enzima,
tambin se utiliza como control de la adecuada pasterizacin de la leche y crema,
dado que la fosfatasa alcalina se inactiva por calentamiento.

2.- OBJETIVOS
Comprobar la aplicacin prctica en el laboratorio de los principios tericos de la
Enzimologa, tales como:
Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto
Clculo de la actividad enzimtica a partir de la velocidad inicial de la
reaccin
Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de reaccin
Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
Como sustrato de la fosfatasa alcalina se utiliza un compuesto artificial: pNitrofenil-fosfato a pH 10.4 que, al poseer un resto orgnico con un grupo fosfato
unido, puede ser reconocido por la enzima.
El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol, compuesto
coloreado que en solucin alcalina absorbe a una longitud deonda de 405 nm, por
lo que su aparicin
en el transcurso de la reaccin puede seguirse
colorimtricamente. Para detener la reaccin se aadir fosfato, ya que el exceso
de este producto de la reaccin inhibe la actividad enzimtica.

52

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Manual de Procedimientos de laboratorio

4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
**

NOMBRE DEL REACTIVO


Dietanolamina (DEA) pH 10.4
Cloruro de magnesio
p-Nitrofenilfosfato (pNPP)

* R1: Tampn

** R2: Substrato

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CONC.

CANTIDAD
1 mmol/L
0.5 mmol/L
10 mmol/L

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
incubacin adecuada de la determinacin enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 405 nm y medir el blanco con aire.
5.3. Preparar el reactivo de trabajo:
5.3.1. Se prepara mezclando cinco partes de R1 y una parte de R2. Tapar y
mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
5.4. En un tubo perfectamente rotulado, colocar 1.2 ml del reactivo de trabajo y
20l de la muestra, se incuba durante 1 min en el bao Mara.
5.5. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.6. Se leen las absorbancias cada minuto durante 3 minutos.
5.7. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

53

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Manual de Procedimientos de laboratorio

6.- REPORTE DE RESULTADOS


La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1mol de
substrato por minuto, en condiciones estndar. La concentracin se expresa en
unidades por litro (U/L). Se procede a realizar los clculos correspondientes

A/min x 3300 = U/L de FA


7.- CONFIABILIDAD ANALTICA
A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de bilirrubinas
propuestos por la tcnica y los procedimientos adecuados en la preparacin de la
muestra, se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Brcena Ruiz JA, Garca Alfonso C, Padilla Pea CA. Caracterizacin
cintica de la fosfatasa alcalina. Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular. Disponible en:

http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf
10.2 Determinacin cuantitativa de fosfatasa alcalina (FAL). Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT07%20ALP.pdf

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

55

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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Manual de Procedimientos de laboratorio

PRACTICA No. 11
DETERMINACIN DE LIPASA

1.- INTRODUCCIN
La lipasa (LPS) es una enzima pancretica necesaria para la absorcin y digestin
de los nutrientes, cataliza la hidrlisis de los esteres de glicerol de los cidos
grasos. La determinacin de la LPS es til para el diagnostico de enfermedades
del pncreas como pancreatitis aguda y obstruccin pancretica.
Presenta mayor sensibilidad (S: 94%) y especificidad (E: 96%) que la amilasa total
srica. Se eleva el primer da y los niveles plasmticos persisten elevados un poco
ms de tiempo que los de amilasa. Se usa para el diagnstico de pancreatitis un
valor de corte del triple del lmite superior del valor normal. Existen aumentos por
debajo de 3 veces el valor normal en la insuficiencia renal grave, roturas de
aneurisma, nefrolitiasis, obstruccin intestinal, quimio o radioterapia. La
determinacin simultnea de amilasa y lipasa tiene una S y E > 95%.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles presentes de lipasa en un suero problema, mediante la
medicin espectrofotomtrica y sus respectivos clculos para su obtencin.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La lipasa pancretica en presencia de colipasa, iones calcio y desoxicolato,
hidroliza el sustrato 1-2-O-dilauril-rac-glicerol-3-glutrico-(6'-metilresorufina)-ester.
La velocidad de formacin de metilresorufina determinado fotometricamente, es
proporcional a la concentracin cataltica de lipasa.

4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
*
5
**
6
**
7
**
8
***
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


CONC.
TRIS pH 8.3
Colipasa
Desoxicolato
Taurodesoxicolato
Tartrato pH 4.0
Sustrato de Lipasa
Cloruro clcico (CaCl2)
Patrn suero humano liofilizado
** R2: Substrato
*** Lipase Cal.

CANTIDAD
40 mmol/L
> 1 mg/L
1.8 mmol/L
7.2 mmol/L
15 mmol/L
> 0.7 mmol/L
0.1 mmol/L

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Manual de Procedimientos de laboratorio

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
incubacin adecuada de la determinacin enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 340 nm y medir el blanco con aire.
5.3. En tubos de 12 x 75 preparar el tubo que ser el estndar y otro que ser el
problema
5.3.1. Tubo de estndar (perfectamente rotulado) colocar 1 ml de reactivo y 40l
del estndar.
5.3.2. Tubo del problema (perfectamente rotulado) colocar 1 ml de reactivo y
40l de la muestra.
5.4. Mezclar perfectamente ambos tubos, evitando la formacin de espuma.
5.5. Incubar la muestra durante 4 minutos en el bao Mara.
5.6. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se coloca en una
celdilla para espectrofotmetro y se realiza la lectura de la absorbancia inicial.
5.7. Se lee la siguiente absorbancia transcurridos 5 minutos.
5.8. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1mol de
substrato por minuto, en condiciones estndar. La concentracin se expresa en
unidades por litro (U/L). Se procede a realizar los clculos correspondientes
A= A1-A2
(A/min) Muestra - (A/min) Blanco= (A/min) Muestra
(A/min) Patrn - (A/min) Blanco= (A/min) Patrn
(A/min) Muestra / (A/min) Patrn X Actividad Calibrador= U/L de lipasa en la muestra

58

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Manual de Procedimientos de laboratorio

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de Lipasa serica
propuestos por la tcnica y los procedimientos adecuados en la preparacin de la
muestra, se garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Etxeberria Lekuona D, Pueyo Royo A. Pancreatitis aguda. Libro electrnico
de Temas de Urgencia. Disponible en:

http://www.cfnavarra.es/salud/PUBLICACIONES/Libro%20electronico%20de
%20temas%20de%20Urgencia/5.Digestivas%20y%20Quirurgicas/Pancreatit
is%20aguda.pdf
10.2 Determinacin cuantitativa de lipasa. Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT19%20LIPASE%20-LQ.pdf

59

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

60

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

61

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PRACTICA No. 12
DETERMINACIN DE AMILASA

1.- INTRODUCCIN
La alfa-amilasa es una enzima que se encuentra en bacterias y tejidos animales,
cataliza la hidrlisis del almidn y el glucgeno. Las determinaciones de la
actividad de amilasa srica, son de inters clnico en el diagnostico de la funcin
pancretica. Puede reflejar tambin enfermedad de la vescula biliar, algunos
problemas gastrointestinales y otros trastornos.
En la pancreatitis aguda se eleva a las 2-12h de comienzo del dolor y puede
normalizarse en 2-5 das. La amilasa se eleva en muchos procesos intra y
extraabdominales. El grado de hiperamilasemia no se correlaciona con la
gravedad del proceso de pancreatitis aguda (PA), pero a medida que aumentan
las cifras aumenta la sensibilidad y la especificidad. Cifras 5 veces por encima del
valor normal son altamente indicativas de PA.

2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles presentes de amilasa en un suero problema, mediante la
medicin espectrofotomtrica y sus respectivos clculos para su obtencin.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La -amilasa hidroliza el 2-cloro-4-nitrofenil--D-maltotrisido (CNPG3) a 2-cloro4-nitrofenol (CNP) y forma 2-cloro-4-nitrofenil--Dmaltoside (CNPG2), maltotriosa
(G3) y glucosa (G). La velocidad de formacin de 2-cloro-4-nitrofenol, determinado
fotomtricamente, es proporcional a la concentracin cataltica de - amilasa
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO
1
*
MES pH 6.0
2
*
CNPG3
3
*
Cloruro sdico
4
*
Acetato clcico
5
*
Tiocianato potsico
6
*
cida sdica
* RT: Reactivo de Amilasa

CONC.

CANTIDAD
100 mmol/L
2.25 mmol/L
350 mmol/L
6 mmol/L
900 mmol/L
0.95 gr/L

62

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4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
incubacin adecuada de la determinacin enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 405 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Posteriormente en un tubo de ensayo se adiciona 1 mL del reactivo de trabajo
y se incuba en el bao Mara durante 5 minutos.
5.4. Transcurrido el tiempo se retira la muestra del bao Mara y se agregar 25 L
de suero y lea inmediatamente la absorbancia inicial.
5.5. Incubar nuevamente durante 4 minutos en el bao Mara.
5.6. Leer las absorbancias. Anotar los incrementos en la absorbancia en intervalos
de 60 segundos (A/min) durante 2 minutos.
5.7. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Multiplicar el (A/min) por 4824 para obtener el resultado en U/L. los valores de
derivan en base a la absorvitividad milimolar del p-nitrofenol la cual es de 8.5 a
405 nm.
A/min x 4824= U/L AMS

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de Amilasa propuestos
por la tcnica y los procedimientos adecuados en la preparacin de la muestra, se
garantiza la confiabilidad analtica de esta prctica

63

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8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Etxeberria Lekuona D, Pueyo Royo A. Pancreatitis aguda. Libro electrnico
de Temas de Urgencia. Disponible en:

http://www.cfnavarra.es/salud/PUBLICACIONES/Libro%20electronico%20de
%20temas%20de%20Urgencia/5.Digestivas%20y%20Quirurgicas/Pancreatit
is%20aguda.pdf
10.2 Determinacin cuantitativa de -amilasa (AMS). Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT27%20AMYLASE%20-LQ.pdf

64

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FACULTAD DE Bioanlisis
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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

RESULTADO:

VR: _________________________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

65

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

66

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Manual de Procedimientos de laboratorio

PRACTICA No. 13
DETERMINACIN DE FOSFATASA CIDA Y FRACCIN PROSTTICA
1.- INTRODUCCIN
Las fosfatasas cidas son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza y
tienen la propiedad de hidrolizar fosfomonosteres a pH 5,0, liberando como
productos de la reaccin un alcohol y fosfato inorgnico. Se encuentran presentes
en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas en prstata,
estmago, hgado, musculo, bazo, eritrocitos y plaquetas.

Niveles elevados de fosfatasas cidas se encuentra en alteraciones


prostticas como hipertrofia, prostatitis o carcinoma, en enfermedades
hematolgicas, seas (enfermedad de Paget) o hepticas. Niveles bajos de
fosfatasa cida no tiene significado clnico.
La fosfatasa cida prosttica es una isoenzima localizada principalmente en la
prstata, si bien puede detectarse tambin en menor cantidad en leucocitos,
pncreas, bazo y vescula biliar. Se consideran normales las concentraciones
inferiores a 4 ng/ml. Al igual que el PSA, la fosfatasa cida prosttica no es
especfica del cncer de prstata y pueden detectarse niveles elevados en
alrededor del 15 % de los pacientes con adenoma prosttico o prostatitis. Su
sensibilidad oscila entre el 15 % en el estadio A y el 80 % en el estadio D.
2.- OBJETIVOS
Determinar los niveles presentes de fosfatasa acida y su fraccin prosttica en un
suero problema, mediante lecturas de espectrofotomtrica y la realizacin de
clculos.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
Mtodo Hillmann: La fosfatasa cida a pH 5.0 hidroliza el -naftilfosfato o fosfato
inorgnico a -naftol. El -naftol se hace reaccionar con un cromgeno diazotado
formando un compuesto coloreado con pico de absorcin a 405 nm.
4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
**
3
**
4
***
5
****
* R1: Tampn

NOMBRE DEL REACTIVO


Citrato sdico pH 5.2
Alfa-Naftil fosfato
Fast Red TR
Tartrato sdico
cido actico
** R2: Sustrato
*** R3: Tartrato

CONC.

CANTIDAD
50 mmol/L
10 mmol/L
6 mmol/L
2 mmol/L
0.5 mol/L

**** R4

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4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL MATERIAL


Tubos de ensaye de 12 x 75
Cubetas para espectrofotmetro
Pipeta automtica

4.3 Equipo
NUM. CLAVE
1
2

NOMBRE DEL EQUIPO


Espectrofotmetro
Bao Mara

CANTIDAD
3
3
2

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente precalentar el bao Mara a 37oC, el cual se usara para la
incubacin adecuada de la determinacin enzimtica.
5.2. Programar el espectrofotmetro a 405 nm y medir el blanco con agua
destilada.
5.3. Posteriormente adicionar en los tubos de ensaye lo siguiente:
REACTIVO
RT mL
R3 L
MUESTRA L

FAC TOTAL (T)


1.0
--100

FAC NO PROSTTICA (NO P)


1.0
10
100

5.4. Mezclar e incubar durante 5 minutos.


5.5. Transcurrido el tiempo de incubacin leer la absorbancia inicial.
5.6. Leer las absorbancias cada minuto durante 3 min.
5.7. De acuerdo a las lecturas obtenidas realizar los respectivos clculos.

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (A/min). La
unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 mol de
substrato por minuto, en condiciones estndar. La concentracin se expresa en
unidades por litro (U/L).

A/min x 750 = U/L de FAC (T)


(E/min FAC (T) - E/min FAC No inhibida por Tartrato) X 750 = U/L de
FAC Prosttica.

68

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7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de Fosfatasa acida y
fraccin prosttica, propuestos por la tcnica y los procedimientos adecuados en
la preparacin de la muestra, se garantiza la confiabilidad analtica de esta
prctica.

8.- GARANTIA DE CALIDAD


El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Emilio Guija, Mercedes Sobern. Mecanismo de accin de las fosfatasas
cidas de bajo peso molecular. An Fac Med Lima 2007; 68(4). Disponible en:

http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v68n4/a11v68n4.pdf
10.2 Determinacin cuantitativa de fosfatasa cida (FAC). Disponible en:

http://www.spinreact.com/uploads/pdf/BEDTT06%20ACP.pdf
10.3 Marcadores Tumorales. Fosfatasa cida prosttica. Disponible en:

http://www.ctv.es/USERS/pasi/labora/marctumor.htm#FOSFATASA%20%C
3%81CIDA%20PROST%C3%81TICA

69

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Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE Bioanlisis
REGIN VERACRUZ

HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________


EDAD:

SEXO: ______________________

VR: ____________________

RESULTADO:
FOSFATASA CIDA TOTAL: ______________
FOSFATASA CIDA NO PROSTTICA: _____
FOSFATASA CIDA PROSTTICA: ________

________________________________
Nombre y Firma de quien reporta

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HOJA DE METACOGNICIN

1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No. 14
DETERMINACIN DE CALCULOS BILIARES

1.- INTRODUCCIN

Los clculos (o piedras) biliares se forman de los productos del colesterol o


la bilirrubina que son excretados por el hgado en la bilis. El hgado
normalmente produce bilis. sta drena en la primera parte del intestino
delgado, donde ayuda en la digestin. Entre comidas, la bilis permanece
almacenada en la vescula biliar. Mientras la bilis est almacenada, se
pueden formar cristales. Cuando los cristales crecen, forman clculos
biliares.
La prevalencia a nivel mundial en adultos vara entre 5,9% y 21,9%, con
grandes variaciones geogrficas y regionales; Latinoamrica es una regin
con alta prevalencia.
Los clculos de la va biliar se dividen segn su localizacin, en dos tipos:
primarios y secundarios. Se consideran primarios cuando permanecen en el
sitio en que se forman y, secundarios, cuando se forman en la vescula biliar
y migran a la va biliar. Los primarios se subdividen en intrahepticos y
extrahepticos, y el lmite es la unin de los conductos hepticos derecho e
izquierdo.
Adems, se clasifican segn su apariencia morfolgica y sus componentes,
en dos grupos principales: clculos de pigmento y de colesterol. Los
clculos de colesterol se subdividen en puros, combinados o mixtos,
mientras que los clculos de pigmento se subdividen en clculos negros o
caf. Para obtener datos relevantes para el diagnstico etiolgico de los
clculos biliares, se deben tener en cuenta tres factores principales: el color,
la forma y la apariencia al corte.

2.- OBJETIVOS
Identificar los componentes presentes en la composicin de los clculos biliares
estudiados.

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3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN


Los clculos biliares son partculas de material slido, precipitado e insoluble en la
bilis. Se forman principalmente con componentes de la bilis (colesterol y/o
bilirrubina). Cuando se saturan se produce la nucleacin, que es el proceso inicial
de la cristalizacin del colesterol, sales biliares y de calcio. A partir de ah se
forman los clculos.
De COLESTEROL: Suelen ser solitarios. Se producen por perturbacin en
digestin de las grasas.
De PIGMENTOS: Aparecen raramente, pero en gran nmero. Se producen por
determinadas enfermedades de la sangre, que destruyen los glbulos rojos y
liberan el pigmento que contienen. Los glbulos rojos se descomponen en el
hgado y es segregado por la bilis.
MIXTO: Es el clculo biliar ms comn.
Se compone de Colesterol (96%), Calcio (3%) y Bilirrubina (1%).

4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE
1
*
2
*
3
*
4
**
5
**
6
**
7
***
8
***
* R1: Colesterol

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3

NOMBRE DEL REACTIVO


CONC.
Ac. Actico
5%
Ac. Sulfrico
ANH. Actico
Ac. Actico
5%
Piramidon
5%
P. De Hidrogeno
Cloruro Frrico
Ac. Clorhdrico
** R2: Hemoglobina
*** R3: Bilirrubina

NOMBRE DEL MATERIAL


Mortero con pistilo
Tubos de ensayo
Cajas petri

CANTIDAD
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL

CANTIDAD
2
3
3

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5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. Previamente a la prctica se deben triturar muy bien los clculos biliares para
tener un mejor control de la muestra.
5.2. Para determinar la constitucin del clculo biliar es necesario tratar la
muestra con los siguientes reactivos:
COLESTEROL
Ac. actico 5% 0.5 ml
Ac. sulfrico 0.5 ml
Anh. actico 0.5 ml
Color (+)

verde

HEMOGLOBINA
Ac. actico 5%
0.5 ml
Piramidon 5% 0.5
ml
p. de hidrogeno
0.5 ml
azul/morado

BILIRRUBINA
cloruro frrico 0.5
ml
Ac. clorhdrico
0.5 ml

amarillo

6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se reportar positivo el componente del clculo biliar, al virar la tonalidad en cada
una de las muestras montadas para su determinacin.

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de cada componente
existente en el clculo biliar, propuestos por la tcnica y los procedimientos
adecuados en la preparacin de la muestra, se garantiza la confiabilidad analtica
de esta prctica.
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.
10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Gallstones (Cholelithiasis). Children's Hospital Boston. Disponible en:

http://www.childrenshospital.org/clinicalservices/Site2133/Documents/gallsto
nes_spa.pdf
10.2 Gmez Jaramillo D. Clasificacin y fisiopatologa de los clculos
biliares. Univ. Med. Bogot (Colombia), 50 (1): 91-97, enero-marzo de 2009.
Disponible en:

http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v50n1/pdf/Clasificaci%F3
n%20y%20fisio.pdf
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HOJA DE RESULTADO

RESULTADO:_____________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________.

________________________________
Nombre y Firma de quien Reporta.

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1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No. 15
SINDROME DE MALABSORCIN
1.- INTRODUCCIN
El sndrome de malabsorcin se caracteriza por una absorcin inadecuada de
nutrientes desde el intestino hasta su incorporacin al torrente circulatorio o a la
linfa. La absorcin es la funcin principal del intestino. El intestino delgado de un
individuo adulto supuestamente sano tiene una superficie total de
aproximadamente 2 millones cm2. Esto se logra mediante 3 tipos de diferenciacin
morfolgica: las vlvulas conniventes, las vellosidades intestinales y las
microvellosidades del enterocito.
Se considera que existe malabsorcin cuando existen determinadas alteraciones
en el interior del intestino, en su pared o en el transporte linftico. Bsicamente la
malabsorcin es la consecuencia de la alteracin de al menos una de las
siguientes funciones digestivas:
Digestin intraluminal. En el interior del tubo digestivo las protenas, hidratos de
carbono y grasas se degradan en formas que pueda asimilar el organismo. El
proceso comienza en la boca con la saliva y contina en el estmago, con los
jugos gstricos, aunque la digestin definitiva se produce en el intestino delgado
por la accin de las sales biliares y el jugo pancretico. El dficit en la secrecin
de enzimas pancreticas o de sales biliares produce una hidrlisis incompleta de
las grasas y protenas o una falta de solubilizacin de las grasas de la dieta que
origina diarrea y malabsorcin.
Digestin terminal. La pared mucosa intestinal tiene un borde en cepillo donde se
produce la hidrlisis de hidratos de carbono. La destruccin de este borde puede
producir problemas de malabsorcin.
Transporte transepitelial, en el que los nutrientes, lquidos y electrolitos se
transportan a travs de la pared del intestino delgado para ser distribuidos por el
organismo. Los cidos grasos absorbidos se convierten el triglicridos y, junto con
el colesterol, se acoplan formando quilomicrones para distribuirse por el sistema
linftico intestinal. La lesin de las clulas epiteliales puede provocar la alteracin
del transporte a travs de la clula y alteracin en la formacin de quilomicrones.
El bloqueo de los vasos linfticos impide el transporte de los nutrientes desde la
clula intestinal hasta los rganos donde se llevan a cabo el almacenamiento o el
metabolismo.
Las consecuencias de la malabsoricin afectan a muchos sistemas orgnicos:

Tracto digestivo: diarrea (tanto por la malabsorcin de nutrientes como por


secrecin intestinal excesiva), flatulencia, dolor abdominal, prdida de peso.
Sistema hematopoytico: anemia por falta de hierro, piridoxina, folato o
vitamina B12, y hemorragias por falta de vitamina K.

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Sistema musculoesqueltico: trastornos seos (como osteoporosis y


osteomalacia) y tetania por malabsorcin de calcio, magnesio, vitamina D y
protenas.
Sistema endocrino: amenorrea (supresin de la menstruacin), impotencia,
esterilidad por la malnutricin generalizada e hiperparatiroidismo por falta
crnica de calcio y vitamina D.
Piel: manchas por falta de vitamina K; edemas por dficit proteico;
dermatitis por falta de vitamina A, cinc, cidos grasos esenciales y niacina.
Sistema nervioso. Neuropata perifrica por falta de vitaminas A y B12.

2.- OBJETIVOS
Identificar en una muestra de paciente, anormalidades o problemas en la
absorcin de nutrientes con ayuda de la determinacin de enzimas y/u otros
componentes presentes en la muestra de estudio.
3.- PRINCIPIO Y METODOLOGA DE LA DETERMINACIN
La tripsina y la quimiotripsina son enzimas proteolticos. Su funcin es digerir las
protenas en el intestino delgado. Normalmente, sus precursores (las formas
inactivas: tripsingeno y quimiotripsingeno) se sintetizan en el pncreas y se
transportan hasta el intestino delgado. Una vez en el intestino delgado, se activa el
tripsingeno, convirtindose en tripsina por la accin de una enzima situada en la
mucosa intestinal. A continuacin, la tripsina activa el quimiotripsingeno,
convirtindolo en quimiotripsina. Juntos, forman unas potentes sustancias
qumicas responsables de romper las protenas que forman parte de los alimentos
en pequeos fragmentos, llamados pptidos. Si el pncreas funciona
correctamente, se podr detectar tripsina y quimiotripsina en el intestino delgado y
en las heces.
La reaccin de Benedict identifica azcares reductores (aquellos que tienen su OH
anomrico libre), como la lactosa, la glucosa, la maltosa, y celobiosa. En
soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que
precipita de la solucin alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. El fundamento
de esta reaccin radica en que en un medio alcalino, el ion cprico (otorgado por
el sulfato cprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo Aldehdo del azcar
(CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo
ladrillo correspondiente al xido cuproso (Cu2O).
El medio alcalino facilita que el azcar est de forma lineal, puesto que el azcar
en solucin forma un anillo de piransico o furansico. Una vez que el azcar est
lineal, su grupo aldehdo puede reaccionar con el ion cprico en solucin.

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4.- LISTA DE REQUERIMIENTOS


4.1 Reactivos
NUM.
CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO
1
*
Solucin salina
2
*
Gelatina bacteriolgica
3
**
Ac. clorhdrico
4
**
Reactivo de Benedict
5
***
Negro de Sudan
* R1: Tripsina y Quimiotripsina
** R2: Int. Lactosa

CANTIDAD
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 gota.
*** R3: Detec. Grasas

4.2 Material
NUM. CLAVE
1
2
3
4
5

CANTIDAD
2
5
2
3
1

NOMBRE DEL MATERIAL


Portaobjetos
Tubos de ensayo
Cajas petri
Pipetas
Gradilla

CONC.

5.- TCNICA O PROCEDIMIENTO


5.1. PRESENCIA DE TRIPSINA Y QUIMIOTRIPSINA
Para la realizacin de esta prctica se requiere de materia fecal.
Se realiza una suspensin de la materia fecal con un poco de solucin
salina.
Se coloca una gota de la suspensin de la materia fecal en una gelatina
bacteriolgica y se deja durante 20 30 minutos.
5.2. INTOLERANCIA A LA LACTOSA
Se coloca en un tubo de 13X100, 1 mL de la suspensin de materia fecal
ms 1 mL de un cido fuerte y ebuir durante 5 minutos.
Rescatar el sobrenadante en un tubo de 13X100 y colocar 1mL del reactivo
de Benedict.
5.3. DETECCIN DE GRASAS
Para la deteccin de grasas se coloca en un portaobjetos 1 gota de
suspensin de materia fecal ms 1 gota de Negro de Sudan y observar al
microscopio

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6.- REPORTE DE RESULTADOS


Se reportar positiva la determinacin de cada prueba que presente algn cambio
o presencia de componentes anormales en la reaccin.

7.- CONFIABILIDAD ANALTICA


A travs de los mecanismos de reaccin para la obtencin de componentes
presentes en la muestra de estudio, indicativos de intolerancia a la lactosa, y los
correctos procedimientos en cada anlisis, se garantiza la confiabilidad analtica
de esta prctica.
8.- GARANTIA DE CALIDAD
El uso de reactivos de pureza aceptable, el correcto manejo del material e
insumos y la supervisin y asesoramiento continuo del docente y personal de
laboratorio asegura la calidad en el proceso.
9.- PRACTICABILIDAD
El analista puede ser un alumno de qumica clnica supervisado por el docente el
tcnico acadmico.

10.- BIBLIOGRAFA
10.1 Sndrome de malabsorcin. Disponible en:

http://www.cepvi.com/medicina/enfermedades/malabsorcion.shtml
10.2 La dietoterapia en el sndrome de malabsorcin. Revista Cubana Aliment Nutr
1996; 10 (1). Disponible en:

http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol10_1_96/ali11196.htm

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HOJA DE RESULTADO

NOMBRE DEL PACIENTE:__________________________________________.


EDAD:

SEXO:

RESULTADO:
PRESENSIA DE TRIPSINA Y QUIMIOTRIPSINA: _____________
INTOLERANCIA A LA LACTOSA: __________________________
DETECCIN DE GRASAS: _______________________________

________________________________
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2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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PRACTICA No. 16
PERFIL HEPATICO COMPLETO
1. INTRODUCCION
En el hgado, se llevan a cabo las principales transformaciones metablicas del
organismo, siendo el rgano encargado de la transformacin bioqumica de los
principios inmediatos ingeridos en la dieta y absorbidos a nivel intestinal, as
como de su distribucin a todo el organismo. Para conseguirlo, lleva a cabo -entre
otras- las siguientes actuaciones:

Interviene activamente en el metabolismo de los principios inmediatos.


Participa en los procesos de sntesis y regeneracin sangunea.
Forma la bilis.
Es el rgano encargado de la eliminacin de productos potencialmente
txicos para el organismo.
Participa en las funciones del sistema monocito-macrfago.
Participa en el metabolismo de hormonas y vitaminas.
Sintetiza protenas encargadas de transportar hormonas y vitaminas en la
sangre.
Degrada las hormonas y facilita su eliminacin.
Sirve de almacn de ciertas vitamnas.
Participa en el metabolismo de la vitamina D3 activa.

El hgado, es el encargado de proporcionar a los tejidos, energa, glucosa y cidos


grasos, en los perodos interdigestivos.
Las pruebas funcionales hepticas son aquellas que permiten determinar la
capacidad global del hgado para llevar a cabo las funciones que le son propias,
fundamentalmente la detoxificacin, la sntesis y las de tipo metablico.
Todas aquellas pruebas seleccionadas para determinar la gravedad y evolucin de
una enfermedad heptica, deben valorar diferentes parmetros bioqumicos en
funcin de la propia evolucin de la enfermedad y deben adems ser interpretadas
segn el contexto clnico global.
No todas aquellas determinaciones bioqumicas que reflejan la gravedad y
evolucin de una enfermedad heptica, son realmente pruebas funcionales.
Las distintas pruebas que determinan ciertos componentes sanguneos que al
variar su concentracin plasmtica, ponen en evidencia una lesin en el hepatocito
o una falta de permeabilidad de las vas biliares (los que se conocen como
marcadores sricos de enfermedad heptica) no valoran en realidad la
funcionalidad de este rgano y, por tanto, no son estrictamente pruebas
funcionales hepticas.

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Tampoco lo son, algunas pruebas bioqumicas de gran especificidad muy


utilizadas actualmente que permiten diagnosticar una determinada enfermedad
heptica (hepatitis vrica, tumores hepticos, etc.) pero que no evalan realmente
el funcionamiento del hgado.
No obstante, por razones de tipo prctico, unas y otras suelen incluirse en
cualquier clasificacin de las pruebas funcionales hepticas.

2. OBJETIVO
Determinar e identificar las pruebas correspondientes a un perfil heptico completo
de una muestra problema.

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3. REPORTE DE RESULTADOS
.

NOMBRE DEL PACIENTE:

EDAD:

SEXO:

RESULTADO:
PRUEBA

RESULTADO

VALORES DE
REFERENCIA

AMINOTRANSFERASAS
(ALT)
AMINOTRANSFERASAS
(AST)
FOSFATASA ALCALINA
PROTEINAS TOTALES
ALBUMINA
BILIRRUBINA TOTAL
BILIRRUBINA DIRECTA
BILIRRUBINA
INDIRECTA

________________________________
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1. QUE HICE?

2. PARA QUE LO HICE?

3. QUE APRENDI?

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