UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ZONA CENTRO BOGOT CUNDINAMARCA

CEAD JOS ACEVEDO y GMEZ

ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA

#5
Gloria Perdomo
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Bsicas, Tecnologa e Ingeniera ECBTI. Bioqumica. Grupo # 2. Bogot - Colombia. Docente Marcela ZAMBRANO.
Sesin 3: Noviembre 14 de 2013
Entrega preinforme: Noviembre 14 del 2013

Estudiante
Gloria
Perdomo

Correo electrnico

Cdigo

Mediacin

Grupo terico

glorikapt@hotmail.com

1022974304

CV

201103_43

ST: Sistema Tradicional

OBJETIVOS
ESPECFICOS (debe ser ms de uno)
Determinar el efecto del pH, la
concentracin del sustrato y la
temperatura sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica de la ureasa.
Determinar la presencia de ureasa en
leguminosas y tortas de oleaginosas
midiendo su actividad biolgica.
CONCEPTOS TERICOS

Nombre
tutor
terico

Correo tutor terico

Golda
Torres

golda.torres@unad.edu.co

CV: Campus Virtual

estructurales iguales y es de las enzimas que

exhibe especificidad absoluta por su sustrato.
Las investigaciones sobre la ureasa tambin
permitieron deducir un principio importante de
las reacciones enzimticas como es la
funcin de los grupos -SH (sulfidrilo) en
ciertas enzimas. La ureasa posee 3 o 4
grupos sulfidrilos activos, siendo un
representante de un gran nmero de enzimas
cuya actividad depende de la existencia de
grupos -SH intactos formando parte de la
cadena peptdica de la enzima como cisteina.

El estudio cintico persigue la caracterizacin

de la actividad cataltica de la enzima,
determinando las condiciones ptimas bajo
las cuales presentan la mayor actividad. La
ureasa es una enzima muy difundida en el
reino vegetal especialmente en semillas de
leguminosas (soya, canavalia).

CINTICA. Es la velocidad de reaccin

qumica se puede medir como la velocidad de
formacin de uno o ms de su productos.

Un buen mtodo para seguir el curso de la

hidrlisis es la titulacin del NH3 producido
con un cido de normalidad conocida y en
presencia de un indicador adecuado. Esta
enzima tuvo mucha importancia en el
desarrollo de la enzimologa moderna ya que
merced a los trabajos de Summer fue la
primera aislada y cristalizada. La ureasa tiene
un PM de 483000, consta de 6 subunidades

PARTE EXPERIENTAL

UREASA. Es una enzima que cataliza la

hidrlisis de urea a dixido de carbono y
amonio.

MATERIALES

100 gramos de habas verdes

100 gramos de frijoles verdes
100 gramos de habichuelas verdes
100 gramos de frijol de soya
Indicador de tashiro

Pesar 5 g de muestra,
pasarla a un erlenmeyer,
agregar 10 ml de NaCl 1%;
agitar mecnicamente
durante
15
minutos
y
centrifugar la suspensin a
2.500 rpm por 15 minutos

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Mortero con mango

Agitadores de vidrio
Tubos de ensayo
Gradillas
Baln aforado de 25 ml
Vasos de precipitado 1000 ml de
vidrio
Vasos de precipitado 200,
600,1000 ml plsticos
Pipetas 1, 10 y 5 ml
Probetas 100 ml y 50 ml
Estufas con mallas
esptulas, espectrofotmetro
Centrifuga
Erlenmeyers de 50 y 250
incubadora o estufa entre 50-60C
Vidrio reloj
Balanzas analticas
Tablas de diseccin
Bureta de 25 ml
Pinzas y soporte para titulacin
REACTIVOS

Buffer fosfato, a pH 5.0; 6.0; 7.2;

8.0 y 10.0 a 0.05 M
Solucin de Urea 0.25 M
Solucin de HgCI2 1%
Solucin de HCI 0.1 N
Buffer fosfato, a pH 4.0, 5.5, 7.0,
8.5,10.0 0.1 M 50 ml de c/u
Solucin de NaCl 1%
Solucin fenol nitroprusiato de
sodio : 4,7g fenol y 6mg de
nitroprusiato de sodio en 100ml de
agua desionizada
Disolver 2g de NaOH en 100ml de
agua desionizada y agregar 7,5ml
de hipoclorito de sodio comercial al
5%. Guardar en frasco mbar.
Solucin de HCI 1.0 M (titulada
exactamente).
PROCEDIMIENTO

Extraccin de la ureasa.

transferir el
sobrenadante a un baln
aforado de 25 ml. Al residuo
agregar de nuevo otros 10 mI
de NaCI
1% y repetir exactamente el
procedimiento anterior.

Reunir los dos

sobrenadantes y completar a
25 ml con NaCI 1%. Este es
el extracto que
contiene ureasa. Dejar en
bao con hielo

Determ inacion de la actividad a

diferentes pH: pH optimo de una
enzima:
Metodo 1:
Preprese 2 series de 5
tubos: 5 servirn como
blanco y 5 para determinar el
efecto de pH.
(Tubos
p)
rotulados
claramente.
Agregue
lo
indicado en el cuadro,
incubndolos como se indica

Terminada la incubacin
transfiera el contenido de
cada tubo a un erlenmeyer
diferente,
agregando a cada uno 3
gotas de indicador de tashiro;
finalmente titule con HCI de
normalidad
conocida.

Determinacion de la actividad a
diferentes pH: pH optimo de una
enzima:
Metodo 2: Extracto
extracto
quevegetal:
contenga la
material

El
ureasa se puede obtener de una
serie de leguminosas, las
recomendadas son: frijol, habas,
habichuela y frijol soya. Pese
aproximadamente 5,0 g del
material vegetal a utilizar

enzimtico

de

colquelo en un mortero y
macere con 20ml de NaCl 1%
previamente
enfriado en un bao de hieloagua y realice la extraccin por
15 minutos; luego Centrifuge por
10min a 2500 rpm.

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Centrifuge
a 2500 rpm por 10 min y coloque
el sobrenadante en el baln
aforado y complete a volumen
con
NaCl al 1%. Guarde el extracto
enzimtico refrigerado en un
bao agua-hielo.

Mezclar bien el contenido de los

tubos de ensayo y colocarlos en
un bao termostatado entre 50
y 60o C por 10 min para el
desarrollo del color. Dejar enfriar
y leer la absorbancia a 630 nm;
si la absorbancia es mayor a 2.0,
realizar la dilucin adecuada y
volver a leer.

Transfiera el sobrenadante a un
baln aforado de 50ml y el
residuo transfiralo nuevamente
al
mortero y realice una segunda
extraccin con 10ml de NaCl al
1% y fro, por 15 min.

BIBLIOGRAFA
Mdulo de Bioqumica.

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RECONOCIMIETO CUALITATIVO DE LIPIDOS

#6
Gloria Perdomo
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Bsicas, Tecnologa e Ingeniera ECBTI. Bioqumica. Grupo # 2. Bogot - Colombia. Docente Marcela ZAMBRANO.
Sesin 3: Noviembre 14 de 2013
Entrega preinforme: Noviembre 14 del 2013

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Gloria
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Correo electrnico

Cdigo

Mediacin

Grupo terico

glorikapt@hotmail.com

1022974304

CV

201103_43

ST: Sistema Tradicional

OBJETIVOS
ESPECFICOS

reconocer los diferentes tipos de

lpidos que se encuentran en los
tejidos biolgicos.
establecer relaciones entre la
estructura y la funcin de los
lpidos y su participacin en los
diferentes procesos metablicos.

Nombre
tutor
terico

Correo tutor terico

Golda
Torres

golda.torres@unad.edu.co

CV: Campus Virtual

En su composicin intervienen cidos grasos

y otros componentes como alcoholes,
glcidos,
cido
fosfrico,
derivados
aminocidos etc.
Lo lpidos compuestos se clasifican en:

fosfolpidos: y de estos parten los

fosfogliceridos (glicerofosfolipidos) y
los fosfoesfingolipidos

gucolipidos: y de este parten los

cerebrocidos y los grangliosidos.

.
CONCEPTOS TERICOS

COLESTEROL.

LIPIDOS COMPUESTOS.

El colesterol es un esterol (lpido) que se

encuentra en los tejidos corporales y en
el plasma sanguneo de los vertebrados.
Se presenta en altas concentraciones en
el hgado, mdula
espinal, pncreas y cerebro. Pese a tener
consecuencias perjudiciales en altas
concentraciones, es esencial para crear
la membrana plasmtica que regula la

Son los lpidos que adems de contener en

su molcula carbono, hidrogeno y oxigeno
tambin contienen otros elementos como
nitrgeno, fosforo, azufre u otra biomolecula
como un glcido. A los lpidos complejos
tambin se les llama lpidos membrana
pues son las principales molculas que
forman las membranas celulares.

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entrada y salida de sustancias que

atraviesan la clula. El nombre de
colesterol
procede
del
griego
, kole (bilis)
y
, stereos (slido), por haberse
identificado
por
primera
vez
en
los clculos de la vescula biliarpor Michel
Eugne Chevreul quien le dio el nombre
de colesterina, trmino que solamente
se conserv en el alemn (Cholesterin). Abundan
en las grasas de origen animal.

ESTRUCTURA DEL COLESTEROL.

La frmula qumica del colesterol se

representa de dos formas: C27H46O /
C27H22OH.
Es
un lpido esteroide, molcula de ciclopent
anoperhidrofenantreno (oesterano),
constituida
por
cuatro
carboxiclos
condensados o fundidos, denominados A,
B, C y D, que presentan varias
sustituciones:
1. Dos radicales
metilo en
las
posiciones C-10 y C-13.
2. Una cadena aliftica ramificada de
8 carbonos en la posicin C-17.
3. Un grupo hidroxilo en la posicin
C-3.
4. Una
insaturacin
carbonos C-5 y C-6.

entre

es bastante soluble en disolventes

apolares como elcloroformo (CHCl3).

PRUEBAS DEL COLESTEROL.

Algunos de los primeros mtodos para

efectuar pruebas de colesterol incluan la
obtencin de productos coloreados,
haciendo reaccionar el colesterol con
sustancias fuertemente cidas. Dado que
se descubri que los steres de colesterol
y el colesterol libre no producen
cantidades equivalentes de color esto dio
lugar a la adicin de un paso de
saponificacin para transformar los
steres de colesterol en colesterol libre.
Actualmente se utilizan mtodos ms
rpidos y seguros que utilizan enzimas
como reactivos para las pruebas de
colesterol.
A qu tipo de lpidos pertenece el
colesterol.
El colesterol es un esterol (lpido) que se
encuentra en los tejidos corporales y en
el plasma sanguneo de los vertebrados.
Es un lpido esteroide. Se presenta en
altas concentraciones en el hgado,
mdula espinal, pncreas y cerebro.

los

En la molcula de colesterol se puede

distinguir una cabeza polarconstituida por
el grupo
hidroxilo y
una
cola
o
porcin apolar formada por el carbociclo
de
ncleos
condensados
y
los
sustituyentes alifticos. As, el colesterol
es una molcula tan hidrfoba que la
solubilidad de colesterol libre en agua es
de 10-8 M y, al igual que los otros lpidos,

LA YEMA DE HUEVO.

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Que son los fosfolpidos.

os fosfolpidos son
un
tipo
de lpidos anfipticos compuestos por una
molcula de glicerol, a la que se unen
dos cidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un
grupo fosfato. El fosfato se une mediante
un enlace fosfodister a otro grupo
de tomos,
que
generalmente
contienen nitrgeno,
como colina, serinao etanolamina y
muchas veces posee una carga elctrica.
Todas lasmembranas plasmticas activas
de las clulas poseen una bicapa de
fosfolpidos.
Los fosfolpidos ms abundantes son
la fosfatidiletanolamina (o cefalina),fosfati
dilinositol, cido
fosfatdico, fosfatidilcolina (o lecitina)
y fosfatidilserina.
ESTRUCTURA DE LOS FOSFOLIPIDOS
La estructura bsica de los Fosfolpidos
es muy similar a la de los triglicridos
excepto que el C-3 (sn3) del esqueleto
de glicerol esta esterificado al cido

fosfrico. La estructura bsica de los

fosfolpidos es el acido fosfatdico que
resulta cuando la sustitucin X en la
estructura bsica que se indica en la
figura que sigue es un tomo de
hidrogeno. Las sustituciones incluyen a
la etanolamina (fosfatidiletanolamina),
colina
(fosfatidil
colina,
tambin
llamadas
lecitina),
serina
(fosfatidilserina),
glicerol
(fosfatidilglicerol), mio-inositol
(fosfatidilinositol, estos compuestos
pueden tener una variedad en el
nmero de alcohol inositol que sean
fosforilados
generando
polifosfatidilinositoles),
y
fosfatidilglicerol (el difosfatidilglicerol
ms comnmente conocido como
cardiolipinas). Vea la pagina Sntesis
de Lpidos para las imgenes de varios
fosfolpidos.

QUE SON LOS ESFINGOLPIDOS.

Los esfingolpidos
o
esfingofosfolpidosson lpidos complejo
s
que
derivan
delaminoalcohol insaturado de
18 carbonosesfingosina; la esfingosina se
halla unida a uncido graso de cadena
larga
mediante
un
enlace amida formando la ceramida. Son
una clase importante de lpidos de
las membranas
celulares de animales y vegetales y son

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los ms abundantes en los tejidos de los

organismos ms complejos.
GLUCOLIPIDOS.
Los glucolpidos o glucoesfingolpidos
son esfingolpidos compuestos
por
una ceramida (esfingosina + cido graso)
y un glcido de cadena corta; carecen de
grupo fosfato. Los glucolpidos forman
parte
de
la bicapa
lipdica de
la membrana celular; la parte glucdica de
la molcula est orientada hacia el
exterior de la membrana plasmtica y es
un
componente
fundamental
del glicoclix,
donde
acta
en
el reconocimiento
celular y
como receptor antignico.
Entre los principales glcidos que forman
parte de los glucolpidos encontramos
la galactosa,
la manosa,
la fructosa,
laglucosa, la N-acetilglucosamina, la Nacetilgalactosamina y el cido silico.

MATERIALES
Probeta de 100 ml
Agitador de vidrio
Vaso de precipitado de 600 ml
Vaso de precipitado de 1000 ml
Vaso de precipitado de 600 ml plstico
Vaso de precipitado de 1000 ml plstico
Esptula
Erlenmeyer de 250 ml
Pipetas de 10 ml
Soporte universal y pinzas.
Pinzas para la varilla refrigerante
Pinzas para crisol Crisol o cpsula
mediana y pequea.
Pinzas de madera
Embudos
3 huevos
20 gramos de cerebro fresco de res.

REACTIVOS.
180 ml de etanol
200 ml de ter
50 ml de KOH 1.5N
50 ml de acetona
50 ml de HNO3
Solucin de molibdato de amonio
50 ml de acetona

Dependiendo del glucolpido, la cadena

glucdica puede contener, en cualquier
lugar,
entre
uno
y
20 ml de etanol
quince monmeros demonosacrido. Al
20 ml de ter
igual que la cabeza de fosfato de
10 ml de acetona
un fosfolpido, la cabeza de carbohidrato
10 ml de HNO3
de un glucolpido eshidroflica, y las colas
Solucin de molibdato de amonio
de cidos grasos son hidrofbicas. En
30 ml de acetona
10 ml de HC
disolucin acuosa, los glucolpidos se
50 mlter
de NaOH
al 30bien la yema, agitando
disuelva
comportan
de
manera
similar Preparar
a una solucin de alcohol
as: 40 ml de alcohol y 20 Reactivo
ml de ter.
durante
10 minutos, filtre a travs de
Ay
B
DE
Fehling
los fosfolpidos.
Tome un huevo, hacer un orifico en
papel filtro y recoja el filtrado en un
uno de los extremos y a travs de l
vaso de precipitado seco.
deje salir la clara.
Prepare una solucin de mezcla de
Luego transfiera la yema a un vaso
etanol- ter (2:1), tome 14 ml de
de precipitado PROCEDIMIENTO
que contenga una
etanol y mezcle con 7 ml de
mezcla de 40 ml de etanol
ter.
1.2 Reconocimiento de
y 20 ml de ter

fosfogliceridos
fosfolipidos
RECONOCIMIENTO
DEo COLESTEROL
Y FOSFOLIPIDOS A PARTIR DE LA
YEMA DE
Disolver el residuo
Utilice
el
resto
del
Lave el residuo con 20
HUEVO.precipitado.
enml5 de
mldedela agua
Paselo
a un
formar un precipitado
que
mezcla
de etanol- ter (2:1).

PARTE EXPERIENTAL

Se debe
destilada y 5 gotas
crisol y caliente sobre
un a sequedad
generalmente
es
fosfolipidos.
Evapore
de el filtradoHNO3
Centrifugue y recoja el sobrenadante
mechero hasta convertirlo
anterior sobre una concentrado,
plancha de filtren
en un vaso de precipitado de
50 ml.
calentamiento
o a baoymara,
completamente
en
agregue al filtrado
El
precipitado debe cenizas.
recogerlo
cuidando de no dejar
el de
1
mlquemar
de solucin
guardarlo para la prueba de
residuo. Disuelva el residuo
en 5 ml de
Molibdato
fosfolipidos.
de ter y virtalo poco aamonio. Observe la
poco y agitando en coloracin
un vaso dey
la
precipitado que contenga
20 ml de de
formacin
precipitado.
acetona.

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EXTRACCION DE LIPIDOS DEL

CEREBRO

1.1 Reconocimiento de
colesterol
Evapore el liquido anterior a
bao mara, hasta que se
forme una pasta Agregue 15 ml
de de solucin de KOH al 1.5
N, agite bien y transfiera a un
erlenmeyer de 250 ml y
deposite en l perlas de vidrio y
caliente la mezcla a reflujo
durante 20 minutos.

Enfriar y aadir 20 ml de
ter, agita r durante 10
minutos y centrifugar. El
precipitado
es
jabn,
descartar.
Guardar
el
sobrenadante que contiene
colesterol.

Tome
el
sobrenadante,
evaprelo en una bao de
vapor, lejos de la llama, cuando
ya quede slo el residuo,
adicionar 5 ml de alcohol y
pasar la solucin a un tubo de
centrifuga y centrifugar durante
5 minutos.

Pasar el lquido sobrenadante a

otro tubo de centrifuga y aadir
agua gota a gota hasta que se
forma bastante precipitado.
Dejar en reposo durante 15
minutos
y
centrifugar
nuevamente y decantar el
lquido sobrenadante, guardar y
marcar como sobrenadante de
colesterol.
Recoger
el
precipitado.

Pese 4 gramos de cerebro

fresco de res. Reprtalos en
dos tubos de centrifuga,
macrelos con
ayuda
de
un
agitador
suavemente contra las paredes
del tubo. Agregue 5 ml de
acetona, mezcle
durante 10 minutos, centrifugue
a 3000 rpm por dos minutos.

Decante la acetona en un
erlenmeyer de 50 ml y
colquele
el
nombre
de
extracto I.
Con el residuo, agregue 10 ml
de
acetona,
vuelva
a
centrifugar y el sobrenadante
colquelo en el
vaso de extracto I
Coloque el residuo de los tubos
a bao mara por 10 minutos y
agrguele 5 ml de ter, mezcle,
centrifugue a 3000 rpm por 1
minuto, decante el ter en otro
vaso de 50 ml marcado como
extracto II.

mezcle bien, centrifugue a

3000 rpm a 2 minutos, decante
el etanol en un tercer vaso de
50 ml y marcado como extracto
III. Repita una vez ms el
procedimiento desde laadicin
de los 5 ml de etanol caliente.

Al residuo adicinele 5 ml de
ter y vuelva a centrifugar y el
lquido depostelo en el vaso
del
extracto II. Repita nuevamente
la operacin.
Extienda en los tubos el
residuo y squelo a bao
mara, una vez secos adicione
5 ml de etanol al 97% caliente

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separacion de los lipidos del

extracto II

Evapore a bao mara el extracto II.

Agregue al residuo 5 ml de
acetona, mezcle bien y centrifugue
por 2 min. Decante el lquido en el
vaso de extracto I.
Al residuo que queda, agregu 5 ml
de ter, mezcle bien, y centrifugue,
decante el liquido en el
vaso del precipitado extracto II.

Al residuo adicione, 3 ml de etanol

caliente, mezcle y centrifugue y
decante el etanol en el vaso
de extracto III.
Evapore los extractos II y III, hasta
sequedad. (en bao mara),
Tome el extracto II, adicione 4 ml
de etanol caliente y realice las
pruebas para fosfolipidos.

2.2 prueba para fosfolipidos

Coloque el extracto en una
cpsula de porcelana, evapore
el etanol, contine calentando
hasta
que
el
residuo
quede
completamente en cenizas

adicione 5 gotas de HNO3, y 5 ml

de agua destilada, disuelva bien las
cenizas y filtre, al filtrado adicione 5
ml de Molibdato de amonio ,
observe la coloracin y formacin
de precipitados.

2.3 PRUEBA PARA

GLUCOLIPIDOS Y
ESFINGOLIPIDOS
Disuelva el extracto III, en 3
ml de etanol, calentando
para disolverla, agregue 4
ml de agua y
realice

Agregue 1 ml de HCL
concentrado,
agite
bien,
caliente a bao de agua
hirviendo por 15
minutos.
Deje
enfriar
y
adicinele gota a gota NaOH al
30% hasta alcalinizar (con tiras
de papel
indicador de pH), realice la
prueba de Fehling.

1.1 Reconocimiento de
colesterol1.1
Reconocimiento de
colesterol