Mtodos Cromatogrficos

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/

CROMATOGRAFIA

PLANAR

CENTRFUGA

CP

COLUNA

CCD

GASOSA

CG

LQUIDA

CGAR

CLSSICA

CLAE

Cromatografia
Histrico
Michael Tswett ()- botnico russo 1906
Etimologia
CHROMA = Cor
Graphein = escrever
Dcada de 30 camada delgada
Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG
Dcada de 60 CLAE

http://members.shaw.ca/vict/chemistry_test3.htm

Cromatografia
Definio
um processo pelo qual diferentes solutos so separados por uma
dinmica diferencial do processo migratrio em um sistema contendo
uma ou mais fases, das quais uma desloca-se continuamente em uma
dada direo e no qual as substncias exibem mobilidades distintas
devido a diferenas de adsoro,partio, solubilidade, presso de vapor,
tamanho da molecular ou densidade de carga inica.

Parmetros em cromatografia:
Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido)
Resoluo
Pratos tericos
Altura equivalente a um prato terico (HETP)

Definio
Mtodo fisico-qumico de
separao de substncias
Presena de duas fases:
Estacionria e mvel
Separao ocorre devido a
diferena de interao
entre as substncias e as
fases
Podendo ser uma analise
qualitativa e/ou quantitativa

Cromatografia em papel

PRINCPIO BSICO
Tcnica de separao e anlise de misturas por
interao dos seus componentes entre uma Fase
Estacionria e uma Fase Mvel.

Uses for Chromatography

Chromatography is used by scientists to:
Analyze examine a mixture, its components,
and their relations to one another

Identify determine the identity of a mixture or

components based on known components

Purify separate components in order to isolate

one of interest for further study

Quantify determine the amount of the a mixture

and/or the components present in the sample

Cromatografia: Classificao
1. Forma fsica do suporte
Cromatografia planar: CP e CCD
Cromatografia em coluna CG e CL
-dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica)
-estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico)
-tipo de coluna (aberta/fechada)
-fase estacionria (lquido/slido)
2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou
mecnico)
3.Polaridade das fases utilizadas

Mecanismos de separao

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm

Polaridade da fase estacionria:

Fase normal - Fase estacionria polar
Fase reversa - Fase estacionria apolar

CCD - exemplos

Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma
solvel na FM
estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil

Thin Layer Chromatography - t.l.c.

Series of spots forms

Compare samples in mixture with
known substances.
Measure Rf values.
Coloured compounds & colourless
compounds.

Separation and identification.

Pigment

Colour

RF value

carotene

yellow-orange

0.91

pheophytin a

grey

0.75

pheophytin b

light grey

0.63-0.75

chlorophyll a

blue green

0.63

chlorophyll b

green

0.58

xanthophylls

yellow

0.53

xanthophylls

yellow

0.47

xanthophylls

yellow

0.32

Eluent: Cyclohexane : propanone :petroleum ether (low boiling point) 5 : 3 : 2

Cromatografia em Camada Delgada

Mtodo rpido (20-40 min.)

Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)

Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido
Natureza da amostra
1.saturados x insaturados

Comportamento cromatogrfico
> reteno insaturados

2.grupos funcionais
COOH > -OH > -NH3 > -SH > -CHO > C=O > CO2R > OCH3 > CH=CH
e
3. Impedimento estrico

Atividade: I, II ...V ( % de gua adicionada

0----15%)

Cromatografia em papel

Compostos hidrossolveis, cidos

orgnicos e ions metlicos
Princpio: partio (solubilidade)
Quantidade de amostra necessria
10-3 a 10-6 g
Tipos: ascendente, descendente,
bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - gua retida na celulose
(papel Whatman)
Mtodos de deteco: fsicoqumicos
Anlise qualitativa: Rf (fator de
reteno) - problema :
reprodutibilidade
Anlise quantitativa: densitmetro,
extrao dos solutos

Adsoro depende:

Tipos de adsorventes:

natureza qumica do
adsorvente

G- aglutinantes (gesso amido ou

talco)

rea de superfcie/
tamanho da partcula

H- sem aglutinante (p/ CL)

porosidade da partcula

F- contm fluorescncia

- atividade- - >stios ativos

R- adsorvente sem aditivo

P-camada preparativa

Critrios para escolha da fase mvel:

analitos devem ser solveis diferentemente
no deve haver reao entre analitos/FM e
FM/FE

Comparao
CP

CCD

Vantagens:
tcnica simples
no requer
instrumentao sofisticada
baixo custo

Vantagens:
maior sensibilidade
mais rpido
> repetibilidade
< difuso
> faixa de aplicao
reveladores reativos
permite aquecimento
Desvantagens
degradao de compostoslbeis
devido grande superfciede
exposio
dificuldades na quantificao

Desvantagens:
uso limitado
alargamento de banda-difusopouca alternativa de reveladores

Cromatografia Lquida em coluna aberta

Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (HPLC)

Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado,

caros

Sistemas de injeo:vlvulas de volumes definidos

Colunas de guarda

Colunas: recheios
materiais porosos com partculas

de dimetros o mais homogneo possvel e de
dimetro igual ou menor a 10 um (em geral)
Silica e
Alumina.

Colunas com fase ligada
silica como suporte

A) formao do ster silicato (Si- O

-

R)

B)formao da ligao siloxano (Si-

O
- SiR)

C)Ligao Si- C

At 60.000 pratos tericos

Detector:
Alta sensibilidade
Resposta rpida para todos os compostos da amostra
Insensvel mudanas na Fase mvel
Insensvel mudanas de temperatura
Resposta independente para a fase mvel
Resposta linear
No deve destruir a amostra
Fcil operao
Fornecer informaes qualitativas

Detector Uv
- Vis
Detector de Fluorescncia
Detector de arranjo de diodos
Detector de ndice de Refrao
Detectores eletroqumicos
Quantificao:
Calibrao Externa
Calibrao Interna

Cromatografia a Gs
Rapidez
Alto poder de separao

Amostras volteis

Separao de vrias classes

de compostos em uma anlise

Compostos termicamente

Sensibilidade (ppm - ppb)

Tcnicas auxiliares p/
identificao

Facilidade de registrar dados

Variedade de detetor
(especificidade)

estveis

Cromatografia a Gs: aplicaes

Anlise de cidos graxos e triglicerdeos
Anlise de micotoxinas
Anlise de compostos volteis responsveis pelo
aroma caracterstico de alimentos
Anlise de aucares
Anlise de amino cidos
Anlise de pesticidas
Anlise de frmacos
etc
etc

Cromatografia a Gs: tipos

Cromatografia Gs-Slido
FE: slidos (slica, carvo grafitinizado,
polmeros porosos)
Princpio de reteno:(adsoro, volatilidade)
Cromatografia Gs-Lquido ***
Lquido mantido estacionrio em suporte inerte
Princpio de reteno: solubilidade, volatilidade

Cromatografia a Gs: Instrumentao

Gs de arraste (FM)
H2, N2, He, Ar
Funo: transporte da amostra
Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro

Cromatografia a Gs: Instrumentao

Injetor
Colunas empacotadas cmara de aquecimento
Colunas capilares:
split
splitless
on- collum
Cuidados:
Introduzir qtddes reprodutveis
de amostra
Vaporizar totalmente a amostra
sem decomp-la
No discriminar compostos

Cromatografia a Gs: Instrumentao

Colunas - tipos
Parmetro

Coluna empacotada

Coluna capilar

Diam. Int. (mm)

1-4

Compri/o (m)

1-3

Pratos tericos

2400

3000

0,5 - 2

Espessura F.E.(m)
Vazo gs (ml/min)

20 - 60

Vol. amostra (l)

02 - 20

0,15 - 0,75
10 -100

1- 5
0,001- 0,5

http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/

Cromatografia a Gs: Instrumentao

Colunas - fase estacionria (FE)
Apolar: hidrocarbonetos no aromticos, silicones (ex.: SE-30) P.E.
Polar: contm grande quantidade de grupos polares (Ex.:
Carbowax)- interaes tipo pontes de hidrognio
Intermediria: grupos polares ou potencialmente polares em
esqueleto apolar (Ex. SE-52)
Escolha da coluna:
Polaridade da fase estacionria,
dimetro e espessura do filme
quantidade de amostras, tempo
de anlise, presso (velocidade da FM), temperatura do forno
Comprimento
pratos tericos

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Colunas - fase estacionria (FE)
Abreviao de algumas fases estacionrias
DEGA- adipato de dietileno glicol
DEGS- succinato de dietileno glicol
SE
- 30- metil silicone
OV- 11- 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M- polietilnoglicol

Programao de temperatura

Cromatografia a Gs: Instrumentao

Detetor - requisitos

Alta sensibilidade

Baixo nvel de rudo

Faixa linear ampla p/ a resposta

Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos,

especficos)

Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura

Destrutivos/ no destrutivos

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Detetor -Tipos

Ionizao de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal)

FM = hidrognio ou nitrognio, destrutivo

Condutividade trmica (resposta universal, no destri a amostra) - FM

= helio ou hidrognio,no destrutivo

Captura de eltrons (seletivo p/ halognios orgnicos, nitrilas, nitratos e

organometlicos) FM = nitrognio, no destrutivo

Terminico (seletivo p/ compostos contendo N e P)

Formao de ons pela combusto

da amostra na presena de H2 e O2.
Origina corrente eltrica no coletor
gerando um sinal do qual a
combusto do gs de arraste
descontada

O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram

eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente
constante que ser registrada como linha de base.
Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar
eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo
proporcional concentrao do composto.

Cromatografia a Gs: Anlise qualitativa

Tempo de reteno
Tempo de reteno relativo
Co-cromatografia com padres (spiking)
Grficos p/ sries homlogas
ndices de reteno (Kovats, ECL)
Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)

Tr= tempo de reteno

Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer
a coluna
Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm

Cromatografia a Gs:Anlise quantitativa

Relao concentrao
x
rea do pico

Normalizao

Padro interno

Padro externo

Fator de resposta

Normalizao:
Todo componente produz um pico (f)
A resposta do detector dependente apenas da
concentrao (f)

Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas
Padres em concentraes prximas amostra
Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo

Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma

determinada classe de substncias
Fator de resposta= concentrao/rea

Para um padro contendo a

mesma concentrao de trs
substncias diferentes com
reas A1, A2 e A3

Se assumirmos um fator
como 1,00 por ex. f3 =1,00

Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada
uma calculada utilizando estes fatores:

Exemplo .Uma amostra contm X, Y e Z.

O padro contm 200 mg de cada em 100mL de solvente.
A injeo de 5uL resulta em:

Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8
Fy = 1190/660 = 1,8

II. A anlise da mostraproblema resulta em:

Multiplica-se cada pico por seu fator:

X= 90 x 5,8

Y = 265 x 1,8 e

Z = 460 x 1

rea total = 450 + 477 + 460 = 1387

Depois calcula-se a % de rea

Z deve estar presente em todas as amostras

Esse mtodo corrige a diferena de volume a cada injeo

Padronizao interna
Uma substncia conhecida adicionada em concentrao
definida em todos os padres e nas amostras;
No co-elui com a amostra
estvel e detectado na concentrao em que se encontra

Etapas:
Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as
reas e concentraes do PI e da substncia de interesse
Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo
estoque do padro interno (PI)