Laboratorio de Bioqumica, Diciembre 7 de 2105

Informe No.5

CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Gutirrez, Viany, 2111

Rodrguez E. Duvn, 2111841

Resumen:
Se emplearon dos mtodos para cuantificar una protena, Albumina srica bovina (BSA): el
mtodo de Bradford y el mtodo de Biuret, que mediante la preparacin de una curva de
calibracin sirvieron para determinar la concentracin de BSA en una muestra desconocida
de la protena.
Palabras claves: mtodo de Bradford, mtodo de Biuret, curva de calibracin, Ley de
Lambert-Beer.

1. Introduccin

Mtodo de Bradford

Cuando se quiere conocer la actividad especfica

de una enzima o el contenido proteico de un
alimento, es necesario conocer cuantitativamente
la concentracin de protenas.
Se han
desarrollado diferentes mtodos que se basan en
la formacin de complejos entre las protenas y
reactivos especficos.
El mtodo de Bradford cuantifica la unin entre
un colorante y una protena, y compara su seal a
595nm con soluciones patrn de la misma. Otro
mtodo es la tcnica de Biuret, que forma un
complejo violeta con la protena, y compara su
seal a 545nm.

Est basado en el cambio de color del

colorante azul brillante de Coomassie en
respuesta a diferentes concentraciones de
protenas. Este compuesto inter acciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y
aromticos. Esta unin del colorante con las
protenas provoca un cambio en el mximo de
absorcin del colorante desde 465 a 595 nm. Por
lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del
Azul Brillante de Coomassie G-250 de
presentarse en dos formas con colores
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte
en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de
Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
El mtodo tiene una sensibilidad de 1-15 g.

2. Marco terico
1

Mtodo de Biuret

Blanco
1
2
3
4

La reaccin de Biuret es una reaccin coloreada

(violeta) debida a la formacin de un complejo de
Cu en un medio alcalino en compuestos que
poseen ms de un enlace peptdico, como las
protenas:

0
0,2
0,6
0,8
1
0,59

M. problema M1

0,001
0,669
1,066
1,149
1,422
1,027

Tabla 1. Datos espectrometricos obtenidos durante el ensayo de

Bradford.

Mtodo de Biuret.

Figura 1. Complejo formado de Cu2+.

Este mtodo tiene una sensibilidad de 1000-10000
g.

Blanco
5
6
7
8
9
10

0
2,5
5,0
7,5
10
15
20
5,80

Absorbancia

0,000
0,065
0,131
0,192
0,257
0,366
0,478
0,150

A partir de los datos de las tablas 1 y 2 se

construyeron las grficas de absorbancia en
funcin de la concentracin con el fin de hallar la
expresin matemtica que correlacione de forma
lineal las dos variables y as poder hallar la
concentracin de la muestra problema por
interpolacin.

Las tablas 1 y 2 muestran los datos

espectrometricos obtenidos luego de aplicar los
mtodos de cuantificacin de protenas; en ellas
se especifica la concentracin de cada patrn de la
curva y su respectiva absorbancia as como la
absorbancia de la muestra problema que en los
dos mtodos se ubic dentro del rango de
cuantificacin por lo que no fue necesario diluir la
muestra.
Mtodo de Bradford
Concentracin(mg/ml
)

Concentracin(mg/
ml)

M. problema
M2
Tabla 2. Datos espectrometricos obtenidos durante el ensayo de
Biuret

3. Resultados y discusin

tubo

tubo

Absorbancia
2

Mtodo de Bradford

Mtodo de Biuret
1.42

f(x) = 0.9x + 0.49

R = 0.98

1.07

1.15
f(x) = 0.02x + 0.01
R = 1

0.67

Grfica 1.Curva de calibracin. Los datos experimentales

no se ajustan de manera estricta a una relacin lineal.

Grfica 2. Curva de calibracin. Los datos se ajustan

perfectamente a una relacin lineal

A partir de la expresin matemtica presentada en

la grfica 1 se puede hallar la concentracin de la
muestra analizada por el mtodo de Bradford.
Sustituyendo el valor obtenido de absorbancia,
1,027 se obtiene:
A=0,902C +0,4902
1,027=0,902C +0,4902

Por lo que la concentracin en mg/ml de la

solucin es
C=

1,0270,4902
=0,59 mg/ml
0,902

De igual forma se hall la concentracin de una

muestra problema empleando el mtodo de
Biuret. A partir de la grfica 2 se obtiene que la
concentracin est dada por la expresin

C=

0,1500,0135
=5,80 mg/ml
0,0235
3

El resultado del mtodo de Bradford es aceptable,

sin embargo cabe resaltar que la curva de
calibracin puede mejorarse ya que la
concentracin calculada debera ser un poco
menor dada la correlacin existente entre las

absorbancias. Por el contrario el mtodo de Biuret

funcion muy bien y el resultado es confiable ya
que se ubica entre una concentracin de 5 y 7,5
mg/ml tal como el valor de absorbancia lo
predice.

patrn

absorbanci
a

Protena (mg/ml)

Factor de dilucin*

Protena (mg/ml)
Concentracin medida

Protena (mg)**

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M1
M2

0,669

0,2

0,1/1,1

0,018

0,020

1,066

0,6

0,1/1,1

0,054

0,055

1,149

0,8

0,1/1,1

0,072

0,079

1,422

0,1/1,1

0,090

0,01

0,065

2,5

0,1/1,1

0,225

0,248

0,131

5,0

0,1/1,1

0,45

0,5

0,192

7,5

0,1/1,1

0,675

0,742

0,257

10

0,1/1,1

0,9

0,99

0,366

15

0,1/1,1

1,35

1,49

0,478

20

0,1/1,1

1,8

1,98

1,027

0,61

0,1/1,1

0,055

0,06

0,150

5,80

0,1/1,1

0,522

0,57

Tabla 3. Cantidad de protena en cada muestra.

*De cada patn se tom una alcuota de 0,1 ml y se mezcl con 1ml de reactivo.
**La cantidad de protena en la muestra analizada se halla multiplicando la concentracin de la solucin medida por el
volumen final de 1,1 ml.

4. Problemas propuestos
a. Defina con sus propias palabras que es una
curva patrn.
Es un mtodo que se utiliza para hallar una
concentracin desconocida de un analito, a partir
de patrones con cantidades conocidas de este.
Para utilizar la curva debe haber una relacin
lineal entre la seal aportada por el instrumento y
la concentracin del analito de inters.

El reactivo de Biuret forma un complejo colorido

que tiene un mximo de absorcin a 545nm. El
reactivo es una solucin alcalina que contiene
cobre y forma un complejo con los enlaces
peptdicos de la protena, ver figura 1.. La
reaccin se basa en la formacin de un complejo
de color violeta, debido a la reaccin entre los
pares de electrones libres del nitrgeno que
forman el enlace peptdico y los iones Cu2+. Este
complejo posee mximo de absorcin en 300nm y
en 545nm, pero la utilizada es la segunda debido a

b. Explique por qu en el mtodo de Biuret la

absorbancia de una protena se lee a una
longitud de 545nm.
4

que a 300nm se encuentran interferencias con

otros elementos.

La cuantificacin de protenas la hara por el

mtodo de Biuret, es una muestra que muy
probablemente posee la concentracin en los
lmites de deteccin.

c. Cul es el mtodo ms sensible y el menos

sensible? Por qu?
La sensibilidad de un mtodo analtico mide la
capacidad del mtodo para diferenciar entre
pequeas variaciones del analito. Y segn la
IUPAC se define como la pendiente de la curva de
calibracin. Por lo tanto el mtodo ms sensible
es el de Bradford, puede distinguir menores
diferencias de concentracin y la pendiente de la
curva de calibracin es mayor en comparacin del
mtodo de Biuret. En consecuencia el mtodo
menos sensible es el de Biuret.
d. Decide qu mtodo de determinacin de
protenas elegiras para la cuantificacin de
protenas en: suero, orina, durante una
purificacin enzimtica, en un extracto
bacteriano concentrado, en preparaciones de
membranas plasmticas solubilizadas con
SDS, en preparaciones de membranas
mitocondriales solubilizadas con Triton X100. Justifique su respuesta.

Orina
La cuantificacin de protenas la hara por el
mtodo de Bradford ya que, la presencia de
nitrgeno en urea de la muestra crea interferencia,
en el mtodo de Biuret.
Durante la purificacin enzimtica
La cuantificacin de protenas la hara por el
mtodo de Bradford porque, es el mtodo ms
sensible ideal para una muestra delicada y escasa.
Adems el calentamiento al que se debe someter
la muestra en el mtodo de Biuret podra
desnaturalizar las enzimas.
En preparaciones de membranas plasmticas
solubilizadas con SDS y en preparaciones de
membranas mitocondriales solubilizadas con
Triton X-100
La cuantificacin de protenas la hara por el
mtodo de Biuret ya que, el mtodo de Bradford
presenta interferencia con detergentes.

Suero y extracto bacteriano concentrado

5. Conclusiones
2. La concentracin real de la muestra analizada
por el mtodo de Bradford es menor. Las
desviaciones de la curva de calibracin generan
un aumento de la concentracin a la hora de
realizar la interpolacin con la absorbancia
obtenida.

1. Dada la sensibilidad de los dos mtodos era

de esperarse que la concentracin de la muestra
analizada por el mtodo de Bradford tuviera
una concentracin menor que la muestra
analizada por el mtodo de Biuret.
5

3. Cuando se presentan limitaciones en la

cantidad de muestra disponible, el mtodo de
Biuret es una buena opcin para realizar
procedimientos de cuantificacin de protenas.

IBAEZ C, Jorge; MAINERO M, Rosa;

DORIA S, Mara del Carmen. Experimentos de
qumica en microescala para nivel medio
superior. Universidad Iberoamericana. Mxico,
2009. Pgs. 291,292.

Referencias

OLIVER, Jordi; ROCA, Pilar; RODRIGUEZ,

Ana Mara. BIOQUIMICA, TECNICAS Y
METODOS. Editorial Hlice. Espaa, Madrid,
2003. Pg. 156.

CESPON
ROMERO,
Rosa
Mara.
DESARROLLO
DE
MTODOS
ANALTICOS AUTOMTICOS PARA LA
DETERMINACIN DE METALES EN EL
MEDIO AMBIENTE LABORAL. Universidad
de Santiago de Compostela. Espaa, Santiago
de Compostela, 2007. Pg. 166.