PRACTICA N4

TECNICAS DE COLORACION
I.

INTRODUCCION:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver
con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre
la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden
emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir
entre tipos diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo ms corriente,
aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y
alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido
secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce generalmente el
encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las
clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

II.

OBJETIVOS:

III.

Entrenar en la preparacin del frotis.

Conocer las diferentes coloraciones utilizados en la sala de prcticas.
Observar microscpica de morfologa y agrupamientos bacterianos.

MARCO TEORICO:

A. PREPARACION DEL FROTIS

Tiene como finalidad una delgada pelcula del preparado para una adecuada tincin y
observacin microscpica

A.1. EXTENSIN: Se emulsiona la pequea cantidad de bacteria con la gota de agua

destilada
* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en
el portaobjetos y se extiende con movimientos circulares.
* A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de
agua que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y
se extiende como antes.
A.2. SECAR: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin
A.3. FIJACIN: Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la
llama hasta que se seque, sin calentar demasiado. El calor excesivo alterara la forma
normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe
notarse caliente, pero no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano.
B. COLORANTE O TINTE
Cuando se requiere conocer los detalles morfolgicos de las bacterias es necesario
recurrir a tcnicas de coloracin. Los colorantes empleados pueden ser naturales o
sintticos
El tinte es un compuesto orgnico que le da contraste a la clula.
Cromgeno (solvente orgnico que le provee las propiedades de color)
Auxcromo (grupo qumico que se ioniza con el cromgeno y forma sales que se
pegan a las fibras y tejidos).
La adhesin del tinte va a depender de la carga que posea

Las propiedades cidas o bsicas de los colorantes permiten su fcil clasificacin en:
B.1. ACIDOS.
Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un ncleo colorante con carga
(-), es decir el grupo inico que imparte el color tiene carga negativa, o sea, es un

anin. Estos colorantes tien material citoplasmtico, no son muy usados en

Microbiologa. Por ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina cida
B.2. BSICOS.
En los que el ion que lleva el color tiene carga (+). Estos colorantes tienen
afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los ms usados
en microbiologa, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen
cido ribonucleico en todo el protoplasma de la clula bacteriana, stas se tien
fcilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta.
B.3. NEUTROS.
Se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la carga
elctrica de stos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina.
C. TIPOS DE TINCION
C.1. TINCIN NEGATIVA
No se trata de una tincin propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con
cromforos, ni se lleva a cabo ninguna reaccin entre estructuras celulares y los
colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solucin de
nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que
formarn una pelcula opaca a la luz. En este tipo de tincin se prescinde de la
fijacin por calor, se deja secar la preparacin y se observan los microorganismos
brillantes sobre un fondo oscuro

Fig. Tincin negativa de bacilos

C.2. TINCIN SIMPLE.
Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma, el tamao y la
ordenacin de las bacterias
Se denomina as, porque solo se utiliza un colorante, generalmente bsico.
Con este tipo de coloracin no se pretende diferenciar microorganismos o
estructuras celulares.
Las tcnicas de coloracin simple pueden ser positivas cuando el colorante es
fijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro o
coloreado sobre un fondo luminoso o claro

Fig. Tincin simple con cristal violeta de Staphylococcus

C.3. TINCION DIFERENCIAL:

Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas se pueden observar
diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son: la tincin
de gram y la tincin acido resistente
TINCIN DE GRAM.: En 1884, un bacterilogo dans, Christian Gram,
desarroll una tcnica de tincin que permite separar a las bacterias en dos
grandes grupos: gram positivas y gram negativas, basados en si retienen o no, el
colorante primario (cristal violeta) luego del proceso de decoloracin. Los
organismos que retienen el cristal violeta luego de la adicin del agente
decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta, y se designan como
gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tien con el colorante
secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan
FUNDAMENTO DE LA COLORACION GRAM
o El principal constituyente de la pared es un polmero complejo de azucares y
aminocidos (mureina)
o En los Gram negativos existe una membrana externa, compuesto por
fosfolpidos y lipopolisacaridos (LPS)
PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS

PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

C.4. COLORACION ESPECFICA

Incrementa el contraste, revela estructuras particulares como; endosporas,
flagelos y cpsulas
IV.

MATERIALES Y METODOS:
IV.1.
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

MATERIALES:

Cultivo de bacterias.
Cristal violeta (1 g. de cristal violeta en 100 cc de H2O Dest.).
Lugol (1 g. de yodo en 2 g. de yoduro potsico en 100 cc de H2ODest.).
Alcohol acetona.
Safranina (1 g. de safranina en 100 cc de agua destilada).
Aceite de inmersin.
Microscopio binocular.
Portaobjetos.
Asas de cultivo.
Mechero.

IV.2.

METODOLOGIA:

A. PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR FROTIS

o limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizar el frotis, dejarlo secar, una vez
seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces.

o Cuando este fri, marcar la cara donde se har el frotis.

o Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo
o Tomar el cultivo del que se har el frotis y flamear la boca de este. Tomar la porcin
de la muestra que se va a examinar por medio de un asa o escobilln.
o Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado
***Si la muestra se encuentra en un medio lquido, basta con colocar una pequea
gota con el asa estril sobre el portaobjetos.
***Si la muestra est en un medio slido, colocar una gotita de solucin salina o
agua destilada estril sobre el portaobjetos y con el asa estril se transfiere una
pequea muestra de bacterias en la gotita.
o Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda con el asa la
gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire.
o Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.
o Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10 min o hasta que seque
completamente.
o Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero, pasndolo tres veces a
travs de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre
el dorso de la mano.
B. PROCEDIMIENTO PARA TINCION SIMPLE Y NEGATIVA
o Cubra el frotis con la solucin del colorante simple o negativo durante 2 minutos.
o Lave el portaobjetos, con una corriente suave de agua, de manera que el agua no
incida directamente sobre la preparacin hasta que ya no escurra colorante.
o Deje secar el frotis al aire.
o Observar al microscopio con el objetivo de 100X
Fig. Preparacin del frotis y coloracin simple.

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C. PROCEDIMIENTO PARA TINCION GRAM

o Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.
o Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.
o Tomar material de la colonia elegida, con un asa previamente esterilizada a
la llama y suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad
del portaobjetos. Extender el material sobre toda la superficie del
portaobjeto.
o Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.
o Se cubre completamente el frotis con una solucin de "cristal violeta", y se
o
o
o
o

deja actuar durante 60 segundos.

Lavar con abundante agua destilada.
Agregar una solucin de "lugol" y dejar actuar durante 30 segundos.
Lavar con abundante agua destilada.
Decolorar el frotis obtenido colocndole sobre este alcohol acetona dejando

actuar durante 10 a 20 segundos.

o Lavar con abundante agua destilada.

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o Cubrir el frotis con gotas de una solucin llamada "safranina", dejndola

actuar durante 30 segundos.
o Lavar con abundante agua destilada nuevamente.
o Observar al microscopio con el objetivo de 100X

V.

RESULTADOS:

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VI.

CONCLUCION:

CUESTIONARIO
1. Qu es un colorante y que clases existe?

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2. Dibuje las principales formas de bacterias y sus formas de agrupacin?

3. Cul es la diferencia entre la coloracin simple y la coloracin negativa?

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4. Segn la coloracin estructural defina y mencione los colorantes que se

utiliza?
A. Capsula

B. Flagelo

C. Fimbria

D. Espora

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5. Mencione los colorantes de la batera de gram?

6. Por qu las bacterias gram positivas son violetas y gram negativas rosadas?

7. Mencione y explique cuales son los colorantes primarios y de contraste en la

coloracin diferencial?

VII.

BIBLIOGRAFIA:

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o AQUIHUATI Ramos, Maria de los Angeles y PERES Chavela, Maria de

Lourdes. 2004. Manual de prcticas del laboratorio de microbiologa general.
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUAT
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de abril del 2015
O COVADONGA Vzquez. Ana Martn, M Isabel De Silniz y SERRANO
Susana. Tcnicas bsicas de Microbiologa Observacin de bacterias. Reduca
(Biologa). Serie Microbiologa. 3 (5): 15-38, 2010 ISSN: 1989-3620
o MENDO Rubio, Manuel.2014. Manual de laboratorio Medios de cultivo en
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o RODRIGUEZ Valera Francisco. 2008. Prcticas de microbiologa.
o ROJAS Trivio, Alberto. 2011. Conceptos y practica de microbiologa general.
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q=conceptos+y+practica+de+microbiologia+general&oq=conceptos+y+practic
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