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QUITO
2015
ii
Los derechos que como autor me corresponden, con excepcin de la presente autorizacin,
seguirn vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artculos 5, 6, 8, 19 y
dems pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
iii
iv
AGRADECIMIENTO
A Dios mi gua, y mi fortaleza quien con su amor infinito me dirigi por el camino correcto,
quien me alivi en mis momentos de tristeza y me ayud a superar los obstculos que se me
presentaron.
A mis padres Manuel y Carme quienes con esfuerzo y sacrificio permitieron que yo culminara
con mis estudios universitarios, quienes con su cario y amor forjaron en m una persona de
bien.
A mi hermana querida Myrian Poalacin quien estuvo alentndome da tras da para seguir
adelante y no renunciar a mis sueos, gracias por entenderme, por tus consejos y especialmente
gracias por ser el instrumento que Dios utiliz para que l llegara a mi corazn y encontrara el
lado alegre de la vida.
A mis amigos Luis Asero, Melissa Enrquez, Glenda Andrade, Naty Velasco, Johanna Bonilla y
Anita Peralta que siempre estuvieron cuando los necesitaba brindndome su apoyo y amistad
desinteresada, tambin a mis amigos Diego Pullas, Victoria Ballagn y Margoth Quillupangui
quienes siempre encontraban la forma para hacernos olvidar de los momentos de tristeza.
A la Lic. Celia Velastegu quien siempre confi en mis capacidades, quien me alent y ayud a
que este trabajo se desarrollara.
A mi directora de tesis la Ing. Lorena Villareal quien con sus conocimientos me guio durante
todo el desarrollo de esta investigacin.
Mary.
CONTENIDO
pg
vi
3. DATOS .............................................................................................................................. 33
3.1 Datos preliminares ............................................................................................................ 33
3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas. .................................................................................. 33
3.1.2 Preparacin del sustrato en camineras.. ......................................................................... 33
3.1.3 Concentracin del inculo para siembra en camineras. .................................................. 34
3.1.4 Concentracin de esporas producidas en camineras.. ..................................................... 34
3.2 Datos del diseo experimental ........................................................................................... 35
vii
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 46
5.1 Resultados de las pruebas preliminares .............................................................................. 46
5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparacin del sustrato en camineras......................... 46
5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato.......................................................... 46
5.1.3 Concentracin de esporas obtenida de la propagacin en botellas.................................. 47
5.1.4 Curvas de concentracin versus volumen de agua adicionado al sustrato. ...................... 48
5.1.5 Curvas de concentracin versus porcentaje de humedad................................................. 49
5.2 Resultados del diseo experimental ................................................................................... 50
5.2.1 Volumen de agua ptimo.. .............................................................................................. 50
5.2.2 Resultados de la masa de agua total.. ............................................................................. 51
5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. ...................... 51
5.2.4 Construccin de la curva de crecimiento.. ...................................................................... 52
5.3 Curvas de crecimiento obtenidas ....................................................................................... 57
5.4 Resultados estadsticos ...................................................................................................... 60
5.4.1 Resultados de %CV.. ...................................................................................................... 62
5.4.2 Velocidad especfica de crecimiento microbiano.. ........................................................... 63
viii
5.5 Seleccin de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp. ............................... 63
5.5.1 Anlisis comparativo del % de humedad.. ....................................................................... 63
5.5.2 Anlisis comparativo de la concentracin.. ..................................................................... 64
5.5.3 Anlisis comparativo del coeficiente de variacin (%CV).. ............................................. 65
5.5.4 Seleccin de las mejores condiciones.. ............................................................................ 66
5.6 Resultados de aplicacin del hongo Trichoderma spp. ....................................................... 66
6. DISCUSIN ....................................................................................................................... 68
7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 70
8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 72
BIBLIOGRAFA .................................................................................................................... 77
ANEXOS................................................................................................................................ 79
ix
LISTA DE FIGURAS
pg
LISTA DE GRFICOS
pg
xi
LISTA DE TABLAS
pg
xiii
LISTA DE ANEXOS
pg
xiv
SIMBOLOGA
TH
Trichoderma harzianum
ms
Va
Vab
Vad
ma
mat
mas
mss
%H
concentracin de esporas
Ne
Dilucin
Temperatura
tiempo
velocidad de crecimiento
Desviacin de la pendiente
Vop
Concentracin promedio
Volumen ptimo
xv
RESUMEN
xvi
ABSTRACT
The best conditions were established for the growth of the Trichoderma harzianum and
Trichoderma hamatum fungi, in jungle-rice used as a solid substrate. To achieve this, native
strains from the area of Ambato were used, isolated in the ground by the MAGAP-Tungurahua
(Ministry of Agriculture, Livestock, Aquaculture and Fishing Tungurahua branch) and
purified by the company Plantsphere Laboratories (PSL). The work was done experimentally
using four levels of substrate moisture, for the first specie: 39,6%; 37,7%; 35,7% and 33,2%; for
the second one: 41,3%; 38,2%; 34,8% and 31%. The spores were incubated at three different
temperatures: environment (21C), 25C and 28C, with natural exposure to light. With the best
moisture for each specie and temperature, and using the curves of spore concentration versus
moisture level, a new inoculation was performed, which allowed the determination of the
growth rate presented by these microorganisms, with the application of growth curves.
The conclusion is that at 25C and 41,3% moisture level, the production rate presented by these
fungi is reduced, obtaining in both species a maximum value of 1,5x107 UFC/mL after 12 days
of incubation.
xvii
INTRODUCCIN
La conciencia social que se ha generado en los ltimos aos ante el enorme deterioro
medioambiental por el uso abusivo de compuestos contaminantes, ha generado un gran inters
en la bsqueda de nuevas estrategias de produccin, que sean ambientalmente sostenibles para
el control de plagas y enfermedades.
Una de las alternativas ms innovadoras para garantizar la seguridad alimentaria, para disminuir
los residuos txicos, los contaminantes del suelo y los recursos hdricos que alteran el equilibrio
ecolgico es la utilizacin del control biolgico, un mtodo que recurre a la ayuda de
microorganismos antagonistas de los agentes infecciosos para controlarlos de forma natural.
En el suelo se encuentran una gran cantidad de microorganismos benficos, entre estos el hongo
Trichoderma. Constituyen un grupo de microorganismos filamentosos, que producen sustancias
antibiticas, metabolitos antifngicos, son competidores por espacio y nutrientes frente a otros
microorganismos. Protegen las races de las plantas, desdoblan la materia orgnica facilitando la
asimilacin de nutrientes, son fciles de aislar, crecen en una amplia gama de sustratos siendo
factible su propagacin masiva. Tambin tiene capacidad de adaptacin y supervivencia en
cultivos de alta contaminacin producida por fungicidas.
El inters actual de disminuir el impacto ambiental con producciones ms limpias para proteger
los recursos naturales ha generado que hace poco tiempo estas especies adquieran un valor
comercial importante. Aunque en el mercado mundial ya se cuentan con formulados a base de
Trichoderma para el control de microorganismos, en el pas existe muy poca informacin. Por
tal razn este proyecto consiste en el estudio de la adecuada produccin masiva de dos especies
endmicas del cantn Ambato, Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum en sustrato
slido, con ayuda de curvas de crecimiento desarrolladas a condiciones controladas.
En el crecimiento de estos hongos se estudiaron dos variables esenciales que son; la cantidad de
agua para la preparacin del sustrato y la temperatura de incubacin, permitiendo generar mayor
produccin de esporas en un menor tiempo. Como primer punto se replic las especies en cajas
Petri, luego se multiplic en botellas de vidrio camineras y finalmente en fundas de
polietileno.
Se realiz ensayos de humedad del sustrato para determinar el mejor valor, adems para generar
comparaciones las especies fueron sometidas a tres temperaturas: al ambiente (21C), 25C y
28C, dando como resultado una mxima concentracin de esporas a la humedad del 41,3% y
temperatura de 25C a los doce das de tratamiento.
Como etapa final los biofungicidas obtenidos, fueron aplicados en plantas de moras y fresas
dando como resultado mayor rapidez de desarrollo, mejor intensidad del color y brillo,
indicativos de que plantas se encuentran sanas y que los microorganismos estudiados si ejercen
un efecto positivo en ellas.
Este anlisis adems de generar informacin propia y vital para el laboratorio, permiti conocer
el comportamiento de los microorganismos frente a los tratamientos realizados y optimizar dos
variables del proceso productivo, obteniendo un bio fungicida que ejercer una accin efectiva
en los diferentes cultivos donde sean aplicados, logrando cosechas ms sanas.
1. MARCO TERICO
Se alimentan de materia orgnica muerta, por lo que se les conoce como saprofitos, estos
generalmente no causan enfermedades. Solo descomponen restos complejos de vegetales y
animales, degradndolos a sustancias qumicas ms sencillas que son devueltas al suelo,
aumentando as su fertilidad. [1]
Algunos hongos pueden prosperar como parsitos invadiendo a sus hospedadores vivos
causando enfermedades (hongos patgenos) en plantas, animales y seres humanos. Los hongos
fitopatgenos ejercen un gran impacto econmico en la industria agrcola debido a las
enfermedades que les pueden causar a los cultivos.
Poseen una pared celular que contiene quitina, estn formados por largas fibras ramificadas,
llamadas hifas, las cuales forman el cuerpo principal del hongo o micelio. En la figura 1 se
indica una hifa con los principales organelos celulares. [2]
Las hifas estn rodeadas de una pared celular en forma de tubo que rodea una cavidad central o
lumen, donde se encuentra el protoplasma. La pared es de consistencia rgida y est compuesta,
principalmente, de hemicelulosa y quitina (dos polmeros fibrilares, el primero de Nacetilglucosamina y el segundo de glucosa). [3]
La reproduccin puede ser: [4]
Los hongos alcanzan un ptimo desarrollo en ambientes oscuros y hmedos con temperaturas
entre 22 y 30C aunque algunos pueden crecer a temperaturas tan altas como 62 C, tan bajas
como 0 C o menos y toleran amplios rangos de pH de 2 a 9 pero casi todos crecen mejor en un
pH cido. [5]
Son importantes porque permiten la elaboracin de pan, cerveza, quesos maduros, bebidas
espirituosas (vinos, champaas), son la base de medicinas como la penicilina, se utilizan en la
biorremediacin, en la agricultura, la horticultura y la silvicultura. Pero pueden ser dainos
cuando pudren madera, textiles, papel, alimentos, etc.
[6]
Las especies de este gnero se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se
presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen
materia orgnica o desechos vegetales en descomposicin. [7]
Este beneficioso hongo es filamentoso, hetertrofo, aerobio, su pared celular est compuesta de
quitina, coloniza fcilmente las races de las plantas, las mejora e impide que nuevos hongos
colonicen la zona donde ste se desarrolla. Son los antagonistas ms utilizados para el control
biolgico debido a su facilidad para ser aisladas y cultivadas en un gran nmero de sustratos.
Adems no son patgenos de plantas, ni peligrosos para los humanos o animales.
Su presencia puede ser detectada por un ligero olor a coco en el sustrato, as como por su color
verde y blanquecino. Producen enzimas y vitaminas, antibiticos que al ser absorbidos por las
races de las plantas generan un crecimiento ms rpido. En ciertos casos el antibitico formado
es especfico contra el patgeno de las plantas, garantizando as su eficacia.
[8]
CH3(CH2)3CH2
1.2.1 Clasificacin Taxonmica. Las especies del gnero Trichoderma spp. pertenecen a un
grupo de hongos filamentosos que han sido caracterizados por sus aplicaciones en el sector
agrcola como controladores biolgicos de una amplia gama de organismos patgenos.
La clasificacin taxonmica del gnero Trichoderma es: [10]
Reino:
Fungi
Divisin
Ascomycota
Subdivisin:
Pezizomycota
Clase:
Sordariomycetes
Orden:
Hypocreales
Familia:
Hypocreaceae
Gnero:
Trichoderma
5
1.2.2 Reproduccin. Las especies Trichoderma spp. se reproduce asexualmente, pueden utilizar
una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidn como fuente
de carbono. Muchas cepas crecen eficientemente en medios slidos o lquidos y en un amplio
rango de temperaturas, son relativamente tolerantes a humedades bajas y crecen en suelos
ligeramente cidos.
1.2.3 Morfologa.
Filides. Son en forma de botella, pueden estar solas o en grupos, hinchada en la regin
central pero delgada hacia el pice: son hialinas y en ngulo recto con respecto a los
conidiforos. Es donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para
la identificacin taxonmica a nivel de especies. [13]
Conidios. Son esporas asexuales de color verde amarillo blanco, con esporulacin densa
que aseguran la generacin del hongo durante gran parte del perodo vegetativo de las
plantas. Su pared est compuesta por quitina y glucanos. Su funcin es la reproduccin
rpida, dispersin y supervivencia. [14]
Sus colonias son de color amarillo verdoso (Figura 5). Interviene como digestor del nitrgeno
orgnico. Es tolerante a la tensin impuesta por escasez de nutrientes, se utiliza en el control
biolgico como fungicida, en aplicacin foliar, tratamiento de semillas y el tratamiento del suelo
para la supresin de diversos patgenos que provocan enfermedades fngicas. Tambin controla
el marchitamiento (una enfermedad que mata las plantas jvenes, ennegreciendo y encogiendo
los tallos). [15]
7
Penetra las races de las plantas sin causar daos, provocando cambios bioqumicos y formacin
de barreras fsicas. Los metabolitos que produce esta especie se encuentran relacionados con la
composicin del medio en el que se encuentra, es decir los nutrientes que tiene disponible.
Disminuye su poblacin conforme aumenta la altura sobre el nivel del mar. Su ambiente ptimo
son climas templados. [16]
[18]
Trichoderma es un hongo muy favorable porque no ataca a los seres vivos. Producen enzimas
como la -1,3-glucanasa que ayudan a degradar las paredes celulares de las hifas del hongo a
destruir (husped), consiguiendo as absorber los nutrientes del interior del hongo atacado.
En Biocontrol (2004) se indica que el proceso micoparastico incluye las siguientes etapas: [20]
Crecimiento de Trichoderma.
Secrecin de enzimas.
Los metabolitos con actividad antifngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de
compuestos voltiles y no voltiles, muy diverso en cuanto a estructura y funcin. Muchas cepas
de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros
microorganismos, con los que no se establece contacto fsico, estas sustancias inhibitorias son
consideradas como antibiticos. [21]
[22]
1.6.2 Humedad. La actividad metablica del hongo depende estrechamente de la humedad del
medio (sustrato), ya que esta variable influye significativamente en el crecimiento microbiano,
en la biosntesis y la secrecin de diferentes metabolitos.
Un bajo contenido de humedad limita la difusin de los nutrientes y la degradacin del sustrato,
dando como resultado un bajo crecimiento microbiano. Mientras que, altos valores de humedad
en la matriz slida disminuye la porosidad del sustrato dificultando la transferencia de oxgeno.
Por este motivo, es conveniente buscar el nivel ptimo de humedad con el objeto de optimizar el
crecimiento del microorganismo o, en su caso, obtener una mayor produccin de metabolitos
(enzimas, cidos orgnicos, etc.). [23]
1.6.3 Aireacin. Dos componentes del aire son esenciales para los hongos: el oxgeno y el
dixido de carbono, sin embargo es necesario tener en cuenta que altas concentraciones de CO 2
10
1.6.5 Tamao de partcula del sustrato. El tamao de partcula es un factor importante a tener
en cuenta. Los sustratos de partculas pequeas proporcionan una gran rea especfica, lo que
afecta de manera positiva al desarrollo del microorganismo. Sin embargo, un tamao de
partcula demasiado pequeo, que genere a su vez un espacio interarticular reducido, disminuye
la eficiencia de la respiracin/aireacin dificultando el crecimiento microbiano.
[27]
1.6.6 Exposicin de luz. La mayora de especies del gnero Trichoderma son fotosensibles,
puesto que se presentan una mayor esporulacin al ser expuestas a la luz. Sin embargo, cuando
se someten a perodos alternados de luz y oscuridad, se favorece la colonizacin del hongo
sobre diferentes sustratos slidos. [28]
El control biolgico se produce de forma natural sin intervencin del hombre, permite modificar
el equilibrio entre las poblaciones microbianas gracias a los mecanismos de accin entre los
patgenos y los microorganismos antagonistas. Los hongos poseen un conjunto de
caractersticas que los hacen agentes de biocontrol potencialmente ideales.
[29]
1. Muchas de las especies saprofitas antagonizan a la mayora de los organismos de las plagas.
11
12
1.9 Fermentacin
Desde el punto de vista microbiolgico, se entiende por fermentacin aquel proceso en el que
los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilizacin de sustancias
orgnicas, en ausencia o presencia de oxgeno. La descomposicin de los sustratos se lleva a
cabo por enzimas producidas por los microorganismos. [34]
Este mtodo es el ms usado por la industria biotecnolgica gracias a las siguientes ventajas: se
obtiene un producto ms homogneo, es ms sencillo el control de la temperatura, aireacin,
agitacin, y pH, adems se puede llevar a cabo la medicin directa de la biomasa. [37]
13
1.9.2 Fermentacin en medio slido. Las fermentaciones en sustratos slidos, utilizadas para el
cultivo de microorganismos en materiales slidos que contienen o no una cantidad limitada de
agua libre, se emplea en la obtencin de enzimas fngicos por cultivo en superficie. En este
proceso el sustrato sirve como soporte para que los microorganismos crezcan sobre l. Presenta
algunas ventajas como un menor costo de inversin, la reduccin del costo energtico y un
menor volumen de aguas residuales producidas. [38]
La tcnica de fermentacin en medio slido consiste de las siguientes etapas: [39]
Los hongos filamentosos son los microorganismos ms adaptados para crecer en sustratos
slidos con un bajo contenido de agua libre, reduciendo la probabilidad de contaminacin por
bacterias o levaduras: adems tienen la capacidad de utilizar polisacridos como fuentes de
carbono.
14
Fermentacin lquida
Fermentacin slida
Sustratos econmicos de carcter
Sustratos
agroindustrial
insolubles
biopolmeros
(almidn,
celulosa,
pectina, lignina)
Agua
actividad de agua
Temperatura
bajo
Control de pH
Agitacin
Mecnica
homogenizacin
Escalamiento
industrial
Fcil
Inoculacin
y de un desarrollo ingenieril
inoculacin,
proceso
continuo
Alto riesgo de contaminacin
Contaminacin
bacteriana
Genera
Gasto Energtico
un
del equipo
elevado
bacterias
energtico
Tamao y volumen
Efluentes
contaminacin
contaminacin
contaminantes
Concentracin del
producto
inters
esporas fngicas
15
Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a travs del
tiempo. En la figura 8, se muestran las fases de crecimiento de los microorganismos. [41]
A)
Fase de latencia.
Tambin es conocida como fase lag; coincide con el perodo de adaptacin del microorganismo
a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente despus de la
inoculacin y su duracin depende del estado fisiolgico de la clula inoculada y de las
condiciones ambientales. Durante este periodo, el nmero de clulas no se incrementa, pues el
microorganismo utiliza la energa disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere
para su desarrollo en el nuevo medio.
B)
Fase logartmica.
Esta fase presenta mayor inters por ser la etapa donde las clulas se multiplican a la mxima
velocidad, su crecimiento puede ser cuantificado con base en el nmero de clulas que se
producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por
16
unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo
permanece constante y es independiente de la concentracin del sustrato, siempre y cuando esta
sustancia se encuentre en exceso.
C)
Fase estacionaria.
La fase estacionaria termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrientes se
agotan, las condiciones ambientales indispensables para la clula se modifican o cuando las
clulas produce metabolitos txicos que inhiben su reproduccin.
D)
Fase de muerte.
Se inicia cuando los nutrientes que estn en el medio de cultivo no son suficientes para que el
microorganismo pueda producirse y aunque quedan clulas vivas, su nmero es superado por el
de las clulas muertas. Tambin se debe a la acumulacin de sustancias txicas generadas por el
metabolismo del microorganismo.
[42]
Las celulasas producidas por el hongo Trichoderma son utilizadas en la industria textil para
suavizar y acondicionar los textiles, as como para producir polvos de lavado de alta calidad.
17
Las enzimas obtenidas a partir de estos microorganismos tambin son usadas en la industria del
papel para modificar las propiedades de la fibra y para reducir el contenido de lignina. [43]
Se ha demostrado que algunas especies de Trichoderma tienen potencial para ser aplicadas en la
biorremediacin de sitios contaminados con sustancias de origen orgnico (hidrocarburos del
petrleo, explosivos y plaguicidas) e inorgnico (metales pesados y cianuro). [44]
Tambin existen reportes de T. polysporum, T.koningii, T. pseudokoningii y T. harzianum con
la capacidad para degradar hidrocarburos saturados y aromticos presentes en aceites
combustibles. As mismo, Trichoderma sp. se ha empleado para la detoxificacin de cianuro
usando dos enzimas (rodanasa y cianuro hidratasa) capaces de degradarlo.
[45]
La lanctona 6PAP con aroma a coco es considerada como un agente saborizante no txico
utilizado para la aromatizacin de artculos alimenticios, lo que le confiere importante inters
comercial en la industria de alimentos y aroma. Adems tiene funcin antifngica.
18
2. PARTE EXPERIMENTAL
El arrocillo fue sometido a cuatro tratamientos diferentes durante la preparacin (Ver tabla 2),
los criterios considerados fueron: la baja cantidad de agua en el sustrato limita la accesibilidad
de nutrientes obtenindose un mnimo crecimiento y el exceso de humedad disminuye la
porosidad del sustrato dificultando la oxigenacin.
367
330
295
255
400
340
280
220
Primero se trabaj con Trichoderma harzianum para observar cmo se desarrolla a las
condiciones planteadas y finalmente se procedi con Trichoderma hamatum, incrementndose
el rango de volumen de agua adicionado al sustrato es su preparacin, para determinar hasta qu
punto es fcilmente manipulable.
19
La etapa de prueba inicial es indispensable en este proyecto. A partir de los datos obtenidos se
elaboraron curvas de concentracin de esporas (logC) versus cantidad de agua adicionada al
arrocillo (Va) (Ver grfico 1 y 2) para cada temperatura de incubacin (T), importante en la
obtencin de la mayor cantidad de esporas de los hongos a estudiar.
Las curvas obtenidas en las pruebas preliminares proporcionan datos ptimos de agua (Vop), los
cuales permitieron preparar el sustrato a una humedad establecida y generar un excelente
crecimiento las dos especies de Trichoderma. En la determinacin del porcentaje de humedad
(%H), se incluy tambin la humedad del arrocillo que establece la Norma INEN 1690 para su
comercializacin.
En esta etapa se elaboraron las curvas de crecimiento para cada microorganismo, a las distintas
temperaturas planteadas, el proceso de propagacin se efectu en fundas de polietileno con 160g
de sustrato cada una, realizando varias repeticiones por precaucin ante la contaminacin de
microrganismos del ambiente y para verificar la repetibilidad del proceso. (Ver tabla 3).
20
Especie
Temperatura,
C
Volumen de
Pruebas
Diseo
agua,
preliminares
experimental
mL
# botellas
#fundas
36
10
36
10
36
10
96
30
Trichoderma
21
harzianum
2
3
4
1
25
2
3
4
Trichoderma
hamatum
1
28
2
3
4
Total
21
V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)
T1
Vop
V3, Ci
logC = f(t)
Curva de
crecimiento
V4, Ci
V1, Ci
V2, Ci
TH
T2
logC = f(Va)
Vop
V3, Ci
logC = f(t)
22
Curva de
crecimiento
V4, Ci
V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)
T3
V3, Ci
Vop
logC = f(t)
Curva de
crecimiento
V4, Ci
Figura 9. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH)
V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)
T1
Vop
V3, Ci
logC = f(t)
Curva de
crecimiento
V4, Ci
V1, Ci
V2, Ci
THa
T2
logC = f(Va)
Vop
V3, Ci
logC = f(t)
23
Curva de
crecimiento
V4, Ci
V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)
T3
V3, Ci
Vop
logC = f(t)
Curva de
crecimiento
V4, Ci
Figura 10. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum
(THa).
Los mejores productos obtenidos de cada especie fueron aplicados en matas de fresas y moras,
teniendo en cuenta un testigo para observar las diferencias que presentan luego de un tiempo de
aplicacin, proceso necesario para verificar que los microorganismos generados, s, mantienen
sus caractersticas esenciales, de proteccin e induccin a un rpido crecimiento de las plantas.
Se utilizaron cinco plantas de fresas del mismo tamao. A tres de ellas se aplicaron una mezcla
de las especies estudiadas, las dos restantes se las estableci como testigos. Para la aplicacin en
plantas de moras se usaron tres plantas las cuales no fueron del mismo tamao (Ver figura 18).
Sin embargo se consider escoger a la planta ms grande como testigo y a las restantes
adicionarles las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum individualmente.
A las plantas utilizadas no se les adicion ningn componente extra, a parte de los
microorganismos y tierra que contena abono orgnico al momento de ser trasplantadas.
R;(0 - 500)g
Ap0,1g
Vasos de precipitacin
V = 500mL
Ap100mL
Vasos de precipitacin
V = 100mL
Ap10mL
V = 500mL
Ap100mL
Probeta graduada
V = 100mL
Ap1mL
Pipeta graduada
V = 25mL
Ap1mL
Pipeta Pasteur
V = 3mL
Ap0,5mL
Pisetas
V = 500mL
Ap100mL
Cintas de pH
R;(0 - 14)
Ap0,5mL
Autoclave
Pera de succin
Termohigrometro
R;(0 - 30)psi
Ap0,5psi
R;( 0 - 50 ) C
Ap0,1C
V = 500mL
Gradilla de plstico
Porta y cubre objetos
Microscopio ptico
Aumento: 40X
24
Cmara de Neubauer
Cmara de Siembra
Asa bacteriolgica
Equipo de diseccin
Cajas Petri
Botellas de vidrio (camineras)
V = 375mL
Mecheros de alcohol
Olla arrocera
V = 1800mL
H2O(l)
CH3OH
C2H5OH
NaOH(sol)
HCl(sol)
NaClO (sol)
2.6 Procedimientos
Tambin se debe tener presente la inspeccin constante para observar si existe contaminacin.
De as serlo se esteriliza en autoclave a 1 atm y 121C por un tiempo de 20 min para garantizar
la muerte del o los agentes contaminantes presente y as proceder a su descarte.
TRICHODERMA SPP.
PREPARACIN DEL
SUSTRATO
ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIN DEL
SUSTRATO
INOCULACIN
INCUBACIN
COSECHA
CONTAMINACIN
ESTERILIZACIN
DESCARTE
DILUCIONES
SERIADAS
ALMACENAMIENTO
2.6.2 Preparacin del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA)
Pesar una cantidad determinada de PDA y diluirlo en agua segn las especificaciones del
fabricante que son: 39 g del medio en 1000 mL de agua destilada
Ajustar el pH a 7 adicionando hidrxido de sodio 0.1 N cuando la mezcla es cida o con
cido clorhdrico 0.1 N si la mezcla es bsica.
Calentar la mezcla hasta el punto de ebullicin para que se disuelva por completo, agitar
levemente para evitar que el medio se queme o se chorree.
Esterilizar por 20 min a 121C y 1 atm de presin
Esperar a que el envase contenedor del medio de cultivo se enfre hasta que sea manipulable
para evitar quemaduras
Dispensar el medio en cajas Petri evitando la formacin de burbujas de aire.
Esperar a que el medio se solidifique.
Nota: Evitar que el medio de cultivo en el envase alcance la temperatura ambiente, porque se
solidificar e impedir la dosificacin en las cajas Petri.
Adicionar 160 g de sustrato en cada una de las fundas y sellar con dos dobleces pequeos
para evitar la contaminacin con microorganismos del ambiente.
Grapar las esquinas de la funda para evitar que se riegue en el proceso de esterilizacin
Esterilizar en autoclave a 121C y 1 atm de presin por un perodo de 20 min.
Agitar efusivamente las botellas esterilizadas para que el sustrato quede lo ms suelto
posible.
2.6.5 Siembra del inculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas. En este proceso es
necesario recurrir a la ayuda del recuento celular con la cmara de Neubauer para determinar la
concentracin de esporas presente en un volumen determinado.
Procedimiento
Tomar la cepa a utilizar y aadir una pequea cantidad de agua destilada esterilizada.
Separar las esporas con una asa bacteriolgica y diluirlo a 100 mL
Determinar la concentracin de UFC/mL con la tcnica del recuento celular y la cmara de
Neubauer, realizando varias repeticiones para tener un valor ms exacto.
Colocar las botellas de vidrio con el sustrato previamente esterilizadas en la cmara de
siembra
Rotular para evitar confusiones de cepa, humedad y temperatura.
Poner 2 mL de la solucin madre en cada caminera y agitarlo suavemente para que las
esporas se dispersen por el sustrato.
Finalmente colocarlas en las incubadoras que se encuentran a temperatura fija.
2.6.5.1 Recuento celular. El recuento celular es una tcnica que tiene por objeto determinar el
nmero de clulas que estn comprendidos en una unidad de volumen de muestra.
Todos los recuentos celulares constan de 3 fases que son:
29
Las ms comunes son las cmaras dobles, donde existen 2 zonas de conteo, una superior y la
otra inferior, (hemisferio superior e inferior) en su parte central se encuentra grabada una
retcula cuadrangular (figura 13).
Hemisferio
superior
Hemisferio
inferior
Figura 13. Cmara de Neubauer
30
especifica que los cuadros medianos se subdividen en 16 cuadros pequeos, dando un total de
400 cuadrados en cada hemisferio.
En el caso que la concentracin celular sea muy alta, y sea fcil perderse en el recuento se debe
utilizar un orden de conteo en forma de zig - zag. En la figura 15 se muestra el proceso de
contaje de esporas en forma de zig - zag. [46]
Ne
St A D
(1)
31
32
3. DATOS
Variable
Valor
Densidad, g/ml
T = 21C
% Humedad
H2O
Arrocillo
0,9980
12
3.1.2 Preparacin del sustrato en camineras. En las tabla 5 y 6 se muestra el tratamiento dado
al arrocillo con cuatro valores diferentes de agua adicionada para cada una de las especies,
Trichoderma harzianum (TH) y Trichoderma hamatum (THa).
ms, (g)
mH+c, (g)
mc, (g)
Vad, (mL)
800
969
60
258
800
970
60
220
800
970
60
185
800
969
59
145
ms, (g)
mH+c, (g)
mc, (g)
Vad, (mL)
800
970
60
290
800
963
59
236
800
971
60
169
800
966
60
114
33
Especie
(UFC/mL)
Trichoderma harzianum
2,1E+06
(TH)
Trichoderma hamatum
3,1E+06
(THa)
21
25
28
Dilucin
Ne, UFC
Lectura 1
Lectura 2
1:100
16
15
1:100
14
13
1:100
11
10
1:100
1:100
31
31
1:100
26
25
1:100
22
20
1:100
11
16
1:100
22
21
1:100
17
16
1:100
11
12
1:100
34
21
25
28
Dilucin
Ne, UFC
Lectura 1
Lectura 2
1:100
13
15
1:100
1:10
42
34
1:10
10
1:100
33
26
1:100
22
24
1:10
173
165
1:10
92
83
1:100
13
14
1:100
15
13
1:10
135
130
1:10
110
101
3.2.1 Preparacin del sustrato en fundas. Las tablas 10 y 11 exponen los valores de masa del
sustrato utilizados y el volumen de agua adicionado a la preparacin del sustrato.
ms, (g)
mH+c, (g)
mc, (g)
Vad, mL
21
800
1005
59
244
25
800
989
57
268
28
800
996
59
248
35
ms, (g)
mH+c, (g)
mc, (g)
Vad, mL
21
800
981
58
277
25
800
993
58
265
28
800
988
58
230
3.2.2 Concentracin del inculo para siembra en fundas. La tabla 12 muestra la cantidad de
esporas por mL, obtenidas de la cosecha de los mejores resultados de concentracin de las
pruebas preliminares y utilizadas para inocular el nuevo sustrato.
Especie
(UFC/ml)
6,31E+05
2,50E+05
36
T2 = 25C
T3 = 28C
Tiempo,
Das
Lectura, UFC
Dilucin
Lectura, UFC
Dilucin
Lectura, UFC
Dilucin
37
1:10
17
19
21
24
1:10
22
24
26
18
1:10
22
26
28
22
1:10
113
101
82
122
1:10
122
122
101
92
1:100
16
15
11
13
1:100
18
14
14
1:100
12
16
17
24
1:100
24
16
15
20
1:100
22
25
23
19
1:100
35
23
22
27
1:100
20
22
21
27
12
1:100
20
27
24
34
1:100
32
30
27
30
1:100
30
23
24
26
14
1:100
38
24
19
29
1:100
27
32
26
30
1:100
23
31
25
27
17
1:100
27
28
26
30
1:100
26
29
28
32
1:100
26
27
26
28
20
1:100
21
24
31
27
1:100
22
21
25
23
1:100
24
28
26
26
24
1:100
24
22
19
20
1:100
20
23
18
17
1:100
16
14
18
15
27
1:100
17
15
16
15
1:100
15
18
17
15
1:100
14
13
12
13
30
1:100
13
10
14
13
1:100
12
12
13
11
1:100
10
Tiempo,
Das
T2 = 25C
Lectura, UFC
T3 = 28C
Lectura, UFC
Dilucin
Lectura, UFC
Dilucin
1
Dilucin
1
38
1:10
11
10
12
1:10
13
16
14
15
1:10
15
15
14
1:10
94
121
119
109
1:10
129
117
109
124
1:10
59
71
68
68
1:100
11
13
15
15
1:10
18
16
19
18
1:100
11
13
10
12
1:100
15
16
23
15
1:100
25
23
24
23
1:100
18
25
16
16
12
1:100
25
23
26
24
1:100
22
37
30
28
1:100
21
22
20
27
14
1:100
25
23
28
24
1:100
27
30
27
33
1:100
21
18
25
25
17
1:100
23
28
27
22
1:100
30
29
28
31
1:100
22
25
19
24
20
1:100
22
25
27
27
1:100
25
27
25
35
1:100
18
23
20
22
24
1:100
24
23
27
25
1:100
27
28
27
26
1:100
12
14
13
12
27
1:100
17
19
20
19
1:100
19
23
21
21
1:100
11
10
30
1:100
10
11
12
12
1:100
11
13
10
1:10
56
48
51
52
4. CLCULOS
4.1.1 Clculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato. El sustrato
(arrocillo) debe ser lavado para eliminar residuos no deseados y suciedad, pero durante este
proceso absorbe agua debido a su porosidad. Por tal razn se debe determinar la cantidad de
agua retenida.
(2)
Donde:
4.1.2 Clculo del volumen total de agua adicionada en la preparacin del sustrato.
(3)
Donde:
39
(4)
Donde:
4.1.4 Clculo de la masa del sustrato seco. Es la masa del arrocillo utilizado restndole el 12 %
de agua que contiene el sustrato.
(5)
40
Donde:
4.1.5 Clculo del porcentaje de humedad. Este clculo determina la cantidad de agua que
contiene el medio de propagacin expresado en porcentaje.
%H
mat
m ss mat
(6)
Donde
%H = porcentaje de humedad
mat = masa de agua total
maa = masa del sustrato seco
Donde:
4.2.1 Porcentaje de humedad ptimo. Con los datos obtenidos de las pruebas preliminares se
construye los grficos 1 y 2 las cuales mediante interpolacin y extrapolacin permiten conocer
la cantidad de agua necesaria para preparar el sustrato, segn el microorganismo y la
temperatura utilizada en el proceso de propagacin.
(7)
42
Los clculos estadsticos se realizaron con los resultados generados para construir las curvas de
crecimiento, especficamente se utiliz la fase de latencia y la fase logartmica de cada una de
las grficas de las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.
THa
T1 = 21C
T2 = 25C
T3 = 28C
T1 = 21C
T2 = 25C
T3 = 28C
0,1557
0,1644
0,1523
0,1877
0,1968
0,1850
Sm
0,0160
0,0152
0,0182
0,0252
0,0209
0,0145
5,7171
5,7238
5,8179
5,4252
5,4788
5,4037
Sb
0,0993
0,0947
0,1130
0,1565
0,1296
0,0903
R2
0,8635
0,8858
0,8238
0,7873
0,8556
0,9151
SLc
0,1706
0,1627
0,1941
0,2689
0,2227
0,1552
4.3.1 Correccin de logaritmo base 10 a logaritmo natural. Se requiere una correccin, puesto
que los resultados obtenidos para la construccin de las curvas de crecimiento estn trabajados
43
con log(x) pero deben ser expresados en funcin de ln(x), Por tal motivo los resultados de la
tabla 17 deben ser corregidos, a excepcin del ajuste de las curvas ya que ste es independiente.
(8)
(
)
(9)
4.3.2 Clculo de la velocidad de crecimiento de las curvas. Las ecuaciones exponenciales son
difciles de manejar. Por tal motivo se las debe modificar en otras ms sencillas como una recta.
La transformacin se realiza aplicando logaritmos en los dos trminos a la ecuacin 10.
(10)
Donde:
X = nmero de clulas
Xo = nmero de clulas iniciales
= velocidad de crecimiento
t = tiempo de incubacin
(11)
44
4.3.3 Clculo del Coeficiente de variacin. Permite comprobar la variabilidad de los datos,
utilizando la pendiente y su desviacin.
%CV
(12)
* 100
Donde:
45
5. RESULTADOS
5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparacin del sustrato en camineras. Las tablas 16 y
17 muestra la cantidad de agua total utilizada en la preparacin del sustrato de los dos
microorganismos propagados en las camineras.
mH+c,
mc,
mab,
Vab,
Vad,
Va,
(g)
(g)
(g)
(g)
(g)
(mL)
(mL)
800
969
60
109
109,2
258
367
800
970
60
110
110,2
220
330
800
970
60
110
110,2
185
295
800
969
59
110
110,2
145
255
mH+c,
mc,
mab,
Vab,
Vad,
Va,
(g)
(g)
(g)
(g)
(g)
(mL)
(mL)
800
970
60
110
110,2
290
400
800
963
59
104
104,1
236
340
800
971
60
111
111,2
169
280
800
966
60
106
106,1
114
220
5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato. Las tablas 18 y 19 muestran las
humedades con las que se trabaj en la preparacin del medio de cultivo para estas especies.
46
ma, (g)
mas, (g)
mat, (g)
mss,(g)
%H
366,4
96
462,4
704
39,6
329,5
96
425,5
704
37,7
294,6
96
390,6
704
35,7
254,6
96
350,6
704
33,2
ma, (g)
mas, (g)
mat, (g)
mss,(g)
%H
399,4
96
495,4
704
41,3
339,5
96
435,5
704
38,2
279,6
96
375,6
704
34,8
219,7
96
315,7
704
31,0
21
25
28
Va, mL
Dilucin
367
C, UFC/ml
log
C1
C2
UFC/mL
1:100
8,00E+06
7,50E+06
7,75E+06
6,89
330
1:100
7,00E+06
6,50E+06
6,75E+06
6,83
295
1:100
5,50E+06
5,00E+06
5,25E+06
6,72
255
1:100
3,50E+06
3,50E+06
3,50E+06
6,54
367
1:100
1,55E+07
1,55E+07
1,55E+07
7,19
330
1:100
1,30E+07
1,25E+07
1,28E+07
7,11
295
1:100
1,10E+07
1,00E+07
1,05E+07
7,02
255
1:100
5,50E+06
8,00E+06
6,75E+06
6,83
367
1:100
1,10E+07
1,05E+07
1,08E+07
7,03
330
1:100
8,50E+06
8,00E+06
8,25E+06
6,92
295
1:100
5,50E+06
6,00E+06
5,75E+06
6,76
255
1:100
3,50E+06
4,50E+06
4,00E+06
6,60
47
21
25
28
Va, ml
Dilucin
400
C, UFC/ml
log
C1
C2
UFC/mL
1:100
6,50E+06
7,50E+06
7,00E+06
6,85
340
1:100
3,50E+06
4,00E+06
3,75E+06
6,57
280
1:10
2,10E+06
1,70E+06
1,90E+06
6,28
220
1:10
4,50E+05
5,00E+05
4,75E+05
5,68
400
1:100
1,65E+07
1,30E+07
1,48E+07
7,17
340
1:100
1,10E+07
1,20E+07
1,15E+07
7,06
280
1:10
8,65E+06
8,25E+06
8,45E+06
6,93
220
1:10
4,60E+06
4,15E+06
4,38E+06
6,64
400
1:100
6,50E+06
7,00E+06
6,75E+06
6,83
340
1:100
7,50E+06
6,50E+06
7,00E+06
6,85
280
1:10
6,75E+06
6,50E+06
6,63E+06
6,82
220
1:10
5,50E+06
5,05E+06
5,28E+06
6,72
5.1.4 Curvas de concentracin versus volumen de agua adicionado al sustrato. Los grficos 1
y 2 indican la cantidad de agua que se adiciona al sustrato en su preparacin, para obtener una
mxima concentracin de esporas a las diferentes temperaturas de incubacin.
7,30
7,20
T1 = 21C
T2 = 25C
7,10
T3 = 28C
logC
7,00
6,90
6,80
6,70
6,60
R = 1
6,50
250
300
350
400
Va, mL
7,40
7,20
T1 = 21C
7,00
T2 = 25C
T3 = 28C
logC
6,80
6,60
6,40
6,20
6,00
5,80
5,60
200
250
300
350
400
Va, mL
7,30
7,20
7,10
logC
7,00
T1 = 21C
6,90
T2 = 25C
6,80
T3 = 28C
6,70
6,60
6,50
32
34
36
38
40
42
%H
7,40
7,20
7,00
logC
6,80
6,60
T1 = 21C
6,40
T2 = 25C
T3 = 28C
6,20
6,00
5,80
5,60
30,0
32,0
34,0
36,0
38,0
40,0
42,0
%H
5.2.1 Volumen de agua ptimo. En las tablas 22 y 23, se muestran los resultados obtenidos por
extrapolacin e interpolacin de las curvas de concentracin versus el volumen total de agua
(Ver grficos 1 y 2), los valores representan las mejores condiciones para preparar el sustrato de
las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum a las tres temperaturas.
logC,
Vop,
(C)
(UFC/mL)
mL
21
6,90
390
25
7,20
400
28
7,04
385
50
logC,
Vop,
(C)
(UFC/mL)
mL
21
6,80
400
25
7,16
400
28
6,83
360
5.2.2 Resultados de la masa de agua total. Las tablas 24 y 25 indican la cantidad de agua total
utilizada para preparar el sustrato de los microorganismos.
ms,
mH+c,
mc,
Vad,
mad,
mat,
(g)
(g)
(g)
(mL)
g)
(g)
21
800
1005
59
244
243,7
485,7
25
800
989
57
268
267,6
495,6
28
800
996
59
248
247,7
480,7
ms,
mH+c,
mc,
Vad,
mad,
mat,
(g)
(g)
(g)
(mL)
g)
(g)
21
800
981
58
277
276,6
495,6
25
800
993
58
265
264,6
495,6
28
800
988
58
230
229,7
455,7
51
Condicin
Temperatura,
C
% Humedad
Trichoderma
Trichoderma
harzianum
hamatum
21
40,82
41,31
25
41,31
41,32
28
40,57
39,29
52
Condicin 2
Condicin 3
Concentracin, UFC/mL
Concentracin, UFC/mL
Concentracin, UFC/mL
Tiempo,
Das
C1
0
C2
C3
6,31E+05
C4
C1
C2
C3
6,31E+05
C4
C1
C2
C3
C4
6,31E+05
53
8,50E+05 9,50E+05 1,05E+06 1,20E+06 1,10E+06 1,20E+06 1,30E+06 9,00E+05 1,10E+06 1,30E+06 1,40E+06 1,10E+06
5,65E+06 5,05E+06 4,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 5,05E+06 4,60E+06 8,00E+06 7,50E+06 5,50E+06 6,50E+06
9,00E+06 7,00E+06 4,50E+06 7,00E+06 6,00E+06 8,00E+06 8,50E+06 1,20E+07 1,20E+07 8,00E+06 7,50E+06 1,00E+07
1,10E+07 1,25E+07 1,15E+07 9,50E+06 1,75E+07 1,15E+07 1,10E+07 1,35E+07 1,00E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,35E+07
12
1,00E+07 1,35E+07 1,20E+07 1,70E+07 1,60E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,30E+07
14
1,90E+07 1,20E+07 9,50E+06 1,45E+07 1,35E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,55E+07 1,25E+07 1,35E+07
17
1,35E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,30E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,35E+07 1,30E+07 1,40E+07
20
1,05E+07 1,20E+07 1,55E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,30E+07
24
1,20E+07 1,10E+07 9,50E+06 1,00E+07 1,00E+07 1,15E+07 9,00E+06 8,50E+06 8,00E+06 7,00E+06 9,00E+06 7,50E+06
27
8,50E+06 7,50E+06 8,00E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,50E+06 7,50E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,50E+06
30
6,50E+06 5,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 6,50E+06 5,50E+06 4,50E+06 4,50E+06 4,00E+06 5,00E+06
Condicin 1
Condicin 2
Condicin 3
Concentracin, UFC/mL
Concentracin, UFC/mL
Concentracin, UFC/mL
C2
C3
2,50E+05
C4
C1
C2
C3
2,50E+05
C4
C1
C2
C3
C4
2,50E+05
54
5,50E+05 4,50E+05 5,00E+05 6,00E+05 6,50E+05 8,00E+05 7,00E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,00E+05 4,50E+05
4,70E+06 6,05E+06 5,95E+06 5,45E+06 6,45E+06 5,85E+06 5,45E+06 6,20E+06 2,95E+06 3,55E+06 3,40E+06 3,40E+06
5,50E+06 6,50E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,00E+06 9,50E+06 9,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 5,00E+06 6,00E+06
7,50E+06 8,00E+06 1,15E+07 7,50E+06 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,15E+07 9,00E+06 1,25E+07 8,00E+06 8,00E+06
12
1,25E+07 1,15E+07 1,30E+07 1,20E+07 1,10E+07 1,85E+07 1,50E+07 1,40E+07 1,05E+07 1,10E+07 1,00E+07 1,35E+07
14
1,25E+07 1,15E+07 1,40E+07 1,20E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,65E+07 1,05E+07 9,00E+06 1,25E+07 1,25E+07
17
1,15E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,50E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,55E+07 1,10E+07 1,25E+07 9,50E+06 1,20E+07
20
1,10E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,75E+07 9,00E+06 1,15E+07 1,00E+07 1,10E+07
24
1,20E+07 1,15E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,30E+07 6,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06
27
8,50E+06 9,50E+06 1,00E+07 9,50E+06 9,50E+06 1,15E+07 1,05E+07 1,05E+07 5,50E+06 4,00E+06 4,50E+06 5,00E+06
30
5,00E+06 5,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 4,50E+06 5,00E+06 2,80E+06 2,40E+06 2,55E+06 2,60E+06
Tiempo,
Das
logC1
logC2
logC3
Condicin 2
logC4
logC1
logC2
5,80
logC3
Condicin 3
logC4
logC1
logC2
5,80
logC3
logC4
5,80
55
5,93
5,98
6,02
6,08
6,04
6,08
6,11
5,95
6,04
6,11
6,15
6,04
6,75
6,70
6,61
6,79
6,79
6,79
6,70
6,66
6,90
6,88
6,74
6,81
6,95
6,85
6,65
6,85
6,78
6,90
6,93
7,08
7,08
6,90
6,88
7,00
7,04
7,10
7,06
6,98
7,24
7,06
7,04
7,13
7,00
7,04
7,02
7,13
12
7,00
7,13
7,08
7,23
7,20
7,18
7,13
7,18
7,18
7,06
7,08
7,11
14
7,28
7,08
6,98
7,16
7,13
7,20
7,11
7,18
7,06
7,19
7,10
7,13
17
7,13
7,15
7,11
7,18
7,11
7,16
7,15
7,20
7,11
7,13
7,11
7,15
20
7,02
7,08
7,19
7,13
7,04
7,02
7,10
7,06
7,08
7,15
7,11
7,11
24
7,08
7,04
6,98
7,00
7,00
7,06
6,95
6,93
6,90
6,85
6,95
6,88
27
6,93
6,88
6,90
6,88
6,88
6,95
6,93
6,88
6,85
6,81
6,78
6,81
30
6,81
6,70
6,85
6,81
6,78
6,78
6,81
6,74
6,65
6,65
6,60
6,70
Tiempo,
Das
logC1
logC2
logC3
Condicin 2
logC4
logC1
logC2
5,40
logC3
Condicin 3
logC4
logC1
logC2
5,40
logC3
logC4
5,40
56
5,74
5,65
5,70
5,78
5,81
5,90
5,85
5,88
5,88
5,88
5,85
5,65
6,67
6,78
6,77
6,74
6,81
6,77
6,74
6,79
6,47
6,55
6,53
6,53
6,74
6,81
6,88
6,88
6,95
6,90
6,98
6,95
6,74
6,81
6,70
6,78
6,88
6,90
7,06
6,88
7,10
7,06
7,08
7,06
6,95
7,10
6,90
6,90
12
7,10
7,06
7,11
7,08
7,04
7,27
7,18
7,15
7,02
7,04
7,00
7,13
14
7,10
7,06
7,15
7,08
7,13
7,18
7,13
7,22
7,02
6,95
7,10
7,10
17
7,06
7,15
7,13
7,04
7,18
7,16
7,15
7,19
7,04
7,10
6,98
7,08
20
7,04
7,10
7,13
7,13
7,10
7,13
7,10
7,24
6,95
7,06
7,00
7,04
24
7,08
7,06
7,13
7,10
7,13
7,15
7,13
7,11
6,78
6,85
6,81
6,78
27
6,93
6,98
7,00
6,98
6,98
7,06
7,02
7,02
6,74
6,60
6,65
6,70
30
6,70
6,74
6,78
6,78
6,74
6,81
6,65
6,70
6,45
6,38
6,41
6,41
7,50
7,25
logC (UFC/ml)
7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0
10
15
20
25
30
35
Tiempo, das
7,50
7,25
logC (UFC/ml)
7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0
10
15
20
25
30
Tiempo, das
57
35
7,50
7,25
logC (UFC/ml)
7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0
10
15
20
25
30
35
Tiempo, das
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
0
10
15
20
25
30
Tiempo, das
58
35
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
0
10
15
20
25
30
35
Tiempo, das
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
0
10
15
20
25
30
Tiempo, das
59
35
Los grficos 11, 12, 13, 14, 15 y 16 muestran la velocidad de crecimiento obtenidas a las
diferentes condiciones para los dos microorganismos las cuales coinciden con los valores de la
tabla 15.
7,50
7,20
logC (UFC/ml)
6,90
6,60
6,30
6,00
5,70
5,40
0
10
tiempo, das
7,60
7,30
logC (UFC/ml)
7,00
6,70
logC = 0,1644 t + 5,7238
R = 0,8858
6,40
6,10
5,80
5,50
0
10
tiempo, das
60
7,30
7,00
logC (UFC/ml)
6,70
logC = 0,1523 t + 5,8179
R = 0,8238
6,40
6,10
5,80
5,50
10
tiempo, das
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
logC = 0,1877 t + 5,4252
R = 0,7873
6,00
5,50
5,00
0
10
tiempo, das
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
0
10
tiempo, das
7,50
logC (UFC/ml)
7,00
6,50
5,50
5,00
0
10
tiempo, das
62
Trichoderma hamatum
0,3585
0,3787
0,3507
0,4324
0,4531
0,4260
0,0368
0,0351
0,0419
0,0580
0,0481
0,0335
13,166
13,182
13,399
12,494
12,618
12,445
Sb
0,2286
0,2181
0,2602
0,3605
0,2986
0,2081
r2
0,8635
0,8858
0,8238
0,7873
0,8556
0,9151
SLc
0,3928
0,3747
0,4470
0,6192
0,5129
0,3574
%CV
10,27
9,27
11,94
13,42
10,61
7,86
0,3585
0,3787
0,3507
Trichoderma hamatum
0,4324
0,3627
0,4531
0,4372
0,4260
De acuerdo con los resultados obtenidos en las grficas de preparacin del sustrato, en las
curvas de crecimiento y en el anlisis estadstico se seleccionan las mejores condiciones para
propagar las dos especies nativas de Trichoderma spp.
63
% Humedad
40,57
39,29
41,31
41,32
40,82
41,31
Trichoderma harzianum
Trichoderma hamatum
T = 21C
T = 25C
T = 28C
Trichoderma harzianum
6,3E+05
6,3E+05
6,3E+05
2,5E+05
2,5E+05
2,5E+05
1,0E+06
1,1E+06
1,2E+06
5,3E+05
7,3E+05
6,6E+05
5,2E+06
5,5E+06
6,9E+06
5,5E+06
6,0E+06
3,3E+06
6,9E+06
8,6E+06
9,4E+06
6,8E+06
8,9E+06
5,8E+06
1,1E+07
1,3E+07
1,1E+07
8,6E+06
1,2E+07
9,4E+06
12
1,3E+07
1,5E+07
1,3E+07
1,2E+07
1,5E+07
1,1E+07
14
1,4E+07
1,4E+07
1,3E+07
1,3E+07
1,5E+07
1,1E+07
17
1,4E+07
1,4E+07
1,3E+07
1,3E+07
1,5E+07
1,1E+07
20
1,3E+07
1,1E+07
1,3E+07
1,3E+07
1,4E+07
1,0E+07
24
1,1E+07
9,8E+06
7,9E+06
1,2E+07
1,4E+07
6,4E+06
27
7,9E+06
8,1E+06
6,5E+06
9,4E+06
1,1E+07
4,8E+06
30
6,3E+06
6,0E+06
4,5E+06
5,6E+06
5,4E+06
2,6E+06
64
concentracin UFC/mL
1,3E+07
1,1E+07
1,5E+07
1,5E+07
1,3E+07
1,2E+07
Trichoderma harzianum
Trichoderma hamatum
T = 21C
T = 25C
T = 28C
%
16,00
Coeficiente de variacin
14,00
13,42
12,00
11,94
10,00
8,00
10,61
10,27
Condicin 1
9,27
7,86
6,00
Condicin 2
Condicin 3
4,00
2,00
0,00
Trichoderma harzianum
Trichoderma hamatum
65
5.5.4 Seleccin de las mejores condiciones. En la tabla 34 se resumen las condiciones que
aprobaron el criterio de mayor produccin de esporas de los hongos Trichoderma harzianum y
Trichoderma hamatum.
Especie
Condicin
Trichoderma harzianum
41,31
1,5E+07
9, 27
Trichoderma hamatum
41,32
1,5E+07
10, 61
Las figuras 16, 17, 18 y 19 muestran plantas de fresa y moras antes y luego de ser aplicado
Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. En las fresas se aplic una mezcla de los dos
microorganismos, mientas que en las moras la aplicacin de las especies fue individual. En los
dos tratamientos se dejaron plantas como testigo para poder comparar su desarrollo.
66
6. DISCUSIN
De las grficas logC en funcin del volumen de agua adicionado al sustrato (Ver grficos 1
y 2) se observa que la interpolacin y extrapolacin de la curvas permite determinar el
punto ptimo de crecimiento a cada temperatura de incubacin, sin embargo para 21C y
25C de Trichoderma hamatum se observa cantidades altas para llegar al ptimo Vop,
produciendo desconfianza de los resultados obtenidos. Motivo por el cual fue necesario
recurrir a la prctica donde se estableci que 400 mL de agua es el valor mximo para
obtener una moderada manipulacin del sustrato.
Los resultados de porcentaje de humedad obtenidos (Ver tabla 26) se encuentran alrededor
del 40%, valores que se estn dentro del rango (20 - 70%) establecido en la teora (Ver cita
24). Sin embargo en esta tabla se puede observar que a 28C se requiere una menor
humedad; este fenmeno se justifica que a mayor temperatura existe un mayor riesgo de
contaminacin con microorganismos del ambiente.
68
Las velocidades especficas de crecimiento microbiano obtenidas (Ver tabla 32) muestran
valores similares entre las mismas especies, pero si se compara entre las dos especies
estudiadas se observa que estas difieren, pudindose evidenciar que la especie Trichoderma
hamatum que se desarrolla con mayor rapidez.
Para Trichoderma hamatum se acepta el %CV = 10,6 (Ver tabla 31 y grfico 17) a pesar de
tener un valor menor a 28C. Para esta decisin se bas en la concentracin (Ver tabla 33) y
en la curva obtenida de las pruebas preliminares (Ver grfico 2), donde a 25C se obtiene la
mayor concentracin de esporas y se justifica que pudo existir contaminacin lo que gener
que el %CV sea un poco alto. No obstante son valores aceptables para los microorganismos.
Las especies aplicadas en las plantas de fresas ejercen un efecto positivo pues generan un
desarrollo y produccin de frutos ms rpido en comparacin con las que no fueron
aplicadas. Adems se observa un tamao de hojas ms grande, las plantas se tornan ms
verdes y brillosas siendo estos indicativos de que se encuentran sanas (Ver figuras 16 y 17)
69
7. CONCLUSIONES
El sustrato utilizado y la cantidad de agua adicionada es una relacin 2:1, pues se comprob
que un valor superior dificulta la manipulacin del sustrato, reduce el crecimiento, limita la
adecuada oxigenacin de la matriz slida y el crecimiento solo se realiza en la superficie.
70
Los resultados del coeficiente de variacin obtenidos son aceptables, considerando que se
trabaj con microorganismos donde los errores producidos pueden ser altos, debido a la
contaminacin con microorganismos del ambiente y al equipo utilizado en el contaje de
esporas.
71
8. RECOMENDACIONES
Implementar una cmara de flujo laminar para reducir la contaminacin causada por
microorganismo del ambiente al momento de las inoculaciones.
Difundir a la colectividad agrcola los beneficios que brinda Trichoderma en los diferentes
cultivos con la finalidad de obtener productos orgnicos de calidad.
72
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78
ANEXOS
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80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
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