Laboratorio de Biologa Molecular 04/06/2015

UNIVERSIDAD DEL ATLNTICO

TCNICA DE EXTRACCIN DE ADN SALTING-OUT EN CELULAS
NUCLEADAS Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Martnez villa Katleen1.

1 Estudiante del programa de Biologa, Facultad de Ciencias Bsicas,
Universidad Del Atlntico, Barranquilla, Colombia.
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RESUMEN
En la experiencia, se utiliz una muestra de sangre de 10 ml, la cual fue depositada
en 10 tubos eppendorf con el fin de realizar la respectiva extraccin de ADN, con lo
cual se utilizaron diferentes reactivos para lograr la lisis celular, separacin
precipitacin del ADN. Posterior a esto se llev a cabo la confirmacin de la
muestra de ADN mediante la tcnica de electroforesis en gel de agarosa cuyos
resultados no fueron los esperados, debido a que no hubo un corrimiento adecuado a
travs del gel y por lo tanto no se pudo cuantificar la muestra, se concluy que dicho
resultado fue producto posiblemente de errores metodolgicos que pueden
involucrar la concentracin del gel, el nmero de voltios, la preparacin del tampn,
etc.
Palabras clave: Extraccin de ADN, electroforesis, cidos nucleicos.
INTRODUCCION
En la mayora de clulas eucariotas, los cidos nuclicos se encuentran presentes en
el nucleo celular, por ello para comparar patrones de bandas provenientes de
diferentes muestras biolgicas por ejemplo, es necesario extraer este ADN del
ncleo en el que se encuentra y posteriormente visusalizarlo. Para esta extraccin se
han implementado diversas tcnicas, donde la mayora de ellas presentan etapas
fundamentales como la lisis celular, precipitacin de protenas y otras sustancias no
deseadas, precipitacin del ADN e hidratacin del mismo, utilizando diversas
sustancias que permiten la purificacin de la muestra de manera efectiva. Sin
embargo, las tcnicas para la extraccin de ADN pueden variar de acuerdo a la
especificidad y complejidad de la muestra y a la eficiencia que requiera el
investigador.

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En la extraccin de cidos nucleicos se empieza por lisar la clula mediante el uso
de una solucin de lisis, en este, sustancias como detergentes y la enzima proteinasa
K, actan disolviendo las membranas y desestabilizando componentes proteicos,
donde el detergente se encarga de dispersar las lipoprotenas de las membranas y
desnaturalizar complejos protenicos. Por su parte la proteinasa k interacta con las
protenas histonas del ADN desestabilizando la estructura del mismo. Sin embargo
parar asegurarse de proteger los cidos nucleicos de la accin de enzimas, se utiliza
una sustancia inhibidora de DNAsas conocida como EDTA en la solucin de lisis,
adems de un buffer para mantener estable el pH de la solucin. Luego por
centrifugacin se separa la muestra en fases para desechar aquellas sustancias no
deseables, luego se precipita el ADN mediante la adicin de una sal y alcohol frio,
finalizando con la hidratacin del mismo.
En la presente practica la tcnica usada en extraccin de cidos nucleicos fue
salting-out, el cual utiliza un buffer que contiene (Tris-HCl, pH 8.3, Proteinasa K),
con lo que es posible destruir las membranas nucleares, liberando a la solucin los
cidos nucleicos. Quienes luego son precipitados mediante altas concentraciones de
sales como acetato de sodio (AcONa) y con la adicin de un alcohol. Por lo tanto
utiliza el aumento de la fuerza inica del medio respecto de soluciones acuosas.
Por ltimo, el ADN debe ser observado con el fin de comparar patrones, verificar la
calidad del mismo, etc, segn el objetivo del investigador, para ello se utiliza la
tcnica conocida como electroforesis en gel de agarosa, fundamentada en la
migracin de cidos nuclicos a travs de un campo elctrico en funcin de su
tamao y carga ellctrica, utilizando una matriz gelatinosa como sustrato, donde la
deteccin del ADN se hace posible mediante el uso de una sustancia sensible a la luz
ultravioleta, el bromuro de etidio (Sambrook et al. 2002), dicha sustancia se
intercala entre la molcula.
OBJETIVOS
Identificar las diferentes fases en la purificacin de cidos nuclicos.
Comprender y relacionar el uso de los diferentes reactivos en el proceso de
extraccin y purificacin con lo aprendido en torno a las propiedades
fisicoqumicas de los cidos nucleicos y protenas
Comprender la aplicacin de la tcnica de electroforesis en el proceso de
separacin de cidos nucleicos.

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MATERIALES Y METODOLOGIA
Materiales y reactivos:
Los materiales mencionados a continuacin sern utilizados tanto para la
extraccin de ADN comprendiendo la solucin de lisis de glbulos rojos y
glbulos blancos, como para la electroforesis en gel de agarosa.
Materiales:
Micropipetas de volmenes variables.
Tubos Eppendorf.
Centrifuga.
Incubadora.
Cmara electrofortica.
Beaker.
Pipeta.
Reactivos:
Acetato de amonio 7.5 M.
SDS al 10%.
Solucin Proteinasa K (20mg/ml)
Tris HCL 1M.
MgCl2 1M.
Na2 Cl 5M.
EDTA 0.5M.

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TE 100 X(Tris-EDTA).
Etanol Absoluto.
Isopropanol.
Agarosa 0.7 %.
TBE 0.5 X.
Bromuro de etidio.
Buffer de Carga.
Tris-base.
cido actico glacial.
EDTA PH 8,0.
Agua.
Marcador de peso molecular.

Metodologa:
Parte 1: Extraccin de ADN:
a. Preparacin de clulas a partir de sangre perifrica: 7 ml de una muestra
sangunea fueron llevados a un tubo vacutainer con EDTA, la que
posteriormente se reparti en 9 tubos eppendorff conteniendo cada un 5 ml de
sangre por tubo. A cada tubo se le adiciono solucin de lisis de glbulos rojos
(LGR) hasta completar 15 ml, mezclando la solucin por suave inversin.
Dicha solucin se llev a refrigeracin por 10 minutos a 4C. a continuacin
la mezcla se llev a centrifugacin (3000 rpm por 15 minutos). Una vez la
centrifugacin culmino, la separacin de fases fue evidente, permitiendo
descartar el sobrenadante (eritrocitos lisados). Luego se repiti el
procedimiento anterior agregando nuevamente solucin de lisis de glbulos

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rojos, esta vez 1.0 ml, golpeando el tubo con el fin de desprender el pellet. Se
llev la mezcla a centrifugacin a 2000 rpm por 15 minutos. (Este ltimo
paso se realiza las veces necesarias hasta que el pellet sea de color blanco).

b. Lisis de glbulos blancos y digestin proteica: el botn celular proveniente

del paso a, fue resuspendido en 0.3 ml de lisis de glbulos blancos,
adicionando a la mezcla 5 microlitros de SDS al 10%, 2.5 microlitros de
solucin de proteinasa K (20mg/ml) e incubado toda la noche a 37C.
c. Precipitacin con isopropanol: luego de que fue completada la digestin de
glbulos blancos, se obtuvo una solucin gomosa, la cual contiene el ADN. A
esta le fue agregada 80 microlitros de acetato de amonio (7.5 M) por tubo
eppendorf, los cuales fueron agitados, esta vez vigorosamente por 15
segundos y luego llevados a la centrifuga por 25 minutos a 300 rpm. El
sobrenadante que se observa en los 10 tubos eppendorf contiene el ADN, por
lo que se transfiri a un tubo falcon de polipropileno de 15 ml, descartando el
botn proteico que constituye el precipitado. Posteriormente se adiciono un
volumen igual al contenido en el tubo falcon de isopropanol frio y se mezcl
por suave inversin hasta observar el precipitado de ADN. El isopropanol fue
descartado y el precipitado transferido a un tubo eppendorf. El ADN
precipitado se lav con etanol al 70% y se llev a centrifugacin a 13000
rpm por un minuto con el fin de eliminar el isopropanol. Como tanto el
isopropanol y el etanol son voltiles se dej secar el ADN al aire. El ADN fue
resuspendido en 100 microlitros de buffer TE 1X y se incubo a 65C por una
hora. El ADN fue almacenado a 4C para la posterior electroforesis.
Parte 2: electroforesis en gel de agarosa:
Inicialmente la base de corrida fue nivelada con cinta de enmascarar. Luego se
prepar el gel de agarosa y se verti en caliente en la base de corrida. Luego se
introdujo el peine en la ranura correspondiente a la cmara del gel, este ltimo se
dej enfriar por 30 minutos. Se retir posteriormente el peine del gel solidificado al
igual que la cinta de enmascarar, sumergiendo la base de corrida con el gel en 240
ml de buffer TAE 1X. La muestra se carg en los posillos del gel y se tap la cmara
verificando que los polos correspondieran a negativo y positivo respectivamente,

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encendiendo a continuacin la fuente de poder. En este punto se program el tiempo
de corrida y el voltaje que en este caso fue de 60 V por 90 minutos poniendo a correr
la electroforesis. Una vez transcurri el tiempo de corrida se verifico que el ADN
haya corrido lo suficiente, retirando entonces el gel de la cmara y trasladndolo al
transiluminador UV para observar as la corrida y por ende las condiciones del
ADN.

RESULTADOS, CONCLUSIN Y DISCUSIN.

La metodologa descrita en la prctica se sigui casi correctamente, teniendo en
cuenta los volmenes, concentraciones, intervalos de tiempo etc., sealados en la
gua de laboratorio, a continuacin se describirn los resultados del proceso seguido
adems de los posibles errores obtenidos.
La lisis celular fue exitosa, en este procedimiento, la lisis de glbulos rojos arroj
como resultado el precipitado de un botn de color blanco en el fondo del tubo
eppendorf, la adicin de la solucin de lisis y la centrifugacin solo se realiz dos
veces debido a que la decoloracin de la muestra se produjo en la segunda
centrifugacin (fig. 1), lo que en ocasiones resulta en la repeticin del procedimiento
ya que la coloracin del botn sigue siendo oscura y no se tiene certeza de la
completa lisis de glbulos rojos. Luego el procedimiento para glbulos blancos solo
se realiza una vez.

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Figura 1. Primer precipitado en lisis celular y centrifugacin (Izq.). Segundo
precipitado en lisis celular y centifugacin, se observa botn blanco precipitado
(Der.).
La lisis celular es un proceso de vital importancia en la extraccion de cidos
nuclicos, sta permite romper las membranas plasmtica y nuclear. En otros casos,
se tienen tejidos que deben separarse de modo que se tengan clulas diferenciadas.
Sin embargo en este caso la muestra fue de tipo sangunea, por lo tanto no fue
necesaria una separacin celular debido a que las clulas se encuentran libres en el
torrente. Los glbulos rojos primero deben lisarse, stos no contienen ncleo
organelos, por lo que slo es necesario romper la membrana plasmtica, por su parte
los glbulos blancos si tienen ncleo, sitio donde aguarda el material gentico.
Para esta practica se utilizaron 5 microlitros de SDS al 10%, el SDS o duodecil
sulfato de sodio, ste es un detergente cuya funcin es disolver los componentes
lipdicos en las membranas, adems de descontaminar la muestra. Al disolver las
membranas, el ADN est libre en la solucin extrado de los ncleos de los glbulos
blancos, sin embargo se encuentra an empaquetado por lo que necesita ser expuesto
a la accin de la enzima proteinasa K, stas degradan las histonas, responsables del
empaquetamiento del ADN, adems de romper los enlaces peptdicos de otros
componentes proticos, actan tambin en la inhibicin de las DNAsas, quienes
pueden actuar degradando el ADN. Para la digestin de estas protenas, se dej la
solucin en incubacin a 37C toda la noche.
Los componentes proticos y dems sustancias descartables en el procedimiento
fueron aisladas del ADN por separacin de fases, mediante centrifugacin y el uso
de isopropanol, quin adems contribuye fuertemente en la precipitacin. Una vez se
logr la precipitacin y el ADN se encontr aislado y purificado, se llev a cabo su
observacin y confirmacin mediente electroforesis en gel de agarosa.
En la electroforesis es ultilizado un gel, en este caso agarosa, con el fin de reducir el
movimiento de las molculas, debido a que este es poroso, de modo que acta como
un tamiz en el que las molculas son separadas. Con esto, aquellas molculas de
menor tamao se mueven mas rpidamente a travs del gel que aquellas de mayor
tamao. Ahora, el movimiento de las molculas ocurre debido a que estas tienen una
polaridad, por esto, estas molculas colocadas en un campo elctrico experimentan
una fuerza de atraccin haca el polo que posea la carga opuesta. As, el conjunto de
factores como el voltaje, concentracin del gel entre otras, permitieronn el
despazamiento del ADN, dando como resultado la presencia de bandas corridas a
travs del gel (fig. 2).

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Figura 2. Resultados electroforesis. De izquierda a derecha: M (marcador de peso

molecular), A, B, C, D, E, F, G.
Se observa que no se obtuvo un tamao definido de las bandas, quienes se presentan
de manera curvada y no demanera definida como normalmente aparecen en este tipo
de pruebas (fig. 3). Esto puede deberse a alguna falencia en el procediminto seguido,
ya sea el nmero de voltios que segn la gua de laboratorio debi ser de 70 V y se
utilizaron 60 V, la concentracin del gel, el tiempo de corrida o la concentracin del
buffer, el cual pudo haber sido distinto en el gel y en el tampn de electroforesis,
tambin puede deberse a que la temperatura es desigual a lo largo del gel. Adems
de esto se observa la formacin de pozos, debido a que el ADN se encontraba
fuertemente impregnado en el gel al momento de depositar el ADN en este.
Adems de esto, no se observa migracin de las bandas hacia el polo positivo como
se debia esperar, migrando unicamente el marcador molecular. Adicional a las
falencias mencionadas anteriormente, tambin puede que la muestra de ADN se
encontrara contaminada con protenas.

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Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa utilizando ADN molde. Imagen tomada

de un artculo de investigacon: identificacin y tipificacin de leishmania. Instituto
de Medicina Tropical, Amberes, Blgica.

En contraste a la figura 2, en la figura 3 se observan bandas definidas al igual que las

pertenecientes al marcador molecular, donde el tamao de las bases es apreciable.
Ocuri una correcta migracin de la molcula cargada positivamente hacia el polo
negativo en un pH estable.
Como conclusin, podemos sealar que una electroforesis exitosa depende en gran
medida tanto del protocolo usado en la extraccin, como de aquel usado en el
momtaje de la electroforesis. As, es necesario respetar los intrvalos de tiempo,
concetraciones adecuadas, adems del delicado cuidado del manejo manual de las
muestras quienes pueden proporcionar contaminacin por error. Esto con el fin de
obtener una cantidad y calidad de ADN apreciable ademas de puro. Por lo tanto es
necesario manterner la integridad del ADN al realizar un mtodo de extraccin. Con
todo lo anterior, los objetivos propuestos fueron cumplidos en gran medida, debido a
la capacidad de comprender las reacciones llevadas a cabo en loas diversas tcnicas
de extraccin , ya que estos cuentan con similitudes, adems de esto relacionar la

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interaccin de los compuestos utilizados con lo aprendido anteriormente en cuanto a
las propiedades fisicoqumicas de los cidos nuclicos y protenas y por ltimo el
entndimiento de la cuantificacin y observacin del ADN y su uiltidad en el campo
de la ciencia.
BIBLIOGRAFIA
Cariaga Martnez A. E., Zapata P. D. El laboratorio de Biologa Molecular.
Una gua prctica. Coleccin: cuadernos de Ctedra. Editorial Universitaria
de Misiones. Ao 2005

Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y

caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. Carmen Alicia Padilla
Pea, Jess Diez Dapena, Emilia Martnez Galisteo, Jos Antonio Brcena
Ruiz, Concepcin Garca Alfonso. Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular, Campus Universitario de Rabanales-Crdoba.

Protocolo para la extraccin de ADN de plantago major dirigida a la

tipificacin molecular. Julio cesar Gmez gonzalez.2005.

Sambrook J, Russell DW, 2002, Molecular cloning. A laboratory manual,

Cold Spring Harbor Laboratory Press.