PRACTICA N 2: Extraccin del DNA de leucocitos 2humanos,

utilizando el mtodo de cloroformo-alcohol isoamilico y por

columnas de slica.

I.

INTRODUCCION
En todos los organismos , la clula es la unidad de origen
estructural y funcional bsica , todos poseen prcticamente el
mismo mecanismo y tienen en comn un cdigo gentico
.Dicho cdigo gentico se encuentra ordenado en una
secuencia lineal por los cuatro nucletidos que conforman el
DNA.
Es
de
gran
importancia
la
obtencin
del
cido
desoxirribonucleico (DNA) humano a partir de leucocitos es
recaudar el producto mximo de DNA libre de protenas, fenoles
y otras sustancias que inhiban las enzimas de restriccin. El
DNA de alta calidad es muy importante para el uso de futuras
tcnicas en el rea de Biologa Molecular .
La lisis celular libera las molculas en una fase acuosa que es
separada de los restos celulares por centrifugacin. Las
protenas son removidas de la fase acuosa con solventes
orgnicos (fenol, cloroformo). El ADN, que permanece en la fase
acuosa, precipita junto al etanol y posteriormente es purificado
y re suspendido en un buffer adecuado o con otros
procedimientos
usando
columnas
,para
tenerlo.
Una vez obtenido podr ser cuantificado y calificado .

II.

MATERIALES Y METODOS
A. Materiales
Micropipetas de 0.5-20Ul,20-200Ul-200-1000uL
Centrifuga para tubos Falcon 15ml
Microcentrifuga para tubos eppendorf
Tips de 0.5-20Ul,20-200Ul-200-1000uL
Tubos Eppendorf
Tubos para morada con anticoagulante EDTA
2 Jeringas de 5ml
Algodn
Ligaduras
B. Reactivos
Extraccin del DNA utilizando
cloroformo-alcohol isoamilico

Isopropanol
Etanol 70%

el

mtodo

de

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utilizando el mtodo de cloroformo-alcohol isoamilico y por
columnas de slica.

Cloroformo:Alcohol Isoamilico(24:1)
Buffer Lisis de eritrocitos (NH4Cl 0,15M, KHCO3
10mM ,EDTA PH 8 0,1M)
Buffer Lisis de Leucocitos ( NaCl 100mM , SDS 0,5% ,
EDTA PH 8 25mM,Tris-Hcl 10mM PH 7,5)
Proteinasa K 0,1 mg/ml
Buffer TE (Tris -HCl 10mM , EDTA 1mM)

Extraccin del DNA utilizando el mtodo de columnas de

silica

Kit de extraccin de DNA (GeneJETTM Whole Blood

Genomic DNA purification)
Proteinasa K
Buffer AL
Buffer AW1 ,AW2
Columnas de extraccin DNA easy mini spin (QIAGEN)
Buffer AE
Etanol

C. Mtodos
FORMOL- ALCOHOL ISOAMILICO
Obtencin de la Muestra
Primeramente, se colecto 3 ml de la sangre de un alumno en tubos de
vidrio con anticoagulante (EDTA), se mezcl bien la sangre con el
anticoagulante. Se diluyo la sangre con suero fisiolgico en una
proporcin de 1:3
Lisis de Eritrocitos
Se agreg 6mL de Buffer lisis de eritrocitos a un tubo de ensayo de
20mL, seguidamente se agreg 2mL de sangre diluida al tubo que
contiene el buffer lisis de Eritrocitos se mezcl el tubo por inversin 5
veces y se procedi a incubar Ia muestra sobre hielo, durante
5mimuntos, se mezcl el tubo 3 veces durante la incubacin
Se centrifugo a 7000rpm durante 1minuto de lo cual se descart el
sobrenadante (se tuvo cuidado de no eliminar el pellet que contena
los leucocitos) y se lav el pellet con 1mL de suero fisiolgico,
nuevamente se volvi a centrifugar
Lisis de Leucocitos

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utilizando el mtodo de cloroformo-alcohol isoamilico y por
columnas de slica.

Obtenidos los leucocitos se agreg 500uL del buffer Lisis de

Leucocitos, resuspendieron y se traspasaron a un tubo eppendorf . Se
agreg 5uL de proteinasa K y se mezcl debidamente
Posteriormente se incubaron las muestras a 56C durante 30minutos
agitndose cada dos minutos
Precipitacin de Protenas
Despus del tiempo de incubacin se agreg a cada una de las
muestras 500uL de la mezcla clorofomo: alcohol Isoamllico (24:1) y se
agitaron por 10 segundos
Se centrifugo a 10 000rpm durante 5min y se transfiri la fase
acuosa a un nuevo tubo eppendorf
Precipitacin y Lavado del del DNA
Al sobrenadante obtenido que en este caso es la fase acuosa se le
agrego un volumen de isopropanol frio y se dej precipitar el DNA
Se centrifug a 10 000rpm durante 1minuto y el DNA formo un pellet
blanco inmediatamente se procedi a eliminar el sobrenadante y
enjuagar el pellet de DNA con 500 uL de etanol 70% frio
Nuevamente se centrifugo a 10 000mm durante 1minuto, se elimin
el sobrenadante y se resuspendio el pellet de DNA en 30 ul de Buffer
T.E..
Finalmente se incubo a 65 durante 5 minutos y se guard el DNA
obtenido a -20C.

METODO DE COLUMNA SILICA

Se Tom 3m| de Sangre Perifrica en un tubo con anticoagulante
EDTA, se mezcl por inversin 4 veces, se elimin el suero de la
muestra. y se colecto el paquete globular
Se aadio 250u| de Sangre Perifrica ,30ul de Proteinasa K ,200ul de
Buffer PBS y 200ul de Buffer AL en un tubo eppendorf debidamente
esterilizado. Se mezcl aplicando bortex y se dej incubando a 55C
por 10 minutos aproximadamente
Pasado el tiempo indicado se aadio 200ul de etanol y se coloc toda
la mezcla en las Columnas de extraccin DNA easyminispin (QlAGEN)
y centrifugamos por 1minuto a 8000rpm (En este paso el ADN se une

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a la membrana). Terminada la centrifuga se elimin el lquido y

aadimos 500u| de buffer de Lavado AW1. Se volvi a centrifugar por
1 min a 8000rpm.Descartamos el lquido y aadimos 500ul de buffer
de lavado AW2, se repiti la centrifugacin por 1 minuto a 8000rpm.
Nuevamente descartamos el lquido y repetimos la centrifugacin por
2mininutos pero sin aadir nada mas solo para para secar la
membrana.
En la parte final se aadi 60ul de agua buffer AE, reposo por 23mininutos y centrifugamos otra vez a 8000rpm por 1minuto para
recuperar el ADN.

III.

RESULTADOS

Una vez realizados ambos mtodos se dejaron 6 das en las

condiciones adecuadas para poder ser cuantificados y poder
determinar su pureza de DNA .
Pero se pudo observar que hubo una falla al momento de realizar
mtodo de extraccin utilizando cloroformo: alcohol isoamilico por
formo una colacin que no era la esperada , y no se pudo obtener el
DNA esperado, por lo que no se pudo determinar dichos parmetros
Muy por el contrario, el caso de la extraccin por el mtodo de
columna de silica , a la cual se le realizo una dilucin del DNA
obtenido, en agua destilada (1:10) y se ley las muestras de DNA en
el espectrofotmetro uv-visible a 260 y_ 280nm , previamente un
blanco para cada longitud los cuales fueron 0,0330 y 0,0303
respectivamente. Los cociente de las absorbancias a 260 y 280nm
fueron 0,0070 y 0,0060 respectivamente.X

Entonces con estos datos se calcul (Clculos I) la calidad y cantidad

de DNA , y estos fueron :
-La relacin de los cocientes es de 1,1
-La concentracin de DNA es 13 ug /ml

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columnas de slica.

IV.

CONCLUSIONES
1. El mtodo de extraccin del DNA de cloroformo-alcohol
isoamilico es ms largo y dificultoso que el de columnas de
silica, lo que hizo imposible obtener un resultado ptimo y
mucho menos resultados de calidad ni cuantificacin de DNA,
para dicho mtodo
2. En el mtodo de extraccin de DNA con columnas de silica
nos permiti obtener la relacin de los cocientes es de 1,1 ,
este valor es menor que 1,7 entonces podemos concluir que
el DNA esta con presencia de protenas .
3. La concentracin de DNA en los leucocitos de una muestra de
sangre fue de 13ug/ml lo que equivale a 0,57 Mm lo que es
relativamente normal.

V.

BIBLIOGRAFIA
1.Guia de Practicas de Biologa Molecular 2016 (Ing. Jase Carpio
Carpio)

VI.

ANEXOS
METODO CLOROFORMO ALCOHOLISOAMILICO

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utilizando el mtodo de cloroformo-alcohol isoamilico y por
columnas de slica.

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columnas de slica.

METODO COLUMNA DE SILICA

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utilizando el mtodo de cloroformo-alcohol isoamilico y por
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VII.

CUESTIONARIO
1) Indique la diferencia de accin de los Buffer-LE y el Buffer
-LL
El Buffer de Lisis de Eritrocitos rompe los globulos rojos atravesando
una barrera , la cual posee hemoglobina , esta a su vez contiene Fe
el cual es el principal degradante de DNA.
El Buffer de Lisis de Leucocitos agrega iones al medio para que el
DNA nose degrade ,este a diferencia atraviesa las dos membranas
gracias al SDS.
2) Mencione las diferencias entre detergentes ionicos y no
ionicos
Los ionicos tienen fuerte afinidad por el agua, motivada por su
atraccin electrosttica hacia dipolos del agua puede arrastrar
consigo a las soluciones de cadenas de hidrocarburos.Po ejemplo
cidos carboxlicos ,esteres de sulfrico , acidos sulfnicos alcanos
Los no ionicos no se ionizan, se solubilizan mediante un efecto
combinado de un cierto nmero de grupos solubilizantes dbiles
(hidrfilos) como ter, y OH-.
El grupo hidrofbico est formado por una cadena larga que tiene
grupos dbilmente solubilizantes, por ejemplo, enlaces etreos y
grupos OH. La repeticin de estas unidades tiene el mismo efecto
que un hidrfilo fuerte salvo que no hay ionizacin. Por ejemplo
derivados polioxietilenados y polioxipropilenados, derivados de
sorbitn y alcanolamidas grasas
3) Porque es importante agregar el EDTA al Buffer de Lisis de
Leucocitos
Porque atrapa los iones de magnesio, que funciona
quelante ,e inhibe las DNAsas , que degradan el DNA

como

4) Desriba el procedimiento de cuantificacio del DNA utilizando

marcadores de peso molecular
1. Deje digerir a 37 C durante 2 a 3 h.
2. Asegurar que la digestin est completa corriendo cerca de 50
ng en un gel de agarosa al 0.7%. Cuando est completa, siga al
paso 3 4.
3. Si se va a utilizar el ADN como marcador PM sin marcar los
extremos, inactivar la enzima incubndola a 65C durante 10 min.
Luego agregue 110 l de TE y 40 l de 5X SGB para lograr una
concentracin de 25 ng/l. Haga porciones alcuotas y consrvelas a
4C o en el congelador.

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columnas de slica.

4. Para marcar los extremos, precipite agregando 5 l de 2.5 M

NaOAc y 125 l de EtOH absoluto, mezcle bien invirtiendo los tubos
y coloque a -80 C durante 30 min.
5. Centrifugue en una microcentrifugadora durante 10 a 15 min a
velocidad mxima. Vierta la capa sobrenadante e invierta los tubos
para que se escurran. Es muy importante dejar que se seque el
precipitado.
6. Vuelva a suspender el precipitado en 15 l de H2Odd.
Suponiendo que hay poca o ninguna prdida de ADN durante la
precipitacin, la concentracin debe ser de unos 5 g/15 l o de
0.33 g/l.