ENZIMOLOGA

PRCTICA N 4
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UREASA

INTRODUCCIN
La ureasa (EC 3.5.1.5), obtenida de vegetales, es una enzima con un peso molecular de
480000; est conformada por 6 subunidades donde se observan 4 puentes disulfuro; su
punto isoelctrico es de 5,0 y su pH ptimo de accin esta entre 6,0 y 7,0.
Para medir su actividad el mtodo ms preciso es usando el pH stat; durante el proceso, se
adiciona cido para mantener el pH en el valor de 7 (pH con el que se inicia la reaccin). Es
necesaria una correcta mantencin del pH para la ionizacin del cido carbnico y los
productos del amonio.
pK1
H2CO3

pK2
+

H + HCO3

H+ + CO32-

pK3
+

NH4

H+ + NH3

Para la determinacin de la actividad de ureasa se toma en cuenta lo siguiente:

d[H+]
-d[urea] =
dt
dt
2fn fc
1 + 2k2
donde:
fn = [H+]
y
fc =
[H+]
+
k3 + [H ]
1 + [H+] + k2
k1
[H+]
La temperatura de trabajo es a 38C y la KM de la enzima para la urea es de 10,5 mmol/L
OBJETIVOS:
1. Desarrollar un experimento de cintica enzimtica
2. Determinar Vmax y KM de ureasa en forma experimental, utilizando las ecuaciones y
grficas de Lineweaver- Burk, Eadie-Hoffstee, Hanes y Eisenthal Cornish-Bowden.

ENZIMOLOGIA

PROCEDIMIENTO
Prepare siete sistemas de medicin utilizando matraces de 25 ml.
Coloque en ellos 25 ml de urea de 7 distintas concentraciones: 1, 2, 5, 10, 15, 20 y 50 mM
Para ello utilice una solucin madre de urea de concentracin 0,025M; complete la tabla:
[urea] mM

10

15

20

50

ml de urea 0,025M
ml de H2O (hasta 25ml)

Introduzca en el primer matraz el imn del agitador magntico (completamente limpio y

seco); arme el sistema a 38C introduciendo el electrodo del conductmetro. Encienda el
agitador y djelo por unos segundos hasta que la lectura del conductmetro se haga
constante; adicione con la micropipeta automtica un mililitro de ureasa disuelta en agua
destilada (20 mg en 8 ml de H2O).
Tome lecturas cada 10 segundos durante 1 o 2 minutos, cuando la variacin sea constante.
Anote sus lecturas y determine la pendiente (v0)
Repita el procedimiento con los otros 6 matraces.
Haga esto lo ms pronto posible pues la enzima puede empezar a desnaturalizarse.
No olvide lavar bien el electrodo del conductmetro antes de cada determinacin.
Puede hacer el experimento tambin, midiendo el cambio del pH en un intervalo de tiempo
determinado (por ejemplo un minuto) y all determina la concentracin de hidrogeniones
correspondiente a ese cambio y reemplaza este dato en la frmula para calcular la Vi.
Si desea ms precisin en el resultado, use una bureta con HCl 1N y adicione el cido a
medida que va variando el pH (estabilizndolo al valor inicial lo ms rpido posible) para
saber cuantos hidrogeniones ha gastado en un intervalo de tiempo establecido, en cada una
de las concentraciones de urea estudiadas?
Despus de aplicar todas las posibilidades, ya que Ud conoce la K M de la enzima diga cual
mtodo es el ms adecuado para obtener este parmetro (el que se acerque ms al real).
Aplicando la frmula v02/[S] determine si las concentraciones usadas son las correctas; de
no ser as plantee un nuevo set de concentraciones (use ahora solo 6 matraces)
Con los resultados obtenidos haga las diferentes grficas y determine KM y Vmax

Haga un comentario de sus resultados tratando de explicar los errores experimentales que
de seguro se van a presentar por ser una primera experiencia.
ENZIMOLOGA

[S] (mM)

vo (mol/min)

1/[S]

1
vo

vo
[S]

[S]
vo

INTERROGANTES
1. Puede usted hacer la determinacin de la actividad de ureasa con un pH stat, con los
equipos con los que cuenta en el laboratorio? Explique

2. La pendiente de las distintas rectas Corresponder exactamente a las Unidades de

actividad enzimtica? Explique