3.

Tcnicas cromatogrficas Fundamentos y caractersticas La cromatografa es un mtodo

de separacin de molculas de diferente distribucin en dos fase: fase mvil (se separa
durante la cromatografa) y la fase estacionaria (no se desplaza). La fase estacionaria se
corresponde a la resina de la columna y la fase mvil se corresponde a la disolucin que se
hace pasar por la columna.
La cromatografa es lquida, por lo que se utiliza un disolvente. El disolvente se hace pasar
por la columna por una bomba peristltica, que hace pasar el disolvente por la columna a
una velocidad de flujo determinada. Va conectada a un tubo de tefln que no reacciona con
las disoluciones. La muestra se puede poner en mediante un inyector o en la bomba si no
hay inyector. La columna cromatogrfica est conectada por su salida a un detector. El
detector registra la absorbancia de lo que est pasando por el detector (lo que sale de la
columna). Dependiendo de la protena se aumentar o disminuir el rango del detector. El
detector est conectado a un colector de fracciones, conectado tambin a un
cromatograma, que dibuja los cambios de absorbancia.
- Etapas 1. La primera etapa, que no siempre es necesaria, es el empaquetado de la
columna. No es necesaria ya que algunas columnas vienen pre-empaquetadas y, una vez
que empaquetas una columna, la puedes reutilizar varias veces.
La mayora de las resinas vienen en polvo, por lo que habr que hidratarlo y ponerlo en el
tampn en el que se hace la cromatografa para que la resina se hinche al absorber el agua.
Una vez la resina est en condiciones se llena la columna dejando que sedimente para que
se empaquete la columna (las partculas tienen que quedar pegadas las unas con las otras).
Tras esto se abre la vlvula dejando que salga el lquido sobrante (el agua que no han
absorbido las partculas).
1 2. El siguiente paso se tiene que realizar en todas las cromatografas, se ha de equilibrar
la columna, ponerla en las condiciones iniciales de la cromatografa. Se ha de colocar la
columna en las condiciones necesarias para que la muestre se separe correctamente:
situaciones de tampn, pH, etc.
3. Cargar la muestra y dejar que penetre la columna.
4. Elucin, se coloca el tampn necesario para eluir todas las protenas. En ninguna
cromatografa debe quedar ninguna protena dentro de la columna, se debe terminar el
proceso cromatogrfico completo. La elucin es la salida de la columna. Las fracciones que
recogemos tienen un volumen determinado.
El cromatograma mide la variacin de absorbancia en el tiempo, lo que se traduce a
volumen de difusin (ya que conociendo la velocidad de flujo y la velocidad a la que avanza
el cromatograma puedes calcular el volumen de difusin por distancia). As, el
cromatograma muestra el perfil de salida de las molculas de una columna cromatogrfica.
Velocidad de flujo 1ml/min Cromatograma 1cm/min Un centmetro en el dibujo
corresponde con un mililitro, por lo que se puede saber en qu fraccin se obtienen los
picos de absorbancia Si no tienes un cromatograma, hay que medir la absorbancia de cada
tubo, por lo que la presencia de registradores ayuda al proceso. El volumen de elucin es el
volumen de la fase mvil a la cual una molcula cualquiera abandona la columna. El

volumen de elucin es el volumen en el que se ha encontrado el mximo de absorcin (el

pico).
Tipos de cromatografa Los tipos de cromatografa se diferencian en el principio de la
cromatografa, en los elementos que separa la cromatografa.
- Filtracin en gel: Separa por masa molecular.
Interaccin hidrofbica: Separa por la hidrofobicidad de la fase mvil.
Intercambio inico: Separa por carga.
Cromatografa de afinidad: Se da un reconocimiento biolgico.
Cromatografa de fase reversa: Se basa en la hidrofobicidad de la fase estacionaria, en
lugar de ser polar, es apolar.
2 Filtracin en gel Ninguna protena reacciona con la matriz, no hay interaccin entre la
resina y las partculas. Se separan por la mayor o menor penetrabilidad de las molculas
dentro de un gel reticulado. Habr canales dentro de las partculas, por lo que dependiendo
del tamao entrarn o no dentro de estas.
La fase mvil es el disolvente fuera del gel y la fase estacionaria es el disolvente dentro de
las partculas (est atrapado). Los disolventes normalmente son medios acuosos no
desnaturalizantes.
Habr molculas de diferentes tamaos, alguna de las cuales no entrar a los poros del gel,
por lo que descender ms rpido por la columna. Tras esto habr un grupo de protenas
que penetrar a algunos de los poros del gel y otras sustancias que entrarn a todos y cada
uno de los poros del gel, al no ver un lmite a su paso. Habr por tanto un orden de tamao
decreciente, saldr primero lo de mayor tamao y luego lo de menor tamao.
El intervalo de fraccionamiento es tpico de cada resina cromatogrfica (ab). Si el tamao es
mayor que a, ser un soluto que no entre a ningn poro del gel. Si el tamao es menor que
b, ser un soluto que penetra por todo el gel. Las partculas con tamao entre a y b son
molculas que pentrarn con diferente probabilidad a los canales del gen dependiendo de
su tamao. El rango de fraccionamiento se da por lo tanto por dos lmites: superior e inferior.
En algunos casos solo hay un nmero, el lmite de exclusin.
o o o El volumen de exclusin es el volumen que hay entre las partculas de gel, el volumen
ocupado por la fase mvil. Es el volumen en el cual eluye una partcula que no penetra en
ninguno de los poros del gel, por lo que tendr que tener un tamao > a.
El volumen total es el volumen de elucin de una partcula que penetra completamente en el
gel, por lo que tendr que tener un tamao < b. Ser el volumen de la fase mvil y la fase
estacionaria.
El volumen de elucin es el volumen de las partculas que estn entre el tamao a y b.
Si hacemos una cromatografa con lmite 250000-40000 para protenas de peso molecular:
1000000, 500000, 200000, 150000, 50000, 20000, 10000 y 5000, obtendremos 5 picos
(1000000 y 500000; 200000, 250000, 50000; y 20000, 10000 y 5000).
Puede haber procesos de adsorcin inespecfica si una sustancia eluye ms tarde que el
volumen total, por lo que se habr unido a la resina.
o Aplicaciones Se utiliza para la separacin de molculas de diferente tamao en

condiciones nativas, el clculo de masas moleculares, el desalado de muestras o cambio de

disolvente y para evaluar la pureza de una muestra.
3 o Determinacin del peso molecular Intercambio inico Se utiliza para separar solutos
que tienen carga en funcin de dicha carga. Lo que en la filtracin en gel conocemos como
resina, en el intercambio inico se denomina intercambiador. La matriz tendr grupos
polares unidos a su superficie, a diferencia de la filtracin en gel donde la matriz era inerte.
La interaccin depende de la carga del intercambiador y la carga de la protena por
interacciones de tipo electrosttico.
El intercambiador puede tener grupos negativos o positivos en su superficie. Si el
intercambiador tiene carga positiva intercambiar aniones (intercambio aninico), si el
intercambiador tiene carga negativa intercambiar cationes (intercambio catinico).
La carga neta de una protena depende de su punto isoelctrico y del pH del tampn en el
que est disuelta.
o o Las protenas cuyo pH es menor que el punto isoelctrico estarn cargadas
positivamente.
Las protenas cuyo pH es mayor que el punto isoelctrico estarn cargadas negativamente.
4 As sabremos qu protenas interaccionarn con cada tipo de matriz y a qu pH se
equilibrar esta para poder realizar el intercambio inico.
o Grupos funcionales unidos a la resina Fuerte o dbil se refiere al rango de pH en el que se
puede utilizar el tipo de marcadores. Cuanto ms fuerte sea el intercambiador, se podr usar
en un rango mayor de pH.
Cuando se pasa una muestra por intercambio inico se quiere que haya baja fuerza inica y
un pH que permita que se unan a la resina las protenas que queremos purificar. Cuando
pasamos la muestra habr protenas que queden retenidas y otras protenas que no lo
harn, ya que no se unirn a la matriz (protenas flowthrough). Normalmente ello se lava en
el mismo tampn de equilibrado para eliminar los restos de protenas que no han
interaccionado adecuadamente.
Tras esto eluiremos las protenas que han quedado unidas a la columna. La elucin se har
por cambios en la fase mvil: o Cambios en el pH Se dar un desplazamiento del
equilibrio haciendo que la protena deje de estar unida a la columna. Cambios de pH muy
bruscos pueden hacer que se desnaturalicen las protenas, por lo que muchas veces este
mtodo no es utilizado.
o Aumento de la fuerza inica Al aumentar la fuerza inica (utilizando Cl- Na+), los iones
competirn para unirse por los grupos cargados de la matriz. A medida que la cantidad de
iones crece, se va provocando la salida de las protenas. Primero eluirn las protenas con
interacciones ms dbiles, por lo tanto las que estn menos cargadas.
o Tipos de elucin En la elucin isocrtica se utiliza un mismo tampn de condicin
constante.
En las eluciones por pasos, se va aumentando la concentracin de cloruro de sodio
progresivamente, eluyendo cada vez un grupo de protenas.
En la elucin por gradiente, igual que en el caso anterior, se utiliza un gradiente

ascendente de cloruro de sodio. Se mezclarn por lo tanto el tampn sin cloruro de sodio y
el tampn con cloruro de sodio, aumentando la concentracin de este de forma creciente.
Las protenas se unirn en orden creciente de fuerza de interaccin con la matriz. En este
caso eluyen de forma separada protenas que en las eluciones por pasos no separaran, es
ms sensible.
5 Si hay puntos isoelctricos muy prximos se utilizar una elucin por gradiente, ya que es
difcil determinar los pasos a los que eluirn las diferentes protenas. En cambio, si los
puntos isoelctricos son muy diferentes, se utilizarn las eluciones por pasos.
Ejemplo DNA Tambin es posible separar el DNA, no nicamente protenas. Ello se debe a
que el DNA tiene carga negativa, por lo que se puede separar en columnas de intercambio
aninico (mono Q). En el caso del DNA, este eluir en dependencia del tamao, ya que las
cargas van asociadas al nmero de pares de bases (cuanto ms pequeo sea el DNA antes
eluir, ya que tiene menos carga). As, se separa por orden creciente de tamao.
Interacciones hidrofbicas Las molculas se separarn de acuerdo a su carcter
hidrofbico. Habr una fase estacionaria con grupos hidrofbicos inmovilizados, como el
grupo etilo o fenilo. En este caso se utilizar en la fase mvil una elevada concentracin
inica, ya que esta interaccionar con el agua facilitando que las molculas hidrofbicas
interaccionen con la matriz.
Se suele usar para purificar protenas despus de una cromatografa por intercambio. La
parte apolar de la molcula va a interaccionar con la matriz. La elucin se realizar
disminuyendo la fuerza inica o utilizando molculas que compitan con los grupos
inmovilizados de la fase estacionaria.
6 La elucin puede ser de la misma forma por pasos o utilizando gradientes. Normalmente
se utilizan gradientes de fuerza inica decreciente, por lo que ser un fenmeno inverso al
intercambio inico.
Primero eluirn las molculas menos apolares (ms polares), ya que tendrn una
interaccin ms dbil con los grupos de la matriz de carcter apolar. Las ltimas en eluir
sern las que estn muy unidas a la matriz y son muy apolares. Tambin se pueden utilizar
gradientes crecientes de disolventes orgnicos (detergentes), estos aumentan la apolaridad
de la fase mvil.
Gradientes de fuerza inica decreciente Gradientes crecientes de disolventes orgnicos Los
tipos de matrices son muy variables: En dependencia del tipo de grupo habr mayor o
menor hidrofobicidad para interaccionar con la matriz.
7 Afinidad La cromatografa de afinidad es muy especfica, se basa en propiedades
especficas de determinadas molculas. En muchas ocasiones no se podr realizar ya que
no se tiene un ligando especfico para la protena.
Hay interacciones muy propicias: antgeno-anticuerpo, hormona-receptor, enzima-sustrato,
IMAC y cromatografa de afinidad oligo-dt. Con IMAC (Immobilized Metal Affinity
Chromatography) se pueden separar todas las protenas con, por ejemplo, colas de
histidinas. Se puede manipular el sistema para poder utilizarla.
Hay tres etapas de preparacin: 1. Activacin del soporte, 2. Unin brazo espaciador, 3.

Unin del ligando.

En esta cromatografa hay un soporte con grupos reactivos que se pueden activar
qumicamente.
Normalmente estos grupos reactivos unen un brazo espaciador, una molcula
hidrocarbonada de determinada extensin que permite una mejor interaccin de la molcula
con la protena que se quiere separar (ya que si se tiene unida directamente a la columna
por impedimentos estricos la interaccin no es correcta). Nuestra protena diana que se
quiere purificar se unir al ligando, que est unido a la molcula hidrocarbonada.
Habr un paso de equilibrado, de unin de la muestra. El primer pico que se muestra en el
grfico sern las protenas contaminantes. Despus se hacen lavados para eliminar los
restos de protenas contaminantes y se eluye la protena, obteniendo el segundo pico.
8 La elucin de las protenas unidas ser mediante el desplazamiento del equilibrio,
afectando variables que afecten a la interaccin.
o o Normalmente se hace una elucin especfica por competencia, buscando una
molcula anloga que compita con la protena por el ligando de la columna. Tambin se
puede utilizar un ligando al que se una la protena diana en mayor concentracin que el
ligando de la columna.
Tambin se puede hacer una elucin inespecfica, alterando variables que afectan a la
interaccin o en presencia de agentes desnaturalizantes.
Cromatografa de afinidad por metales (IMAC) Se coloca una cola de histidinas a la protena
de inters de forma artificial. Esta cola suele estar compuesta por 6 histidinas ubicadas en el
extremo N-terminal o C-terminal. Hay normalmente dos tipos de protocolos: o Condiciones
nativas Se utiliza para enzimas que no se tienen que desnaturalizar.
o Condiciones desnaturalizantes Se utiliza cuando no se logra solubilizar la protena en
condiciones nativas, debido por ejemplo a que se forman cuerpos de inclusin (los cuales
no se disuelven). Hay protenas muy cargadas positivamente que se unen de forma muy
fuerte, por lo que se utiliza cloruro de guanidinio que, adems de desnaturalizar, rompe
interacciones electrostticas.
Primero se lisan las clulas en las condiciones en las que se va a hacer la cromatografa.
Esta purificacin, comparada con una purificacin normal, es una purificacin de un paso
rpido. Tras esto se pasa la muestra (el lisado del cultivo) por la columna, esta columna est
pre-empaquetada y se hacen lavados con una elucin por pasos con cantidades crecientes
de imidazol, ya que este compite por el nquel de la matriz con las histidinas.
La cromatografa une de manera preferencial todas las protenas con histidinas, pero al
hacer la dilucin por pasos estas protenas se pierden, ya que se preferencia la interaccin
de la protena diana con 6 histidinas (la unin ser ms fuerte). Sin esta elucin no se unira
cualquier protena que tuviese histidinas.
La preparacin de este tipo de columnas es igual a la explicada de manera general para la
cromatografa de afinidad. Habr una activacin de los grupos de la matriz, se aadir el
brazo espaciador y luego el ligando, que normalmente ser NTA (cido nitrilo-actico). El
NTA es el ligando que se tiene inmovilizado de forma covalente a la columna de afinidad por

metales. Cuando se pase la solucin de nquel, el NTA formar encales de coordinacin con
el nquel, retenindolo. Tras esto se carga la muestra con la protena con las colas de
histidina, que quedar unida al nquel.
9 El flowthorugh sern las protenas residuales, protenas dbilmente unidas que eluyen con
condiciones variables de imidazol. Tras esto eluirn las protenas unidas dbilmente (con
algn grupo histidina). Tras el pico de la protena no se llega a la lnea base debido al
imidazol. Por ello habr un paso de desalting para eliminar el imidazol, ya sea por dilisis o
por una cromatografa de filtracin con gel.
Tambin se puede utilizar con otras molculas que no sean protena, como el mRNA. El
mRNA representa menos del 5% del RNA total de la clula, por lo que no puedes hacer la
purificacin del RNA para aislarlo.
As, se utiliza una purificacin de afinidad para la cola de poliA. Las columnas tendrn
inmovilizados un oligo-dt (timinas), el cual se unir las molculas de mRNA con la cola
poliA. As, el rRNA y el tRNA no interaccionarn, eliminndolos de la columna. Para eluir el
mRNA se disminuir la concentracin de sales, alterando la formacin de los puentes de
hidrgeno.
HPLC: High Pressure (Performance) Liquid Chromatography Esta cromatografa se realiza
gracias a bombas que generan el evada presin. As, se obtiene una mayor resolucin que
en las cromatografas normales. Tiene mucha resolucin y es muy repetitivo y suele ser
bastante rpido.
Los picos se obtienen ya que se pueden hacer gradientes muy suaves, especificando la
pendiente del gradiente. Adems, las columnas estn mejoradas. Las partculas del soporte
son mucho ms pequeas (est ms empaquetado y ms compacto), por lo que permite
unir mejor la muestra y aplicar una mayor presin, aunque normalmente el flujo es ms
lento.
Hay varios reservorios con los diferentes tampones que queremos mezclar para hacer la
elucin, equilibrado de la columna, etc. Los tubos de tefln tienen filtros en el fondo para
que no entren impurezas, ya que al estar tan empaquetadas las columnas pueden causar
problemas. Los tampones son desgasificados ya que las burbujas pueden causar daos en
las columnas y distorsiona la absorbancia. Los dislventes estn conectados con bombas e
alta presin que determinan la cantidad de A y B que se mezcla para formar los diferentes
gradientes. A la vlvula de inyeccin de la muestra se une la columna.
De la salida de la columna habr un espectrofotmetro que estar conectado a un
ordenador. Adems, podr estar asociado a un colector de fracciones para recoger lo que
salga de la columna cromatogrfica.
10 En el sistema de inyeccin tienes un loop que es donde vas a cargar la muestra. La
muestra se puede conectar a la bomba para que pase a la columna. En el sistema de
inyeccin hay vlvulas con distintas posiciones: inyeccin de la muestra, columna y
desperdicio. Solo abriendo y cerrando las vlvulas puedes hacer que el contenido vaya a un
lugar u otro.
RP-HPLC: Cromatografa de fase reversa Es una cromatografa de hidrofobicidad, ya que

la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria (a diferencia de en la cromatografa

normal en la que la fase estacionaria es la ms polar). Se separa en funcin de la
hidrofobicidad de las molculas.
La hidrofobicidad va creciendo a medida que se aumenta el nmero de grupos carbono. Ello
determina el tipo de molculas a separar en cada una de las columnas. Las protenas
enteras se separan en una fase estacionaria de C4 o C6. La fase de C18 se utiliza para
pptidos pequeos. La fase mvil suele ser acetonitrilo o metanol en agua. Se aumentar la
canticidad de acetonitrilo para diluir las protenas.
En las cromatografas con fase estacionaria polar, la ultima molcula que eluia era la ms
polar. Sin embargo en la cromatografa de fase reversa ser la molcula ms polar ser
primera que eluya.
La presencia de las bombas y la precisin a la hora de mezclar los disolventes permite
hacer gradientes muy suaves, de forma que se separan dos sustancias que en otro
gradiente quedara en picos solapados.
Como las molculas salen ms separadas entre s hay menos intensidad en la absorbancia
en los diferentes puntos en comparacin con la cromatografa normal. Ello baja la
sensibilidad de deteccin de las molculas.
11 En el caso de las histonas se da una elucin en orden de polaridad. La histona ms polar
es la H1, por lo que es la primera que eluye, luego eluyen el resto con unos picos muy
parecidos. Se hace una elucin con pasos para la H1, y a partir de aqu se hace un
gradiente para separar el resto de histonas, por ello se pueden separar diferentes variantes
de la histona H2A por ejemplo. Al ser protenas la columna ser una C8, ya que las histonas
son muy bsicas y en una C4 las histonas no se uniran.
HILIC-HPLC: Cromatografa de interacciones hidroflicas Tiene puntos de contacto con la
fase reversa, la cromatografa en fase normal y con el intercambio inico.
Con la fase reversa ya que se utiliza una fase mvil apolar, el acetonitrilo. Con la
cromatografa en fase normal ya que se utiliza una fase estacionaria polar. Con el
intercambio inico ya que las protenas tienen carga o son muy polares.
Esta cromatografa se utiliza cuando la fase reversa no permite separar un grupo de
protenas, es una alternativa a esta. Tiene una extremada sensibilidad y se puede acoplar
con mucha facilidad a los sistemas de espectrometra de masas. El mecanismo de
funcionamiento es ms complicado que la fase reversa ya que hay tres tipos de interaccin:
o Reparto entre la fase mvil poco hidroflica y la fase mvil saturada con agua La fase
mvil debe contener al menos un 3% de agua, no se puede llegar al 100% de acetonitrilo.
Esta cantidad de agua se necesita para producir una capa de solvatacin alrededor de las
partculas para que haya un reparto. Por ello una parte es ms polar que la otra parte, de
forma que las molculas menos polares quedan retenidas con cantidades mayores de
acetonitrilo.
o o Interacciones electrostticas Puentes de hidrgeno Las interacciones permiten que se
formen puentes de hidrgeno.
12 En este tipo de cromatografa eluir primero el compuesto ms apolar, por lo que se

cambia el orden de elucin respecto a la fase reversa.

Se utiliza para separar frmacos hidroflicos.
Hay una diferencia entre los perfiles de HPLC y los otros perfiles, ya que los perfiles de
HPLC se d el tiempo de reproduccin, reproducible y especfico para cada columna. Por
ello el eje de las X, en lugar de ser mililitros como ocurre normalmente, son minutos. As,
muchas veces se identifican sustancias por el tiempo de retencin en una determianda
columna de HPLC.
Adems, muchas veces se utiliza como control de calidad.
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