Bio Reactor

DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH
REGULADO Y TEMPERATURA DE 25C EN EL

BIORREACTOR BIOFLO 3000 M1227 Y ESTUDIO INICIAL DE
FERMENTACIONES EN SISTEMA CONTINUO
GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO

JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ
Proyecto de grado para optar por el ttulo de

Ingeniero de Produccin Agroindustrial
Director
BERNADETTE KLOTZ
Biloga
ROSA ERLIDE PRIETO
Qumica
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL
BOGOTA, D.C.
2001
Nota de aceptacin
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
Presidente del Jurado
________________________________
Jurado
________________________________
Jurado
Bogot D.C, 16 de Julio del 2001
A mis Padres por su paciencia y

colaboracin durante estos dos aos.
Julin Pedroza
A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma

y mis hijos.
Mauricio Ramrez
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto,
por su valiosa colaboracin y orientacin para el desarrollo del mismo.
CONTENIDO
Pg
RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV

INTRODUCCION --------------------------------------------------------------------- XV
1. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------- 16
1.1 GENERAL -------------------------------------------------------------------------- 16
1.2 ESPECFICOS--------------------------------------------------------------------- 16
2. REVISION BIBLIOGRAFICA---------------------------------------------------- 17
2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA
EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES

CEREVISIAE --------------------------------------------------------------------------- 17
2.1.1 Biologa de las fermentaciones ------------------------------------------------------------ 17
2.1.1.1 Gluclisis -------------------------------------------------------------------------------------- 17
2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos-------------------------------------------- 21
2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura------------------------------------------- 22
2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono-------------------------------------- 23
2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrgeno ------------------------------------ 23
2.1.3 Condiciones de la fermentacin ----------------------------------------------------------- 24
2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA 25
2.2.1 Temperatura ------------------------------------------------------------------------------------ 25
2.2.2 pH-------------------------------------------------------------------------------------------------- 26
2.2.2.1 Ajuste del pH --------------------------------------------------------------------------------- 27
2.2.2.2 Buffers ----------------------------------------------------------------------------------------- 27
V
Contenido
VI
2.2.3 Aireacin ----------------------------------------------------------------------------------------- 28

2.3 BIORREACTORES ------------------------------------------------------------------------- 28
2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores ----------------------------------------------------- 28
2.3.2 Monitoreo de la fermentacin -------------------------------------------------------------- 29
2.3.3 Retroalimentacin ----------------------------------------------------------------------------- 30
2.4 CULTIVOS CONTINUOS ---------------------------------------------------------------- 30
2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo --------------------------------------- 32
2.4.2 Cintica del cultivo continuo----------------------------------------------------------------- 32
3. MATERIALES Y METODOS ------------------------------------------------------------- 35
3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35
3.2 DISEO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36
3.2.1 Diagramas de flujo ---------------------------------------------------------------------------- 36
3.2.1.1 Pruebas preliminares ---------------------------------------------------------------------- 36
3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------ 36
3.2.2 Preparacin de los medios de cultivo para pruebas preliminares ---------------- 37
3.2.3 Esterilizacin de los erlenmeyer y adecuacin de los medios de cultivo ------- 38
3.2.4 Activacin e inoculacin de la levadura ------------------------------------------------- 38
3.2.5 Variables a medir durante la fermentacin preliminar ------------------------------- 39
3.2.5.1 pH ----------------------------------------------------------------------------------------------- 39
3.2.5.2 Nmero de microorganismos ------------------------------------------------------------ 39
3.2.5.3 Slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa--------------------------------- 39
3.2.6 Anlisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares ---------------------- 39
3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo --------------------------------------------------------- 39
3.2.8 Fermentacin alcohlica en el Bioflo ----------------------------------------------------- 40
3.2.9 Fermentacin alcohlica sin regulacin de pH ---------------------------------------- 40
3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentacin en el Bioflo--- 40
3.2.11 Reproducibilidad de la fermentacin alcohlica en el Bioflo --------------------- 41
3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentacin ----------------------------------------- 41
3.2.11.2 Tcnicas utilizadas------------------------------------------------------------------------ 42
3.2.11.3 Validacin estadstica de los datos --------------------------------------------------- 42
Contenido
VII
3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42

3.3 MATERIALES Y METODOS------------------------------------------------------------ 42
3.3.1 Mtodo Kjeldahl para la determinacin de nitrgeno total-------------------------- 42
3.3.1.1 Fundamento del mtodo ------------------------------------------------------------------ 42
3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 43
3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 43
3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43
3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 44
3.3.1.6 Clculo y expresin de los resultados ------------------------------------------------- 45
3.3.2 Mtodo para la determinacin de azcares reductores por titulacin
de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------------------------- 45
3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 46
3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46
3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47
3.3.3 Determinacin del nmero de microorganismos por recuento en cmara
de conteo Neubauer Improved --------------------------------------------------------------------- 48
3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.4 Mtodo para la determinacin del contenido alcohlico de etanol por
el mtodo de destilacin simple ------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.5 Determinacin de slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ------------ 51
3.3.5.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 51
Contenido
VIII
3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51
3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51
4. PRESENTACIN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 53
4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS
PERISTLTICAS ---------------------------------------------------------------------- 53
4.1.1 Configuracin de sistema de bombas peristlticas para control de pH -------- 55
4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56
4.2.1 Porcentajes de variacin de pH para los medios semisinttico y natural ------ 57
4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 57
4.3.1 Determinacin de velocidad de agitacin para una fermentacin alcohlica-- 57
4.3.2 Determinacin de la concentracin de cido y base --------------------------------- 58
4.3.3 Fermentacin preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58
4.4.1 Calibracin de mtodo de determinacin de nitrgeno total ----------------------- 59
4.4.1.1 Curva de calibracin del mtodo Kjeldahl con urea ------------------------------- 59
4.4.1.2 Curva de calibracin para etapa de destilacin y titulacin---------------------- 60
4.4.2 Calibracin del mtodo de determinacin de azcares reductores
por titulacin de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62
4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS
EN EL BIOFLO -------------------------------------------------------------------------------------- 63
4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63
4.5.2 Datos de contenido de nitrgeno total en la biomasa-------------------------------- 65
4.5.3 Datos de slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66
4.5.4 Datos de azcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------- 66
4.5.5 Volmenes consumidos de cido y base por el sistema de regulacin
de pH ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67
4.5.6 Variacin de pH en las fermentaciones sin control de pH -------------------------- 68
5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69
Contenido
IX
5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR
RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69

5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 70
5.3 ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS -------------------- 70
5.3.1 Anlisis de la estandarizacin del mtodo de determinacin de
nitrgeno total------------------------------------------------------------------------------------------- 70
5.3.2 Anlisis de la estandarizacin del mtodo de determinacin de
azcares reductores residuales -------------------------------------------------------------------- 71
5.4 ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH
RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72

5.4.1 Crecimiento de microorganismos --------------------------------------------------------- 72
5.4.2 Contenido de nitrgeno en la biomasa ------------------------------------------- 73
5.4.3 Slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ----------------------------------- 76
5.4.4 Azcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------------------- 76
5.4.4.1 Balance de masa de azcar consumido en las fermentaciones---------------- 77
5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulacin de pH --------------- 82
5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS
DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL

CRECIMIENTO MICROBIANO-------------------------------------------------------------- 82
CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 85
RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 87
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 88
BIBLIOGRAFA --------------------------------------------------------------------------------------- 105
LISTA DE TABLAS
Pg
Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23
Tabla 2.2 Composicin del extracto de levadura producido mediante autlisis------- 24
Tabla 2.3 Parmetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29
Tabla 3.1 Normas y mtodos utilizados--------------------------------------------------------- 35
Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintticos ------------------------------------------------------ 37
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38
Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristlticas------------------------------- 54
Tabla 4.2 Caudales de bombas peristlticas para flujos de entrada y salida
empleando tubo de silicona de 1/8--------------------------------------------------------------- 55
Tabla 4.3 Resultados para medio semisinttico ----------------------------------------------- 56
Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56
Tabla 4.5 Porcentajes de variacin de pH------------------------------------------------------ 57
Tabla 4.6 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y
tiempo de operacin a diferentes velocidades de agitacin -------------------------------- 57
Tabla 4.7 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y
tiempo de operacin a diferentes concentraciones ------------------------------------------- 58
Tabla 4.8 Resultados de calibracin para mtodo total de Kjeldahl--------------------- 59
Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilacin y titulacin del mtodo
Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61
Tabla 4.10 Resultados de calibracin para mtodo de determinacin de
azcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64
Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrgenos celular por mililitro ---------------- 65
Tabla 4.13 Resultados de toma de Brix a 20 C--------------------------------------------- 66
Tabla 4.14 Resultados de determinacin de azcares reductores residuales-------- 67
X
Lista de Tablas
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67

Tabla 4.16 Variacin de pH en una fermentacin sin control de pH -------------------- 68
Tabla 5.1 Porcentajes de error del mtodo de determinacin de nitrgeno total
en diferentes estandarizaciones realizadas---------------------------------------------------- 71
Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones
en el Bioflo ----------------------------------------------------------------------------------------------- 72
Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrgeno en fermentaciones en el Bioflo -------------- 73
Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrgeno por clula ----------------------------------- 74
Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrgeno por clula ----------------- 75
Tabla 5.6 Balance de azcares en fermentaciones en el Bioflo
para 10 litros de medio ------------------------------------------------------------------------------- 79
Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azcares en diferentes
fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------- 80
Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilucin
y max para una fermentacin en sistema continuo.---------------------------------------- 84
XI
LISTA DE FIGURAS
Pg
Figura 2.1 Secuencia de la gluclisis ------------------------------------------------------------ 19
Figura 2.2 Va anaerobia de la gluclisis ------------------------------------------------------- 20
Figura 2.3 Va aerbica de la gluclisis --------------------------------------------------------- 20
Figura 2.4 Relacin de concentracin de substrato y velocidad
especfica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21
Figura 2.5 Curva de crecimiento tpica de una poblacin celular ------------------------ 22
Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilucin y concentracin de substrato
en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31
XII
LISTA DE ANEXOS
Pg
Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88
Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90
Anexo C Datos del seguimiento de una fermentacin con flujos de
entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94
Anexo D Sistema de bombas peristlticas del Bioflo 3000 M1227 --------------------- 100
XIII
RESUMEN
En la lnea de investigacin de fermentacin, se continu con el conocimiento en el

manejo y funcionamiento del biorreactor; este trabajo present un aporte
complementario enfocado a la evaluacin del sistema de regulacin de pH y su
incidencia en el desarrollo de una fermentacin alcohlica. Para establecer la influencia
de la variable pH se determin parmetros como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrgeno, consumo de slidos solubles totales, contenido de sacarosa,
contenido de etanol y contenido de azcares residuales, comparando una fermentacin
con regulacin de pH contra una sin regulacin, presentando mejor rendimiento al
controlar el pH. Para el estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo, el
biorreactor present inconsistencias en los flujos que no permitieron desarrollar dicho
proceso.
Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated pH on an
ethanolic fermentation at 25C. Also, through this study it was want to complete
instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined
during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non
controlled pH: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total
soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In
addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized.
XIV
INTRODUCCION
La facultad de Ingeniera de la Universidad de La Sabana adquiri un biorreactor para

investigacin en el rea de fermentaciones y como apoyo en la formacin acadmica.
Los trabajos anteriormente realizados en el Bioflo se centraron en establecer una gua
de manejo y funcionamiento de ste, determinando la precisin y la reproducibilidad de
fermentaciones alcohlicas a temperatura constante de 30 C y 25 C. El presente
trabajo es un complemento al manejo del biorreactor, en el cual se evala el sistema de
regulacin de pH y los sistemas continuos de cultivo, brindando un aporte al protocolo
de operacin del equipo.
El monitoreo y control de una fermentacin es un rea activa de investigacin que
busca mejorar la eficacia de los bioprocesos, alcanzando uniformidad y confiabilidad en
el proceso de fermentacin. La variable pH es de gran importancia ya que afecta al
proceso fermentativo de diversas maneras, produciendo reacciones no deseadas,
inhibiendo la actividad enzimtica de las levaduras y formando productos no esperados
en el proceso de fermentacin. Es por esto que el trabajo est orientado al manejo y
funcionamiento del biorreactor en el desarrollo de una fermentacin alcohlica a pH
regulado y temperatura ptima de 25 C para el crecimiento de la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de medir la reproducibilidad de esta fermentacin
se realiza el seguimiento de parmetros tales como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrgeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variacin de slidos
solubles, contenido de azcares reductores residuales y contenido de etanol.
Adicionalmente se continu con la estandarizacin de los mtodos analticos aceptados
internacionalmente a las condiciones del laboratorio de investigacin de la Facultad. Se
han realizado nuevas adquisiciones de equipos, que ofrecen mejor exactitud y precisin
en los anlisis, como lo es la determinacin de contenido de nitrgeno total en una
muestra. A la vez se empleo el mtodo de titulacin de Lane y Enyon, alternativo para
determinacin de azcares reductores residuales diferente al mtodo colorimtrico
empleado en las anteriores investigaciones.
Como parte principal de la gua complementaria de manejo y funcionamiento del Bioflo,
se encuentra la configuracin de los sistemas de bombas peristlticas, necesarias para
controlar variables como pH en una fermentacin alcohlica y dar pie al uso del
biorreactor en sistema continuo, lo cual se evalu de manera preliminar en el presente
trabajo y servir para el que desee profundizar las investigaciones realizadas por la
facultad
de
Ingeniera
en
la
lnea
de
fermentacin.
XV
CAPITULO 1
OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar una fermentacin alcohlica a pH regulado y temperatura constante en el
Bioflo y realizar un estudio preliminar de fermentaciones en sistema continuo.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar mediante fermentaciones alcohlicas preliminares, qu medio de

cultivo, semisinttico o natural, presenta un mayor rango de variacin de pH.
Determinar la concentracin necesaria de cido y base a ser utilizada en la

regulacin de pH y configurar de manera preliminar los sistemas de bombas
peristlticas del Bioflo.
Determinar la reproducibilidad de una fermentacin alcohlica en el biorreactor

a pH constante y temperatura de 25 C.
Establecer una gua de manejo y funcionamiento del sistema de bombas

peristlticas del biorreactor en una fermentacin alcohlica utilizando el
sistema de regulacin de pH.
Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos
16
CAPITULO 2
REVISION BIBLIOGRAFICA
En ste captulo se presenta el marco terico para el desarrollo del siguiente

trabajo. Bsicamente se hace una revisin sobre la fermentacin alcohlica,
variables que afectan la fermentacin, el funcionamiento de un Biorreactor y la
teora bsica sobre fermentaciones en sistema continuo.
2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL

CRECIMIENTO
DE
LA
LEVADURA
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE.
La fermentacin en gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos,
levaduras o bacterias, pero las levaduras son las ms utilizadas por su papel en la
fabricacin de bebidas alcohlicas. Son los microorganismos que ms se usan en
la bioindustria, se pueden cultivar por las clulas mismas y por los productos
finales que se producen durante la fermentacin alcohlica.
La produccin de alcohol por levadura se realiza por una fermentacin alcohlica
anaerbica, del cual resulta un rendimiento menor de clulas, pero cantidades
satisfactorias de alcohol y CO2.
Durante los primeros das del proceso de fermentacin, las clulas de levadura
crecen por respiracin consumiendo oxigeno y creando un medio anaerobio. Tan
pronto como l oxigeno desaparece se inicia la fermentacin, produciendo alcohol.
La levadura pasa de metabolismo aerobio al anaerobio.
La tolerancia al alcohol depende, adems de las caractersticas genticas de la
cepa, de diversos factores ambientales como la concentracin de azcares en el
medio desde el inicio de la fermentacin y en fases posteriores, temperatura, pH y
de manera importante la concentracin del etanol en las diferentes etapas de la
fermentacin.
2.1.1 Biologa de las fermentaciones.
Aproximadamente el 96% de la produccin del etanol mediante fermentacin a

nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El
etanol se produce en la ruta de gluclisis, especficamente en la va anaerbica,
en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin
global es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 Etanol + 2 CO2 +ATP + Energa
El rendimiento terico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49

gramos de CO2. Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en
biomasa y el rendimiento en etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor terico. El
ATP formado se utiliza para las necesidades energticas de la clula (Owen,
1991, 134).
En cuanto a la estructura celular de la levadura, la envoltura de la clula de
levadura incluye una membrana plasmtica, un espacio periplsmico y una pared
celular constituida principalmente por polisacridos y una pequea cantidad de
pptidos. La pared tiene una estructura semirrgida permeable al soluto que
proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil.
2.1.1.1
Gluclisis
La gluclisis ejemplifica de que manera los procesos bioqumicos de una clula se

desarrollan en pequeos pasos secuenciales, los cuales son catalizados cada uno
por una enzima especfica. Los primeros pasos de la gluclisis requieren de un
ingreso de energa, que es suministrada por el acoplamiento de estos pasos al
sistema ATP/ADP.
La secuencia completa comienza con una molcula de
glucosa. Se invierte energa en los pasos 1 y 3 por transferencia, en cada paso,
de un grupo fosfato desde una molcula de ATP a la molcula de azcar. La
molcula de 6 carbonos, proveniente de la glucosa presenta la lisis en el paso 4 y
a partir de este paso en adelante la secuencia produce energa. Cabe anotar que
en este paso se producen 2 molculas de gliceraldehdo fosfato que en el paso
final producir las dos molculas de cido pirvico. En los pasos 6 y 9 las
molculas de ADP toman energa del sistema, fosforilndose a ATP. De esta
forma la molcula de glucosa se ha convertido en dos molculas de cido pirvico.
La ganancia neta de energa son dos molculas de ATP y dos molculas de
NADH por molcula de glucosa.
El cido pirvico obtenido en la gluclisis puede seguir dos vas. Una va es
aerbica (respiracin) y la otra es anaerbica (fermentacin). La va aerbica es
la va principal del metabolismo energtico de las levaduras en presencia de
oxgeno y la va anaerbica es la va fermentativa que funciona en ausencia de un
aceptor externo de electrones. En ausencia del oxgeno el cido pirvico se
convierte en etanol.
La siguiente grfica muestra las dos etapas de la gluclisis; La primera etapa usa
ATP y la segunda produce ATP y NADH.
Figura 2.1 Secuencia de la gluclisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biologa.
Va anaerbica o fermentacin: Los pasos por los cuales el cido pirvico,

formado por la gluclisis, se convierte anaerobiamente en etanol. En el primer
paso se desprende CO2. En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el
acetaldehdo. La mayora de la energa potencial de la glucosa permanece en
el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 molculas

de etanol ms 2 molculas de CO2 a partir una molcula de glucosa.
Glucosa
2 Etanol + 2 CO2
Figura 2.2 Va anaerobia de la gluclisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biologa.
Va aerbico o respiracin: En presencia de oxgeno, la siguiente etapa de la

degradacin de la glucosa implica la oxidacin progresiva del cido pirvico a
CO2 y agua, proceso conocido como respiracin. El paso previo es la
oxidacin del cido pirvico a un grupo acetilo de dos carbonos que se
combina con la coenzima A para formar el acetilCoA. El acetilCoA entra en el
ciclo de Krebs que es el siguiente paso de la respiracin, en el cual los
carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a CO2 y los tomos de
hidrgeno pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la
gluclisis, en cada paso interviene una enzima especfica.
Figura 2.3 Va aerbica de la gluclisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biologa
La secuencia respiratoria completa es:

Glucosa + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O + Energa
2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos

Una poblacin de microorganismos presenta generalmente un patrn de
crecimiento caracterstico cuando se inocula en un medio de cultivo fresco.
Fase de retraso: En esta fase las clulas se ajustan a las nuevas condiciones.
Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo
las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el
crecimiento exponencial continua a la misma velocidad.
Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las

clulas aumenta progresivamente. Transcurrido un periodo de tiempo, las
clulas crecen a una velocidad mxima constante y no dependen de la
concentracin de substrato. La siguiente grfica ilustra este comportamiento.
Figura 2.4 Relacin de concentracin de substrato y velocidad especfica de

crecimiento de un microorganismo
Fuente: TREVAN, M. Biotecnologa: principios biolgicos.

La zona B a C equivale a la fase exponencial del cultivo, con substrato en exceso
y un crecimiento a una velocidad mxima constante. La zona A a B corresponde a
la desaceleracin de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase
exponencial hasta el inicio de fase estacionaria.
En la fase exponencial, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo
en un cultivo puede describirse mediante la siguiente ecuacin:
Nt = N0 x 2n
donde:
Nt es nmero de clulas en un tiempo t
N0 es el nmero de clulas inoculadas
n es el nmero de generaciones al tiempo t
Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de

los nutrientes indispensables se agota o algn producto de desecho fabricado
en el medio llega a un nivel en el que es inhibidor y cesa el crecimiento
exponencial. En la fase estacionaria no hay incremento ni decremento en la
cantidad de clulas, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar,
incluyendo el metabolismo energtico y la produccin de metabolitos
secundarios.
Fase de muerte: Despus de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la

incubacin de las clulas, estas pueden seguir vivas y continuar
metabolizando, pero lo ms probable es que mueran. En algunos casos, la
muerte se acompaa por lisis celular, dando a lugar a disminucin en el conteo
microscpico directo junto con la disminucin del conteo de viabilidad.
Grficamente, en escala semilogartmica se observa el comportamiento tpico del

crecimiento de una poblacin de microorganismos.
Figura 2.5 Curva de crecimiento tpica de una poblacin celular
Fuente: BROCK, T. Microbiologa.

2.1.2
Requerimientos nutricionales de la levadura
Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han aadido los

nutrientes apropiados. La solucin acuosa que contiene los nutrientes necesarios
se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan

a la clula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca ms
clulas semejantes a ella misma. Adems de las fuentes de energa, que pueden
ser substancias orgnicas o inorgnicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener
fuentes de carbono, de nitrgeno y macro y micro nutrientes respectivos.
Un medio de cultivo ptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la
mxima produccin.
La composicin de los medios de cultivo debe ser
constantemente adaptada a los procesos de fermentacin. En general los
requerimientos bsicos de nutrientes para los microorganismos y las formas
comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla.
Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes
NUTRIENTE
FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO
CARBONO
GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO

DE LEVADURA, PEPTONA
NITROGENO
ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO3,

(NH4)2SO4,
FOSFORO
Na2HPO4, KH2PO4
AZUFRE
Na2SO4, H2S
POTASIO
KCL, K2HPO4
MAGNESIO
MGSO4, MgCL2
SODIO
NaCl
HIERRO
QUELATOS DE HIERRO, FeCl3
MICRONUTRIENTES
MnSO4, CuCl2, ZnCl2, CoCl2, NiCl2, Na2MoO4, Na2Se4
Fuente: BROCK, T. Microbiologa

2.1.2.1
Substratos utilizados como fuente de carbono
Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energa en la industria de la

fermentacin. Por razones econmicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez
son utilizadas como nica fuente de carbono, excepto en los procesos que exigen
el control exacto de la fermentacin. La melaza, el extracto de malta, el almidn,
las dextrinas, la celulosa y los aceites vegetales son utilizados comnmente como
fuentes de carbono en diversos procesos fermentativos.
2.1.2.2
Substratos utilizados como fuente de nitrgeno
Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso
como fuente de nitrgeno. Una fuente de nitrgeno que es metabolizada
eficientemente es el lquido de maceracin del maz, que se forma durante la
formacin de almidn a partir de maz. Los extractos de levadura son excelentes
substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene
aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas
pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras
para la aplicacin industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la
caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de man, la harina de soya, las
semillas de algodn y las semillas de girasol.
El extracto de levadura es medio complejo y su composicin se presenta a
continuacin.
Tabla 2.2 Composicin del extracto de levadura producido mediante autlisis
COMPOSICIN (%)
MATERIA SECA
70
NITROGENO TOTAL
8.8
PROTEINA (N * 6.25)
55
AMINOACIDOS
38.4
CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm)
TIAMINA
20-30
RIVOFLAVINA
50-70
PIRIDOXINA
25-35
ACIDO PANTOTENICO
200
NIACINAMINDA
600
Fuente: CRUEGER, W. Biotecnologa: Manual de microbiologa industrial.

El extracto de levadura al ser un medio complejo, provee de la mayora de los
factores potenciales de crecimiento, factores que consisten en vitaminas,
aminocidos, purinas y pirimidinas, los cuales no pueden ser sintetizados por
algunos microorganismos.
Se establece que los medios de cultivo para llevar a cabo una fermentacin
alcohlica a nivel laboratorio, que muestran mayor rendimiento son los que utilizan
extracto de levadura, acompaado de un complejo vitamnico (Alba y Sierra, 1999,
123)
2.1.3 Condiciones de la fermentacin.
En la fermentacin alcohlica las levaduras utilizan los azcares sacarosa,
fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden.
La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular.
Aunque las fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerobias, las

levaduras necesitan algo de oxgeno para sintetizar algunos esteroles y cidos
grasos insaturados.
Muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden producir concentraciones de
etanol de hasta el 12 % al 14%. Existen cepas seleccionadas capaces de producir
hasta un 18% a 20% de alcohol, aunque la velocidad de fermentacin se ve
fuertemente reducida cuando la concentracin de etanol aumenta (Owen, 1991,
136).
En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de
las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaria. La velocidad de
fermentacin aumenta generalmente con la temperatura entre los 15C y los 35 C
y los niveles de glicerol, acetona, acetaldehdo y piruvato se elevan en los medios
de fermentacin. La formacin de niveles elevados de alcohol tambin depende
de la temperatura (Owen, 1991, 136).
En la produccin de bebidas alcohlicas deben controlarse las fermentaciones de
forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se
conviertan en alcohol y en compuestos con aromas caractersticos y deseables, y
por otro lado, se minimice la formacin de aromas y sabores indeseables. Entre
los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del
etanol, steres, compuestos carbonlicos, cidos orgnicos, compuestos
azufrados, aminas y fenoles.
A medida que la riqueza alcohlica aumenta, la poblacin de otras levaduras que
se encuentran en el medio a fermentar decrece y va siendo sustituida como
poblacin dominante por la Saccharomyces cerevisiae. Este patrn de sucesin
est fuertemente influenciado por las condiciones de fermentacin como son la
temperatura y el pH; por ejemplo, a una temperatura de 25C y pH de 3.0 a 3.5,
las cepas de Saccharomyces cerevisiae dominan la fermentacin y las otras
especies mueren. Como tambin la adicin de SO2 reduce la poblacin de
levaduras silvestres en el medio y de esta manera favorece la preponderancia de
Saccharomyces cerevisiae, ya que esta especie es ms resistente a este biocida
(Garca, 1993, 295).
2.2
VARIABLES
ALCOHOLICA
QUE
AFECTAN
LA
FERMENTACION
La fermentacin es un proceso determinante en la composicin final del producto

fermentado. Son muchos los factores que influyen en el desarrollo de una
fermentacin: Temperatura, pH y aireacin.
2.2.1 Temperatura
La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las
levaduras. La temperatura ms adecuada para su reproduccin y la fermentacin
oscila entre 22 C a 27 C y se reproduce con mayor rapidez cuando la

temperatura es de 25 C. A temperaturas superiores a 30 C, las levaduras
pierden capacidad para desdoblar los azcares y al aproximarse a 40 C dejan de
crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentacin alcohlica nunca
se debe superar temperaturas de 32 C durante el periodo fermentativo ya que se
corren varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991):
Inactivacin de las levaduras responsables de la transformacin de los
azcares en alcohol y CO2.
Prdida de alcohol por evaporacin con merma de grado alcohlico.
Iniciacin de fermentaciones indeseables.
La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje
de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando
se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el
grado alcohlico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas
o superiores a los 30 C 35 C (Surez, 1990, 211).
Adems las fermentaciones alcohlicas efectuadas a 25 C obtienen mejores
resultados que las efectuadas a 30 C ya que:
El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 C la levadura
se desarrolla un 25.5% ms que a 30 C; El consumo de slidos solubles,
sacarosa y grado alcohlico a 25 C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 GL
respectivamente mientras que a 30 C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 GL(Merchan y
Castillo, 1999, 120).
El buen desarrollo de la fermentacin esta en parte ligado a la necesidad de evitar
que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La
experiencia ha demostrado que son tanto ms sensibles a la elevacin de
temperaturas cuanto ms vieja sea la poblacin, lo que constituye una causa de
ralentizacin y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en
el medio azcares aun no transformados en alcohol.
A partir de 30 C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente
su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 C. El
hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no
aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentacin y mayor grado
alcohlico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilizacin de una fraccin
importante de compuestos aromticos (Surez, 1990, 211).
2.2.2 pH
El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentacin no se ve afectado por
la variacin de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05
hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un mximo de rendimiento de acuerdo a
la formacin de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de
1998).
En una fermentacin alcohlica, el pH vara normalmente entre un mnimo de 2.8 y
un mximo de 3.8, rango que depende bsicamente de la composicin del medio
10
a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores

menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenmeno de
inhibicin por pH, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro
activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado
estado de ionizacin y este estado vara en funcin del pH el medio. Por lo tanto,
la actividad enzimtica es funcin del nmero de centros activos y estos,
dependen del pH del medio. Por otra parte, este fenmeno puede interpretarse
por el importante efecto que el pH del medio tiene sobre la estructura y la
permeabilidad de la membrana celular (Revista Alimentacin, equipos y
tecnologa, Junio de 1993).
La marcha fermentativa depende adems del pH del medio y los productos que
resultan son mejores en cuanto a rendimiento a valores de pH bajos. Tambin el
conjunto de las floculaciones coloidales estn reguladas por el pH del medio, as
como algunas de sus caractersticas organolpticas tales como color y sabor.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae el crecimiento se da ms rpido que en
las bacterias a bajos valores de pH, ofreciendo la ventaja de operar una
fermentacin alcohlica evitando contaminacin. Si se utiliza sacarosa como
fuente de carbono el sistema es ms sensible al pH que al utilizar glucosa, ya que
la inversin de la sacarosa se acelera a pH bajos.
El producto final de una fermentacin alcohlica esta constituido esencialmente
por una solucin hidroalcohlica de cidos orgnicos salificados en distintas
proporciones, especialmente de potasio, magnesio y calcio. Esta solucin
contiene diferentes sustancias, que pueden permanecer en estado de solucin
verdadera, de solucin coloidal o de simple suspensin. Las proporciones de
estos constituyentes pueden ser sensiblemente variables entre ellos y esto en
funcin de diversos factores tales como pH. El pH es una caracterstica de
primaria importancia, y esto por diferentes motivos. Ante todo organolpticamente
el pH influye fuertemente sobre la sensacin de acidez, dado que sta depende
ms de la concentracin hidrogeninica (fuerza cida) que de la cantidad de
cidos contenidos. Sobre la formacin del fosfato frrico y consiguiente quiebra
fosftica tiene fuerte influencia el pH, y se ha podido demostrar que el pH ptimo
para el pleno desarrollo de ste fenmeno se sita sobre el valor de 3.3. A valores
sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Se puede
comprender como las desviaciones de pH pueden hacer aparecer riesgos que no
se tenan, hecho que se produce, por ejemplo, a continuacin del tratamiento de
un vino con un desacidificante o tambin por la adicin directa de un cido (De
Rosa, 1998, 239).
2.2.2.1 Ajuste del pH
Adicin de cido tartrico o de cido ctrico: Los dos nicos cidos que se
pueden usar tanto tecnolgicamente como legalmente, son el cido tartrico y
el ctrico.
11
Desacidificacin:
Los desacidificantes utilizables tcnicamente en las
fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el
tartrato neutro de potasio.
2.2.2.2 Buffers
En los medios de cultivo es deseable mantener un pH constante (rango 3.0 3.5)
durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de
amortiguadores o buffers. Tambin sucede que el pH en un medio de cultivo se
ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidrxido de sodio si el pH
es demasiado cido; o un compuesto cido, por ejemplo el cido clorhdrico, si el
pH es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios
en el pH de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de
cultivo un amortiguador de pH, actuando dentro de los lmites mximos de pH; por
lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de pH.
Para lmites prximos a la neutralidad (pH 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un
amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos
de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo.
2.2.3 Aireacin
La velocidad de fermentacin al inicio del proceso fermentativo, depende
estrechamente de las condiciones de aireacin,
desarrollndose dicha
fermentacin ms rpidamente cuando las levaduras estn mejor aireadas. Por lo
tanto, es conveniente airear el medio hasta el mximo, mximo que coincidir con
l limite de solubilidad de un gas (oxgeno) en un liquido y que es muy bajo. Por
mucho que se airee al principio, se tender a alcanzar muy pronto la saturacin
del mosto en oxgeno.
La utilizacin del oxgeno por levaduras slo tiene lugar al comienzo de la
fermentacin. Una vez arrancada sta, no necesita oxigenacin o de lo contrario
se desviara el proceso alcohlico, y comenzara entonces la metabolizacin de
los azcares por va respiratoria, produciendo mayor cantidad de clulas.
La fermentacin con agitacin es ligeramente ms rpida que la fermentacin sin
agitacin. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azcar obtenidos son
similares en ambas condiciones de operacin, observndose un ligero aumento en
el grado alcohlico y el azcar residual en la fermentacin sin agitacin (Lpez,
Marzo de 1995, 55).
2.3 BIORREACTORES
Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto
de la densidad de la poblacin, como de la velocidad de crecimiento. Su
aplicacin incluye la preparacin de bebidas alcohlicas, como una amplia gama
en la industria biotecnolgica.
Se pueden adaptar para realizar cultivos
12
discontinuos o continuos. En cultivos discontinuos, el microorganismo crece a

partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial
o se acumulan subproductos txicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En
cambio en el tipo continuo se emplean dos elementos en su control, la velocidad
de flujo y la concentracin de un nutriente limitante.
2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores
En el ambiente dentro de un biorreactor se debe asignar la ptima actividad
cataltica para las levaduras mediante parmetros como temperatura, pH, oxgeno
disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitacin, que tienen un significativo
efecto en el desarrollo de la fermentacin y las reacciones enzimticas. Para
proveer el ambiente deseado, las propiedades del sistema deben ser
monitoreadas y se deben tomar acciones de control para rectificar cualquier
desviacin de los valores deseados. El monitoreo y control de las fermentaciones
es un rea activa de investigacin destinada a mejorar la productividad de los
bioprocesos y alcanzar una confiable y uniforme operacin de fermentacin.
Varios niveles de procesos de control existen en la industria de la fermentacin. El
control manual es el ms simple, requiere de operacin humana para manipular
dispositivos tales como bombas, motores y vlvulas. La retroalimentacin es
usada para mantener parmetros a valores especficos. Con la creciente
aplicacin de los sistemas de computadoras en la industria de la fermentacin,
tambin se quiere apuntar a la implementacin de controles avanzados y
estrategias de optimizacin basado en modelos de fermentacin.
2.3.2 Monitoreo de la fermentacin
Para entender el control del estado de una fermentacin se debe conocer las
variables crticas que afectan a un bioproceso. Estas variables pueden ser
agrupadas en tres categoras: fsicas, qumicas y biolgicas. Muchas de las
medidas fsicas estn establecidas en la industria; otras estn actualmente siendo
desarrolladas o son foco de investigacin para obtener nuevos instrumentos.
Idealmente las medidas deben realizarse in situ y en lnea. Actualmente el
monitoreo en lnea tiene aplicacin en los siguientes grupos:
Produccin de biomasa.
Produccin de enzimas microbianas.
Produccin de metbolitos microbianos: etanol, cido ctrico, acetona, butanol,

polisacaridos, vitaminas.
Procesos de transformacin: glucosa a etanol, etanol a vinagre, produccin de

antibiticos.
Las medidas que son realizadas en lnea generalmente son: temperatura, presin,
pH, oxgeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitacin, consumo de
energa, nivel de espuma.
13
Tabla 2.3 Parmetros medidos o controlados en biorreactores

FISICOS
TEMPERATURA, PRESION,
NIVEL DE LIQUIDO, NIVEL DE
ESPUMA, VELOCIDAD DE
AGITACION, CONSUMO DE
ENERGIA, VELOCIDAD DE
FLUJO DE GAS, VELOCIDAD
DE FLUJO DE MEDIO,
VISCOSIDAD DEL CULTIVO
QUIMICOS
PH, OXIGENO Y CO2

DISUELTO, POTENCIAL
REDOX, COMPOSICION DE
GAS DE SALIDA,
CONDUCTIVIDAD,
COMPOSICION DEL MEDIO
BIOLOGICOS
CONCENTRACION DE
BIOMASA, CONCENTRACION
DE ENZIMAS, COMPOSICION
DE BIOMASA(ADN, ARN,
PROTEINA,
ATP/ADP/AMP/NAD),
MORFOLOGIA.
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principies.

2.3.3 Retroalimentacin
Cuando se necesita mantener el valor de una variable constante durante el
proceso, por ejemplo el pH a un valor dado, se tienen diferentes sistemas
controladores. Uno de los controladores ms simples es el de retroalimentacin,
el cual consta de un aparato de medicin (potencimetro) que enva el valor de la
medicin al controlador. En el controlador el valor medido es comparado con el
valor establecido o fijo y se registra la diferencia. La desviacin con respecto al
valor real se llama error, el cual es usado por el controlador para determinar que
accin debe seguir para corregir el proceso. El controlador produce una seal la
cual es transmitida al ejecutar encendindolo o apagndolo; Para el caso del pH,
si la medida baja del punto determinado, una bomba adiciona lcali a la
fermentacin hasta retornar el valor de pH requerido.
Figura 2.6 Componentes del retroalimentador
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principles.
2.4 CULTIVOS CONTINUOS

14
Si se prepara un cultivo de tal forma que el cese del crecimiento se deba al

agotamiento del medio, es decir, limitacin del substrato, en lugar de la
acumulacin de metabolitos txicos, entonces la fase exponencial del crecimiento
puede prolongarse mediante la adicin de nuevo medio al recipiente. Esta
operacin puede repetirse hasta que el recipiente se llene, No obstante, si se
instala un sistema de flujo continuo en un fermentador de tal forma que el cultivo
fresco desplace, en un volumen igual, al cultivo agotado, entonces se puede
conseguir una produccin de clulas de forma continua. Un fermentador continuo
de tanque agitado contiene dispositivos para la alimentacin y descarga en
continuo. El contenido del recipiente se encuentra en estado estacionario, es
decir, no varia con el tiempo; esto se aplica a la retencin de microorganismos y a
la concentracin de los componentes del medio en el fermentador. Las
condiciones de estado estacionario pueden alcanzarse operando sobre principios
quimiostticos, que implican ajustar el caudal del alimento al fermentador a un
valor apropiado y constante, permitiendo a las concentraciones de
microorganismos, substrato y producto bioqumico alcanzar sus niveles naturales.
En el quimiostato, el crecimiento de las clulas se controla ajustando la
concentracin de un substrato mediante la fijacin de una tasa de dilucin que
fijar la tasa de crecimiento en el sistema. Cualquier substrato que se requiera
puede ser utilizado como substrato limitante. Generalmente los substratos
limitantes que ms incidencia tienen en el crecimiento de la Saccharomyces
cerevisiae son el ion amonio, glucosa y fosfato (Crueger, 1991, 79).
Los efectos de diferentes tasas de dilucin y concentracin del substrato limitante
para la proliferacin de los microorganismos se explican as: Cuando las tasas de
dilucin son altas, el organismo no puede crecer lo suficientemente rpido para ir
de acuerdo con su dilucin y el cultivo es lavado del quimiostato. En el otro
extremo, con tasas de dilucin muy lentas una fraccin importante de las clulas
pueden morir de inanicin, puesto que el nutriente limitante no llega con la
suficiente rapidez para mantener el metabolismo celular. La concentracin de
microorganismos en el quimiostato se controla por la cantidad de nutriente
limitante. Si la concentracin de ste (nutriente en el medio que llega) se elevara
dejando constante la tasa de dilucin, la concentracin de microorganismos
aumentara aunque la tasa de crecimiento seguira siendo la misma y la
concentracin de substrato en el quimiostato seguira siendo virtualmente cero.
De esta manera, ajustando la tasa de dilucin y la concentracin de substrato,
experimentalmente se puede obtener a voluntad una variedad de concentracin de
microorganismos y tasas de crecimiento. La figura 2.7 explica el comportamiento
del efecto de diferentes tasas de dilucin respecto a la concentracin de
microorganismos y las tasas de crecimiento.
15
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilucin y concentracin de substrato en un

quimiostato
Fuente: BROCK, T. Microbiologa

De acuerdo a la grfica anterior, se nota que a altas tasas de dilucin, el
crecimiento no puede equilibrar la dilucin, la poblacin se extingue y la
concentracin del substrato alcanza un mximo. Sin embargo, en el mayor rango
de tasas de dilucin, la concentracin de microorganismos permanece constante y
la concentracin de substrato conserva un valor muy bajo.
Aunque la
concentracin de microorganismos permanece constante, la tasa de crecimiento y
el tiempo de duplicacin vara en un intervalo amplio.
En conclusin, los dispositivos para cultivo continuo (quimiostatos) son un medio
para mantener la poblacin en crecimiento exponencial durante largos periodos.
Lo principal de un dispositivo para cultivo continuo es reabastecer lentamente el
recipiente del cultivo con medio fresco, en tanto se elimina el medio ya usado y las
clulas a la misma velocidad. La velocidad a la que se realiza esta dilucin rige la
velocidad de crecimiento de la poblacin celular en el recipiente del cultivo.
2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo
El cultivo continuo opera bajo condiciones de un estado de equilibrio, es decir,

las concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes.
El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de substrato mientras que
el cultivo discontinuo, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso
de substrato.
La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo est controlada por la
velocidad de dilucin (y por ello bajo el control del operario) y su valor es
siempre menor que la velocidad mxima de crecimiento max. Por en
contrario, la velocidad especfica de crecimiento en la fase exponencial de un
16
cultivo discontinuo alcanzar la velocidad mxima de crecimiento max

correspondiente a las condiciones que prevalezcan en el cultivo.
2.4.2 Cintica del cultivo continuo
En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la perdida de clulas debida
al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del
microorganismo(Trevan, 1990,86).
D=
La velocidad de flujo D se define como la velocidad de flujo volumtrico que entra
y sale a travs del volumen del fermentador. D es definida como:
D=F/V
Donde D es la velocidad de dilucin en h-1, V es el volumen de fermentador en ml
y F es el flujo en ml*h-1.
La concentracin de substrato en el quimiostato viene determinada por la
velocidad de dilucin. En efecto, esto se debe a que el crecimiento est
consumiendo el substrato hasta una concentracin que permite que la velocidad
de crecimiento iguale a la velocidad de dilucin.
Si el substrato se agota hasta un grado en que su concentracin tenga un nivel
inferior al que soporta la velocidad de crecimiento impuesta por la velocidad de
dilucin, se da la siguiente secuencia de sucesos (Trevan, 1990, 87):
La velocidad de crecimiento de las clulas ser menor que la velocidad de

dilucin y saldrn del quimiostato a una velocidad superior a la que se est
formando, por lo que decrece la produccin.
La concentracin de substrato en el quimiostato aumentar dado que existe un

nmero menor de clulas para consumir el substrato.
La mayor concentracin de substrato ocasionar que las clulas crezcan a una

velocidad mayor que la velocidad de dilucin, con lo que aumentar la
concentracin de biomasa.
La disminucin de la velocidad de crecimiento y el cese del crecimiento debido al

agotamiento de substrato puede describirse por la relacin entre y la
concentracin residual de substrato limitante esencial. El substrato limitante es
aquel componente del medio que primero se agota y esto se explica de acuerdo a
la relacin de Monod. El efecto controlador de la velocidad de dilucin est
regulado, esencialmente, por la relacin entre y s(Trevan, 1990, 87):
= max x s / Ks + s
donde s es la concentracin residual del substrato limitante y Ks es la constante de
utilizacin o saturacin para el substrato limitante y equivale a la concentracin de
substrato cuando el valor de es la mitad que el de max.
En un estado de equilibrio = D; por lo tanto:
17
D = max x se / Ks + se
Donde se es la concentracin del substrato residual en el estado de equilibrio.
Despejando se de la ecuacin anterior resulta:
se = Ks x D / max D
Esta ecuacin predice que la concentracin de substrato en el quimiostato viene
determinada por la velocidad de dilucin. En efecto, esto se debe a que el
crecimiento est consumiendo el substrato hasta una concentracin que permite
que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilucin.
La concentracin de clulas en el quimiostato en el estado de equilibrio viene
definida por la ecuacin:
xe = Y ( SR ( Ks x D / max D ) )
donde:
Y es factor de rendimiento para el substrato limitante (g biomasa/ g substrato
consumido).
SR es la concentracin original del substrato en el medio.
La velocidad especfica mxima de crecimiento en los procesos industriales se
escoge de forma que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms
pequeo del fermentador y en el tiempo ms corto.
El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentacin continua a
velocidades muy bajas o muy altas de dilucin. A velocidades medias de dilucin
la relacin molar entre la biomasa producida y el CO2 que se desprende es
constante. A bajas velocidades de dilucin la proporcin de CO2 se hace ms
grande. Esto se debe a que se utiliza ms fuente de energa para el
mantenimiento de la estructura celular, para la regulacin osmtica o para la
motilidad de la clula. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del
carbono aadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato
o cidos tricarboxlicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas
velocidades de flujo, con nitrgeno como substrato limitante, se forman materiales
de reserva, como polisacridos, lo que resulta en un aumento en el tamao de la
clula y por tanto de la biomas
18
CAPITULO 3
MATERIALES Y METODOS
En este captulo se describen las metodologas que fueron utilizadas para la

realizacin de este trabajo. Las metodologas internacionalmente aceptadas,
fueron adaptadas a las infraestructuras de los laboratorios con los que cuenta la
Facultad de Ingeniera.
3.1
PROCEDIMIENTO
Para la implementacin de las normas se realizaron los siguientes pasos:

Tabla 3.1 Normas y mtodos utilizados
DETERMINACION
NORMA/METODOS
Nitrgeno
Norma AOAC 960.52
Etanol
Manual de mtodos analticos para el

control de calidad de bebidas
alcohlicas (NTC) y norma AOAC
969.12
Azcares reductores
Slidos solubles totales y % Sacarosa
Norma AOAC 923.09

Refractmetro y Sacarmetro
Conteo de microorganismos
Mtodo cmara de conteo
FUENTE: Autores
Elaboracin de curvas de calibracin para los mtodos de determinacin de
nitrgeno y azcares reductores, utilizando muestras de concentracin
conocida, para los mtodos empleados.
Clculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor terico de las

muestras de concentracin conocida con el valor de las muestras
experimentales.
3.2
DISEO EXPERIMENTAL
3.2.1 Diagramas de flujo

3.2.1.1 Pruebas preliminares
Preparacin de medios de cultivo s1,
s2, s3, n1, n2, n3 (s= medio
semisinttico, n= medio natural)
Cada medio se prepara por

triplicado en erlenmeyer de
500
ml
debidamente
Activacin de levadura a 35C en

solucin 5% de azcar
Inocular la levadura activada a

cada medio preparado
Desarrollo de las fermentaciones a

temperatura de 25 C hasta
estabilizacin de slidos solubles
totales
Determinacin de parmetros en
funcin del tiempo: nmero de
microorganismos, slidos solubles
totales, %sacarosa, pH
Evaluacin de las fermentaciones:

seleccin del medio de mayor
fluctuacin de pH
3.2.1.2
Se toma una muestra diaria de

15 ml cada medio (s1, s2, s3,
n1, n2, n3). Se determina
media aritmtica y desviacin
Se
determina
mediante
regresin lineal la pendiente
para cada medio de cultivo y
el porcentaje de variacin de
Pruebas en el Bioflo
Configuracin del funcionamiento del

bioflo: velocidad de agitacin,
concentracin de cido y base para
regulacin de pH y bombas de
alimentacin
Para la velocidad de agitacin

se observan los tiempos de
operacin a velocidades de
50, 75 y 100 r.p.m. Para la
concentracin de cido y
base,
se
emplea
concentraciones de 1 N y 5 N
Fermentacin alcohlica en el
biorreactor, preparacin de medio de
cultivo a 10 litros bajo condiciones
constantes de temperatura 25 C y pH
de 4.5, paralelo a una fermentacin
sin funcionamiento del sistema de
regulacin de pH a 25C.
Determinacin de parmetros en
funcin del tiempo: nmero de
microorganismos, slidos solubles
totales y %sacarosa, nitrgeno total.
Determinacin de parmetros finales:

contenido de etanol y azcares
residuales
Elaborar gua de manejo y

funcionamiento del bioflo bajo trabajo
de regulacin de pH
Trabajo preliminar para manejo del bioflo

en cultivos continuos: concentracin de
substrato limitante y tasa de dilucin.
El nmero de rplicas de cada

fermentacin es de dos (2)
empleando el medio s2.
Se realiza por triplicado

tomando una muestra diaria
de 30 ml a excepcin de
porcentaje de sacarosa que se
toma
al
final
de
la
fermentacin Se determina la
Se realiza al final de cada
fermentacin por triplicado
determinando media aritmtica
y desviacin estndar
Se emplea el medio s2 a un
volumen de 10 litros, tomando
muestra diaria para determinar
crecimiento
de
microorganismos, contenido
3.2.2 Preparacin de los medios de cultivo para pruebas preliminares

El medio de cultivo utilizado para este estudio se presenta en la tabla 3.2 y 3.3
Tabla 3.2 Medios de cultivo semisintticos
CONTENIDO
MEDIO S1
MEDIO S2
MEDIO S3
Extracto de levadura
(g/l)
8.00
8.00
8.00
Sacarosa (g/l)
100.00
100.00
100.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solucin Madre de
Complejo vitamnico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
0.25
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
Fuente: Autores
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales

CONTENIDO
MEDIO N1
MEDIO N2
MEDIO N3
Pia (Ananas
comosus) (g/l)
1000.00
1000.00
1000.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solucin Madre de
Complejo vitamnico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
0.25
Fuente : Autores
Cada medio se elabor por triplicado. Posteriormente se debe llegar a 20Brix con
ms adicin de sacarosa.
3.2.3 Esterilizacin de los erlenmeyer y adecuacin de los medios de cultivo
Para la esterilizacin de los 18 erlenmeyer se utiliz una estufa WTB-BINDER,
para ello se procedi a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que
permanecieran estriles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La
esterilizacin se llev a cabo a 200oC durante dos horas. Se procedi a la
introduccin del medio en los erlenmeyer, este proceso se realiz dentro de una
cmara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminacin de los
medios de cultivo. Luego se aument la temperatura de los medios a 25oC, al
colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparacin
del medio de cultivo se agreg el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una
inhibicin bacteriana qumica, y de esta forma, evitar el crecimiento de la flora
bacteriana que podra contaminar el medio, formada principalmente por bacterias
fermentativas tolerantes a medios cidos.
3.2.4 Activacin e inoculacin de la levadura

La levadura Saccharomyces cerevisiae se activ previamente antes de ser
inoculada en cada cultivo. Esta preparacin es necesaria para 1 litro de medio.
Se pes 5 gramos de sacarosa comercial y se depositaron en el baln aforado de
100 ml completando el volumen con agua destilada. Se coloc en el bao
termostatizado hasta que lleg a una temperatura de 35 C. Se pes 0.6 gramos
de levadura y se coloc en el vaso de precipitado de 100 ml. Se aadi 6 ml de la
solucin azucarada y se dej en el bao termostatizado a 35 C hasta que se
notara la presencia de gas (CO2). (Alba y Sierra, 1999, 76)
Se depositaron los 6 ml de la levadura activada para inocular el medio de cultivo el
cual se fijo a 20 Brix adicionando sacarosa.
La inoculacin de la levadura se realiz tomando en consideracin los
procedimientos para el manejo estril de cultivos.
Para ello todas las
inoculaciones se realizaron en la cmara de flujo laminar CAE ET, utilizando
material previamente esterilizado (pipetas, erlenmeyer) y utilizando el mechero
para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios.
3.2.5 Variables a medir durante la fermentacin preliminar
3.2.5.1
pH
Para medir el pH, se tom una muestra diaria de cada medio durante la
fermentacin, agitando previamente de manera suave durante 30 segundos el
medio de cultivo. El pH fue medido mediante un potencimetro debidamente
calibrado.
3.2.5.2
Nmero de microorganismos
El conteo se realiz diariamente por triplicado durante la fermentacin, empleando

la cmara de conteo Neubauer Improved en el microscopio.
3.2.5.3
Slidos solubles totales y %sacarosa
Los slidos solubles totales se tomaron diariamente y por triplicado durante la

fermentacin, empleando el refractmetro y el porcentaje de sacarosa se tom el
da final de la fermentacin utilizando el aermetro-sacarmetro, segn Brix Tp 20
C.
3.2.6 Anlisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares
Para la determinacin de los parmetros se tomaron muestras diarias de manera
estril y por triplicado. El anlisis se realiz mediante un manejo estadstico
simple, determinando cual es el medio de cultivo que presenta mayor rango de
fluctuacin de pH. Las metodologas que se siguieron para la determinacin de

los parmetros se presentan en la seccin 3.3.
3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo
Se realizaron ensayos preliminares con el medio que present mayor rango de
fluctuacin de pH, a un volumen de 6 litros; Estas pruebas permitieron configurar
las siguientes condiciones para llevar a cabo la fermentacin alcohlica:
Determinacin de velocidad de agitacin. De manera previa empleando agua y

posteriormente con medio.
Concentracin de cido y base para regulacin de pH empleando cido ctrico

y carbonato de calcio, solo con funcionamiento del sistema regulador del Bioflo.
Se determin mediante las necesidades volumtricas de cido y base para
regular el pH en el funcionamiento del mismo sistema regulador.
Configuracin de bombas de alimentacin peristlticas para salida y entrada de

flujos del biorreactor.
3.2.8 Fermentacin alcohlica en el Bioflo.

Se utiliz el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El nmero de
rplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.
Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones
constantes:
Temperatura de 25 C
pH de 4.5: pH que permite evaluar mejor el sistema de bombas peristlticas y

observar el desarrollo continuo del sistema de regulacin de pH, ya que difiere
del pH normal del desarrollo de una fermentacin (pH de 2.8 hasta 3.8).
3.2.9 Fermentacin alcohlica sin regulacin de pH.

Se utiliz el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El nmero de
rplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.
Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones
constantes:
Temperatura de 25 C
Se realiz la comparacin de las dos fermentaciones mediante los datos de las

variables medidas a lo largo de cada fermentacin.
3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentacin en el

Bioflo
Lavar y esterilizar el vaso del Bioflo en autoclave
6
Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros

Ajustar slidos solubles totales a 20 Brix
Instalar el vaso en la cabina de control y agregar el medio de cultivo
Conectar mangueras del condensador y adaptar el motor al vaso
Insertar la termocupla y abrir la vlvula de agua a una presin de 20 psi
Encender el Biorreactor y seleccionar modo 2 de fermentacin.
Calibrar e instalar el potencimetro
Fijar la temperatura y pH de trabajo: 25C y 4.5 respectivamente
Inocular la levadura y fijar agitacin al medio.
Medir a diario: Nmero de m.o, slidos solubles totales, Contenido de nitrgeno, y
pH en fermentacin sin regulacin.
Determinar al final de la fermentacin: azcares reductores, contenido alcohlico y
% de sacarosa.
3.2.11 Reproducibilidad de la fermentacin alcohlica en el Bioflo
La reproducibilidad de la fermentacin alcohlica se determin por medio de las
variables a ser medidas durante el desarrollo de cada fermentacin tanto para la
fermentacin con regulacin de pH y sin regulacin.
3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentacin
Nmero de microorganismos: Se tom una muestra diaria durante la

fermentacin para conteo total mediante cmara Neubauer Improved.
Slidos solubles totales y % sacarosa: Se tom una muestra diaria, se realiz

por refractmetro y sacarmetro respectivamente. El porcentaje de sacarosa
se tom solo al final de cada fermentacin.
Nitrgeno total: Se tom una muestra diaria, se realiz mediante mtodo

Kjeldahl.
Contenido de etanol: Al final de la fermentacin se tom una muestra, se

realiz mediante destilacin alcohlica, segn Norma Icontec.
Azcar residual: Al final de la fermentacin, se realiz mediante mtodo de

AOAC 923.09.
pH: Se realiz la lectura en el monitor del Bioflo diariamente.
3.2.11.2
Tcnicas utilizadas
Nmero de microorganismos: Cmara de conteo Neubauer Improved.
Slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa: Refractmetro y aermetro

(sacarmetro).
Nitrgeno total: Mtodo Kjeldahl, segn Norma AOAC 960.52.
Contenido de etanol: Mtodo de destilacin, segn el Manual de Mtodos

analticos para el control de calidad de bebidas alcohlicas (ICONTEC).
Azcar residual: Norma AOAC 923.09.
3.2.11.3 Validacin estadstica de los datos

El anlisis se realiz mediante un manejo estadstico simple, determinando media
aritmtica y desviacin estndar en cada una de las variables medidas a lo largo
del proceso de fermentacin con un intervalo de confianza del 95%.
3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuos
Se trabaj de manera preliminar un cultivo continuo en el Bioflo, utilizando el
medio semisinttico con fosfato de amonio, que fue alimentado durante el proceso
con el mismo. Se trabaj un cultivo con un volumen constante de 10 litros en el
vaso del Biorreactor.
Se establecieron los siguientes parmetros:
Concentracin de sustrato limitante.
Tasa de dilucin, que determina la tasa de crecimiento. Los cultivos

preliminares en sistema cerrado permiten establecer la tasa de crecimiento en
la fase exponencial; en la fase exponencial se encuentra el mximo consumo
de sustrato limitante y formacin de producto. En el cultivo continuo, la salida
de producto determina la entrada de sustrato limitante al sistema abierto.
3.3 MATERIALES Y METODOS

3.3.1 Mtodo Kjeldahl para la determinacin de nitrgeno total
3.3.1.1 Fundamento del mtodo
En este mtodo la muestra analizada se descompone con cido sulfrico
concentrado en caliente, para convertir el nitrgeno en ion amonio. Cuando la
descomposicin se completa, la solucin resultante se enfra, se diluye y se
alcaliniza con hidrxido de sodio. El amonio liberado se separa por destilacin y
se recoge en una solucin cida y posteriormente se cuantifica por titulacin.
El cido sulfrico que se utiliza para descomponer la muestra, oxida al carbono e
hidrgeno a dixido de carbono y agua, siendo esta etapa la ms crtica en este
mtodo.
3.3.1.2 Reacciones que se presentan
muestra + H2 SO4 + H2O
(NH4)2 SO4 + 2 NaOH
(NH4)2 SO4 + CO2
Digestin
2NH3 + Na2 SO4 + 2H2O Destilacin
2 NH3 + 2H3BO3
2H2BO3- + 2NH4+ Destilado
2H2 BO3- + 2HCl
2H3 BO3 + 2Cl- Titulacin
Para calcular un volumen terico de HCl con una normalidad dada se tiene de la
estequiometra de la reaccin:
ml de HCl x Normalidad = Xg N [(132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3 x 73 g
HCl x 1 equiv. HCl x 1000ml) / (28g N x 132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3
x 36.5 g HCl)]
Donde se obtiene:
ml de HCl x Normalidad HCl = Xg Nitrgeno x 71.43
3.3.1.3 Materiales
Sistema de digestin de KJELDAHL BUCHI B-316
Unidad de destilacin BUCHI B-316
Centrfuga HERMLE Z320
Tubos de vidrio para digestin BUCHI
Vaso de precipitado de 1000 ml (plsticos)
Bureta de 10 ml ( + 0.05 ml)
Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente
Erlenmeyer de 250 ml
Placa de calefaccin y agitacin
Tubos para centrfuga
Balanza analtica
3.3.1.4 Reactivos
Acido sulfrico concentrado r.a
Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio
Indicador de Taschiro
Acido brico al 2%
Solucin de hidrxido de sodio al 32%
Acido clorhdrico 1 N
Agua destilada
Carbonato de sodio
3.3.1.5 Procedimiento
!
Digestin
Tomar una muestra homogenizada de 20 ml del fermento y colocarla en un

tubo de ensayo para centrifugarla a 4000 r.p.m. durante 20 minutos.
Una vez centrifugado eliminar el
pipeta de 5 ml.
lquido sobrenadante con ayuda de una
Adicionar al tubo de ensayo 20 ml agua destilada y agitar vigorosamente para

que el sedimento se separe de la parte inferior del tubo.
Verter esta solucin en un tubo de vidrio para digestin de Kjeldahl y enjuagar
dos veces ms el tubo de ensayo con agua destilada, vertiendo el agua de
enjuague en el tubo de vidrio para digestin.
Adicionar 20 ml de cido sulfrico concentrado y una pastilla de catalizador de
Kjeldahl sin selenio.
Encender el sistema de digestin BUCHI dejando el control de temperatura
10 e instalar el tubo de vidrio con la muestra junto con el sistema
evacuacin de gases.
Se debe asegurar debidamente el sistema
evacuacin de gases para evitar fugas, observando que los gases circulen
el sentido correcto.
en
de
de
en
Al iniciar la digestin se debe regular la temperatura del sistema de digestin,

observando la formacin de un anillo de gases en la parte media del tubo de
vidrio de digestin.
10
Calentar hasta que se complete la reaccin, esto se verifica cuando la solucin

resultante toma una coloracin verde manzana traslcida.
Dejar enfriar y permitir la completa evacuacin de los gases de digestin.
Desmontar el sistema y pasar a la unidad de destilacin.
!
Destilacin:
Verificar el correcto funcionamiento de la unidad de destilacin BUCHI,

observando los contenedores de cido brico, NaOH y agua destilada. A la
vez, se debe abrir la llave de refrigerante.
Configurar la unidad de destilacin en el panel de control, seleccionando el
debido mtodo de trabajo, que establece una destilacin de 5 minutos.
Adaptar el tubo de vidrio de digestin en la unidad de destilacin y a la vez
colocar un erlenmeyer de 250 ml para recoger el destilado.
Iniciar la destilacin oprimiendo la tecla enter, en este momento la unidad
adiciona 80 ml de NaOH al 32% al tubo de digestin y 75 ml de cido brico al
2% al erlenmeyer.
Una vez terminado el tiempo de destilacin se retira el tubo de digestin y el
erlenmeyer que contiene el destilado.
Adicionar indicador taschiro y se procede a valorar la solucin del erlenmeyer
recolector de 250 ml con cido clorhdrico 1 N debidamente valorado, con un
viraje de color verde a azul oscuro.
3.3.1.6 Clculo y expresin de los resultados
El contenido de nitrgeno de la muestra se calcula de la siguiente manera:
Nm= (VHCl * NHCl)/71.43
Donde:
Nm: contenido de nitrgeno de la muestra en gramos.
VHCl: volumen de HCl gastados en la titulacin en ml.
NHCl: Normalidad de HCl (equivalentes por litro). En ste caso 0.94656 N (Solucin
de HCl 1N debidamente valorada con NaOH 1 N valorado con biftalato de potasio)
71.43: constante de la estequiometra de las reacciones.
3.3.2 Mtodo para la determinacin de azcares reductores por titulacin de
Lane y Enyon
Los azcares reductores estn constituidos por aquellos azcares que poseen
accin reductora directa sobre una solucin cupro-tartrico-alcalina.
11
Esta determinacin comprende los siguientes pasos:

!
Clarificacin
Determinacin de azcares reductores totales por titulacin. (Mtodo

volumtrico).
El mtodo volumtrico o la titulacin de Lane y Eynon para la determinacin de

azcares reductores consiste en la adicin de la muestra a determinar azcares
reductores a una solucin de reactivo de Felhing. La titulacin termina cuando la
solucin que contiene los azcares reductores reduce la solucin de Felhing con la
aparicin de un precipitado de coloracin roja debido al xido cuproso.
3.3.2.2 Materiales
Baln aforado de 100 ml (+ 0.1 ml)
Baln aforado de 250 ml
Balanza analtica METTLER TOLEDO (+ 0.1 mg)
Pipeta volumtrica de 10 ml (+ 0.05 ml)
Vaso de precipitado de 1000 ml
Vaso de precipitado plstico de 1000 ml
Vaso de precipitado de 250 ml
Erlenmeyer de 500 ml
Embudo de Buchner
Papel filtro dimetro de poro de 0.2 m
Perlas de vidrio
Placa calefactora y de agitacin
Bureta de 10 ml (+ 0.05 ml)
Bureta de 50 ml (+ 0.1 ml)
3.3.2.3 Reactivos
Solucin de azcar invertido al 1% (2 litros)
Sacarosa pura y seca = 23.75 granos

Acido benzoico = 4 gramos
Acido clorhdrico = 9 ml r.a.
Agua destilada = 2000 ml
12
Solucin A (1 litro)
Sulfato cprico puro 5H2O = 69.3 gramos

Solucin B (1 litro)
Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado = 354 gramos

Hidrxido de sodio puro = 100 gramos
Clarificacin del fermento
Solucin saturada de acetato neutro de plomo

Oxalato de potasio anhidro
Titulacin
Azul de metileno
Preparacin de solucin estndar de azcar invertido
Disolver 23.75 gramos de sacarosa pura en cerca de 120 ml de agua en un

matraz volumtrico de 250 ml. Aadir 9 ml de HCl concentrado y djese en
reposo durante 8 das a temperatura ambiente. Diluir hasta la marca con agua.
Transferir 200 ml a un matraz volumtrico de 2 litros. Aadir cerca de 200 ml
de agua agitando y 71.4 ml de una solucin de NaOH 1 N y 4 gramos de cido
benzoico. Agregar 1 litro de agua, mezclar y verificar con papel indicador que
la solucin tenga aproximadamente un pH de 3. Ajustar si es necesario y diluir
hasta la marca. Esto produce una solucin estable al 1% (m/v) de azcar
invertido.
Clarificacin del fermento
Tomar 100 ml del fermento y colocarlo en un vaso de precipitado.

Neutralizar exactamente con solucin de NaOH 1N.
Para soluciones
coloreadas es conveniente utilizar
un potencimetro para controlar la
neutralizacin.
Agregar por pequeas porciones, solucin de acetato neutro de plomo, hasta
que no se observe la formacin de ms precipitado.
Diluir con agua hasta la marca del matraz, mezclar y dejar en reposo.
Filtrar la parte sobrenadante, utilizar papel y embudos secos (filtrar a vaco).
Agregar por pequeas porciones, oxalato de potasio anhidro, agitando despus
de cada adicin hasta que no se observe la formacin de ms precipitado.
Volver a filtrar.
13
El filtrado que se obtiene corresponde, volumen a volumen, con el fermento

original.
Determinacin de azcares por titulacin
Colocar en un erlenmeyer de 500 ml, 15 ml de agua destilada, 5 ml de la

solucin B y 5 ml de la solucin A.
Aadir algunas perlas de vidrio y colocar el erlenmeyer con la solucin de
Felhing en una placa calefactora.
Hervir la solucin exactamente 2 minutos.
Agregar 4 gotas de azul de metileno 5 segundos antes de terminar el periodo
de ebullicin.
Aadir desde la bureta el fermento a la solucin en ebullicin hasta que
desaparezca el color azul dejando la coloracin roja debida a la aparicin de
xido cuproso. Esta titulacin no debe sobrepasar los 3 minutos.
3.3.2.5
Clculo y expresin de los resultados
La concentracin de azcares reductores en el fermento se determina de la

siguiente manera:
[ ] Azcares reductores = g de azcar invertido que reducen 10 ml de Felhing/
Volumen de titulacin en ml.
Los gramos de azcar invertido que reducen 10 ml de Felhing se obtienen a partir
de una titulacin con la solucin patrn de azcar invertido al 1%.
3.3.3 Determinacin del nmero de microorganismos por recuento en
cmara de conteo Neubauer Improved.
Las cmaras de conteo se utilizan para determinar microscpicamente el nmero
de microorganismos totales (vivos y muertos) en un determinado volumen de
suspensin. Este mtodo se emplea en muestras con concentraciones de
microorganismos mayores o iguales 106 m.o/ ml y que no contengan partculas
que impidan determinar de manera precisa el nmero de microorganismos.
En las cmaras de conteo hay una retcula grabada sobre la superficie de una
placa de vidrio, con cuadros de un rea pequea y conocida. Sobre cada cuadro
hay un volumen de magnitud conocida, muy pequea, pero medida con mucha
precisin. Se debe contar la cantidad de clulas por unidad de rea de la retcula,
empleando el microscopio de contraste, obteniendo una medida del nmero de
clulas por el pequeo volumen de la cmara. De aqu se determina fcilmente el
nmero de clulas por mililitro de suspensin, multiplicndolo por un factor de
dilucin basado en el volumen de la cmara donde se coloc la muestra.
14
La cmara de conteo Neubauer Improved es detallada a continuacin. La

profundidad de la cmara es de 0.1 mm. La cuadrcula de recuento muestra 9
cuadros grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadros grandes de las esquinas
estn divididos en 16 cuadros con aristas de 0.25 mm. Se utilizan para recuento
de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados
medianos con aristas de 0.2 mm y cada cuadrado mediano esta subdividido en 16
cuadrados pequeos con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm2.
Todos los cuadrados medianos tienen lneas de lmite triple. La lnea central es la
frontera y decide si las clulas de esta zona se deben contar o no.
3.3.3.2 Materiales
Microscopio de contraste de fases
Cmara de conteo Neubauer Improved
Tubos de ensayo
Pipeta de 10 ml (+0.075 ml)
Pipeta de 1 ml (+0.01 ml)
Mechero de alcohol
Macropipeta
Goteros
3.3.3.3 Reactivos
Formaldehdo
Agua destilada
Tomar por triplicado muestras de fermento de manera homognea de 1 ml y
diluir a 1x10-1 en un tubo de ensayo (9ml de agua destilada y 1 ml del medio
fermentado).
Adicionar dos gotas de solucin de formaldehdo al 40%.
Agitar y tomar una o dos gotas de la suspensin homognea, colocndola
sobre la cmara Neubauer Improved. Cubrir con un cubreobjetos el rea de
las celdas.
Colocar la cmara de conteo en el microscopio y enfocar con el lente de 40X,
ajustando el debido contraste.
Situarse en el cuadro grande central de los 9 cuadrados existentes de la
cmara.
15
Hacer el conteo de los cinco cuadrados que conforman el cuadrado grande

central, preferiblemente en forma diagonal. Cada cuadrado tiene a su vez 16
cuadrados pequeos.
3.3.3.5 Clculos y expresin de los resultados
Realizar los clculos correspondientes segn la siguiente frmula estadstica:
NMO = P / (SC x Pf x Fd)
NMO = Nmero de microorganismos por microlitro (l). Si el resultado se

requiere expresar por ml, se debe multiplicar por 1000 el resultado obtenido.
P = Nmero de partculas contadas. Corresponde al promedio de 5 cuadros.
SC = Superficie contada que corresponde a 0.04 mm2.
Pf = Profundidad de la cmara que corresponde a 0.1 mm.
Fd = Factor de dilucin utilizado
3.3.4 Mtodo para la determinacin del contenido alcohlico de etanol por el

mtodo de destilacin simple
La muestra se somete a destilacin simple en condiciones especficas y en el
destilado se determinan los grados alcoholimtricos (porcentaje de etanol en
volumen), utilizando un alcoholmetro.
3.3.4.2 Materiales
Alcoholmetros Gay Lussac Cartier a 15 C(+ 0.1 G.L)
Mechero de gas
Probeta de 250 ml
Aparato de destilacin
Baln aforado de 250 ml
Perlas de vidrio
3.3.4.3 Reactivos
Agua destilada
Destilacin
16
En un baln aforado de 250 ml adicionar la muestra y llenar hasta la marca.

Instalar el aparato de destilacin.
En el baln de destilacin verter la muestra, a continuacin lavar el baln que
contena la muestra con agua destilada, llenndolo hasta las tras cuartas
partes del mismo. Adicionar el agua de lavado al baln de destilacin.
Agregar perlas de vidrio para regular la ebullicin. Comenzar la destilacin con
un calentamiento regulado y continuo.
Recoger el destilado en el mismo baln en que se midi la muestra, ste baln
debe estar sumergido en agua con hielo para evitar prdidas debido a la alta
volatilidad del etanol.
La destilacin termina cuando se han completado las partes del baln que
recibe el destilado, retirando el tubo ubicado en la parte inferior del refrigerante
y lavndolo con agua por dentro y por fuera sobre el mismo baln.
Completar a volumen con agua destilada hasta la marca.
Estimacin del grado alcoholmetrico
Llenar la probeta del alcoholmetro e introducir el mismo en la probeta.

Dejar en reposo el alcoholmetro hasta que se estabilice realizando la lectura
por el menisco inferior del alcoholmetro.
3.3.5 Determinacin de slidos solubles totales y % de sacarosa
La determinacin de slidos solubles totales se basa en una medicin
refractomtrica de la cual se obtiene el valor a una temperatura dada.
El porcentaje de sacarosa se realiza mediante el uso de un aermetro, el cual se
introduce en una solucin y la lectura se realiza por el menisco que forma.
3.3.5.2 Materiales
Refractmetro
Sacarmetro
Termmetro (0-110 C)
Probeta de 250 ml
3.3.5.3 Reactivos
Alcohol
17
3.3.5.4
Procedimiento
Slidos solubles totales
Limpiar el prisma del refractmetro con alcohol y agua destilada, utilizando

algodn para evitar ralladuras.
Verificar que la lectura sea cero colocando dos o tres gotas de agua destilada.
Llevar a 20 C la muestra del fermento.
Hacer la respectiva medicin con dos o tres gotas de fermento dejndolas caer
sobre el prisma.
Observar la medicin ajustando debidamente el refractmetro.
Porcentaje de sacarosa
Tomar una muestra de 250 ml de fermento, llevarla a 20 C y colocarlo en una

probeta
Introducir el sacarmetro en la probeta, esperar a que se estabilice cuidando
de que no se pegue en las paredes. Realizar la lectura.
18
CAPITULO 4
PRESENTACION DE RESULTADOS
En este captulo se presentan los resultados de las pruebas correspondientes al

diseo experimental presentado. Adems se presenta la gua de manejo y
funcionamiento del sistema de bombas peristlticas del Biorreactor en una
fermentacin alcohlica aplicando el sistema de regulacin de pH. Cabe anotar
que en la metodologa utilizada para determinar nitrgeno total y azcares
reductores fue necesario realizar una estandarizacin del equipo previo al
desarrollo del mtodo respectivo. En cuanto a las tablas de resultados, las celdas
que se encuentran sombreadas corresponden a los das en que no se tom la
medida por ser fin de semana y el laboratorio no se encuentra disponible para su
uso.
4.1
GUIA DE MANEJO
PERISTALTICAS
DEL
SISTEMA
DE
BOMBAS
El Biorreactor Bioflo 3000 M1227 consta de un sistema de cinco bombas

peristlticas asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un
modo de funcionamiento y operacin dependiendo del parmetro a controlar en
una fermentacin discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los
siguientes:
Modo Off: En ste modo la bomba no tiene ningn funcionamiento ya que no
responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada.
Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las bombas.
Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina un caudal
para un porcentaje de velocidad.
Modo Base y Acido: Cuando el sistema de regulacin de pH entra en
funcionamiento, el modo cido y base en las bombas peristlticas son los que
realizan la accin de control de pH a un valor especifico.
Modo On: Este modo funciona cumpliendo una operacin de velocidad fija en
la bomba y su valor es de 125%, donde la bomba funciona de manera
continua.
Modos LVL1, LVL2, LVL3: Estos modos se utilizan cuando los sensores de
control de niveles en el Bioflo estn presentes en el sistema. Generalmente
estos modos se utilizan para fermentaciones en continuo. Cada uno de los
modos de nivel pueden a la vez seleccionarse para manejo del sistema
continuo. Los modos de funcin del LVL1, 2 y 3 son Off, Add y Harvest. Esto
indica que cada sensor de nivel puede ser utilizado para alimentar de medio de
cultivo o para cosechar respectivamente, teniendo en cuento que cada sensor
de nivel se le asigna una bomba.
En general, para el sistema de bombas peristlticas se emplean como entrada o
salida de flujos del Biorreactor, las cuales deben instalarse apropiadamente para
su correcto funcionamiento (Ver Anexo D). La configuracin de las bombas
depende de su uso y se instalan en el sistema as:
Para flujos de entrada al Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto hasta la parte baja de
la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba, para esto se coloca la
bomba en modo ON, hasta que se adapta totalmente el tubo. El tubo de
silicona termina por acoplarse al recipiente contenedor. La bomba se configura
en los modos mencionados.
Para flujos de salida del Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto designado hasta la
parte alta de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba para
terminar acoplado en el recipiente contenedor.
Las bombas en su funcionamiento tienen unos ciclos variables de velocidad con
los cuales determinan caudales de entrada y de salida del Biorreactor. Los ciclos
variables se enuncian a continuacin.
Tabla 4.1 Ciclos de funcionamiento de bombas peristlticas
D
%
V E L O C
I D
5
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
1 0 0
A T O S
F U N C
A D
D E
I O N
C I C L O S
D
A M I E N T O
T I E M P O
M U E R T O
( s e g )
1 5 . 0
1 3 . 5
1 3 . 0
1 2 . 8
1 1 . 5
1 0 . 9
8 . 9
7 . 8
6 . 8
5 . 5
5 . 2
3 . 0
C I C L O
D E
T R A B A J O
( # G I R O )
1 / 8
1 / 4
3 / 8
5 / 8
7 / 8
1
1 / 8
1
3 / 8
1
3 / 4
2
2
1 / 4
2
1 / 2
2
3 / 4
Fuente: Autores
A la vez se presenta los caudales determinados a diferentes porcentajes de

velocidad para las bombas peristlticas, medidos para caudales de entrada y de
salida, de acuerdo a las diferencias presentadas en el desarrollo posterior del
sistema en continuo empleando los puertos designados para cosecha y
alimentacin del Bioflo ( Ver Anexo D). Se determinaron los caudales entre un
rango de 5 % 50 % de velocidad de la bomba debido a su frecuencia de uso
para cultivos continuos.
Tabla 4.2 Caudales de bombas peristlticas para flujos de entrada y salida
empleando tubo de silicona de 1/8
%
VELOCIDAD
5
15
20
25
30
35
40
50
100
CAUDAL DE
ALIMENTACION
(m l/m in)
0.175
0.475
0.630
0.785
0.940
1.095
1.250
1.565
3.125
CAUDAL DE
COSECHA
(m l/m in)
0.200
0.575
0.780
0.985
1.190
1.395
1.600
2.004
4.031
% DIFERENCIA ENTRE
CAUDAL DE ALIMENTACION
Y COSECHA
12.50
17.39
19.23
20.30
21.01
21.51
21.88
21.91
22.48
Fuente: Autores
4.1.1 Configuracin de sistema de bombas peristlticas para control de pH
Para la utilizacin del sistema de regulacin de pH, en el Bioflo se deben
seleccionar dos bombas peristlticas para la adicin de cido y de base de
acuerdo a la accin de control. Los pasos a seguir son:
Seleccionar el cido y la base a utilizar para la regulacin de pH. En ste caso
se utiliz cido ctrico e hidrxido de potasio respectivamente.
Adaptar dos tubos de silicona a las bombas seleccionadas. El tubo se instala
de la siguiente manera: desde el puerto de adicin que se encuentra en la
tapa del vaso del Bioflo, hasta la parte de abajo de la bomba peristltica,
dndole la vuelta alrededor de ella hasta el recipiente donde se encuentra el
cido y la base respectivamente. Los recipientes a utilizar son erlenmeyer de
500 ml con tapn de caucho por donde se inserta el tubo de silicona. Cada
bomba debe configurarse en el modo cido o base correspondiente.
Despus de adaptar los tubos de silicona de 1/8 de pulgada a las bombas se
deben conectar a los puertos de adicin de cido y base que se encuentran en
la tapa del Bioflo, segn la figura incluida en el Anexo D.
Para seleccionar el modo de funcionamiento de la bomba, en la pantalla del
Bioflo, se coloca el cursor en la columna FEED1 y FEED2 respectivamente,
con la tecla ALTER se pasa al modo base y cido respectivamente. La
bomba se mueve en sentido horario, por lo cual el fluido se mover en dicha
direccin. Verificar si el cido o la base estn siendo bombeados dentro del

vaso de acuerdo al siguiente paso.
Escribir el valor del pH de trabajo, colocando el cursor en la columna de pH1
y fila SET y oprimir ENTER.
En la pantalla MASTER del Bioflo, llevar el cursor a la columna pH1 y fila
CONTROL, donde inicialmente aparece el letrero OFF. Oprimir la tecla
ALTER hasta que aparezca el titulo P.I.D para luego oprimir ENTER.
En el Anexo D se presentan las figuras de gua para la instalacin y configuracin
de sistema de bombas peristlticas y la configuracin de los puertos de entrada y
salida de flujos del Bioflo.
4.2
RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
Se presenta las siguientes tablas de resultados para las fermentaciones en

erlenmeyer empleando medio semisintetico y natural.
Tabla 4.3 Resultados para medio semisinttico
S1
DIA
pH
Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S2
N m .o/m l
pH
Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S3
N m .o/m l
pH
Brix
N m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
6.35
6.32
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.76
6.72
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.36
6.34
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
4.69
4.62
20.1
19.5
3.4E+07
2.8E+07
4.82
4.76
20.1
19.7
4.4E+07
3.1E+07
4.60
4.58
20.1
19.3
3.7E+07
2.6E+07
3.93
3.65
9.3
8.9
6.1E+07
5.8E+07
3.77
3.60
9.4
8.2
6.6E+07
4.4E+07
3.73
3.67
8.5
8.1
8.8E+07
4.4E+07
3.94
3.66
8.7
7.8
1.1E+08
8.6E+07
3.78
3.62
8.3
7.3
9.6E+07
6.4E+07
3.75
3.70
7.8
6.8
1.5E+08
8.2E+07
3.94
3.65
8.2
7.1
1.5E+08
1.1E+08
3.80
3.64
7.5
6.6
1.1E+08
6.6E+07
3.77
3.72
6.9
6.2
1.1E+08
9.2E+07
3.98
3.68
6.5
6.0
7.5E+07
5.6E+07
3.83
3.67
6.8
6.2
6.9E+07
5.4E+07
3.80
3.76
6.6
6.0
7.9E+07
6.6E+07
11
3.96
3.72
6.1
5.8
6.3E+07
4.0E+07
3.86
3.71
6.5
6.0
5.7E+07
4.0E+07
3.84
3.80
6.3
5.5
6.5E+07
6.0E+07
Fuente: Autores
Tabla 4.4 Resultados para medio natural
N1
DIA
pH
Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N2
N m .o/m l
pH
Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N3
N m .o/m l
pH
Brix
N m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
3.56
3.53
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.61
3.58
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.54
3.52
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.68
3.66
17.3
12.0
2.7E+07
2.3E+07
3.71
3.69
19.9
17.5
3.1E+07
2.6E+07
3.67
3.66
19.5
17.5
2.5E+07
2.4E+07
3.82
3.80
6.7
6.6
4.5E+07
3.0E+07
3.72
3.70
7.0
6.9
4.8E+07
4.0E+07
3.73
3.72
6.6
6.5
5.1E+07
3.6E+07
3.94
3.90
6.6
6.4
1.1E+08
8.1E+07
3.90
3.86
6.6
6.4
1.0E+08
6.5E+07
3.88
3.85
6.6
6.4
1.2E+08
9.0E+07
3.95
3.94
6.9
6.7
1.1E+08
8.3E+07
3.88
3.86
7.0
6.9
9.8E+07
8.7E+07
3.87
3.85
7.0
6.7
1.3E+08
9.2E+07
3.96
3.95
6.7
6.2
1.0E+08
9.2E+07
3.89
3.88
6.9
6.5
1.3E+08
8.1E+07
3.89
3.88
6.8
6.6
9.4E+07
8.9E+07
11
3.98
3.96
6.6
6.0
1.2E+08
9.7E+07
3.91
3.89
6.7
6.3
1.5E+08
8.2E+07
3.89
3.88
6.7
6.5
1.1E+08
7.5E+07
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios en el da 11 de la
fermentacin fue del 0 %.
4.2.1 Porcentajes de variacin de pH para los medios semisinttico y

natural
Para calcular la variacin de pH a lo largo de las fermentaciones, se presenta los
porcentajes de variacin de pH. El porcentaje de variacin se calcul comparando
dos valores en la fermentacin, uno comparando el valor de pH del da final
respecto al inicial y otro comparando el valor de pH mayor durante la fermentacin
respecto al pH ms bajo en la misma. Los porcentajes de variacin de pH
calculados da a da se presentan en al Anexo A.
Tabla 4.5 Porcentajes de variacin de pH
MEDIO SEMISINTETICO
% DE
VARIACION
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PH INICIAL
PH FINAL
39.3
43.7
39.8
11.8
8.3
10.2
PH MAYOR
PH MENOR
40.1
45.4
41.7
10.6
7.7
9.2
Fuente: Autores
4.3
RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO
4.3.1 Determinacin de velocidad de agitacin para una fermentacin

alcohlica
El Bioflo permite variar las velocidades de agitacin. Se determin una velocidad
de agitacin ptima para efectuar una fermentacin alcohlica en el Biorreactor;
con ste fin se configura el sistema de regulacin de pH del Bioflo y se trabaja a
diferentes velocidades de agitacin, empleando agua y posteriormente con medio
de cultivo para determinar la concentracin de cido ctrico y como base carbonato
de calcio a utilizar.
Tabla 4.6 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y tiempo de
operacin a diferentes velocidades de agitacin
Agitacin (R.P.M)
pH Inicial
pH Final
Tiempo de
operacin (min.)
50
22.20
50
32.11
75
21.00
75
25.09
100
18.08
100
24.00
Fuente: Autores
A velocidad de agitacin de 125 r.p.m. se presenta turbulencia y formacin de
espuma, lo cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentacin.
4.3.2 Determinacin de la concentracin de cido y base
Utilizando el medio de cultivo que present mayor variacin de pH en las
fermentaciones preliminares (Ver Tabla 4.5) se trabaj a diferentes
concentraciones de cido y base con funcionamiento del sistema de regulacin de
pH.
Tabla 4.7 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y tiempo de
operacin a diferentes concentraciones
Volumen consumido (ml)
CONCENTRACION
1N
5N
pH inicial
pH final
Acido
Base
694
Tiempo de
operacin
(min.)
115
870
435
195
75
600
142
Fuente: Autores
4.3.3 Fermentacin preliminar en el Bioflo
Los resultados de sta fermentacin respecto al uso del sistema de regulacin de
pH se presentan a continuacin. Unicamente de manera preliminar se observ los
consumos de cido y base empleando el sistema de regulacin de pH del Bioflo.
El consumo total durante los 10 das de fermentacin de cido y base fueron
respectivamente de: 600 ml de cido ctrico 5 N y 1750 ml de carbonato de calcio
5N.
Se observ que al transcurso de la fermentacin se form un precipitado debido a
la baja solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas
para realizar conteo de microorganismos. Para solucionar dicho problema se
implemento el uso de KOH.
El comportamiento del crecimiento de
microorganismos bajo el efecto del KOH 5 N como base fue positivo, presentando
valores de crecimiento de 2.7 x107 m.o/ml hasta 3.9 x107 m.o/ml en los dos
primeros das de fermentacin y permite el uso de dicha base en las
fermentaciones propuestas para el proyecto con fines de anlisis.
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS

A continuacin se presentan las calibraciones de los mtodos de determinacin de
nitrgeno total y de azcares reductores.
4.4.1 Calibracin del mtodo de determinacin de nitrgeno total
En el presente trabajo, se utiliz un equipo de digestin y destilacin BUCHI, el
cual provee una mayor exactitud en la determinacin de nitrgeno respecto al
equipo anteriormente usado por los otros trabajos de investigacin referentes a la
lnea de fermentacin de La Universidad de La Sabana.
4.4.1.1 Curva de calibracin del mtodo Kjeldahl con urea
Pesar en papel copia diferentes cantidades de urea previamente seca desde
0.005 g. hasta 0.5 g. Realizar un blanco, utilizando nicamente el papel para
restar al resultado de los dems puntos y obtener el nitrgeno total.
Seguir la metodologa enunciada para la determinacin de nitrgeno total.
Graficar el nitrgeno recuperado en funcin del peso de urea correspondiente.
La urea tericamente contiene 46.62% de nitrgeno (Bonilla y Martnez, 1999,
40).
Tabla 4.8 Resultados de calibracin para mtodo total de Kjeldahl
U R E A (g)
0.0051
0.0080
0.0100
0.0156
0.0202
0.0252
0.0503
0.0752
0.1006
0.1500
0.2003
0.2502
0.3006
0.3503
0.4006
0.5005
N IT R O G E N O
N IT R O G E N O
T E O R IC O (g)
R E C U P E R A D O (g)
0.002354
0.002318
0.003730
0.003643
0.004678
0.004638
0.007273
0.007067
0.009417
0.009329
0.011733
0.011480
0.023434
0.022960
0.035058
0.034230
0.046900
0.045710
0.069914
0.067580
0.093364
0.091210
0.116643
0.113300
0.140140
0.135500
0.163310
0.157300
0.186760
0.179900
0.233333
0.225900
P R O M E D IO % E R R O R M E T O D O =
P R O M E D IO % R E C U P E R AC IO N =
C O R R E L AC IO N T O D O S L O S D AT O S =
% ERRO R
% R E C U P E R A C I N
1.54
2.32
0.85
2.83
0.94
2.15
2.02
2.36
2.54
3.34
2.31
2.87
3.31
3.68
3.67
3.19
98.46
97.68
99.15
97.17
99.06
97.85
97.98
97.64
97.46
96.66
97.69
97.13
96.69
96.32
96.33
96.81
2.49
97.51
0.99999
Fuente: Autores
La grfica de la curva de calibracin correspondiente se presenta a continuacin.

Grfica 4.1 Curva de calibracin para el mtodo total de Kjeldahl
CURVA DE CALIBRACION METODO TOTAL
0.250000
0.200000
NITROGENO(g)
0.150000
0.100000
0.050000
0.000000
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
UREA(g)
Nitrgeno terico (g)
Nitrgeno recuperado (g)
Fuente: Autores
4.4.1.2
Curva de calibracin para etapa de destilacin y titulacin
Preparar una solucin madre de sulfato de amonio al 0.9428% donde 1 ml de

la solucin madre contiene 0.002 g. de nitrgeno.
Tomar diferentes volmenes de solucin madre desde 2.5 ml hasta 90 ml
incorporndolos en los tubos de vidrio para trabajar en el sistema BUCHI de
destilacin. Seguir el procedimiento para la destilacin y titulacin.
Graficar el nitrgeno recuperado en funcin del volumen de solucin madre del
sulfato de amonio.
0.6
Tabla 4.9 Resultados de calibracin para etapa de destilacin y titulacin del

mtodo Kjeldahl
SOLUCION
SULFATO
0.9428% (ml)
2.5
5.0
10.0
15.0
20.0
30.0
45.0
50.0
55.0
60.0
70.0
80.0
90.0
NITROGENO
TEORICO(g)
NITROGENO
RECUPERADO(g)
%ERROR
%RECUPERACION
0.005000
0.010000
0.020000
0.030000
0.040000
0.060000
0.090000
0.100000
0.110000
0.120000
0.140000
0.160000
0.180000
0.004858
0.009938
0.019870
0.029810
0.039750
0.059400
0.089220
0.098940
0.108800
0.117600
0.136800
0.156100
0.174900
2.84
0.62
0.65
0.63
0.63
1.00
0.87
1.06
1.09
2.00
2.29
2.44
2.83
97.16
99.38
99.35
99.37
99.38
99.00
99.13
98.94
98.91
98.00
97.71
97.56
97.17
PRO M EDIO %ERRO R M ET O DO =

PRO M EDIO %RECUPE RACIO N=
CO RRELACIO N T O DO S LO S DAT O S =
1.46
98.54
0.999939
Fuente: Autores
Grfica 4.2 Curva de calibracin para destilacin y titulacin en mtodo Kjeldahl
C U R V A D E C A L IB R A C IO N P A R A D E S T IL A C IO N T IT U L A C IO N
0 .2
0 .1 8
0 .1 6
0 .1 4
NITROGENO (g)
0 .1 2
0 .1
0 .0 8
0 .0 6
0 .0 4
0 .0 2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S U L F A T O ( m l)
N it r g e n o t e r ic o ( g )
N it r g e n o r e c u p e r a d o ( g )
Fuente: Autores
10
El error del mtodo total (digestin, destilacin y titulacin) es del 2.49%, el error
para destilacin y titulacin es de 1.46%, por lo tanto el error para la etapa de
digestin es de 1.03%.
4.4.2
Calibracin del mtodo de determinacin de azcares reductores por

titulacin de Lane y Enyon
Los trabajos anteriores en la lnea de investigacin de fermentacin emplearon el

mtodo colorimtrico, el cual se diferencia en su fundamentacin terica pero
tienen la misma finalidad. La diferencia ms notable es que el mtodo empleado
en el presente trabajo permite fijar un error de exactitud.
Con la solucin de azcar invertido al 1% se realiz la titulacin por el mtodo
de Lane y Enyon descrito previamente. La titulacin se trabajo para reducir 10
ml de solucin Felhing, de donde se determina que 0.0545 g. de azcar
invertido reduce 10 ml de la solucin Felhing.
De acuerdo a lo anterior se fijan 5 volmenes tericos de titulacin de 15, 20,
30, 40 y 50 mililitros y cada volumen debe contener 0.0545 g. de azcar
invertido, por lo cual se deben preparar a partir de la solucin madre de azcar
invertido al 1%.
Siguiendo el mtodo enunciado para la titulacin, se procede a determinar los
volmenes reales en la titulacin a las concentraciones tericas establecidas.
La concentracin real de azcar invertido se determina as:
[ ] Azcares reductores = g. de azcar invertido que reducen 10 ml de Felhing(0.0545g)
/ Volumen de titulacin en ml.
Tabla 4.10 Resultados de calibracin para mtodo de determinacin de azcares

reductores.
VOLUMEN CONCENTRACI
CONCENTRACI
TEORICO DE N REAL DE VOLUMEN REAL
N DE
SOLUCION DE SOLUCION DE DE SOLUCION
SOLUCION DE
AZUCAR
AZUCAR
DE AZUCAR
AZUCAR
INVERTIDO INVERTIDO(g./ INVERTIDO (ml)
INV.(g./ml)
(ml)
ml)
0.00363
15
0.00368
14.8
0.00272
20
0.00275
19.8
0.00182
30
0.00182
29.9
0.00136
40
0.00137
39.9
0.00109
50
0.00109
49.9
Fuente: Autores
% ERROR
1.3
1.0
0.3
0.2
0.2
El porcentaje de error total del mtodo es el promedio de los cinco puntos

determinados y es de 0.6 %.
11
Grfica 4.3 Curva de calibracin del mtodo de determinacin de azcares

reductores por titulacin de Lane y Enyon
C A L IB R A C IO N M E T O D O D E D E T E R M IN A C IO N D E A Z U C A R E S R E D U C T O R E S
0 .0 0 4 0
CONCNETRACION DE SOLUCION DE AZUCAR INVERTIDO (g/ml)
0 .0 0 3 5
0 .0 0 3 0
0 .0 0 2 5
0 .0 0 2 0
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1 0
0 .0 0 0 5
0 .0 0 0 0
0
10
20
30
40
50
60
V O L U M E N D E S O L U C IO N D E A Z U C A R IN V E R T ID O (m ililitr o s )
V O L U M E N T E O R IC O (m l)
V O L U M E N R E A L (m l )
Fuente: Autores
4.5
RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS

EN EL BIOFLO
A continuacin se presentan los datos de las variables medidas durante el

desarrollo de las fermentaciones con regulacin de pH y sin regulacin.
4.5.1
Datos de crecimiento de microorganismos
Para las cuatro fermentaciones, dos con regulacin de pH y dos sin regulacin del
mismo, se presentan los datos de crecimiento determinados por el conteo cmara
Neubauer Improved con los rangos de error de precisin respectivos. Se calcul
de acuerdo a la formula enunciada en el procedimiento para conteo de
microorganismos.
Los triplicados realizados para el conteo de microorganismos en cada
fermentacin se presentan en el Anexo B.
12
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos

NM.O/ml FERM. 1
NM.O/ml FERM. 2
NM.O/ml FERM. 1 SIN

CONTROL DE PH
NM.O/ml FERM. 2 SIN

CONTROL DE PH
DIA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
2.1E+07
9.8E+07
1.1E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.2E+07
6.8E+07
6.2E+07
2.4E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.7E+07
7.1E+07
6.5E+07
2.2E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
6.6E+07
6.3E+07
5.7E+07
2.5E+07
1.1E+08
1.3E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
7.0E+07
6.5E+07
5.8E+07
2.4E+07
7.1E+07
8.3E+07
9.4E+07
2.5E+07
7.4E+07
8.5E+07
9.7E+07
2.3E+07
7.5E+07
8.7E+07
9.9E+07
2.4E+07
7.8E+07
9.1E+07
1.0E+08
7.1E+07
6.6E+07
6.1E+07
5.2E+07
7.6E+07
6.9E+07
6.3E+07
5.5E+07
7.4E+07
6.8E+07
6.4E+07
5.5E+07
7.8E+07
7.0E+07
6.8E+07
5.8E+07
Fuente: Autores
Las grficas de crecimiento para cada fermentacin se presentan a continuacin
con el fin comparativo de las mismas.
Grfica 4.4 Curvas de crecimiento de microorganismos para fermentaciones con
control y sin control de pH.
C U R V A S D E C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
N CELULAS POR MILILITRO
1 .0 E + 0 9
1 .0 E + 0 8
1 .0 E + 0 7
0
10
11
T IE M P O (D A S )
N M .O /M L F E R M . 1
N M .O /M L F E R M . 1 S IN C O N T R O L
N M .O /M L F E R M . 2
N M .O /M L F E R M . 2 S IN C O N T R O L
Fuente: Autores
13
4.5.2
Datos de contenido de nitrgeno total en la biomasa
El nitrgeno determinado corresponde a la cantidad de nitrgeno celular por

mililitro de fermento, utilizando la formula descrita en el procedimiento para el
mtodo Kjeldahl.
De acuerdo a los volmenes de titulacin de HCL 0.94656 N, determinados por
triplicado para cada da de la fermentacin, la desviacin estndar es cero (Ver
Anexo B). De acuerdo a esto se tom el porcentaje de error del mtodo de
determinacin de nitrgeno total, que es de 2.49 %, para determinar los rangos de
nitrgeno celular por mililitro.
Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrgeno celular por mililitro
FERM. 1 mg N / ml
FERM. 1 SIN CONTROL DE PH

mg N / ml
FERM. 2 mg N / ml
FERM. 2 SIN CONTROL DE PH

mg N / ml
DIA
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
0.0644
0.0676
0.0965
0.1015
0.0644
0.0676
0.0644
0.0676
0.2257
0.2373
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2906
0.3054
0.3228
0.3392
0.2584
0.2716
0.2906
0.3054
0.3549
0.3731
0.3876
0.4074
0.2906
0.3054
0.2906
0.3054
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
10
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
Fuente: Autores
Utilizando el rango para todos los das de las fermentaciones, se realizo la grfica
de contenido de nitrgeno celular por mililitro.
Grfica 4.5 Curva de nitrgeno celular por mililitro para fermentaciones con control
y sin control de pH
C O N T E N ID O
D E
N IT R O G E N O
C E L U L A R
0 .4 6
0 .4 1
MILIGRAMOS DE NITROGENO/MILILITRO
0 .3 6
0 .3 1
0 .2 6
0 .2 1
0 .1 6
0 .1 1
0 .0 6
0 .0 1
0
1 0
1 1
T IE M P O (D IA S )
F E R M . 2 m g N / m l
F E R M . 1 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
F E R M . 1 m g N / m l
F E R M . 2 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
Fuente: Autores
14
4.5.3
Datos de slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa
Debido a que todas las muestras tomadas se midieron a 20 C no fue necesario

realizar correccin con tablas a los datos obtenidos.
Tabla 4.13 Resultados de toma de Brix a 20C
D IA
F E R M .1 C O N
R E G U L A C IO N
FERM . 2 CO N
R E G U L A C IO N
F E R M . 1 S IN
R E G U L A C IO N
F E R M . 2 S IN
R E G U L A C IO N
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 0 .0
1 7 .9
1 4 .1
1 0 .7
8 .2
7 .4
7 .0
6 .5
6 .2
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .0
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
2 0 .0
1 7 .3
1 4 .1
1 0 .5
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
7 .3
6 .8
6 .4
6 .0
Fuente: Autores
Grfica 4.6 Curva de Brix para fermentaciones con control y sin control de pH
Brix a 20 C
B rix
2 0 .0
1 8 .0
1 6 .0
1 4 .0
1 2 .0
1 0 .0
8 .0
6 .0
4 .0
2 .0
0 .0
0
10
12
T ie m p o (d a s )
F E R M .1 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 1 S IN R E G U L A C IO N
F E R M . 2 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 2 S IN R E G U L A C IO N
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido en el da 10 de cada fermentacin fue de 0 %
de sacarosa.
4.5.4
Datos de azcares reductores residuales y contenido de etanol
Al final de cada fermentacin se determin la concentracin de azcares

reductores. A manera de ejemplo para la fermentacin 1 con control de pH se
presenta el calculo:
[ ] Azcares reductores = 0.0545 g. Azcar reductor / 40.8 ml fermento
donde 40.8 es el volumen gastado en la titulacin para dicha determinacin. [ ] de
azcares reductores es igual a 0.00133 g/ml 0.133% p/v de azcar reductor en
15
el fermento. El porcentaje de error del mtodo de determinacin de azcares

residuales es muy bajo (0.62%), por lo cual los datos obtenidos no tienen rango
alguno.
Tabla 4.14 Resultados de determinacin de azcares reductores residuales
CONCENTRACION DE AZUCARES REDUCTORES EN g/ ml
DIA
10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
0.00133
0.00141
0.00157
0.00151
Fuente: Autores
Para el contenido de etanol, la temperatura de trabajo fue de 15C debido a la
calibracin del alcoholmetro. Para el da final de la fermentacin se tiene que la
para las fermentaciones con regulacin de pH el contenido de alcohol es de 10
G.L y para las fermentaciones sin regulacin de pH el contenido de alcohol es de
8 G.L. La toma de contenido de etanol no presento error de precisin ni error de
exactitud en el mtodo.
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol
CONTENIDO DE ETANOL EN G.L
DIA
10
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
10
10
Fuente: Autores
4.5.5
Volmenes consumidos de cido y base por el sistema de regulacin

de pH
El sistema de regulacin de pH y sus acciones de control a lo largo de una

fermentacin consumen las siguientes cantidades de cido ctrico 5N e hidrxido
de potasio 5N respectivamente:
Para la fermentacin 1 con control de pH los volmenes fueron de 349 ml de
cido y 234 ml de base.
Para la fermentacin 2 con control de pH los volmenes fueron de 352 ml de
cido y 259 ml de base.
Los consumos da a da en cada fermentacin se presentan en el Anexo B.
Aunque se trabaj a concentraciones de cido y base 5N, los volmenes
consumidos por el sistema de regulacin no son iguales debido a que el KOH es
una base fuerte y el cido ctrico es una cido dbil con una disociacin baja (K =
16
7.4 x 10-7) en relacin con el KOH, lo que ocasiona un mayor consumo de cido
respecto a la base.
4.5.6
Variacin de pH en las fermentaciones sin control de pH
Tomando la medida directamente del panel de control del Biorreactor se reportan

los valores de pH da a da.
Tabla 4.16 Variacin de pH en una fermentacin sin control de pH
D
I A
0
1
2
3
7
8
9
1 0
F E R
N
6
4
3
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
8
2
9
9
0
0
0
1
A
5
1
6
0
3
5
8
0
I O
F E R
N
6
4
4
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
7
3
0
9
0
0
0
0
A
8
3
2
4
1
3
6
9
I O
Fuente: Autores
17
CAPITULO 5
DISCUSION DE RESULTADOS
En ste captulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo. Como parte
importante, se encuentra el anlisis del crecimiento de microorganismos, contenido de
nitrgeno, slidos solubles totales, sacarosa, azcares reductores totales y contenido
de etanol entre una fermentacin alcohlica con funcionamiento del sistema de
regulacin de pH en el Bioflo y otra fermentacin a las mismas condiciones sin
regulacin de pH. Tambin se discute la reproducibilidad de estas fermentaciones de
acuerdo a las variables medidas en una fermentacin alcohlica.
5.1
SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR RANGO

FLUCTUACION DE PH
Para lograr observar el funcionamiento continuo del sistema de regulacin de pH en el

Bioflo y facilitar el desarrollo de la gua de manejo del sistema de bombas peristlticas,
es necesario que de manera preliminar se determine que medio de cultivo presenta
mayor fluctuacin de pH a lo largo de una fermentacin.
El medio de cultivo seleccionado para trabajar en una fermentacin alcohlica en el
Bioflo bajo regulacin de pH fue el preparado con base semisinttica adicionando
fosfato de amonio. De acuerdo a los resultados de los datos tomados diariamente de
pH, se determin que el medio presenta un porcentaje de variacin entre el inicio y la
finalizacin de la fermentacin del 43.7%, como un porcentaje de variacin entre el pH
ms alto y el menor del 45.4% (Ver Tabla 4.5). De acuerdo a la tendencia lineal del pH
respecto al tiempo, se parametrizaron los primeros cuatro das de cada fermentacin
preliminar para determinar la mayor pendiente que indica un mayor rango de fluctuacin
de pH. La regresin lineal mediante el mtodo de los mnimos cuadrados, determin
que el medio S2 presenta una pendiente negativa de 0.673 con una correlacin de
0.905, siendo ste el de mayor pendiente respecto a los otros medios de cultivo
analizados. En el Anexo A se incluyen los datos de parametrizacin para cada una de
las fermentaciones preliminares.
69
Discusin de resultados
70
5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO

La velocidad de agitacin seleccionada para trabajar una fermentacin alcohlica con
funcionamiento del sistema de regulacin de pH en el Bioflo fue de 100 r.p.m., ya que
de acuerdo a los tiempos de operacin para efectuar una regulacin dentro de unos
rangos de pH de 7 hasta 3 y de 3 a 5 respectivamente, fueron de 18.08 minutos para
regulacin con cido y 24 minutos para regulacin con base. Los resultados son los
mejores respecto al tiempo de operacin del sistema de regulacin de pH de acuerdo a
las diferentes velocidades de agitacin evaluadas(Ver Tabla 4.6). La agitacin a 100
r.p.m. provee una homogenizacin apropiada para la toma de muestra en el
seguimiento del crecimiento microbiano y logra una estabilizacin rpida del pH en el
cultivo. Al trabajar a velocidad de agitacin de 125 r.p.m. se present turbulencia en el
medio, observndose exceso de burbujas de aire y formacin de espuma, lo cual
presentara una tendencia a un metabolismo respiratorio en la levadura que no favorece
una fermentacin alcohlica.
Se emplearon dos concentraciones diferentes de cido y base para evaluar cual
concentracin es la indicada para usar en el sistema de regulacin de pH. La
concentracin de cido ctrico 5 N y de carbonato de calcio 5 N mejoran la operacin
del sistema de regulacin de acuerdo a los volmenes consumidos y el tiempo de
accin y no se emplearon concentraciones mayores ya que la levadura puede ser
afectada en su estado fisiolgico. En un rango de regulacin de pH son menores
respecto a una concentracin 1 N (Ver Tabla 4.7). El funcionamiento del Bioflo es
apropiado bajo las concentraciones de 5 N y se evita excesos de volumen en una
fermentacin alcohlica, que dificultara el manejo de las bombas peristlticas
destinadas al sistema de regulacin de pH. Ajustando aun ms el funcionamiento del
sistema de regulacin de pH del Bioflo, se opto por utilizar KOH como base, porqu en
la fermentacin preliminar en el biorreactor el carbonato de calcio present problemas
debido a la baja solubilidad del mismo, afectando la toma de muestras para realizar la
determinacin de recuento de microorganismos, y el uso del KOH present un
crecimiento de microorganismos positivo y no influye en el metabolismo de la levadura.
5.3
ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS
5.3.1 Anlisis de la estandarizacin del mtodo de determinacin de nitrgeno

total
La metodologa de determinacin de nitrgeno por el mtodo Kjeldahl tiene a lugar su
estandarizacin en un equipo que permite obtener mayor confiabilidad en los datos
obtenidos, disminuyendo errores del procedimiento. El porcentaje de error para el
mtodo total es del 2.49 % obteniendo una recuperacin de nitrgeno de 97.51% para
determinaciones de nitrgeno que contengan desde 0.002 g hasta 0.23 g del mismo. El
error es menor a valores de nitrgeno de 0.0035 g y a medida que aumenta la cantidad
de nitrgeno el error aumenta paulatinamente. El error para la etapa de destilacin y
71
titulacin es de 1.46% y permite definir que el error en la etapa de digestin es de

1.03%.
Respecto a las anteriores estandarizaciones realizadas en la lnea de investigacin, se
present una notable mejora en cuanto al porcentaje de error del mtodo. En la
siguiente tabla se presenta la comparacin de los porcentajes de error del mtodo de
determinacin de nitrgeno total.
Tabla 5.1 Porcentajes de error del mtodo de determinacin de nitrgeno total en
diferentes estandarizaciones realizadas
AUTORES
ALBA, D Y
SIERRA, R.
(EQUIPO
KJElDAHL
NACIONAL)
BONILLA, H Y
MARTINEZ, V.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
MERCHAN, C Y
CASTILLO, A.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
RAMIREZ, G Y
PEDROZA, J. (EQUIPO
BUCHI)
PORCENTAJE ERROR
METODO TOTAL
6.26 %
7.45 %
8.00 %
2.49 %
PORCENTAJE ERROR
ETAPA DESTILACION Y
TITULACION
2.75 %
4.50 %
6.00 %
1.46 %
PORCENTAJE DE ERROR
ETAPA DE DIGESTION
3.51 %
2.95 %
2.00 %
1.03 %
RANGO PARA
DETERMINACION DE
NITROGENO (g)
0.002 0.05
0.004 0.025
0.004 0.025
0.002 0.23
ESTANDARIZACION
Fuente: Tesis de lnea de investigacin en fermentacin. Universidad de La Sabana.

El equipo BUCHI reduce errores sistemticos y aleatorios que se puedan presentar por
parte del operario como tambin el error que presenta el equipo en el procedimiento, lo
cual representa mayor confiabilidad en los datos obtenidos.
5.3.2 Anlisis de la estandarizacin del mtodo de determinacin de azcares
reductores residuales
Para la metodologa de determinacin de azcares mediante la titulacin de Lane y
Enyon, el porcentaje de error de 0.62% indica que el mtodo es apropiado y los datos
obtenidos son confiables debido al bajo porcentaje de error. Cabe anotar que el mtodo
exige un estricto seguimiento en su procedimiento para que el error sea mnimo.
Las anteriores estandarizaciones utilizaron el mtodo colorimtrico el cual se basa en
una curva de calibracin y una estimacin lineal para determinar la concentracin de
azcar reductor. La determinacin de azcares por titulacin es alternativo y no es
comparable con el mtodo anteriormente trabajado en cuanto al error del mtodo. Pero
cabe recalcar que debido al bajo error presentado, el mtodo empleado en el presente
proyecto puede ser utilizado para posteriores anlisis en la lnea de investigacin y
lograr una mejora en su procedimiento.
5.4
72
ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH

RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH
Para efectos de anlisis se discute el comportamiento de las variables medidas a lo

largo de las fermentaciones con regulacin y sin regulacin de pH en el Bioflo,
comparando con los antecedentes presentados por los anteriores trabajos de
investigacin realizados en el biorreactor.
5.4.1 Crecimiento de microorganismos
En la siguiente tabla se presenta los valores de mayor nmero de microorganismos
durante la totalidad de cada una de las fermentaciones realizadas en el Bioflo.
Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo
FERMENTACIONES
1 CON REGULACION
DE PH
2 CON REGULACION
DE PH
1 SIN REGULACION
DE PH
2 SIN REGULACION
DE PH
NUMERO DE
MICROORGANISMOS
/ MILILITRO
1.4 E+08
1.5 E+08
9.5 E+07
1.0 E+08
DESVIACION
ESTANDAR
2.5 E+06
1.0 E+06
1.6 E+06
1.6 E+06
Fuente: Autores
Observando las grficas de crecimiento se tiene que las fermentaciones realizadas con
regulacin de pH a valor de 4.5, temperatura de 25C y agitacin a 100 r.p.m. presentan
un mayor crecimiento de microorganismos respecto a las fermentaciones sin regulacin
de pH. El crecimiento en las fermentaciones con regulacin de pH es 47.15% - 50.20%
mayor respecto a las que no regulan el pH, debido a que al no regular el pH, hay una
tendencia a la produccin de metabolitos secundarios (cido ctrico, cido mlico y
otros), los cuales acidifican el medio impidiendo una mayor produccin de biomasa y
etanol, pero con un consumo de slidos solubles similar para ambas fermentaciones,
comportamiento observado en la variacin de pH que presentan las fermentaciones sin
utilizar la regulacin de pH (Ver Tabla 4.16); al inicio de la fermentacin se tiene un pH
de 6.85 y al da 1 el pH disminuye a un valor de 4.21 y para las fermentaciones que
utilizan el sistema de regulacin, el pH permanece constante a un valor de 4.5, fijado
desde el inicio del proceso.
Para fermentaciones alcohlicas desarrolladas en el biorreactor por los anteriores
trabajos de la lnea de investigacin, controlando nicamente la variable temperatura, el
mayor crecimiento microbiano a 25 C fue de 1.4E+08 y a 30 C fue de 7.6E+07. Al
desarrollar una fermentacin regulando el pH a 4.5 se obtiene un crecimiento 6.60%
mayor respecto a una fermentacin a temperatura constante de 25 C, pero significativa
respecto a una temperatura constante de 30 C al ser un 97.50% mayor el crecimiento
en la fermentacin a 25 C y pH de 4.5. El comportamiento que se observa en la
comparacin de este parmetro, indica que a 25 C el crecimiento de microorganismos
se favorece ya que es la temperatura ptima para el desarrollo de una levadura.
Tambin se observa que al regular el pH esta tendencia de mayor crecimiento se
73
beneficia levemente ya que el pH fijado a 4.5 difiere del pH ptimo para el desarrollo de
la levadura en una fermentacin, el cual es de 3.5 y fue ajustado al inicio de las
fermentaciones que no controlan el pH a lo largo del proceso (Aleixandre, Noviembre de
1998). Otro factor que favorece el crecimiento de microorganismos es el medio de
cultivo, ya que el extracto de levadura es el medio que ms provee de requerimientos
nutricionales a la levadura, respecto al preparado a base de peptona utilizado por
fermentaciones realizadas en el Bioflo. Las fermentaciones desarrolladas en el
presente trabajo mantuvieron una agitacin constante mientras que los antecedentes
presentados solo realizan agitacin antes de tomar la muestra.
Grfica 5.1 Comparacin del mayor crecimiento de microorganismos para distintas
fermentaciones en el Bioflo.
2.0E+08
1.5E+08
1.4E+08
1.5E+08
TEMPERATURA 25C Y PH 4.5

7.6E+07
m.o por ml 1.0E+08
TEMPERATURA 25C
TEMPERATURA 30C
5.0E+07
0.0E+00
CRECIMIENTO
Fuente: Autores
5.4.2 Contenido de nitrgeno en la biomasa
Los datos de contenido de nitrgeno que se presenta en la siguiente tabla corresponden
a los das en que se obtuvo el mayor crecimiento de microorganismos en las
fermentaciones en el Bioflo bajo las condiciones ya establecidas.
Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrgeno en fermentaciones en el Bioflo
FERMENTACIONES
FERM. 1 CON
REGULACION DE PH
FERM. 2 CON
REGULACION DE PH
FERM. 1 SIN
REGULACION DE PH
FERM. 2 SIN
REGULACION DE PH
RANGOS DE
NITROGENO
MILIGRAMOS DE
NITROGENO /
MILILITRO
0.3549 0.3731
0.3876 0.4074
0.2584 0.2716
0.2906 0.3054
Fuente: Autores
De acuerdo a los rangos de contenido de nitrgeno, para las fermentaciones con
regulacin de pH la diferencia es de un 3.7% y para las de sin regulacin la diferencia
es del 6.5%, diferencias calculadas tomando los datos ms cercanos de cada rango.
Los parmetros determinados en las fermentaciones realizadas presentan
reproducibilidad debido a la similitud en sus datos y sus porcentajes de diferencia son
bajos, teniendo en cuenta que se trata de un sistema biolgico.
Se observa una tendencia de un menor contenido de nitrgeno en las fermentaciones
que no regulan el pH. El contenido de nitrgeno para las fermentaciones con regulacin
de pH es entre 33.37% - 37.34% mayor que el contenido de nitrgeno para las
fermentaciones sin regulacin de pH.
74
Para las fermentaciones desarrolladas en el Bioflo por los anteriores trabajos de

investigacin, controlando nicamente la variable temperatura, el nitrgeno en la
biomasa para el da donde se presenta el mximo contenido, a 25 C fue de 0.2649
mg/ml 0.3110 mg/ml y para 30C fue de 0.1934 mg/ml - 0.2245 mg/ml. El contenido
de nitrgeno es mayor para una fermentacin con regulacin de pH en un 21.50 %
respecto a una fermentacin con temperatura de 25 C y un 67.00 % mayor respecto a
una fermentacin con temperatura de 30 C. Estos porcentajes son amplios debido a
que el medio que ms provee de requerimientos nutricionales y favorece la produccin
de biomasa es el preparado a base de extracto de levadura respecto al preparado a
base de peptona utilizado por los anteriores trabajos de investigacin; respecto a la
fermentacin a 30 C es mucho mayor porqu al trabajar a 25 C se favorece el
crecimiento de la levadura ya que es la temperatura ptima para su desarrollo. Segn
los resultados de contenido de nitrgeno en la biomasa, se confirma la tendencia del
crecimiento de microorganismos en una fermentacin alcohlica, observando que al
regular el pH la concentracin de microorganismos concuerda con el contenido de
nitrgeno determinado siendo este mayor respecto a la fermentacin que no regula pH.
Nuevamente se establece que la temperatura y la regulacin de pH son determinantes
para que el crecimiento de microorganismos sea ms eficiente.
Para efecto de balance entre contenido de nitrgeno celular y el conteo de
microorganismos se analiza el contenido de nitrgeno en miligramos por clula para
cada fermentacin. El contenido de nitrgeno por clula presenta significativas
fluctuaciones para los anlisis del da cero (0) debido a que en la determinacin de
nitrgeno se pudo haber cometido errores en el mtodo, especficamente en la
centrifugacin de la muestra y retiro del sobrenadante para obtener nicamente las
levaduras presentes, ya que la cantidad de biomasa al inicio de cada fermentacin es
baja y dificulta el anlisis de nitrgeno en la muestra. Concretamente se descart el
dato del da 0 para la fermentacin 2, ya que la determinacin de nitrgeno para todas
las fermentaciones en el da 0 fueron tomadas 30 minutos despus de inocular la
levadura al medio y el resultado debe ser similar, por lo cual este dato present un error
en el procedimiento de la toma de muestra. En la siguiente tabla se presenta el anlisis
a partir de los valores de las Tablas 4.11 y 4.12.
Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrgeno por clula
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O (m g ) / C E L U L A
F E R M .1
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L
DE PH
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 .8 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .3 E -0 9
3 .1 E -0 9
Fuente: Autores
3 .0 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .4 E -0 9
3 .2 E -0 9
4 .1 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
4 .3 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .1 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
75
Se observa una tendencia a un menor contenido de nitrgeno por clula durante los
primeros das de las fermentaciones que regulan pH, ya que el pH interactua con el
estado fisiolgico de la levadura, comportamiento reflejado en el conteo de
microorganismos. Durante la fase estacionaria de crecimiento no se observan
fluctuaciones del contenido de nitrgeno por clula para cada una de las
fermentaciones. De acuerdo a los valores de contenido de nitrgeno por clula para los
das donde se tiene el mayor crecimiento de microorganismos (da 4 para fermentacin
con regulacin de pH y da 3 para fermentacin sin regulacin de pH), el contenido de
nitrgeno por clula es mayor en 8.14 % en una fermentacin sin regulacin de pH
respecto a una fermentacin con pH regulado. De manera concreta, una levadura que
se desarrolla en una fermentacin sin regulacin de pH tiende a una mayor cantidad de
nitrgeno que una que se desarrolla en una fermentacin a pH regulado. En la
siguiente tabla se presenta los rangos de porcentaje peso a peso de nitrgeno por
clula en cada una de las fermentaciones desarrolladas.
Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrgeno por clula
% P /P N IT R O G E N O / C E L U L A
F E R M .1
FERM. 2
DE PH
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
P R O M E D IO S
1 1 .1 6
8 .5 2
8 .0 1
8 .7 3
9 .5 6
9 .6 5
1 1 .3 3
1 2 .7 6
1 1 .9 8
1 0 .1 9
1 1 .7 3
8 .9 5
8 .4 2
9 .1 7
1 0 .0 5
1 0 .1 4
1 1 .9 1
1 3 .4 1
1 2 .5 9
1 0 .7 1
1 6 .0 9
8 .0 4
7 .7 6
9 .2 4
1 0 .0 6
1 0 .0 8
1 1 .0 4
1 1 .8 5
1 0 .9 6
9 .8 8
1 6 .9 2
8 .4 5
8 .1 6
9 .7 1
1 0 .5 7
1 0 .6 0
1 1 .6 0
1 2 .4 5
1 1 .5 2
1 0 .3 8
1 0 .2 9
1 0 .1 8
1 1 .0 1
1 0 .2 5
1 0 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .5 7
1 0 .7 7
1 0 .7 3
1 1 .5 6
1 2 .0 5
1 0 .9 7
1 1 .2 8
1 2 .1 5
1 2 .6 6
1 1 .5 3
1 0 .6 6
1 0 .8 3
1 0 .5 3
1 1 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .2 1
1 1 .3 9
1 1 .0 6
1 2 .4 2
1 1 .2 4
1 1 .4 0
1 1 .3 5
9 .9 4
1 1 .1 9
1 1 .1 5
1 1 .9 8
1 1 .9 3
1 0 .4 5
1 1 .7 6
1 1 .7 2
Fuente: Autores
De acuerdo a los promedios obtenidos de toda la marcha fermentativa, se observa que
el porcentaje de nitrgeno por clula es mayor en un rango del 8.15 % - 8.18 % de una
fermentacin sin regulacin de pH respecto a la fermentacin con regulacin de pH a
4.5.
Estos porcentajes de diferencia que se observan en la anterior comparacin, se deben
a la directa incidencia de la variable pH en cuanto a su comportamiento en la
fermentacin sin regulacin de pH durante el proceso fermentativo, ya que los valores
de pH en las fase de crecimiento presentan un valor cercano al pH ptimo (3.05 3.50)
para el desarrollo de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998). La variacin de pH
en el desarrollo de una fermentacin sin regulacin de pH se observa en la Tabla 4.16.
El porcentaje de nitrgeno por clula tiende a ser ms estable a lo largo de la
fermentacin sin regulacin de pH debido a que la levadura como sistema biolgico,
maneja de manera natural el pH, lo que no sucede al regular el pH debido a que el valor
fijado de 4.5 desde el inicio de la fermentacin esta alejado del rango ptimo de pH para
el desarrollo de la levadura en una fermentacin alcohlica y no es un manejo natural
del pH.
76
5.4.3 Slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa

El comportamiento del consumo de slidos solubles totales durante las fermentaciones
desarrolladas fue similar tanto para la fermentacin con regulacin de pH como para las
que no regulan (Ver Grfica 4.6). En el da 4 para las fermentaciones que no regulan
pH no se tuvo registro de datos (da festivo), pero la tendencia del consumo de slidos
solubles es semejante para todas las fermentaciones, y dicho dato (da 4) tambin tiene
un comportamiento similar a pesar de no registrarse as en la Grfica 4.6. En el da
final de las fermentaciones el porcentaje de sacarosa es cero, es decir toda la sacarosa
fue desdoblada por la levadura en su metabolismo; se observa que los slidos solubles
totales disminuyen hasta un valor aproximado a 6.0 Brix ya que la levadura en la ltima
etapa de las fermentaciones termina de consumir la sacarosa presente en el medio
quedando en el mismo slidos solubles diferentes a la sacarosa y compuestos que la
misma levadura produce. El mayor consumo de slidos solubles se di durante los
primeros cuatro das de cada fermentacin debido a que la levadura se encuentra en la
fase exponencial de crecimiento, fase en la cual existe mayor demanda de nutrientes
para su desarrollo y produccin de metabolitos con una tasa de crecimiento de 0.019
h-1 y un nmero de duplicaciones para las fermentaciones que regulan pH de n=2.6 y
para las que no regulan pH de n=2.0, disminuyendo los slidos solubles a valores
aproximados de 8.0 Brix. De aqu al final de la fermentacin la levadura se encuentra
en la fase estacionaria de crecimiento, debido a que los nutrientes empiezan a agotarse
y la levadura se encuentra en un metabolismo de mantenimiento, y el consumo de
slidos solubles pasa de 8.0 Brix hasta valores de 6.0 Brix. De acuerdo al
comportamiento del consumo de slidos solubles en las fermentaciones con y sin
regulacin de pH, se observa que el pH no influye en dicho consumo, pero los
resultados presentados por anteriores trabajos en fermentaciones en el Bioflo muestran
que existe un bajo consumo de slidos solubles totales llegando hasta valores de 13.1
Brix para una fermentacin alcohlica a 30 C y de 11.7 Brix para una fermentacin
alcohlica a 25 C. Estas fermentaciones no presentaron agitacin constante durante la
marcha fermentativa, por lo cual existe menos oxgeno disuelto en el medio y las
levaduras destinan el consumo de slidos solubles al proceso de fermentacin. A la
vez estas fermentaciones realizan un ajuste inicial de pH a valor de 3.5 y por lo tanto la
levadura no requiere de una produccin alta de metabolitos secundarios para acidificar
el medio, donde la variacin de pH durante la marcha fermentativa se encuentra en un
rango de 3.5 hasta 2.9, presentando un consumo de slidos solubles bajo para dicha
produccin de metabolitos.
5.4.4 Azcares reductores residuales y contenido de etanol
Las fermentaciones con regulacin de pH presentan una menor cantidad de azcares
reductores al final de la fermentacin respecto a las fermentaciones sin regulacin. La
cantidad de azcares reductores al final de las fermentaciones es mnima, con valores
muy prximos a cero (0.00133 g/ml 0.00157 g/ml), concordando con el contenido de
sacarosa que fue de cero. De acuerdo a los resultados (Ver Tabla 4.14) la fermentacin
con regulacin de pH tiene una concentracin de azcares reductores 11% menor que
la concentracin en la fermentacin sin regulacin de pH, indicando que hay un mayor
77
consumo de azcares por las levaduras en una fermentacin con pH regulado para la
produccin de etanol, y en produccin de biomasa.
Respecto al contenido de etanol al final de cada fermentacin, se obtiene mayor grado
alcohlico en una fermentacin con regulacin de pH, un 25 % mayor que una
fermentacin sin regulacin de pH, de acuerdo a los resultados presentados en el
numeral 4.5.4. La menor produccin de alcohol en una fermentacin sin regulacin de
pH se debe a que en la fase inicial del proceso existe una mayor demanda energtica
por parte de la levadura para la produccin de metabolitos secundarios que disminuyen
el pH de un valor de 6.8 hasta valores aproximados de 4.0, lo que causa una
disminucin en el grado alcohlico. En si la levadura tuvo la necesidad de acidificar el
medio disminuyendo la produccin de metabolitos primarios (etanol) y con tendencia a
la produccin de metabolitos secundarios (cidos orgnicos).
Al regular el pH a lo largo de una fermentacin la levadura se adapt a las condiciones
dadas para producir mayor cantidad de alcohol y a su vez consumir los azcares
proporcionados obteniendo menor cantidad de azcares reductores residuales al final
de la fermentacin. La levadura en su metabolismo se adapta mejor al mantener
constantes las variables en el proceso tales como pH y temperatura, a pesar de no
manejar un pH ptimo. Esto se confirma de acuerdo a los antecedentes presentados
en fermentaciones realizadas en el Bioflo sin regulacin de pH, donde la fermentacin
desarrollada a 30 C el porcentaje de azcares reductores finales fue del 10.60 % y el
contenido alcohlico fue de 6.2 G.L y para una fermentacin a 25 C el porcentaje de
azcares reductores finales fue de 6.30 % y el contenido alcohlico fue del 7.0 G.L.
De acuerdo al contenido de alcohol, al utilizar el medio semisinttico con extracto de
levadura, dicho contenido fue mayor respecto a las fermentaciones que utilizaron el
medio a base de peptona debido a que el medio con extracto de levadura provee a las
clulas los nutrientes necesarios y adecuados para su crecimiento y produccin de
metabolitos (Alba y Sierra, 1999, 120).
El balance de consumo de azcares expresa de mejor manera las diferencias
presentadas entre una fermentacin con regulacin de pH y sin regulacin.
5.4.4.1
Balance de masa de azcar consumido en las fermentaciones
El balance de azcares representa la cantidad de azcares consumidos en respiracin,

fermentacin y el transformando en biomasa en una fermentacin alcohlica.
AZUCAR ADICIONADO AL MEDIO = AZUCAR CONSUMIDO EN RESPIRACION Y
PRODUCTOS SECUNDARIOS + AZUCAR CONSUMIDO EN FERMENTACION +
AZUCAR TRANSFORMADO EN BIOMASA + AZUCAR NO FERMENTADO O
RESIDUAL
Para efecto de expresar los clculos se presentan a continuacin tomando como
ejemplo la fermentacin 1 con regulacin de pH:
Azcar consumido en fermentacin: Se calcula a partir de la reaccin general de la
fermentacin presentada en la revisin bibliogrfica. Esta reaccin no incluye los
metbolitos secundarios producidos que no se tendrn en cuenta para facilitar los
78
clculos debido a que se encuentran en cantidades mnimas. De la fermentacin 1

con regulacin de pH se tiene 10 G.L de alcohol. Esto se expresa como 10
mililitros de alcohol en 100 mililitros de mezcla etanol agua. Para el fermento en el
volumen de 10 litros del Bioflo se tiene:
10000 ml Fermento x 0.10 ml (alcohol/ml fermento) = 1000 ml alcohol
La densidad de alcohol puro a 15 C es 0.793 g / ml
Gramos de alcohol = 1000 ml alcohol x 0.793 g / ml = 793 gramos de alcohol
producidos en la fermentacin.
De la reaccin general de fermentacin se tiene:
Gramos de glucosa consumida en la fermentacin =
Gramos de alcohol producido x 180 g glucosa / 92 g de alcohol =
793 g alcohol x 1.956 g glucosa / g alcohol =
1551 g glucosa consumido en la fermentacin
Azcar transformado en biomasa: La levadura Saccharomyces cerevisae contiene
un 45 % de carbono en base seca (Bonilla y Martnez, 1999, 89). El peso de una
levadura seca activa se puede hallar a partir del recuento inicial y la cantidad de la
levadura que se inoculo para iniciar la fermentacin as:
Para 10 litros de medio se inoculo 6 g de levadura seca
El recuento inicial de microorganismos se obtiene de la Tabla 4.11 para el da cero

de fermentacin y es: 2.26 x 1011 m.o
El peso de una levadura seca es igual a 6 g levadura inoculada/ 2.26 x 1011

levaduras = 2.65 x 10-11 g / levadura.
Gramos de carbono en una levadura = 2.65 x 10-11 g / levadura

1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura.
El azcar transformado en biomasa implica tomar el mayor recuento de

microorganismos durante cada fermentacin; para el caso de la fermentacin 1con
regulacin de pH se presenta el da cuarto. De acuerdo a esto se tiene: 1.41 x 1012
microorganismos y el contenido de carbono en ste conteo es:
x 0.45 =
Gramos de carbono final = 1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura x 1.41 x 1012 levadura
= 16.77 g Carbono
Gramos de carbono producido = Gramos de Carbono final Gramos de Carbono

iniciales = 16.77 g Carbono (6 g x 0.45) = 16.77 g C 2.7 g C = 14.07 g Carbono
producido en una fermentacin.
El contenido de carbono en la glucosa representa el 40 %. Los gramos de glucosa

que se transforman en biomasa son iguales: 14.07 g C x g glucosa /0.40 g carbono
= 35.17 gramos glucosa transformados en Biomasa.
Azcar no fermentado o residuales: De acuerdo a la Tabla 4.14 la concentracin de

azcares reductores residuales en la fermentacin 1 con regulacin de pH fue de
79
0.00133 gramos de azcar residual / mililitro de fermento. Para 10000 mililitros de

fermento = 13.30 gramos de azcar residuales.
Para el balance total el azcar adicionado al medio para cada fermentacin llevada a
20 Brix es de 2100 g. La conversin del azcar adicionado para expresarlo como
glucosa es: 2100 g sacarosa x (360 g glucosa/342 g sacarosa)= 2210.50 g Glucosa.
El balance general queda as:
2210.50 g glucosa adicionado = Azcar consumido en respiracin y productos
secundarios + 1551 g de azcar consumido en fermentacin + 35.17 g de azcar
transformada en Biomasa + 13.30 g de azcar residual
Azcar consumido en respiracin y productos secundarios = 611.03 gramos
La siguiente tabla presenta el balance de consumo de azcares para cada una de las
fermentaciones realizadas, junto con los porcentajes de consumo.
Tabla 5.6 Balance de azcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio
FERMENTACION
FERMENTACION 1
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 1
SIN REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
SIN REGULACION
DE PH
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
AZUCAR CONSUMIDO
EN FERMENTACION
1551
70.16
1551
70.16
1241
56.14
1241
56.14
AZUCAR
TRANSFORMADO EN
BIOMASA
35.17
1.59
35.14
1.58
19.48
0.88
22.03
0.99
AZUCAR RESIDUAL
13.30
0.60
14.10
0.63
15.70
0.71
15.10
0.68
AZUCAR CONSUMIDO
EN RESPIRACION Y
PRODUCTOS
SECUNDARIOS
611.03
27.65
610.26
27.63
934.32
42.26
932.37
42.17
CONSUMO
AZUCARES
AZUCAR ADICIONADO
2210.50
2210.50
2210.50
2210.50
Fuente : Autores
De acuerdo a los porcentajes de azcar consumido en fermentacin, no se alcanzo el
rendimiento reportado en la bibliografa del 95% debido a que la levadura tuvo una
tendencia a consumir azcares para el proceso de respiracin y la produccin de
metabolitos secundarios. El rendimiento se acerca ms al terico al regular el pH y es
menor al no regular el pH debido a la acidificacin que se presenta en el proceso.
Tambin este rendimiento no fue el mximo debido a que se manejo un medio
semisinttico en las fermentaciones y dicho rendimiento se basa en requerimientos
nutricionales ptimos para la levadura provedos por medios naturales como lo es un
mosto de uva.
80
El azcar consumido en respiracin y productos secundarios es un 52.80 % mayor en

una fermentacin sin regulacin de pH respecto a una que no regula pH, lo que indica
que en la fermentacin sin regulacin se producen una mayor cantidad de productos
secundarios diferentes al etanol, incluyendo el CO2 producido por respiracin, productos
secundarios que pueden ser txicos e inhiben el desarrollo de microorganismos, lo cual
se observa en el conteo de microorganismos en cada fermentacin y en la cantidad de
azcar transformado en biomasa, estableciendo que una fermentacin con regulacin
de pH presenta mejor eficiencia en la produccin de etanol y crecimiento de
microorganismos, observando que el consumo fue del 70.16 % de sus azcares para la
produccin de etanol y la fermentacin sin regulacin de pH solo consume el 56.14 %
del azcar adicionado para la fermentacin.
Si todo el azcar adicionado al medio se hubiera consumido, sin quedar azcar residual
al final de la fermentacin entonces este azcar se repartira en los porcentajes de
consumo de azcar respectivos para fermentacin, transformacin en biomasa y el
consumido en respiracin y productos secundarios. Tomando como ejemplo la
fermentacin 1 con regulacin de pH, el azcar consumido en fermentacin aumentara
e implica un leve aumento en el grado alcohlico final. De acuerdo a los valores de la
Tabla 5.5 el azcar consumido en fermentacin llegara a un valor de 1561 gramos,
resultando en un grado alcohlico de 10.06 G.L, determinado por el clculo de azcar
consumido en fermentacin explicado anteriormente, que implica un aumento solo del
0.60 % en el grado alcohlico, lo que indica que prcticamente todo el azcar
adicionado fue consumido en el proceso. Para las fermentaciones sin regulacin de pH
el azcar consumido en fermentacin llegara a 1250 gramos, resultando en un grado
alcohlico de 8.06 G.L sea un aumento del 0.75 %.
Como antecedente en fermentaciones realizadas en el Bioflo por anteriores trabajos de
investigacin se tienen los siguientes porcentajes de consumo de azcares para
fermentaciones a 25 C y 30 C sin regulacin de pH y sin agitacin.
Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azcares en diferentes fermentaciones en el
Bioflo
CONSUMO DE AZUCARES
FERMENTACION A 30 C
FERMENTACION A 25 C
% DE AZUCAR CONSUMIDO EN
FERMENTACION
42.54
54.12
% AZUCAR TRANFORMADO EN
BIOMASA
0.86
1.23
% AZUCAR CONSUMIDO EN
RESPIRACION Y PRODUCTOS
SECUNDARIOS
16.59
15.00
% AZUCAR RESIDUAL
40.00
29.50
Fuente: Tesis de lnea de investigacin en fermentacin. Universidad de La Sabana.
81
De acuerdo a los datos que se observan en la Tabla 5.6, el porcentaje de azcar

consumido en una fermentacin trabajada a 25 C es similar al obtenido en una
fermentacin trabajada a 25 C con agitacin y sin regulacin de pH (Ver Tabla 5.5); Al
agitar el consumo es mayor en un 3.53 % respecto a la fermentacin a 25 C sin
agitacin. Respecto a la fermentacin a 30 C la diferencia aumenta en dicho consumo,
siendo un 31.96 % mayor el consumo en la fermentacin a 25 C sin regulacin de pH
y con agitacin. Esta diferencia es mayor debido a que la temperatura de 30 C
disminuye la produccin de alcohol y la levadura pierde capacidad de desdoblar los
azcares (Alvarez, 112, 1991), lo que se explica en la gran cantidad de azcar no
consumido o residual en estas fermentaciones.
Al regular el pH a un valor de 4.5, bajo agitacin constante de 100 r.p.m. y temperatura
de 25 C, aumenta notablemente la cantidad de azcar consumido en fermentacin, ya
que el consumo es un 29.63 % mayor respecto a una fermentacin a 25 C sin
agitacin y sin regulacin de pH. Respecto a una fermentacin a 30 C bajo las
condiciones descritas para 25 C el consumo de azcar en fermentacin es un 64.92 %
mayor. Este significativo aumento del consumo de azcar se debe a la regulacin del
pH ya que la levadura se adapta mejor a la marcha fermentativa, tolerando
concentraciones mayores de alcohol y tambin a que el medio semisinttico con
extracto de levadura proporcion todos los requerimientos nutricionales en cantidades
suficientes para su metabolismo.
Otra diferencia notable es el consumo de azcares en respiracin, el cual es mayor en
fermentaciones con agitacin, regulando o no regulando el pH y a temperatura de 25 C
respecto a las fermentaciones que controlan nicamente la variable temperatura
realizadas por los trabajos anteriores en la lnea de investigacin. Esto se debe a que
la agitacin tiende a aumentar la cantidad de oxgeno disuelto en el medio y la levadura
continua empleando el metabolismo respiratorio.
Porcentajes de consumo de
azcares
Grfica 5.2 Comparacin de porcentajes de consumo de azcares para diferentes

fermentaciones en el Bioflo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Fermentacin a 25 C
Fuente: Autores
Fermentacin a 30 C
Fermentacin a 25 C, con agitacin y

pH regulado a 4.5
% Azcar consumido en fermentacin
% Azcar transformado en biomasa
% Azcar consumido en respiracin
% Azcar residual
82
5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulacin de pH

En las fermentaciones sin regulacin de pH no se realiz un ajuste inicial de pH. El pH
del medio al inicio de la fermentacin es de 6.8, cercano a la neutralidad y se acidifica
hasta el tercer da de fermentacin, bajando hasta un valor de 3.9. Esta baja de pH
obedece a la formacin de productos por parte de la levadura que acidifican el medio,
productos tales como cidos orgnicos provenientes del metabolismo (cido ctrico,
cido mlico, cido lctico), pero a partir del tercer da en adelante el pH se estabiliza
en valores de 4.0, debido al efecto buffer por parte del medio utilizado, ya que el
extracto de levadura es un medio complejo, que contiene protenas, aminocidos,
peptidos que ejercen dicho efecto en el medio.
5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS

DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL
CRECIMIENTO MICROBIANO
Al trabajar en el biorreactor una prueba inicial en sistema continuo para una

fermentacin alcohlica, la configuracin de las bombas peristlticas para entrada y
salida, se realiza de acuerdo a la gua presentada en el Capitulo 4. Lo normal en el
funcionamiento del Bioflo es que a una misma velocidad fijada para las bombas que
alimentan de medio y cosechan no existan diferencias en sus caudales, sin importar el
flujo que se alimente o desaloje del biorreactor o sin importar los puertos a los cuales se
conecten los tubos de silicona (de igual dimetro para salida y entrada). Las
diferencias presentadas en los flujos hacen que en el desarrollo del cultivo continuo
preliminar llevado a cabo, el flujo de cosecha sea mayor que el flujo de alimentacin de
medio al sistema (Ver Tabla 4.2), disminuyendo el volumen contenido en el vaso del
Bioflo a razn de 300 ml diarios aproximadamente, sin cumplir con el sistema
quimiostatico en el cual el volumen del sistema debe ser constante.
Para trabajar de manera correcta el Bioflo en sistema continuo como quimiostato se
deben corregir las diferencias presentadas en los caudales de entrada y salida a un
mismo porcentaje de velocidad de las bombas peristlticas. Confirmando el
comportamiento presentado en el desarrollo de la fermentacin en cultivo continuo, se
opt por determinar los flujos de entrada y de salida a diferentes velocidades de la
bomba peristlitica empleando como flujo agua, estableciendo que dichos flujos no son
iguales a la misma velocidad configurada en la bomba peristltica.
En si, el cultivo continuo en estado quimiostatico no se lleva a cabo debido a la
diferencia entre los flujos de alimentacin de medio y de cosecha o salida de flujo. Para
cumplir con el quimiostato se debe equilibrar las velocidades de las bombas de acuerdo
a las diferencias existentes (Ver Tabla 4.2) de tal forma que el medio de alimentacin
desplace, en un volumen igual, al medio agotado en el Biorreactor para conseguir una
produccin de clulas de forma continua. A causa de este comportamiento y para
efectos de estudio de lo que involucrara un cultivo en sistema continuo se emple el
modelo matemtico basado en la ecuacin de Monod para determinar la concentracin
83
de substrato limitante dada una tasa de dilucin y evaluar el crecimiento de clulas en el

quimiostato bajo condiciones de equilibrio.
De acuerdo a la teora, la tasa de dilucin en el quimiostato es igual a la tasa de
crecimiento en la que se presenta el equilibrio. En la tabla C.1 del Anexo C, se calcul
cada una de las tasas de crecimiento para un cultivo cerrado, y de la teora se tiene:
D= en equilibrio
Para que se presente el estado de equilibrio en el quimiostato es necesario fijar una
tasa de dilucin a partir de las tasas de crecimiento calculadas a largo de la fase
exponencial en una fermentacin con regulacin de pH. Para el desarrollo del modelo
de Monod, la tasa de dilucin se fijo a un valor de D = 0.011 h-1, que proviene del
intervalo de 24-48 horas de un cultivo cerrado, dado que en el primer da de cultivo la
tasa de crecimiento es mxima con un valor de 0.062 h-1 y posterior a las 48 horas de
cultivo la tasa de crecimiento disminuye notablemente hasta 0.003 h-1. La tasa de
dilucin fijada favorece el equilibrio de forma que no se presente una disminucin en la
poblacin de microorganismos debido a tasas de dilucin muy altas, que hace que el
cultivo sea lavado del quimiostato, o una deficiencia en la alimentacin de substrato por
tasas de dilucin muy bajas ya que el nutriente no llega con suficiente rapidez y las
clulas pueden morir por inanicin, extremos que no se deben presentar en el
desarrollo de un cultivo continuo.
De acuerdo a la Grfica 4.4 el valor de max se encuentra dentro del intervalo de
tiempo de cultivo de 0-24 horas, ya que despus de 24 horas de fermentacin viene un
estado de desaceleracin, por lo tanto max = 0.062 h-1 (tasa de crecimiento para
primer intervalo de Tabla C.1).
De la teora se tiene el modelo matemtico:
se = Ks x D / max D
donde Ks para Saccharomyces cerevisiae y como substrato limitante glucosa es 2.5E-5
g/ml (Trevan, 1990, 85). se es la concentracin de substrato limitante en el equilibrio.
De acuerdo a estos valores en la ecuacin se tiene:
se = 2.5E-5 g/ml x 0.011 h-1 / 0.062 h-1 0.011 h-1
La concentracin de substrato limitante en el equilibrio para el desarrollo de un cultivo
en sistema continuo se = 5.4E-6 g/ml. Para un volumen de 10000 ml en el biorreactor
se tiene una cantidad de 0.05 gramos de glucosa a lo largo del desarrollo de un sistema
continuo. La concentracin de clulas para el estado de equilibrio en el sistema
continuo se define por la siguiente ecuacin:
x e = Y ( SR s e )
El valor de SR es la concentracin original de substrato en el medio y equivale 0.22 g/ml
(Ver Tabla 5.6) y el valor de se es el ya calculado. Y es el factor de rendimiento para el
substrato limitante:
Y = gramos de biomasa producida / gramos de substrato consumido
84
De la Tabla 5.6 (datos del balance de azcares en fermentaciones en un cultivo

cerrado) se obtiene el valor de gramos de substrato consumido, el cual es el azcar
adicionado menos el azcar residual = 0.21 g / ml. Los gramos de biomasa producida
se obtienen de la diferencia entre los gramos finales de biomasa y los gramos iniciales
de biomasa (gramos de levadura inoculada). De acuerdo a esto para la fermentacin 1
con regulacin de pH los gramos finales de biomasa por mililitro son: 2.6E-11
g/levadura x 1.4E8 levaduras = 3.64E-3 g / ml y los gramos iniciales de biomasa
corresponden a lo inoculado que fueron 6.00 gramos / 10000 mililitros = 6E-4 g / ml. El
valor de Y es igual a 0.014. La concentracin de clulas es:
xe = 0.014 ( 0.21 g/ml 5.4E-6 g/ml )
El valor de xe es igual a 2.9E-3 gramos de biomasa / ml. Al dividir este valor entre el
peso de una levadura (2.6E-11g/levadura) se tiene el nmero de levaduras presente en
el equilibrio que es igual a 1.1E8 levaduras / ml.
En un sistema continuo de fermentacin se puede variar la tasa de dilucin y el valor de
max terico para la Saccharomyces cerevisiae esta comprendido entre 0.3 h-1 0.5 h-1
(Tuite, 1991, 125) para condiciones ideales de crecimiento. Para complementar el
anlisis del modelo matemtico, se evala el comportamiento de se y xe a partir de
valores ideales de max = 0.5 h-1 y tasa de dilucin muy altas D = 0.4 h-1. La siguiente
tabla ilustra los diferentes valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilucin y
max.
Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilucin y max para una
fermentacin en sistema continuo.
VARIABLES EN
SISTEMA CONTINUO
max = 0.062 h
-1
-1
max = 0.5 h
-1
-1
max = 0.5 h
-1
-1
D = 0.011 h
D = 0.011h
D = 0.4 h
se (g / ml)
5.4E-6
5.6E-7
1.0E-4
xe (g / ml)
2.9E-3
2.9E-3
2.9E-3
Fuente: Autores
De acuerdo a la tabla anterior la concentracin de microorganismos permanece
constante variando la tasa de dilucin en un amplio rango, pero la concentracin de
substrato residual en el equilibrio se aumenta 177 veces al aumentar notablemente la
tasa de dilucin, desde 0.011 h-1 hasta 0.4 h-1 y un valor ideal de max = 0.5 h-1. En el
rango presentado de tasas de dilucin la concentracin de microorganismos permanece
constante y la concentracin de substrato conserva un valor muy bajo, aumentando a
medida que se aumenta la tasa de dilucin.
CONCLUSIONES
El desarrollo de una fermentacin alcohlica bajo regulacin de pH a 4.5 y

temperatura constante de 25 C en el Bioflo 3000 M1227 present un mayor
rendimiento en cuanto a variables tales como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrgeno en la biomasa y contenido de etanol. El crecimiento de
microorganismos, el contenido de nitrgeno y el contenido de etanol fueron un
48.67%, 35.35% y un 25.00% respectivamente mayor con respecto a una
fermentacin alcohlica sin regulacin de pH y a temperatura de 25 C. El control
de la variable pH present una incidencia directa en el desarrollo de una
fermentacin alcohlica mejorando el rendimiento de acuerdo a la formacin de
producto y crecimiento de la levadura.
El medio de cultivo que present el mayor porcentaje de variacin de pH a lo largo

de una fermentacin en erlenmeyer fue el preparado a base de extracto de levadura
con fosfato de amonio y su rango de variacin de pH fue del 43.7% entre el pH
inicial y el pH final. El cido y base empleados en el funcionamiento del sistema de
regulacin de pH del biorreactor Bioflo fue el cido ctrico e hidrxido de potasio a
una concentracin de 5 N cada uno, ya que permiten un ptimo funcionamiento del
sistema de regulacin de pH en cuanto al tiempo de operacin empleado para
regular diferentes rangos de pH.
De acuerdo a los parmetros determinados en una fermentacin con regulacin de

pH, el crecimiento de microorganismos, contenido de nitrgeno en la biomasa,
consumo de sacarosa, variacin de slidos solubles, contenido de azcares
reductores residuales y contenido de etanol son reproducibles en el biorreactor ya
que presentan similitud en las dos fermentaciones realizadas.
Se elabor una gua complementaria de manejo y funcionamiento del sistema de

bombas peristlticas del Bioflo, dirigida al uso del sistema de regulacin de pH y
para el manejo de flujos de entrada y salida en el biorreactor a diferentes
velocidades de flujo.
Se estandariz la metodologa de determinacin de contenido de nitrgeno total

empleando un equipo de digestin destilacin BUCHI B-316 el cual present un
error del mtodo total del 2.49% y un error de la etapa de destilacin y titulacin del
1.46%, trabajando una curva de calibracin para rangos de contenido de nitrgeno
entre 0.002 g 0.23 g. Se realiz la estandarizacin del mtodo de determinacin
85
Conclusiones
86
de azcares reductores por titulacin de Lane y Enyon, el cual present un error del
0.62% para un rango de determinacin de azcares entre 0.109% - 0.363% (%p/v).
El biorreactor Bioflo no permite el montaje de un cultivo continuo en estado

quimiosttico debido a diferencias notables en los flujos de entrada y de salida.
RECOMENDACIONES
Despus de haber realizado el presente trabajo se sugiere:
Trabajar un fermentacin con pH regulado de 3.5, que de acuerdo a la teora es el

pH ptimo en el desarrollo de una fermentacin alcohlica, comparando sus
resultados con los obtenidos en el presente trabajo.
Trabajar con el Biorreactor una fermentacin alcohlica con diferentes substratos

para observar el efecto que tiene sobre el sistema de regulacin de pH del Bioflo.
Adems de los parmetros evaluados en una fermentacin alcohlica, se sugiere

determinar la acidez a lo largo de la fermentacin, relacionando esta variable con la
incidencia del pH, con o sin regulacin de pH.
Trabajar con el Biorreactor una fermentacin alcohlica con agitacin midiendo la

variable de oxigeno disuelto, observando su comportamiento en el proceso
fermentativo.
El biorreactor debe someterse a una revisin tcnica con el fin de establecer si

existe falla tcnica en cuanto al uso de las bombas peristlticas en flujos de entrada
y de salida en el Bioflo y lograr dar continuidad al trabajo de fermentaciones en
sistema continuo.
El biorreactor posee un sistema de configuracin de medidores de niveles los cuales

permiten determinar flujos de entrada y de salida del Bioflo y puede ser estudiado.
Respecto al trabajo en los laboratorios de la Universidad, se sugiere habilitar el

trabajo por lo menos los das Sbado con el fin de dar continuidad a un proceso que
requiera control diario.
Para efectos de eficiencia y economa en el uso del agua para la bomba de

refrigeramiento se recomienda instalar un sistema de recirculacin de agua.
Adaptar un sistema de esterilizacin para el vaso del Bioflo dentro del laboratorio de
Operaciones Unitarias con el fin de evitar posibles accidentes y mayor eficiencia de
la esterilizacin.
87
ANEXO A
DATOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
Tabla A.1 Datos de pH medido a 25C

M EDIO NATURAL
M EDIO SEM ISINTETICO

DIA
A
S1
B
S2
B
S3
B
N1
B
N2
B
N3
B
6.33
6.35
6.32
6.72
6.76
6.74
6.34
6.36
6.35
3.53
3.55
3.56
3.58
3.60
3.61
3.52
3.54
3.54
4.62
4.68
4.67
4.76
4.81
4.80
4.58
4.60
4.59
3.66
3.68
3.68
3.70
3.71
3.69
3.66
3.67
3.67
3.74
3.95
3.68
3.75
3.71
3.59
3.69
3.67
3.73
3.80
3.81
3.82
3.70
3.72
3.72
3.73
3.72
3.73
3.75
3.96
3.69
3.76
3.74
3.61
3.73
3.70
3.75
3.91
3.94
3.90
3.88
3.86
3.90
3.85
3.88
3.86
3.73
3.96
3.69
3.78
3.76
3.63
3.75
3.72
3.77
3.94
3.95
3.95
3.86
3.87
3.88
3.85
3.85
3.87
3.76
4.00
3.73
3.81
3.79
3.66
3.79
3.76
3.80
3.95
3.96
3.96
3.88
3.89
3.89
3.89
3.88
3.89
11
3.80
3.97
3.75
3.83
3.83
3.70
3.83
3.80
3.83
3.98
3.96
3.97
3.89
3.90
3.91
3.89
3.89
3.88
N3
B
Tabla A.2 Datos de conteo tomado a 20C

M EDIO NATURAL
M EDIO SEM ISINTETICO

DIA
N1
B
N2
B
S1
B
S2
B
S3
B
13.0
11.0
13.0
18.0
13.0
14.0
11.0
15.0
12.0
9.8
9.4
11.0
11.6
12.1
10.4
9.6
10.1
9.5
24.0
23.0
24.0
20.0
27.0
19.0
36.0
24.0
19.0
18.0
15.1
11.9
18.3
15.7
18.5
14.4
20.5
17.4
40.0
34.0
43.0
25.0
33.0
38.0
52.0
55.0
31.0
35.8
34.1
45.8
29.8
42.8
29.0
35.1
46.8
44.4
49.0
62.0
48.0
25.0
40.0
39.0
37.0
43.0
39.0
34.0
37.4
45.1
36.3
35.2
39.6
35.8
47.5
48.1
22.0
28.0
29.0
22.0
28.0
24.0
27.0
28.0
32.0
38.5
36.7
40.3
52.2
35.1
37.4
35.9
36.4
37.9
11
18.0
18.0
26.0
16.0 23.0
-1
19.0
25.0
24.0
26.0
49.1
39.8
42.1
60.4
46.2
33.2
42.6
35.6
30.4
Factor de Dilucin 10
Tabla A.3 Datos de slidos solubles totales a 20C

DIA
A
0 20.0
1 20.0
4 8.9
5 8.8
6 8.3
8 6.0
11 5.8
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
19.5 19.9 20.0 20.0 19.7 19.8 20.0 19.3 12.2 14.3 17.5 20.1 18.0 18.1 17.5 19.5 18.6
9.1 9.3 9.3 8.1 9.0 8.2 8.5 8.1 6.6 6.7 6.7 6.9 7.0 7.0 6.5 6.6 6.6
8.0 8.0 8.1 7.2 8.0 7.0 7.1 7.9 6.6 6.4 6.4 6.6 6.4 6.5 6.5 6.4 6.6
7.3 7.3 7.4 6.5 7.2 6.4 6.3 7.0 6.7 6.8 6.9 6.9 6.9 7.0 6.8 6.7 7.0
6.2 6.5 6.4 6.3 6.8 6.2 6.0 6.6 6.2 6.6 6.6 6.5 6.7 6.9 6.6 6.6 6.8
6.0 6.1 6.1 6.1 6.5 5.5 5.8 6.3 6.0 6.5 6.4 6.3 6.5 6.7 6.5 6.5 6.7
88
Tabla A.4 Porcentajes de variacin de pH da a da

Tabla A.5
Datos de parametrizacin de pH respecto a tiempo en cultivos
INTERVALO
DE DIAS
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
26.30
18.60
0.26
0.26
1.05
0.26
46.73
S2
28.90
23.10
0.54
0.54
0.80
1.06
54.94
S3
27.70
19.30
0.81
0.54
0.80
1.05
50.20
N1
3.38
3.81
2.88
0.76
0.25
0.25
11.33
N2
2.77
0.27
4.58
0.25
0.51
0.25
8.63
N3
3.96
1.63
3.48
0.00
0.77
0.00
9.84
MEDIOS
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PENDIENTE
0.555
0.673
0.578
0.066
0.042
0.053
CORRELACION
0.895
0.905
0.893
0.983
0.861
0.935
0_1
1_4
4_5
5_6
6_8
8_11
SUMATORIA DE %
preliminares
89
ANEXO B
DATOS DE FERMENTACIONES EN EL BIOFLO
Tabla B.1 Datos de conteo en cmara Neubauer Improved

P A R
D
T IC
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
P A R
D
T IC
F E R M E N T A C IO N
1 C O N
R E G U L A C IO N
U L A S
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
T R IP L IC A D O
P R
1
2
3
8 .5
9 .2
9 .5
4 0 .2
3 9 .5
4 1 .1
4 4 .5
4 2 .3
4 5 .3
5 4 .7
5 5 .8
5 4 .5
5 6 .3
5 7 .9
5 6 .1
4 8 .5
4 6 .2
4 7 .3
2 8 .8 5
2 9 .3
3 0 .8
2 7 .2
2 7 .5
2 8 .5
2 5 .4
2 4 .8
2 5 .8
F E R M E N T A C
U L A S
C O N T A D A S
T R
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
4
4
5
5
4
2
2
2
1 0
P A R
D
T IC
U L A S
T IC
U L A S
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
P A R
D
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
9
2
6
6
8
5
7
6
3
.
.
.
.
.
.
.
.
3
3
2
9
2
1
1
4
IO N
E N
2 C O N
R E G U L A C IO N
C A M A R A
N E U B A U E R
IP L IC
2
9 .
4 3
4 5
5 5
5 9
4 4
2 7
2 5
2 3
5
.5
.8
.8
.3
.3
.8
.3
.1
A D
D E
P H
IM P R O
O
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
0
4
5
6
7
9
7
5
E D
V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0 .5 1
0 .8 0
1 .5 5
0 .7 0
0 .9 9
1 .1 5
1 .0 2
0 .6 8
0 .5 0
IO
0 7
.2 7
.0 3
.0 0
.7 7
.3 3
.6 5
.7 3
.3 3
D E
P H
IM P R O
V E D
2 0 C
P R
3
9 .
4 2
4 7
5 7
5 8
4 4
2 6
2 5
2 2
8
.8
.1
.3
.5
.1
.2
.5
.8
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
2
6
6
8
4
7
5
3
E D
4 3
.8 7
.4 0
.4 3
.9 0
.5 3
.0 3
.6 3
.1 0
IO
E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4
6
6
7
4
5
8
4
3
0
0
6
8
0
9
0
2
0
1 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .5
9 .8
1 0 .2
9 .8 3
0 .3 5
2 8 .8
2 8 .6
2 9 .5
2 8 .9 7
0 .4 7
3 3 .5
3 4 .2
3 3 .1
3 3 .6 0
0 .5 6
3 8 .2
3 7 .5
3 8 .8
3 8 .1 7
0 .6 5
2 8 .2
3 0 .1
2 9 .5
2 9 .2 7
0 .9 7
2 6 .8
2 6 .2
2 7 .4
2 6 .8 0
0 .6 0
2 5 .1
2 4 .8
2 4 .2
2 4 .7 0
0 .4 6
2 1 .3
2 0 .8
2 2 .1
2 1 .4 0
0 .6 6
2 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .2
9 .4
9 .7
9 .4 3
0 .2 5
3 0 .1
3 0 .5
3 1 .2
3 0 .6 0
0 .5 6
3 5 .5
3 4 .8
3 6 .3
3 5 .5 3
0 .7 5
3 9 .8
4 0 .5
4 1 .1
4 0 .4 7
0 .6 5
3 0 .2
2 9 .7
3 1 .5
3 0 .4 7
0 .9 3
2 8 .1
2 7 .5
2 7 .3
2 7 .6 3
0 .4 2
2 6 .5
2 7 .1
2 5 .8
2 6 .4 7
0 .6 5
2 2 .8
2 3 .1
2 1 .9
2 2 .6 0
0 .6 2
90
Tabla B.2 Datos de Brix
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 8 .2
1 7 .8
1 7 .9
1 8 .0
1 4 .3
14
1 4 .2
1 4 .2
1 0 .6
1 0 .8
1 0 .6
1 0 .7
8
8 .2
8 .4
8 .2
7 .4
7 .4
7 .5
7 .4
7
7
7
7 .0
6 .5
6 .6
6 .5
6 .5
6 .1
6 .2
6 .2
6 .2
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.2
.1
.1
.2
.0
.0
.0
.0
0
1
5
2
0
6
0
6
6
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
P R O M E D IO
20
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
7 .8
7 .2
6 .8
6 .4
6
20
1 7 .4
1 4 .2
1 0 .1
8 .2
7 .3
6 .9
6 .3
5 .9
20
1 7 .6
1 3 .9
1 0 .2
8 .1
7 .2
6 .8
6 .4
6
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
18
1 4 .6
1 1 .5
7 .4
7 .2
6 .7
6 .4
20
18
1 4 .6
1 2 .2
7 .8
7
6 .8
6 .3
20
18
1 4 .8
1 1 .8
7 .9
7 .2
6 .8
6 .4
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 7 .2
1 7 .4
1 7 .3
1 7 .3
1 4 .2
1 4 .2
14
1 4 .1
1 0 .5
1 0 .1
1 0 .8
1 0 .5
7 .2
7 .2
7 .4
7 .3
6 .8
6 .9
6 .8
6 .8
6 .4
6 .4
6 .5
6 .4
6
6 .1
6
6 .0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.0
.2
.0
.0
.0
.0
0
0
5
6
1
6
6
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.1
.3
.2
.1
.0
.0
0
0
2
5
6
2
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.3
.1
.0
.0
.0
0
0
2
5
2
6
6
6
91
Tabla B.3 Datos de contenido de nitrgeno

D E T E R M IN A C I N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
P R O M E D IO
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.5
.4
.4
.3
.3
0
5
0
5
5
5
0
5
0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.5
.6
.4
.3
.3
.2
5
5
0
0
0
5
5
0
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.3
.4
.3
.3
.2
.2
0
0
5
0
0
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.3
.3
.2
.2
0
5
0
5
5
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
Tabla B.4 Consumo de cido y base por sistema de regulacin de pH

92
FERMENTACION 1
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
88
65
25
34
25
16
31
18
89
50
25
14
31
19
35
18
DIA
1
2
3
4
7
8
9
10
FERMENTACION 2
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
91
72
28
38
26
15
32
18
98
62
21
15
30
19
26
20
Tabla B.5 Datos de azcares reductores

DIA
FERMENTACION
1
FERMENTACION
2
10
41.0
38.2
FERMENTACION
1 SIN CONTROL
DE PH
FERMENTACION
2 SIN CONTROL
DE PH
VOLUMEN DE TITULACION (ml)
40.8
40.5
38.5
39.2
35.0
34.5
34.7
36.5 35.5. 36.0
Tabla B.6 Calculo de tasa de multiplicacin y n de generaciones de acuerdo a #

de clulas
INTERVALO
DE DIAS
N de Generaciones
FERMENTACION 1
TASA DE
MULTIPLICACION
N de Generaciones
FERMENTACION 2
TASA DE
MULTIPLICACION
0-24
0-48
0-72
0-96
2.1
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
2.2
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
N de Generaciones
FERMENTACION 1
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
N de Generaciones
FERMENTACION 2
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
1.6
1.8
2.0
0.07
0.04
0.03
1.7
1.9
2.1
0.07
0.04
0.03
93
ANEXO C
DATOS DEL SEGUIMIENTO DE UNA

FERMENTACION CON FLUJOS DE ENTRADA Y DE
SALIDA
El presente anexo presenta los resultados del estudio preliminar para el montaje
de un cultivo continuo en el biorreactor.
RESULTADOS
DE
LA
EVALUACION
DE
PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO
FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
BOMBAS
DE UNA
Previo al establecimiento de una fermentacin alcohlica con flujo de entrada de

nutriente y flujo de salida de cosecha, se determin la tasa de crecimiento de
acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo previamente trabajadas en el
Bioflo. La tasa de crecimiento se calcul para la fase exponencial.
= ln( xf / xi ) / t
Donde:
: Tasa de crecimiento
xf : Nmero de microorganismos da final
xi : Nmero de microorganismos da inicial
t : Intervalo de tiempo entre final e inicial
Para las cuatro fermentaciones realizadas se tiene el clculo de las tasas de
crecimiento durante la fase exponencial de crecimiento, la cual se presento
durante los primeros cuatro das de la fermentacin con control de pH y durante
los primeros tres das para la fermentacin sin control de pH.
Tabla C.1 Tasas de crecimiento para fermentaciones en sistema discontinuo
IN T E R V A LO
DE HORAS
TASA DE
C R EC IM IE N T O
FER M . 1 C O N
R E G U LA C IO N D E
P H (h -1 )
0-24
24-48
48-72
72-96
Fuente: Autores
0.062
0.011
0.003
0.001
TASA DE
TASA DE
TASA DE
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
FER M . 2 SIN
FER M . 1 SIN
FER M . 2 C O N
R E G U LA C IO N C O N T R O L D E P H (h - C O N T R O L D E P H (h 1
1
D E P H (h -1 )
)
)
0.063
0.011
0.002
0.001
0.045
0.006
0.005
0.049
0.006
0.005
De acuerdo a las tasas calculadas y a la teora que define que la tasa de

crecimiento es igual a la tasa de dilucin, y se calcul el flujo necesario para
desarrollar un sistema continuo de fermentacin. La tasa de dilucin a emplear es
la tasa de crecimiento para la fase exponencial. De acuerdo a esto se tiene que
para una fermentacin con control de pH la tasa de dilucin es igual a 0.011 h-1
por lo tanto el flujo para un volumen del sistema de 10000 mililitros es igual a 110
ml / hr 1.8 ml / minuto, para condiciones de equilibrio.
Resultados de una fermentacin empleando flujos de entrada y flujos de
salida
Para fijar los flujos de entrada de nutriente y de salida de producto o cosecha se
emplea el sistema de bombas peristlticas descrito en el numeral 4.1. Utilizando
el modelo matemtico para fermentaciones en sistemas continuos, se fij la tasa
de dilucin de acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo, siendo
necesario medir el crecimiento de microorganismos y confrontando el resultado
con contenido de nitrgeno y slidos solubles totales. Los resultados se presentan
a continuacin.
Tabla C.2 Resultados del seguimiento de una fermentacin con flujo de entrada y
flujo de salida
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
N M .O /m l
R a n g o s u p e rio r
2 .6 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .5 E + 0 7
1 .0 E + 0 8
8 .5 E + 0 7
7 .3 E + 0 7
7 .1 E + 0 7
5 .6 E + 0 7
5 .8 E + 0 7
R a n g o in fe rio r
1 .9 E + 0 7
4 .8 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .2 E + 0 7
6 .2 E + 0 7
5 .7 E + 0 7
3 .8 E + 0 7
5 .2 E + 0 7
4 .7 E + 0 7
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
m g N IT R O G E N O /m l.
0 .0 6 6 0
0 .1 9 8 5
0 .2 6 5 0
0 .3 3 1 0
0 .2 6 5 0
0 .2 4 8 0
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
S O L ID O S
SOLUBLES
T OT ALES
B R IX A 2 0 C
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
Fuente: Autores
De acuerdo al conteo de microorganismos se calcul la tasa de crecimiento que
define la tasa de dilucin necesaria para establecer los flujos de entrada y salida
en el Biorreactor.
Tabla C.3 Tasas de dilucin y flujos en la fermentacin con flujo de entrada y flujo
de salida
INTERVALO DE
HORAS
TASA DE
CRECIMIENTO (hr-1)
0-24
0-48
0-120
0-144
0-168
0-192
0-288
0-312
0.040
0.023
0.011
0.008
0.006
0.005
0.003
0.003
FLUJO(ML/MIN)
% VELOCIDAD DE
BOMBAS
PERISTALTICAS
FLUJO BIOFLO
COSECHA(ML/MIN)
3.88
1.79
1.24
0.92
0.75
0.42
0.37
40%
5%
15%
15%
15%
5%
15%
1.60
0.20
0.58
0.58
0.58
0.20
0.58
FLUJO BIOFLO
TASA DE DILUCIN
ALIMENTACIONML/
COSECHA (hr-1)
MIN)
0.010
0.001
0.004
0.004
0.004
0.002
0.005
1.25
0.18
0.48
0.48
0.48
0.18
0.48
TASA DE DILUCIN
ALIMENTACION (hr-1)
0.008
0.001
0.003
0.003
0.004
0.002
0.004
Fuente: Autores
Para el da final de fermentacin, se determin el contenido alcohlico y
concentracin de azcares reductores dando como resultado 10 G.L y 0.0218 g
azcar reductor/ mililitro.
El conteo de microorganismos se realiz tomando muestra directamente del vaso
del biorreactor y se observ que hasta el quinto da se asemeja a un crecimiento
exponencial similar a de un cultivo discontinuo(Ver Tabla C.2), notando que la tasa
de dilucin para el cultivo continuo se fij a partir del segundo da de fermentacin.
Entre el intervalo del quinto hasta el octavo da de fermentacin se not un
descenso desde 8.5E7 m.o/ml hasta 5.4E7 m.o/ml. Esto se debe a la diferencia
ya expresada para los caudales de entrada y salida de flujo del biorreactor, lo que
implica una diferente tasa de dilucin para la cosecha y alimentacin (Ver Tabla
C.3). Del da 8 hasta el da 13 donde se finalizo la fermentacin no existen
variaciones en el crecimiento de microorganismos ni variacin en el contenido de
nitrgeno. La grfica de nitrgeno por clula present un comportamiento
constante a lo largo de la fermentacin, lo que indica que el conteo realizado es
equivalente al contenido de nitrgeno durante la fermentacin. Para la curva de
grados Brix se observa que desde el da quinto hay una estabilizacin de los
mismos hasta finalizar la fermentacin en valores aproximados a 9 Brix. Esto
indica que solo hubo consumo de slidos solubles durante los primeros 5 das de
fermentacin en continuo. En los siguientes das es probable que la concentracin
de slidos solubles se mantuviera constante debido a la tasa de dilucin, que
alimenta de slidos al cultivo pero tambin los desaloja del biorreactor.
De acuerdo a los valores de tasas de dilucin para cosecha y para alimentacin,
se tiene que la tasa de dilucin fue menor que la tasa de crecimiento hasta el da
12 de fermentacin. El da 13 la tasa de dilucin tiene un valor mayor, tanto para
la alimentacin como para la cosecha, respecto a la tasa de crecimiento para el
intervalo de das de fermentacin. Los fines de semana la tasa de dilucin debi
adaptarse a un caudal bajo para lograr dar continuidad a la fermentacin, evitando

el desgaste del medio alimentador.
Tabla C.4 Datos de conteo en cmara Neubauer Improved
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
8.60
26.10
28.00
39.40
28.10
23.00
15.50
22.30
20.50
T R IP L IC AD O S
10.60
20.90
25.50
28.40
25.60
29.30
21.40
20.85
18.90
7.90
20.40
29.75
35.10
34.60
25.60
28.70
21.20
23.48
P R O M E D IO
9.03
22.47
27.75
34.30
29.43
25.97
21.87
21.45
20.96
DESV. ST D
1.40
3.16
2.14
5.54
4.65
3.17
6.61
0.76
2.32
Tabla C.5 Datos de Brix tomados a 20C

D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
P R O M E D IO
T R IP L IC A D O S
2 0 .0
1 8 .6
1 5 .8
9 .0
8 .4
8 .7
9 .0
8 .8
1 0 .0
2 0 .0
1 9 .0
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
9 .9
2 0 .0
1 8 .7
1 5 .8
8 .9
8 .6
8 .6
8 .9
9 .0
1 0 .0
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
Tabla C.6 Datos de contenido de nitrgeno

D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
T R IP L IC A D O S V O L U M E N H C L 0 .9 4 6 5 6 N ( m l)
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
P R O M E D IO
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
Grfica C.1 Curva de crecimiento de microorganismos
C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
N M.O/ml.
1 .0 0 E + 0 8
Fuente: Autores
1 .0 0 E + 0 7
10
11
12
13
14
T IE M P O ( D IA S )
N m e ro d e m ic ro o rg a n is m o s / m l
Fuente: Autores
Grfica C.2 Curva de contenido de nitrgeno
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O E N M IL IG R A M O S D E N /M L
0 .4 0 0 0 0
0 .3 5 0 0 0
mg NITROGENO/MILILITRO
0 .3 0 0 0 0
0 .2 5 0 0 0
0 .2 0 0 0 0
0 .1 5 0 0 0
0 .1 0 0 0 0
0 .0 5 0 0 0
0
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
Fuente: Autores
10
11
12
13
14
Grfica C.3 Curva de Grados Brix

B R IX A 2 0 C
25
20
BRIX
15
10
0
0
10
11
12
13
14
13
14
T IE M P O (D IAS )
Fuente: Autores
Grfica C.4 Contenido de nitrgeno por clula.

N /C E L U L A
1 .0 0 E -0 8
1
N(mg)/n microorganismos
1 .0 0 E -0 9
N /C E L U L A
Fuente : Autores
10
11
12
ANEXO D
SISTEMA DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL
BIOFLO 3000 M1227
Figura D.1 Bombas peristlticas
Figura D.2 Configuracin de bombas para salida de flujo del Bioflo
Figura D.3 Configuracin de bombas para entrada de flujo del Bioflo
Figura D.4 Configuracin de puerto de entrada de flujo en el Bioflo
Figura D.5 Configuracin de puerto de salida de flujo en el Bioflo
BIBLIOGRAFIA
1. ALBA D. y Sierra R. Determinacin de la incidencia de diferentes substratos en un

proceso de fermentacin utilizando Saccharomyces. Tesis de grado. Universidad
de La Sabana, Ingeniera de Produccin Agroindustrial, 1999.
2. ALEIXANDRE, J.L.
Revista Alimentaria.
composicin del un vino. Noviembre de 1998.
Factores que intervienen en la
3. ALVAREZ, Jos. La via, la vid y el vino. Editorial Trillas, Mxico, 1991.

4. BONILLA H. y Martnez V. Manejo y funcionamiento del biorreactor Bioflo 3000
M1227 en una fermentacin alcohlica a 30 C. Tesis de Grado. Universidad de La
Sabana, Ingeniera de Produccin Agroindustrial, 1999.
5. BROCK, Thomas y Madigan M. Microbiologa. Editorial Prentice Hall. Sexta
edicin, Mxico, 1993.
6. CRUEGER, W y Crueger A. Biotecnologa: Manual de microbiologa industrial.
Editorial Acribia S.A. Tercera Edicin, Espaa, 1991.
7. CURTIS, Helena.
Argentina, 1993.
Biologa.
Editorial Mdica Panamericana.
Quinta edicin,
8. DE ROSA, Tulio, Tecnologa de vinos blancos, Ediciones MP, Espaa 1998.

9. DORAN, Pauline.
1995.
Bioprocess Engineering principles. Editorial Academic Press,
10. GARCIA, QUINTERO, LOPEZ. Biotecnologa alimentaria. Editorial Limusa. Mxico,

1993
11. KRISTIANSEN, B. Integrated Design of a fermentation. Editorial VCH, Alemania,
1994.
12. LOPEZ, F y Guell C. Revista de alimentacin, equipos y tecnologa. Marzo de
1995.
105
Bibliografa
106
13. MADRID, A. Revista de alimentacin, equipos y tecnologa. Sistemas de control y

mejora de la fermentacin en la produccin de vinos. Marzo de 1991.
14. MERCHAN C. Y Castillo A. Manejo y funcionamiento del biorreactor Bioflo 3000
Bench Fermentor en tres fermentaciones alcohlicas a 25C. Tesis de Grado.
Universidad de La Sabana, Ingeniera de produccin Agroindustrial, 1999.
15. OWEN, Ward. Biotecnologa de la Fermentacin. Editorial Acribia S.A. Espaa,
1991.
16. Revista de alimentacin, equipos y tecnologa.
fermentacin. Junio de 1993.
Control en un proceso de
17. SUAREZ, J. A. Microbiologa enolgica. Editorial Mundiprensa. Espaa, 1990.

18. TREVAN, M. Biotecnologa: principios biolgicos. Editorial Acribia S.A., 1990.
19. TUITE, M. Saccharomyces. Biotechnology Handbooks. Editorial Plenum Press.
New York, 1991.

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DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH

REGULADO Y TEMPERATURA DE 25C EN EL

GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO

Proyecto de grado para optar por el ttulo de

Bogot D.C, 16 de Julio del 2001

A mis Padres por su paciencia y

A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma

RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV

EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES

2.2.3 Aireacin ----------------------------------------------------------------------------------------- 28

3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42

5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR

RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69

RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72

ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS

DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL

Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67

En la lnea de investigacin de fermentacin, se continu con el conocimiento en el

La facultad de Ingeniera de la Universidad de La Sabana adquiri un biorreactor para

1.1 OBJETIVO GENERAL

1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar mediante fermentaciones alcohlicas preliminares, qu medio de

Determinar la concentracin necesaria de cido y base a ser utilizada en la

Determinar la reproducibilidad de una fermentacin alcohlica en el biorreactor

Establecer una gua de manejo y funcionamiento del sistema de bombas

Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos

En ste captulo se presenta el marco terico para el desarrollo del siguiente

2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL

Aproximadamente el 96% de la produccin del etanol mediante fermentacin a

2 Etanol + 2 CO2 +ATP + Energa

El rendimiento terico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49

La gluclisis ejemplifica de que manera los procesos bioqumicos de una clula se

Figura 2.1 Secuencia de la gluclisis

Fuente: CURTIS, Helena. Biologa.

Va anaerbica o fermentacin: Los pasos por los cuales el cido pirvico,

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 molculas

Figura 2.2 Va anaerobia de la gluclisis

Fuente: CURTIS, Helena. Biologa.

Va aerbico o respiracin: En presencia de oxgeno, la siguiente etapa de la

Figura 2.3 Va aerbica de la gluclisis

Fuente: CURTIS, Helena. Biologa

La secuencia respiratoria completa es:

6 CO2 + 6 H2O + Energa

2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos

Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las

Figura 2.4 Relacin de concentracin de substrato y velocidad especfica de

Fuente: TREVAN, M. Biotecnologa: principios biolgicos.

Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de

Fase de muerte: Despus de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la

Grficamente, en escala semilogartmica se observa el comportamiento tpico del

Fuente: BROCK, T. Microbiologa.

Requerimientos nutricionales de la levadura

Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han aadido los

se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan

FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO

GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO

ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO3,

QUELATOS DE HIERRO, FeCl3

MnSO4, CuCl2, ZnCl2, CoCl2, NiCl2, Na2MoO4, Na2Se4

Fuente: BROCK, T. Microbiologa

Substratos utilizados como fuente de carbono

Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energa en la industria de la

Substratos utilizados como fuente de nitrgeno