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microbiologia clnica
(protocolos de siembra)
Normas bsicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra):
1. Volante de peticin debe estar bien cumplimentada (filiacin y datos administrativos
del
paciente,
datos clnicos,
datos
de
la
muestra, teraputica seguida, determinacin solicitada)
2. Tener constancia de que la obtencin de la muestra ha sido realizada correctamente,
siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, as como su recogida,
transporte y conservacin.
3. La siembra de dicha muestra se har en los medios idneos para cada caso, bien en
placa, por agotamiento y/o mtodo cuantitativo, o bien en tubo.
Procesamiento de las muestras
1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estril y ha de conservarse a 4C
en menos de 24 horas)
[a]
Agar
sangre,
chocolate
o
Cled/Cystine-Lactose-ElectrolyteDeficient (medios general y especifico para orinas) => se siembra en 3
direcciones/ cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS - para contar
colonias; realizar antibiograma); crecern todo tipo de germenes: cocos
Gram+, bacilos Gram-, levaduras; en Cled/AS no crecen cocos
Gram- (Neisseria,
Moraxella,
Chlamydia);
en
AS
se
comprueba las caractersticas hemolticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus
aureus (B hemoltico) y en Cled, las caracterstica lactosa (+) => amarillas o lactosa
(-) sin cambio de color => azul verdosas.
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por
agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo
para ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en
orinas); crecenbacilos Gram- => Enterobacterias y tambin Pseudomonas;
observaremos las caractersticas de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin
cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra
enla lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras
decitrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciacin
deEnterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los
[c] Agar Campylosel => crecer Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos)
como
colonias
pequeas
translucidas, sensibles
a Nalidixico
(especies C.
coli y C.jejuni)resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S,
ureasa (+) oxidasa (+)catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+)
y C.coli (-); P. hipurato=> un procedimiento cualitativo para determinar la
capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato
sdico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.
[d]
Caldo
Selenito =>
caldo
enriquecido
para
los
gneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la
mayora de la flora entrica excepto Salmonella spp.
[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern como
colonias
rojas
por
ser
lactosas
(+);
no
es
necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) =>
aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Grampleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno y las
vitaminas. El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte
inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayora de
las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este
organismo essensible a los entornos cidos. La alta concentracin de sodio favorece el
crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras
especies de Vibrio, cuya mayora es haloflica. La sacarosa (+) es un carbohidrato
fermentable, y el cloruro sdico estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una
fuente de azufre y acta con el citrato frrico como indicador para detectar la
produccin de cido sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son
indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).
[c]
Agar
Thayer
Martin
o
New
York =>
buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitisque aparecern como colonias de color
gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no
el
resto
de
los
azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias Bhemolticas y al fresco como bacilo pequeo, Gram variable, anaerobio facultativo,
oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las
especies estudiadas, ya que producen -hemlisis alrededor de las colonias. La hemlisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia
de G.vaginalis. Los antibiticos incluidos en el medio inhiben la mayora de los
contaminantes Gram- y de las levaduras.
[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp)
yTrichomonas (protozoo unicelular flagelado).
[f]
Agar
[g] Medio
Sabouraud (se
de
puede
deteccin
incluir
para
detectar Candidas
spp)
de Micoplasmas y Chlamydias
[e]
Agar
Sabouraud (solo
en
orales)
=>
deteccion
de Candidas
spp.
fetus,
Pseudomonas
y
Neisseria.
4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgenodependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno
equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21% - nada de O2). (Clostridium
botulinum).
5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxgeno pero su
metabolismo
es
siempre
fermentativo
(Lactobacillus)
yBacteroides.
11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la tcnica de Maki (rodamiento del
cateter)
[a] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, y podrn crecer bien
algunos
exigentes
como
el
Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecern bien casi todo tipo de grmenes y podr verse sus
caractersticas
hemolticas
si
las
tuvieran.
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se har un pase por Agar
chocolate.
[d] Tambin
puede ponerse
en una
placa
de agar MacConkey.
12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando
a 37C en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificacin.
- Presin osmtica en
general isotnia (300
miliosmoles)
- Presencia o ausencia de oxigeno; la mayora de las bacterias aerobias y
anaerobias son facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos
anaerobios estrictos; bacterias microaeroflica => produce mas CO2.
Principales
tipos
de
medios
de
cultivo
- segn su proporcin de agua / su consistencia (slidos, lquidos, caldo)
- segn su uso / su utilizacin (para aislamiento, crecimiento en general /recuento,
identificacion,
mantenimiento
de
cepas,
para
antibiogramas)
- segn su origen del que proceden (naturales, sintticos y semi-sintticos, complejos)
- segn su presentacin (deshidratados o liofilizados, slidos en placa petri, slidos en
tubo, lquidos en tubo, semi-slidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).
Medios
de
cultivo segn su proporcin en
agua:
- Medios slidos > 15% de agar; para aislamiento, identificacin, elaboracin de
antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y
existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse
su
alumno
usa
el
agar (medio
inerte).
- Medios lquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y
algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminocidos.
- Medios
semisolidos =>
agar
semi-slidos
(<5%
de
agar)
Medios
de
cultivo segn su
uso
o utilizacin:
- Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos +
caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate
{b}medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento
de algn tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus
faecalis/Gram+) contiene azida sdica que impide Gram-; la mayoria de medios
selectivos son tambin medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios
selectivos + sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j.
medio Levine (contiene eosina y azul de metileno que inhibe Gram+ y algunas Gram-,
facilita
a
las
enterobacterias
y lactosa(para
las
fermentadoras)
- Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el
crecimiento de la mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ;
e.j. el caldo comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y
agua);
el
caldo
Tioglicolato.
- Medios
de identificacin (= medios
diferenciales)
=>
sirve
para
clasificar taxonmica-mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol
positivo; caldo Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentacin de glucosa
(sacarolitico
=
sacarosa
positivo).
2. Medio
Chapman (selectivo
y
diferencial)
=>
aislamiento
de Staphylococcus (halfilos)S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro
sdico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado
por algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37C 24-48
horas => amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas
bioqumicas (coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el
color sigue rojizo o purpureo.
3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de
muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos
(Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y
aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe
los coliformes /Gram-,anfotericina => antifngico, trimetropinsulfametroxazol =>
antibitico de amplio espectro).
6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de
energa) para la investigacin de bacilos Gram- (la diferenciacin entre coliformes y
coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el
citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los
coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan
utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina); Comp: citrato
sdico, azul de bromotimol(indicador pH, de que el citrato esta consumido /se
alcalina; verde => azul); grmenes con citrato permeasa => Klebsiella pneumoniae,
Salmonella, Enterobacter aerogenes.
9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar)
=>investigacin de microorganismos hemolticos (consume hemates); es un medio
general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero =>
estriles y desfibrinadas; alfa hemlisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso
alrededor de la colonia; beta hemlisis/ Streptococcus B-hemoltico y Staphylococcus
aureus que
causan
anginas
(total)
=>
halo
transparente;
gamma
hemlisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.
10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y
diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter,
Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador
fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las
floras de Gram- fastidiosas).
11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de enterobacterias patgenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de
L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sdico y citrato frrico
amoniacal(indicador de la produccin SH2/H2S => puntos negro), azul de
bromotimol, fuschsina cida (indicadores de pH); en condicin normal es verde =>
fermentacion de lactosa/acidificacin => vira a amarillo/naranja (caractersticas
de fermentadora L+Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio
cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y despus se
basifican) => verde; cuando se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y
la colonia se vuelve negro (caracterstica de Salmonella y Proteus vulgaris).
12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo);
muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy
utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y
SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato frrico amoniacal y
tiosulfato sdico (componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los
grmenes productor de SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores
del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.
14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el
mtodo de Bauer-Kirby
16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el
aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora Gram+ y
Gram- excepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.
17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas
importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de
L),tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde
brillante(inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico de Shigella); Ly SH2+con la precipitacin de hierro => negro (tpico de Salmonella).
19. Medio
caldo
Columbia =>
caldos
para hemocultivos.
24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo
pruebas
de
API.
(3) Colonias de color azul-verdoso y observacin de bacilos Gram- mediante examen
directo
=> grupo
KES;
la identificacin se
debe
proseguir
mediante
pruebas bioqumicas
(ureasa+ =>
Klebsiella; ornitina
descarboxilasa+ =>
Enterobacter; gelatinasa+ =>
Serratia).
(4) Colonias incoloras a marrn-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas
colonias idnticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar
la coloracin despus de unos 30 segundos => TDA+ da una coloracin marrn +/oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o
Morganella); ausencia de coloracin azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da
una coloracin amarilla y la identificacin se debe proceder a las pruebas de API.
Metodos
de
inoculacin
y
aislamiento
de
microorganismos
1. Metodos
de
siembra
inoculacin:
{a} En medio liquido; con asa => se sumerge el asa cargada en el medio y se agita; con
pipeta => se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se
homogeneiza;
con
escobilln
=
con
asa.
{b} En
medio
solido (en
placa):
- Inoculacin previa al vertido en placa (tcnica de Barry - no se utiliza mucho) => 0,1
ml de inoculo + 25 ml de medio cultivo => fundido/ atemperado a 45-55C para no
esterilizar
=>
homogeneizar
=>
verter
en
la
placa
de
Petri.
- Inoculacin sobre la superficie del medio solidificado (tcnica de Kirby-Bauer) => se
prepara el inoculo en un tubo estril; se introduce un escobilln estril impregnando;
se elimina el exceso presionando el escobilln con movimiento de rotacin contra las
paredes del tubo; se siembra la placa emplenando la tcnica de los tres giros
distribuyendo uniformemente el inoculo; se deja secar la placa 4-5 minutos en posicion
semiabierta e invertida, quedando lista para ser utilizada (en los antibiogramas).
{c} En
medio
solido (en
tubo):
- Siembra por estria en superficie inclinada => se toma la muestra con el asa /hisopo;
se introduce en el tubo que contiene el medio; desde el fondo y en progresin
ascendente se desliza el asa en movimiento de zig-zag (se utiliza para pruebas
bioqumicas
y
renovar
cepas).
- Siembra en picadura (para ver la movilidad de los grmenes en la zona de puncin +
pruebas bioqumicas) => se toma la muestra con la aguja o hilo; se punciona en el
centro del medio introduciendo la punta de la aguja hasta 2-3 mm del fondo del tubo;
se extrae la aguja por la misma linea que se introdujo; medio solido inclinado
=> puede realizarse tambien una siembra en estra por la superficie del medio con la
misma aguja; agar semi-solido => puede usar el asa en lugar de la aguja.
enzima.
Ribosomas - son orgnulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y
procariotas) dan aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > sntesis de
protenas;estructura y composicion => en grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de
ARN mensaje (polirribosomas), cada ribosoma tiene 2 subunidades de 30 y 50
Svedberg (velocidad relativa de sedimentacin), procariotas - 70S y eucariotas - 80S;
comp:
60%ARNr
y
40%
protenas.
Elementos facultativos (algunos no tienen - variables) - son elementos de
supervivencia
y
virulencia
Inclusiones citoplsmicas - aparecen en el citoplasma y no tienen una estructura
uniforme; funciones => depsitos de reserva e intervienen en funciones de regulacin;
Tipos: (1) Grnulos de reserva => lipdicos, corpsculos metacromticos (fosfato
inorgnico), polisacridos (glucgeno y almidn), grnulos de azufre; (2) Vacuolas =>
acmulos de gases o lquidos rodeados de membrana (donde se fija CO2).
Flagelos - largos apndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia
es rara); funciones => responsable de la movilidad (elementos patognico: facilitar la
difusin
de
las
bacterias
a
traves
de
las
membranas); estructura =>
tres
partes
(filamento,
codo
y
corpsculo
basal); tipos =>montricas (1 solo flagelo en un extremo), loftricas (2 o mas en un
extremo), anftricos(un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro
extremo), pertricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);
Pelos /pilis o fimbrias - elementos rgidos constituidos por una protena (pilina);
cortos, muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que
en Gram+; funciones => capacidad de fijacin a superficies (pelos comunes),
proporcionan pelos comunes y sexuales (son morfolgicamente iguales), sistema
de intercambio de informacin gentica por conjugacin (pelos sexuales).
Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio
estricto); una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones
adversas (deficiencia nutricional, desecacin, frio, temperaturas elevadas, agentes
qumicos); se forman por un proceso de esporulacin /esporognesis, pueden
permanecer latentes durante cientos de aos y volver a una forma vegetativa por un
proceso germinacin;localizacin => zona central, subterminal o terminal (depende de
su tamao, pueden o no deformar el bacilo); la espora => clula en reposo con
capacidad de resistencia a la desecacin, calor y agentes qumicos; esporulacin => la
produccin de estructuras, enzimas y metabolitos nuevos y la desaparicin de muchos
Tema
10
Fisiologa
de
las
bacterias
TAXONOMA
CLASIFICACIN
DE
LAS
BACTERIAS
La clasificacin definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan
actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada
suelen ser recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9 edicin de Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados
en
4
categoras
mayores:
1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categora
se incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patologa humana.
Espiroquetas:
Familia Leptospiraceae (genero
- Leptospira)
Familia Spirochaetaceae (genero
- Borrelia,
Treponema)
Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerfilas mviles (crecen mejor a
bajas
presiones
de
oxgeno):
Familia Campylobacteriaceae (genero
- Campylobacter,
Helicobacter)
Bacilos y cocos aerobios - microaerfilos (crecen mejor a bajas presiones de
oxgeno):
- Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas)
- Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos
Familia Legionellaceae (genero
- Legionella)
Familia Neisseriaceae (genero
- Neisseria)
=>
diplococos
Familia Moraxellaceae /
Familia Branhamaceae (genero
- Moraxella,
Branhamella)
=>
diplococos
Otros
generos
=> Brucella (cocobacilos)
Bacilos
anaerobios
y
facultativos:
- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Klebsiella, Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia,
Salmonella,
Shigella,
Yersinia/peste)
Familia Vibrionaceae (genero
- Vibrio,
Aeromonas,
Plesiomonas)
Familia Pasteurellaceae (genero
- Haemophilus)
Otros
generos
=> Gardnerella
Cocos
Gramanaerobios =>
genero
- Veillonella
- Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parsitos
intercelulares
obligados,
altamente
pleomrficas
cocos/bacilos/hilos
- Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parsitos intercelulares
obligados
de
forma
esfrica.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan
patologia
humana
(la
mayoria).
Cocos =>
genero
- Staphylococcus
y
Streptococcus
normal
de
la
piel,
boca
vas
respiratorias
superiores
- Las
principales (en
faringe
y
traquea)
=> Staphylococcus
epidermiditis (coagulasa-),Staphylococcus
aureus (coagulasa+)
en
pequeas
cantidades, Micrococcus spp, Neisseriade especies no patgenas, Estreptococos Ahemolticos y
no
hemolticos,
las
anaerobias
facultativas, Candidas.
- FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los cidos grasos de las
secreciones sebceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes;
se disminuye de forma temporal => la repoblacin es muy rpida.
- Al nacer => la boca y faringe son estriles; tras 12 horas => Streptococcus
viridas (las mas abundantes en la boca), posteriormente => estafilococos
(S.epidermiditis), diplococos Gram-, difteroides (Corynebacterium); salida de
dientes => espiroquetas de Bacteroides, Fusobacterium e Actynomicetes, vibrios
anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto normal => las principales (mira arriba!!)
Los
bronquios,
bronquiolos
y
alvolos
suelen
ser
estriles.
Flora
normal
del
tracto
intestinal
- Al nacer => estril, posteriormente => colonizado por microorganismos de los
alimentos dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y
Lactobacilosy
el
bibern
=> flora
mixta con
menos
Lactobacilos)
.
- Adulto normal => el esfago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el
estomago hay poco (pH acido protegen la clera y salmonelosis - excepto Helicobacter
pilori que puede causar ulcera pptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez:
degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene Lactobacilos y
enterococos; intestino delgado inferior (leon y ciego) contiene la flora fecal; el
coloncontiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides
spp, Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp, cocos
Gram+
anaerobios
(Peptostreptococcus
spp).
- La utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformacin de los pigmentos
biliares en cidos biliares, absorcin y metabolismo primario de nutrientes.
- La administracin de anti-microbianos orales => la posible proliferacin de
cepas resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada.
- La administracin de ATB por va parenteral en una ciruga intestinal => necesario
para reducir al mnimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto
quirrgico
y
infeccin
peritoneal
e
diseminada.
Flora
normal
de
la
uretra
- Los mas frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no
patgenas, enterobacterias (la mayora son pobladores de la piel que recubre esta
zona).
- En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar
una
muestra.
Flora
normal
de
la
vagina
- Al nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce pH acido),
posteriormente el pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y
bacilos,
hasta
la
pubertad.
- En la pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que produce
cidos por su metabolismo de hidratos de carbono => cambio a pH acido (proteccin a
los
otros
microorganismos
potencialmente
patgenos.
- En la mujer adulta esta colonizada ademas de los anteriores (Lactobacillus
acidophillus - aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no
hemoliticos) y otros; el moco cervical contiene lisozima con actividad bactericida.
- En la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos
y
bacilos.
- La administracin de antibiticos de amplio espectro, puede eliminar las especies
protectoras, producindose una multiplicacin excesiva en la vagina de levaduras
(candidas)
u
otras
causantes
de
vaginitis.
Flora
normal
de
la
conjuntiva
del
ojo
Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y
estreptococos no hemolticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la
flora lo ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.
vistos en un microscopio ptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa
del vaco que ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de
investigacin). El poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que
microscopio ptico; emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio ptico <
200
nm
fotones:
400
700
nm
longitud
de
onda.
Microscopio electrnico de barrido (MEB) no tiene tanto poder de resolucin
como el de transmisin, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de
campo y genera unas imgenes que producen una gran sensacin de tri
dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3 modelo que une las caracteristicas de los 2
anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.
Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la
movilidad y la disposicin bacteriana en una muestra se debe observar los grmenes
vivos a partir de cultivos jovenes (lleva pocas horas), que permiten visualizar mejor su
movilidad
y
su
preparacin
en
fresco.
Condiciones
que
debe
cumplir
para
este
fin:
cantidad
de
muestra
adecuada
(ni
mucho
ni
poco)
la
muestra
recogida
en
condiciones
de
esterilidad
- adecuadamente distribuida en el portaobjetos (amplia y homognea)
cantidad
de
agua
o
colorante
adecuada
- para la fijacin por calor => no debe calentarse demasiado (no quemar el dorso de la
mano
y
la
gota
+/-consumida)
=>
para
hacer
tincion
- seguir el mtodo o tcnica adecuada, se trabaja con limpieza y orden, evitando
cualquier
contaminacin.
Tcnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre
portaobjetos y cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y
con
tincin
vital.
Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF
colocandolo en un portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su
morfologa (cocos o bacilos), disposicin/agrupacin y motilidad; Material =>
portaobjetos, microscopio, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra,
mechero Bunsen o de alcohol (para flamear el asa de siembra), muestra de
microorganismo
problema,
agua
destilada
estril,
vaselina
(opcional).
Tcnica - Mtodo de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:
preparar
portaobjetos
y
cubreobjetos
limpios
y
desengrasados
- depositar una gota de agua estril en el portaobjetos (50ul/lambdas)
- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del
microorganismo
y
suspenderla
en
la
gota.
- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensin un cubreobjetos,
evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensin.
observar
al
microscopio
con
objetivo
de
40
aumentos.
Mtodo de examen en fresco sobre gota pendiente en porta excavado:
- colocar en el centro de un cubreobjetos una gota de la suspensin microbiana con una
asa
de
siembra
estril.
- colocar vaselina en los bordes del pocillo del porta excavado
- invertir el cubre sobre el porta excavado, colocandolo encima del rea cncava del
portaobjetos.
- la vaselina adherir el cubre al porta formando una cmara evitando su evaporacin y
corrientes
de
aire.
se
invertir
la
preparacin
observar
al
microscopio
con
objetivo
de
40
aumentos.
Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se
producen cuando se desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha
corriente en dicha direccin; el sellado con vaselina evita este problema.
Coloracin vital - es una tcnica intermedia entre los exmenes en fresco y las
tcnicas de tincin despus de fijacin previa???; consiste en teir las muestras
bacterianas con colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular
parcialmente dichos colorantes; la dilucin debe ser muy altas para que no resulten
toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales grmenes; material =>
microscopio, asa de siembra estril, portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de
filtro,
una
suspensin
de
muestra
problema,
aceite de inmersin, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo
neutro en solucin acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solucin
acuosa
al
1:1.000
o
1:500).
Tcnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos
limpio y desengrasado una gota de suspensin muestra junto con otra gota del
colorante diluido utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el
cubre objetos con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al
microscopio con objetivo de inmersin; resultados => los microorganismos se
visualizaran vivos y ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como
colorante el rojo neutro o de color azul si se utiliza el azul de metileno.
Ventajas
de
las
tcnicas
de
tincin:
- observar mas adecuadamente su morfologa y permite diferenciar entre los distintos
tipos
- dar informacin complementaria de sus estructuras internas y/o externas que no se
observa
en
fresco.
- al conocer sus caractersticas tintoriales, nos orienta hacia un grupo u otro en la
clasificacin
bacteriana.
Factores
que
afectan
a
toda
tcnica
de
tincin:
- pureza del colorante (a + impurezas => + error y - calidad en la tincin).
- concentracin del colorante (valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%)
- pH del colorante (en general son neutro +/- 7 o entre 6,8-7,4)
conservacin
del
colorante
elaboracin
(no
lo
hacemos
/vienen
preparadas)
- tcnica empleada (material limpios y seguir los pasos de la tcnica)
temperatura
(en
general
la
ambiental)
cantidad
de
muestra
(representativa
y
homognea)
- realizar correctamente el frotis (fijarlo bien, en general por calor => coagula las
proteinas bacterianas, para que no se arrastre con el colorante mordientes y
decolorantes)
- soluciones mordientes (ayudar a fijar el colorante a las estructuras microbianas, p.ej.
lugol
en
la
Gram)
tiempos
de
tincin
(segn
el
colorante
que
usemos)
Principales tcnicas de coloracin - clasificacin de colorantes => [1] segn su
origen (naturales y artificiales) [2] segn su comportamiento qumico (cidos, bsicos
y
neutros).
Colorantes naturales - extrado de plantas como la hematoxilina (del tronco de una
planta que por oxidacin produce hematena; el azul de ndigo (de una
leguminosa);extrado de animales como el carmin (de una cochinilla)
Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrn de
hulla(colorantes anilina cidos, bsicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta,
violeta de genciana, fucsina bsica, acido pcrico, azul de metileno, etc.
Tcnica
de
tincin
los
pasos:
-realizar un frotis y fijacin por calor (generalmente), con la intensidad de calor
adecuada
que
soporte
el
dorso
de
la
mano.
-coloracin segun el tipo de tincion (generalmente con colorantes basicos que tien
estructura
acida)
-decoloracin que permite diferenciar distintos grupos bacterianos (genero
Micobacterium son resistentes a la decoloracion cida/BAAR); Gram- decoloradas con
el alcohol 96/alcohol acetonas, alcohol acido, acidoclorhidrico => micobacterias
-lavado siempre entre paso y paso con agua destilada para evitar interferencias entre
un
producto
y
otro.
-coloracin de contraste (generalmente cido), se aplican al final para las estructuras
decoloradas
con
el
decolorante,
p.ej.
safranina.
-observacin
al
microscopio
Tipos
de
tinciones
bacterianas:
(1) Tincin simple => fijacin previa, se utiliza 1 solo colorante, permite la
visualizacin de la morfologa y la agrupacin bacteriana; clasificacin => tinciones
simples con colorantes bsicos, cidos y neutros; se basa en => la afinidad de los
colorantes que suelen ser de tipo bsico (azul de metileno, violeta de genciana, azul de
toloudina => 1-2 minutos, dan color azul a las celulas o fucsina fenicada diluida => da
color
rojo
a
los
componentes
celulares.
(2) Tincin negativa => es un tincin simple (1 solo colorante => tinta china o
solucin acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijacin previa (no
mata las bacterias), permite observar caractersticas estructurales de la bacteria
ademas de su morfologa sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej.
los neumococos;se basa en => colorante acido cargado negativamente, los
microorganismos no se tien (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teido
oscuro); para obtener una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y
evitar a formarse grietas al secarse el colorante) se puede hacer una extensin con el
borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen) en
forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.
(3) Tinciones diferenciales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza 2
colorantes (el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfologa y caractersticas
estructurales (composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloracin
cida
(t.Gram
y
t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza al
menos 2 colorantes, nos permite observar su morfologa y caractersticas estructurales
como esporas, flagelos, cilios, capsulas, corpsculos metacromticos (utiliza 1 solo
colorante???).
Tincin diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando
trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tincin diferencial;
es mas empleado en bacteriologa, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-);
distinto comportamiento debido a la distinta composicion de la pared de las celulas
bacterianas; se emplea como el primer colorante bsico (cristal violeta o violeta de
genciana) que teir de color azul violeta todas las bacterias, posteriormente
un mordiente el lugol que aumenta la afinidad del primer colorante a las celulas (lo
fijara), finalmente unagente decolorante que decolora solamente un tipo de bacterias
(Gram-) que sern teidas con el colorante de contraste o segundo colorante (la
safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color azul violeta sern Gram+.
mechero de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tincin (punte), frasco lavador, muestra
problema, aceite de inmersin, colorantes para la tincin de Gram.
Tcnica:
- realizar la preparacin de frotis => extender 1 gota de agua destilada estril + una
colonia de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto
fijacin
por
el
calor,
pero
no
quemar
las
bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2
minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- aadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solucin iodoiodura de potasio con
OH
de
96
o
con
acetona
a
5/1
o
con
OH
50%)
vuelve
a
lavar
con
agua
el
exceso
decolorar
con
solucin
decolorante
(alcohol
90)
lavar
abundantemente
con
agua
cubrir
el
portaobjetos
con
la
safranina
durante
1
minuto
- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire
observar
con
objetivo
de
inmersin
(100x).
Tincin de grmenes del acido alcohol resistentes (BAAR + criptococo)
A. Tincin
de
Ziehl-Neelsen
Este mtodo fue desarrollado por Ehrlich en 1882 trabajando con bacilo de Koch y
mejorado posteriormente por Ziehl-Neelsen; objetivo => diferenciar del resto, las
bacterias tipos BAAR (bacterias acido alcohol resistentes, p.ej. Mycobacterium), debido
a su gran cantidad de componentes miclicos (lipoideos y cereos/cera) que forman
parte de la pared de este tipo de bacteria (los colorantes convencionales no penetran en
el interior de estas bacterias); De ah se necesitan colorantes altamente concentrados y
la presencia de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; una vez
teidas, su decoloracin posterior no es posible (resiste incluso a decoloraciones
cidas); dicha tincin se emplea principalmente para el diagnostico y estudio de
enfermedades
como
tuberculosis
y
la
lepra.
Material => es el mismo que esta descrito en la tincin simple, pero en cuanto los
reactivos: 1 colorante - solucin fenicada de fucsina bsica (carbo fucsina), 2
colorante de contraste - solucin hidro-alcohlica de azul de metileno fenicado, 3
decolorante alcohol
acido
al
3% (97%
alcohol).
Tcnica => preparacin de frotis y fijacin calor; cubrir el frotis con fucsina fenicada
bsica 5 minutos aplicando en este tiempo calor, hasta la emisin de vapores, evitando
que se caliente demasiado o que se seque el colorante; lavar abundantemente con agua
destilada hasta arrastrar el colorante; decolorar con alcohol acido para arrastrar restos
del colorante (10-30 segundos); lavar abundantemente con agua destilada; cubrir el
frotis concolorante de contraste /azul de metileno fenicado 30 segundos sin necesidad
de calentar, para teir aquellas bacterias que no son resistentes a la decoloracin (se
han decolorado) y resaltar el color rojo de los BAAR+; lavar, secar, rotular y observar
con
objetivo
de
inmersin.
Resultados => con el 1 colorante, BAAR- y BAAR+ (ambas) se tien de rojo; con el
decolorante, BAAR- se decoloran y BAAR+ no se decoloran; con el 2 colorante (de
contraste), BAAR- setien de azul y BAAR+ permanecen de color rojo/ acido alcohol
resistencia+
(bacilos
Mycobacterium
y
algunos
Nocardia)
B. Mtodo de Kin Youw modificado (coloracin en fri) Reactivos => 1
colorante: fucsina fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloracin a 3%, 2 colorante:
azul de metileno fenicado (con fenol); tcnica => idntica, salvo para la fucsina de KY,
dejamos actuar 5 minutos sin calentamiento; existen otras tcnicas de tincin de los
BAAR => tincin de auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia.
Tincin
de
espiroquetas
(para
las
espiroquetas)
Tincin estructurales => tincin de esporas, de flagelos, de cilios (similar a flagelos,
pero corto y se extiende por todo el cuerpo, como pilis), de corpsculos
metacromticos
y
de
capsulas.
Tincin especiales => tincin de auramina y de naranjo de acridina.
Reduccin =>
captan
electro
nes.
obteniendo agua; oxidacin de glucosa => acido pirvico + 1ATP (no producen acido
lctico
ni
acido
mixto)
Respiracin - es un proceso fosforilacin oxidativa de generacin de ATP y se
caracteriza por el aceptor final de electrones generalmente es una molcula inorgnica
(O2); la glucosa se degrada => acido pirvico se sigue oxidando por la va de la
respiracin o la fermentacin (en funcin del sistema enzimtico que tienen) => ATP +
CO2 + H2O; durante la respiracin, cualquier molcula orgnica puede ser
degradada /oxidada con un mayor rendimiento que en la fermentacin.
Respiracin aerbica - cuando el aceptor final de Hidrgenos (electrones) es el O2;
en la respiracin, el acido pirvico producido por la gluclisis se escinde en 2 partes:
una parte se unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde
se liberan electrones y protones (H+); la otra parte para biosntesis???
Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmtica de
las celulas procariticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las celulas
eucariticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una
molcula inorgnica como O2 en la respiracin aerbica o hasta una molcula
inorgnica diferente del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las
moleculas transportadoras de electrones son 3 tipos => [1] flavoprotenas realizan reacciones de oxidacin reduccin, [2] citocromos - protenas con un grupo
prostticos (Fe) en forma oxidada, [3]ubiquinonas o coenzima Q - transportadores no
proteicos
de
bajo
peso
molecular.
Respiracin anaerbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una
sustancia inorgnica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4,
carbonatos
CO2-3.
(Pseudomonas
y
Bacillus)
Fermentacin - proceso que se inicia a partir de acido pirvico formado en la
gluclisis de EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto
orgnico y no requiere O2; caractersticas principales => (1) no precisa O2, pero
se puede ocurrir en su presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs ni cadena
transportadora de electrones,(3) utiliza 1 molcula orgnica como aceptor final de
electrones, (4) libera energa a partir de azucares y otras moleculas orgnicas
(aminocidos, cidos orgnicos, purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2
moleculas de ATP por cada molcula del sustrato inicial, (6) los productos finales
pueden ser acido lctico, etanol y CO2, acido propinico, acido actico, CO2 y agua,
acido butrico, etc. (compuesto orgnico); cuando el aceptor final de electrones es el
lactato, se producir acido lctico y en general cuando el aceptor final sean otras sales
orgnicas, se formaran cidos mixtos p.ej. acido succnico, que son responsables de la
cada de pH en las pruebas empleadas, para la identificacin bacteriana; ademas, las
La
aplicacin
fundamental
es
la
diferenciacin
de
Enterobacteriaceae =>Escherichia (+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no
fermentadora y Klebsiella (+) es una fermentadora tarda de lactosa, es decir lactosa (-)
y ONPG (+); para detectar la enzima B-D-Galactosidasa => se utiliza un compuesto
similar a la lactosa (orto-nitrofenol): al liberarse al medio alcalino por la accin de
BDG
produce
un
color
amarillo.
Material => 1 tubo de ensayos estriles, bao mara o estufa a 37C, asa de siembra,
solucin fisiolgica esteril, discos de ONPG, microorganismo problema
Tcnica => una suspensin densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml
de suero fisiologico estril se aade un disco de ONPG y mezclar durante unos
segundos, incubar a 37C durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30
minutos)
Resultados => en ONPG+ se produce una coloracin amarillo y en ONPG- no se
produce color (incoloro).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y
asas de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de
cultivo
(Hektoen
y
SS);
Material =>
pruebas
de
API,
pipeta
Pasteur.
Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequea cantidad en su
composicion una pequea cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y
purpura de bromo cresol, pH6); aminocidos ensayados en forma L, muestra de
problema
y
papel
parafina.
Tcnica => se aade una gota del inoculo (suspensin microbiana) en cada pocillo de
la
prueba
de
API;
se
incuba
a
35C
durante
18-24
horas.
Resultados => durante las primeras horas de incubacin, el caldo vira a amarillo, por
la fermentacin de glucosa que lleva el medio; pero si el aminocido es descarboxilado,
el pH vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura
(descarboxilasa+); si se queda amarillo sera descarboxilasa-; grmenes con
descarboxilasa+ (Escherichia no es 100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y
Ornitina):
- Lisina => Klebsiella,
Serratia,
Salmonella
- Ornitina => Serratia,
Proteus,
Salmonella
- Arginina => Salmonella, Pseudomonas
Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plstico, papel de
filtro,
porta,
reactivo
oxidasa
de
Kovacs.
Tcnica => mezclar una pequea muestra pura con el reactivo en el papel de filtro
que se sita por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible
cambio de color; otra manera: se aade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs
sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y tambin en otro medio; si son
oxidasa positivo toman un color marrn y en seguida pasan a negro parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el
color a los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, despus de 60" es
negativo; oxidasa-no
se
produce
color.
Pruebas
de
catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental
que acta sobre el perxido de hidrgeno /H2O2 (es un producto final de la
degradacin aerobica oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos
grmenes moriran; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se
pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O + O2; aplicacin =>
diferenciacin deStreptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);
Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plstico (las de platino
catalizar
la
reaccin)
Reactivo =>
H2O2/
agua
oxigenada,
microorganismo
de
problema
Tcnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto,
simultneamente, con una asa se aade una colonia del cultivo del microorganismo de
12-24
horas,
homogeneizar
y
observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no
aparecen burbujas; se podrn observar falsos positivos si se utilizaran medios de
cultivo agar sangreo otros que lleven hemates (los hemates contiene catalasa).
Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API)
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es
productor de H2S (acido sulfhdrico) este impide la formacin de color; tcnica =>
hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el
medio; incubar a 37C durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,
observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rpido, ya que el
color puede desaparecer); si no se forma color, se aade al tubo un poco de polvo de
Zinc;resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y
Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al aadir el
reactivo A y B que indica la reduccin de nitratos a nitritos; [2] al aadir polvo de zink
no se desarrolla color indica formacin de otros productos nitrogenados; Nitratasa- =>
cuando se forma color rojo o rosado al aadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.
Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de
la ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinizacin de un medio
liquido; la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea => carbonato amnico, que sube el
pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicacin => diferenciar Proteus (+) de
otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o bao mara.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color mbar) y microorganismo de
problema
Tcnica => con el asa estril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24
horas; inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar
37C; la
reaccin
se
produce
entre
1-4
horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color mbar vira a rosa fuerte durante el
tiempo de reaccin (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de
Klebsiella,
Enterobacter,
Brucella,
requieren
6
das
de
incubacin.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa)
- observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitacin al ponerse en
contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la
coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en
plasma;aplicacin => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+,
beta hemoltico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el
germen es coco Gram+, catalasa+, beta hemoltico +; tcnica => (usando el kit
comercial /prueba de ltex) seguir la instruccin de la casa comercial que hacen el
reactivo; resultados =>coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un
plasma como reactivo => se observara la formacin de un hilo de fibrina en la
reaccin) y en coagulasa- no se forma grumos.
color naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el
tubo
(grmenes
inertes).
Produccin de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del
medio del fondo del tubo, debido a la formacin de hidrgeno y de anhdrido carbnico
(CO2)
Produccin de acido sulfhdrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa
profunda o un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un
precipitado negro en la capa profunda (que puede enmascarar la acidificacin del
medio => fermentacin de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y
Salmonella.
TSI (Triple Sugar Iron) - identificacin de Yersinia enterocolitica como sacaroltica
(tambin Proteus, Lactobacillus y Clostridium), ya que el medio lleva el 3er hidrato de
carbono (sacarosa al 1%); los fundamentos y la interpretacin de los resultados son los
mismos que en el mtodo anterior, pero es imposible saber si el azucar utilizado es uno
u otro o ambos.
del medio; VP negativa (-)p.ej. E.coli y Proteus, la superficie del medio queda de color
amarillento o cobrizo (la reaccin de los reactivos al mezclarse); la mayora
de enterobacteriaceas en VP dan reacciones opuestas a la reaccin de RM (VP+ =>
RM- o VP- => RM+); las bacterias VP+ producen menor cantidad de cidos mixtos que
sern insuficientes para bajar pH del medio con rojo metilo, por ello, cuando una
bacteria es RM- => VP+.
Micro-tcnicas
1. Sistema
en
Tiras
(API
Biomerieux)
El material y reactivos necesarios para la realizacin de estas pruebas se encuentran
comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se
re-hidratan mediante una suspensin de 5 ml de agua estril con 1 colonia bacteriana y
se incuban; el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en
el medio de cultivo o al aadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas
de lectura o ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del
fabricante); principalmente se utiliza para la deteccin de Enterobacteriaceas,
bacterias aerobios no-fermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; despus de
utilizar todo debe ser incinerado o descontaminado en autoclave o sumergido en un
germicida.
2. Sistemas
en
Tubos
(entero-Tube
BBL)
Se
utiliza
para
identificacin
de
Enterobacteriaceas
y
otras
aplicaciones; fundamento => un tubo en forma de lpiz con numerosos
compartimentos (normalmente son 8 con diferentes medios, donde pueden leer hasta
11 caractersticas); este tubo se inocula (con 1 colonia del medio y alambre de la
inoculacin atraviesa todas las cmaras) y se incuba, produce cambios de color en cada
compartimento; mediante un cdigo numrico o colorimtrico, se puede identificar al
microorganismo.
3. Sistema
rpidos
metodos
automatizados
Cuando las muestras son procesadas a traves de metodos automatizados se logran
excelentes resultados en tiempo muy cortos (se deben seguir las normas dadas por los
fabricantes);
- Para deteccin primaria del crecimiento (espectrofotometra infrarroja) => detecta
los
niveles
de
anhdrido
carbnico
(CO2),
p.ej. BACTEC
- Para identificacin (fotometra) => VITECK (crecimiento, identificacin y
antibiograma)
germen; normalmente CMI es suficiente para combatir una infeccin y los mecanismos
inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el
termino
mas
utilizado.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentracin mxima de ATB que
se puede localizar en el lugar de la infeccin no es suficiente para eliminar el germen,
es decir,la concentracin de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar
mas
por
efectos
txicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis
normales de ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la
infeccin sin llegar a dosis que produzcan efectos txicos, puede eliminar el germen.
Derivados
de
betalactmicos:
6.
Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta sobre
la
pared
celular (se
usa
en infeccin
urinaria)
* Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin
sobreStaphylococcus
aureus.
7. Tetraciclinas - son bacteriostticas y su mecanismo de accin es inhibir la sntesis
de las protenas; no se deben administrar a menores de 8 aos por tener efecto
secundarios sobre la denticin y los huesos; tambin pueden producir toxicidad
sobre el tracto gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biolgico o
semi-sinttico;activas frente a cocos y bacilos Gram+ y Gram- aerobios;
son frmacos de eleccin en
brucelosis, clera,
granuloma
inguinal (ETS).
* Tetraciclina
* Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones
pustulosas porRicketsias y fiebre de las montaas rocosas por Ricketsias, infecciones
del tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de
infecciones causadas por Gram-: chancroide causado por Haemophilus ducreyi, plaga
debida a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), clera causada por Vibrio
cholerae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos
causadas por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada
por
especies
de Brucella (junto
con
estreptomicina), bartonelosis causada
por Bartonella bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium
granulomatis.
8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la sntesis proteica y es toxica a
nivel medular; es de origen sinttico, bacteriosttico, acta frente a Gram+ y (especialmenteHaemophilus
influenzae y Salmonella)
9. Macrolidos y similares - inhiben la sntesis proteica; amplio espectro; se
dan cuando es alrgica a penicilina; son bacteriostticos y bactericidas en alta dosis.
a. Eritromicina (un buen ATB frente neumnia atpica, legionelosis, difteria, tos
ferina)
b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la
bronquitis; neumona; enfermedades de transmisin sexual (ETS); y las infecciones en
los odos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningn efecto sobre los resfriados, la
gripe
y
otras
infecciones
virales.
c. Claritomicina - interfiere la sntesis de protenas en las bacterias sensibles;
faringitis, amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudizacin de bronquitis crnica,
neumona bacteriana (adquirida en la comunidad), infeccin de piel y tejidos blandos
leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infeccin localizada o diseminada
porMycobacterium avium o M.intracellulare, infeccin localizada por M.chelonae, M.
fortuitum y M.kansaii. Prevencin de infeccin diseminada por M.avium complex en
pacientes
con
VIH
de
alto
riesgo
10.
Quimioterpicos
de
sntesis
a. Sulfamidas (es bacteriosttico, de origen sintetico; inhibe la sntesis de acido flico;
activo
frente
Gram+
y
-,
Clamidias,
Nocardia)
b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la sntesis de acido flico;
elimina las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan
las
vas
urinarias,
los
pulmones
(neumona),
odos
e
intestinos
c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacion del ADN bacteriano son buenos ATB de
amplio
espectro,
pero
se
ha
abusado
mucho.
d. Norfloxacina - infecciones de las vas urinarias y la prstata; inhibe
la replicacin del ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de
antibiticos llamadosfluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que
desarrolle
tendinitis.
e. Ciprofloxacina - inhibe la replicacin del ADN bacteriano; para tratar o prevenir
determinadas infecciones bacterianas, tambin se usa para tratar o prevenir el
ntrax (una infeccin grave que se puede propagar en forma intencional como parte de
un ataque bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los grmenes del ntrax
suspendidos en el aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle
tendinitis.
11.
Quimioterapia
antituberculosa actualmente
se
emplea:
* Rifampicina - ATB sistmico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la sntesis de ARN
bacteriano.
Tuberculosis
en
todas
sus
formas
(asociado
a
otros
tuberculostticos).Brucelosis. Erradicacin
de
meningococos
en
portadores
asintomticos, no enfermos. Alrgicos o con contraindicaciones a otros antibiticos o
quimioterpicos. Infecciones causadas por estafilococos (S.aureus, S.epidermidis,
cepas
polirresistentes)
y
porenterococos (S.faecalis,
S.faecium).
* Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido
contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina slo las bacterias activas (en
crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un perodo de incubacin (sin
crecimiento) durante largos perodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos
para evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6
y
12
meses).
* Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjuncin
con
otros
frmacos
antituberculosos.
12.
*
*
*
*
Quimioterapia
Amfotericina
antimictica:
Nistatina
Miconazol
B.
Fluconazol
13.
Quimioterapia
anti-viral
* Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicacin de
ADN
viral,
interfiriendo
con
el
ADN
polimerasa
viral.
* Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interfern, para tratar la
hepatitis C en personas que no han sido tratadas con interfern antes. La ribavirina
pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados anlogos de nuclesidos.
Esta acta impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del
cuerpo.
Pasco...)
Antibiticos - un grupo de compuestos qumicos teraputicamente muy tiles y
queantao se
caracterizaban
por
ser subproductos
metablicos
de
un
microorganismo siendo casi siempre letal para otros grmenes (p.ej. a los hongos);
actualmente la mayora son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros
es descubierto en 1927, cuandoAlexander Flemming descubri la penicilina
extrayendo-lo de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectu los
primero ensayos de sensibilidad anti-microbiana (se contaminaron las placas sin
querer por un hongo); en 1939 Rose y Miller intentaron estandarizar las mltiples
variantes de los anlisis de sensibilidad microbiana por difusin en placa y
posteriormente en los aos 50, Kirby-Bauer y Anderson estandarizaron la tcnica que
se utiliza actualmente por difusin en medio solido o en placa.
Los
principales
pruebas
para
hacer
un
antibiograma:
a.
Manuales
1.
Prueba
de
dilucin
en
medio
solido
y
liquido
2.
Prueba
de
elucin
en
disco
3.
Prueba
de
deteccin
enzimtica
4.
Prueba
de
difusin
en
medio
solido
(de
Kirby-Bauer)
b. Automatizadas