Discusin y resultados.

En este laboratorio se extrajo y se cuantific el cido desoxirribonuclico

(DNA), a partir de clulas de levadura y se observ el efecto de la variacin del
pH, el calor, el formaldehdo, el NaCl y el dimetilsulfxido (DMSO) sobre sus
propiedades.
Primero se realiz la extraccin del DNA. Se pesaron 2,506 g de clulas de
levadura y 5 gramos de arena lavada, luego, se llevaron a un mortero
(previamente enfriado en la nevera) y se moli vigorosamente durante 5
minutos. Esto se hizo para romper la membrana celular. El slido se pas a un
erlenmeyer y se agregaron 15 mL de disolucin salina de EDTA, se agit y se
agreg 1 mL de SDS. El DNA se suspendi en EDTA para suspender la accin de
nucleasas, y el SDS, que es un detergente, ayuda a solubilizar los
constituyentes membranosos y, de esta manera, completar la destruccin de la
envoltura celular. El SDS tambin ayuda a disociar las protenas del DNA.
El erlenmeyer se llev a un termostato a 60C durante 10 minutos. Se enfri a
temperatura ambiente, se agregaron 2,5 mL de perclorato de sodio
sobresaturado, se mezcl y luego se agregaron 20 mL de cloroformo-alcohol
isoamlico. El de perclorato de sodio sobresaturado, ayuda a disociar las
protenas del DNA. El cloroformo y el alcohol isoamlico, se utilizan para
precipitar la protena liberada. Se tap el erlenmeyer y se agit
magnticamente por 15 minutos. Luego, se transfiri toda la mezcla a tubos de
centrfuga. Se equilibraron por peso y se centrifug a 4500 por 15 minutos.
La fase ms densa corresponda a la de cloroformo y el DNA se encontraba en
la capa superior, por lo cual, se retir con cuidado la capa acuosa superior
amarilla con una pipeta Pasteur, evitando el precipitado copioso que quedaba
en la interfase. La fase acuosa se coloc en un erlenmeyer y agregaron
lentamente 35 mL de etanol sobre la solucin. El etanol fue agregado para
separar la fase acuosa. Se mezcl suavemente con una varilla de vidrio y luego
se centrifug a 2.500 rpm durante 5 minutos. Luego, se descart el lquido.
Se disolvi el DNA en 4 mL de agua que contenan 0,2 mL de buffer EDTA
salino. El volumen final fue 3,95 mL.
La absorbancia a 260 nm, qued por fuera del rango de lectura, por lo cual se
hicieron dilucines para leer la absorcin. Los datos obtenidos se relacionan en
al siguiente tabla:
Dilucin
0,2x10
0,2x100
0,2x1000

Absorbancia a 260 nm
3,20
0,363
0,046

Teniendo en cuenta la informacin de la tabla anterior, se prepar la solucin

stock 1, tomando 2,2 mL de la disolucin del DNA extrado y mezclndolos con

70 mL de NaCl 0,15%, su absorbancia fue 0,971 a 260 nm y 0,480 a 280 nm.

Se realiz la lectura a estas longitudes de onda, ya que las bases nitrogenadas
de los oligonucletidos tienen una absorbancia mxima a 260 nm y las
protenas tienen mxima absorbancia a 280 nm, debido principalmente a los
residuos de aminocidos aromticos. De manera que la relacin Abs 260 nm/
Abs 280 nm es una medida de la pureza de la preparacin del DNA, para este
caso la relacin es 2,02, as se puede decir que se tiene un preparacin pura de
ADN.
Los cidos nucleicos tienen conformaciones ordenadas, entre las que
prevalecen las estructuras helicoidales. Ciertos tratamientos alteran la
estructura ordenada del DNA, lo cual puede evaluarse midiendo la radiacin
ultravioleta que absorbe la solucin. El incremento en la absorbancia por la
desnaturalizacin del DNA es conocido como el efecto hipercrmico. La
absorcin UV aumenta ya que se altera la conformacin, las fuerzas
estabilizadoras se debilitan, las dos cadenas comienzan a separarse, las bases
purnicas y pitimidnicas quedan expuestas y ms accesibles a la radiacin
incidente. De manera, que se evalu el efecto de los tratamientos que ms
adelante se mencionarn por absorcin UV.
Para determinar el efecto del pH sobre el DNA de doble hlice, se tomaron 6
tubos y se agreg en cada uno:

Luego, se midi la absorbancia a 260 nm, empleando el tubo B como blanco

para ajustar el 0 de absorbancia. La tabla 1 muestra los datos obtenidos.
Tubo
pH
Abs

0
8,5
0

1
8,5
0,388

2
9,5
0,422

3
10,5
0,424

Tabla 1
Con los datos de la tabla 1 se obtuvo, entonces la grfica 1.

4
11,5
0,467

5
12,5
0,531

0.6
0.5
0.4
Absorbancia a 260 nm

0.3
0.2
0.1
0
5

10

15

pH

Grfica 1
En la grfica 1 se observa que entre los pH contemplados, el 8,5 es en el cual
el DNA muestra mayor estabilidad y a partir de este se observa el efecto
hipercrmico. En esos pH alcalinos, se produce un cambio de carga de diversos
sustituyentes en las bases nitrogenadas, as se elimina la posibilidad de que
esos grupos formen puentes de hidrgeno.
Tambin se observ el efecto del calentamiento y el enfriamiento rpido. Para
lo cual se tomaron 8 tubos y se agreg en cada uno disolucin stock 1 de DNA
y buffer de borato 0,05 M, pH ,5, en las cantidades que se indican en la
siguiente tabla:
7
1,5
1,5
85

8
1,5
1,5
92

Los tubos se sometieron a calentamiento, a la temperatura indicada en la tabla

anterior, por 15 minutos, al cumplirse el tiempo de calentamiento, se pasaron a
un bao de agua-hielo. Se agitaron para lograr un enfriamiento rpido y
homogneo, luego se dejaron llegar a temperatura ambiente y se midi la
absorcin a 260 nm, ajustando el cero de absorbancia con una mezcla de 1,5
mL de buffer borato 0,05 M, pH 8,5 y 1,5 mL de NaCl 0,15%. Los datos
obtenidos de encuentran relacionados en la tabla 2.
Tubo
Temperatura
(C)
Abs

20
37
60
70
80
0,47 0,51 0,53 0,54
4
8
5
6 0,569

82

85
0,59
0,572
3

92
0,599

0.7
0.6
0.5
0.4
Absorbancia a 260 nm 0.3
0.2
0.1
0
0

50

100

Temperatura (C)

Grfica 2.
La grfica 2 no representa el comportamiento esperado, ya que se esperaba un
comportamiento similar al mostrado en la siguiente figura:

En la que se observa que la absorcin de la luz ultravioleta a 260 nm aumenta

bruscamente en un intervalo pequeo de temperatura. El punto medio de ese
intervalo suele conocerse como T m (temperatura de fusin), a la cual se
desnaturaliza la mitad de la estructura helicoidal. La temperatura de fusin
depende de la composicin de las bases de la molcula de DNA, las molculas
ricas en pares GC tienen temperaturas de fusin ms elevadas que las ricas en
AT. Las absorbancias correspondientes a las temperaturas 85C y 92C, que
son menores a las absorbancias esperadas, dado el comportamiento de la
curva, pueden atribuirse a un descendimiento lento de la temperatura por
debajo de la Tm, de tal manera que las hebras complementarias de DNA
separadas se reasociaron espontneamente para formar nuevamente la doble
hlice.
Ahora se contempla el efecto del calor y el formaldehdo. Para lo anterior se
prepararon 8 tubos con los reactivos y las cantidades mostradas en la siguiente
tabla:
7
1,5
1,5
85

8
1,5
1,5
92

Luego de cumplir con el tiempo de calentamiento, los tubos se pasaron a un

bao hielo-agua para lograr un enfriamiento rpido, hasta que alcanz la
temperatura ambiente, y se ley la absorcin a 260 nm. Como blanco para
ajustar el 0 de absorbancia, se prepar un tubo con 1,5mL de buffer con
formaldehdo 2 % y 1,5mL de NaCl 0,15%. Los datos obtenidos se muestran en
la tabla 3.
Tubo
Temperatura
(C)
Abs
Tabla 3.

20
0,474

37
0,518

60
0,535

70
0,546

80
0,569

82
0,572

85
0,593

0.7
0.6
0.5
0.4
Absorbancia a 260 nm 0.3
0.2
0.1
0
0

50

100

Temperatura (C)

Grfica 3.
El formaldehido reacciona con el grupo amino libre de las bases nucleosidas,
formando derivados de metilol y consecuentemente desnaturalizando el DNA.
La desnaturalizacin es fcilmente detectada midiendo la hipercromicidad del
DNA a 260 nm. De manera que los datos obtenidos y la grfica 3, permiten
evidenciar el efecto hipercrmico esperado.
Para evidenciar el efecto del calor y formaldehido en sal 1M, se prepararon 8
tubos con los reactivos y las cantidades mostradas en la siguiente tabla:
7
1,5
1,5
85

8
1,5
1,5
92

Luego de cumplir con el tiempo de calentamiento, los tubos se pasaron a un

bao hielo-agua para lograr un enfriamiento rpido, hasta que alcanz la
temperatura ambiente, y se ley la absorcin a 260 nm. Como blanco para
ajustar el 0 de absorbancia, se prepar un tubo con 2mL NaCl 0,15% y 2mL de
buffer con formaldehdo 2 % y NaCl 0,15%. Los datos obtenidos se muestran en
la tabla 3.
Tubo
Temperatura
(C)
Abs
Tabla 4

20
0,489

37
0,488

60
0,513

70
0,501

80
0,514

82
0,512

85
0,545

0.56
0.54
0.52
Absorbancia a 260 nm

0.5
0.48
0.46
0.44
0

50

100

Temperatura (C)

Grfica 4
Con el aumento de la fuerza inica los puentes de hidrgeno (intraccatenarios
e intercatenarios) se reconstituyen al azar, de manera que en un medio con
fuerza inica elevada, el DNA desnaturalizado se agrega. En esta parte del
experimento se esperaba ver el efecto combinado del desnaturalizante
(formaldehdo) del DNA con el NaCl, que aumenta la fuerza inica. Se obtuvo la
grfica 4 con los datos experimentales, pero en estos no se observa una
tendencia clara, ya que se esperaba el efecto hipercrmico dado por la
desnaturalizacin causada por el formaldehdo

En todos los experimentos se hizo un enfriamiento rpido, para las cadenas

permanecieran

Solubilidad DNA
http://books.google.com.co/books?
id=E6XFouOOv38C&pg=PA56&dq=DNA+soluble+agua&hl=es419&sa=X&ei=ORFDVL_MAcPJggTp7YEY&ved=0CBoQ6AEwAA#v=onepage&q
=DNA%20soluble%20agua&f=false