Cromatografa de gases

Introduccin
A pesar de que, como ya se ha indicado, la cromatografa es bsicamente una tcnica de
separacin, su gran capacidad para resolver muestras complejas ha conducido a utilizarla
cada vez ms como tcnica analtica. Esta utilizacin, ha conducido al desarrollo de una
instrumentacin, que utilizando siempre la separacin por elucin, puede operar en
continuo, con mayor eficacia en la separacin y con un mayor control de las condiciones
cromatogrficas para incrementar la reproducibilidad de los resultados.
Entre las tcnicas cromatogrficas utilizadas con fines analticos, la cromatografa de gases
es probablemente la tcnica de ms amplia utilizacin; ninguna tcnica analtica puede
ofrecer su capacidad de separacin o su sensibilidad a la hora de analizar compuestos
voltiles. Por otra parte, el hecho de que con esta tcnica las mezclas sean separadas en fase
gaseosa, establece los lmites de su utilizacin, que estarn marcados fundamentalmente
por la estabilidad trmica de los compuestos a separar. Por lo general, la utilizacin de la
cromatografa de gases est restringida a la separacin de compuestos con un peso
molecular menor de 1000 a una temperatura mxima de trabajo de aproximadamente 400
EC; dentro de estos lmites, como ya se ha mencionado, la nica limitacin existente ser la
estabilidad trmica de la muestra.
Para realizar una separacin mediante cromatografa de gases, se inyecta una pequea
cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura;
esta corriente de gas, atraviesa una columna cromatogrfica que separar los componentes
de la mezcla por medio de un mecanismo de particin (cromatografa gas lquido), de
adsorcin (cromatografa gas slido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de
ambos. Los componentes separados, emergern de la columna a intervalos discretos y
pasarn a travs de algn sistema de deteccin adecuado, o bien sern dirigidos hacia un
dispositivo de recogida de muestras.

Descripcin del equipo

El esquema general de un cromatgrafo de gases se muestra en la figura.
Los componentes fundamentales de un cromatgrafo de gases, son:
- Fuente de gas.
- Sistema de inyeccin.
- Horno y columna cromatogrfica.
- Sistema de deteccin.
- Sistema de registro.

Detectores

Sistema de deteccin.
A continuacin se describen las caractersticas ideales del detector para la cromatografa de
gases y posteriormente se analizaran los sistemas de deteccin ms utilizados. En algunos
casos en los cromatgrafos de gases se acoplan a los instrumentos espectroscpicos como
los de infrarrojo. En estos casos el dispositivo espectromtrico sirve no slo para detectar la
aparicin de los analitos, sino tambin para identificarlos.

Caractersticas del detector ideal.

Este detector tiene las siguientes caractersticas:
1. Sensibilidad adecuada: Lo que constituye una sensibilidad adecuada no puede evaluarse
de forma cuantitativa, esto debido a que algunos de los detectores
no son satisfactorios a ciertos casos los menos sensibles no son adecuados para algunas de
las aplicaciones. La sensibilidad de los detectores debe encontrarse en un intervalo de 10^-8
a 10^-15 gramos de soluto/segundo.
2. Buena estabilidad y reproductibilidad.
3. Respuesta lineal a los solutos que se encuentran a varias rdenes de magnitud.
4. Intervalos de temperatura: Este intervalo de temperatura va desde la Tamb. hasta al
menos 400C.
5. Independiente a la tasa de flujo, un tiempo de respuesta corto.
6. Alta confiabilidad y un manejo sencillo.
El detector est a prueba de impedancia de operadores inexpertos, si es posible.
7. Respuesta semejante para los solutos, o de otra manera una respuesta selectiva y
predecible para uno o ms tipos de solutos.
8. No se debe destruir la muestra.
De alguna manera cabe aclarar que no existe ningn detector que cumpla con todas estas
caractersticas. A continuacin describiremos alguno de los detectores ms comunes.
Detectores de ionizacin por llama (FID)
Este es el ms utilizado y por lo general uno de los que ms se aplican en cromatografa de
gases. En este detector el efluente de la columna se dirige a una pequea flama de
hidrgeno y aire. La mayora de los compuestos orgnicos produciendo iones y electrones
cuando se pirolizan a la temperatura de la llama de hidrgeno-aire. Esta deteccin implica
controlar la corriente producida al recolectar la carga.
Detector de conductividad trmica (TCD)
Este detector es uno de los primeros utilizados en la cromatografa de gases, y aun tiene una
gran aplicacin. Este dispositivo cuenta con una fuente que se calienta mediante

electricidad y cuya temperatura a una potencia elctrica constante depende de la

conductividad trmica del gas circulante. Se debe mencionar que el elemento calentado
puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, quizs tambin puede ser un pequeo
termistor.
La resistencia elctrica de este depende de la conductividad trmica del gas.
Detector de captura de electrones. (ECD)
Este detector ha llegado a ser uno de los detectores ms utilizados para el anlisis de
muestras ambientales ya que este es sensible a muestras orgnicas que contienen halgenos,
como los plaguicidas, y los bifenilos policlorados.
El eluyente de este detector pasa por un emisor beta radiactivo, casi siempre este es de
nquel-63. Un electrn del emisor provoca la ionizacin del gas portador, con frecuencia
este es nitrgeno y la produccin de una rfaga de electrones.
Este tipo de detector es de respuesta selectiva. Identifica compuestos como halgenos,
perxidos y quinonas y grupos nitro, sin embargo es insensible a grupos funcionales como
aminas, alcoholes e hidrocarburos.
Detectores de conductividad electroltica.
Los compuestos que contienen azufre, halgenos o nitrgeno se mezvlan en el detector Hall
de conductividad electroltica con un gas de reaccin en un reactor tubular que casi siempre
es de nquel, el tubo de la reaccin debe mantenerse a 850-1000 C. Posteriormente se
disuelven los productos en un lquido esto es para originar la solucin conductora. Como
siguiente paso se mide el cambio de conductividad como resultado de las especies inicas
en la celda de conductancia.
Cuando tenemos halgenos, utilizamos al hidrgeno como el gas de reaccin.
Detectores de fotoionizacin.
En este detector las molculas que salen de la columna de cromatografa de gases son
fotoionizadas mediante radiacin ultravioleta proveniente de una lmpara de hidrgeno de
10.2 eV o de una de argn de 11.7 eV. Los compuestos con un potencial de ionizacin
superior no absorben la energa, y por tanto, no son detectadas.
Este tipo de detector es ms sensible a los hidrocarburos aromticos y los compuestos
organosulfurados que se fotoionizan con facilidad.
Detectores de emisin atmica (AED)
En este detector el efluente procedente de la columna de cromatografa de gases se
introducen un plasma inducido por microondas, un plasma acoplado por induccin o un
plasma de corriente continua. El plasma inducido por microondas es el que se usa ms
ampliamente y ya se encuentra en el comercio. Es utilizado junto con diodos en serie o con
un espectrmetro de emisin atmica con un dispositivo de acoplamiento de carga. El
plasma tendr la suficiente energa para atomizar todos los elementos dela muestra y

excitarlos para as poder obtener sus espectros de emisin atmica caractersticos. Por lo
tanto, el dtector de emisin atmica es un detector selectivo del elemento.
Detectores fotomtricos de flama (FPD)
Se utiliza de manera extensa por el anlisis de contaminantes del aire y el agua, de
plaguicidas y de los productos de la hidrogenacin de carbn.
Se trata de un detector selectivo que es sensible sobre todo en compuestos que tienen azufre
y fsforo. El eluyente de este detector se hace pasar a travs de una flama de hidrgeno-aire
a baja temperatura, la cual convierte parte del fsforo en una especie de HPO que emite
bandas de radiacin centradas alrededor de 510 y 526 nm.

Columna cromatogrfica
Al igual que sucede en todas las tcnicas cromatogrficas, la columna es el corazn del
cromatgrafo de gases. Es necesario tener siempre presente que la columna es el autentico
elemento de separacin de los componentes de la muestra; as, una mala eleccin de la
columna, una columna deteriorada o unas condiciones de trabajo inadecuadas, nunca
permitiran obtener buenos resultados aunque se disponga del mejor equipo en el resto del
cromatgrafo, siendo adems las causas citadas las responsables de la inmensa mayor parte
de los problemas que se encuentran a la hora de realizar un anlisis por cromatografa de
gases.
Una columna para cromatografa de gases, esta formada por un tubo, que puede ser de
diversos materiales (preferiblemente inertes), dentro del cual se encuentra la fase
estacionaria.
Esta puede ser un solido activo (cromatografa gas solido), o con mayor frecuencia un
liquido depositado sobre las partculas de un solido portador (columnas empaquetadas o de
relleno) o sobre las propias paredes del tubo (columnas tubulares abiertas).

Columnas empaquetadas
Las columnas empaquetadas consisten, como ya se ha mencionado, en un tubo
(normalmente de vidrio o acero inoxidable) con un dimetro interno que varia entre 2 y 5
mm y de una longitud que oscila entre 1 y 15m, arrollado de una forma adecuada para
poderse introducir en el interior del horno del cromatgrafo.
En el interior del tubo, se dispone la fase estacionaria bajo la forma de un liquido soportado
sobre un material adecuado finamente pulverizado; el dimetro de las partculas del relleno

debe ser, al menos, 10 veces inferior al dimetro del tubo, con el fin de conseguir una buena
uniformidad en su distribucin. El relleno, se encuentra confinado en el interior del tubo
por medio de tapones de algn material poroso (generalmente lana de vidrio o lana de
cuarzo) situados en los extremos.
La longitud, y consecuentemente la eficacia, de las columnas empaquetadas se encuentra
limitada fundamentalmente por la cada de presin del gas portador entre cabeza y salida de
columna.

Columnas tubulares abiertas

Las columnas tubulares abiertas (conocidas normalmente como columnas capilares) fueron
descritas inicialmente por Golay en 1957, y se encuentran entre las ms ampliamente
utilizadas debido a la gran eficacia de separacin que proporcionan.
Bsicamente, una columna tubular esta formada por un tubo (normalmente de vidrio o
slice fundida) de un dimetro comprendido entre 0,2 y 0,8 mm, en cuya pared interna se
dispone la fase estacionaria. Segn sea la forma en que se dispone la fase estacionaria sobre
la pared del tubo, se distinguen bsicamente dos tipos de columnas:

Columnas WCOT (Wall Coated Open Tubular). En este tipo de columnas (que son
las de uso mas frecuente), la fase estacionaria se encuentra depositada formando una
pelcula liquida directamente sobre las paredes del tubo.
Columnas PLOT (Porous Layer Open Tubular). En estas columnas la pared interna
del tubo esta recubierta por una capa de un soporte adsorbente; si a su vez el soporte
esta impregnado con una fase estacionaria liquida, las columnas son denominadas
SCOT (Support Coated Open Tubular).

Es evidente que la permeabilidad de las columnas tubulares hacia los gases es mucho
mayor que la de las columnas empaquetadas (del orden de 100 veces mayor), por lo que

este tipo de columnas pueden tener unalongitud bastante grande (son muy frecuentes
columnas de 50 m) sin provocar presiones excesivamente elevadas en cabeza de columna.
El enorme uso que se hace de este tipo de columnas es debido fundamentalmente a que la
elevada eficacia que ofrecen (son frecuentes valores de 30.000 a 50.000 platos frente a los
2.000-4.000 de una columna empaquetada) permite la separacin de mezclas muy
complejas con relativa facilidad; por otra parte, la gran eficacia de este tipo de columnas
permite conseguir buenas resoluciones sin recurrir a fases estacionarias de gran
selectividad, lo que simplifica mucho el problema de la eleccin de la fase estacionaria
(prcticamente todas las separaciones se pueden realizar con tres o cuatro columnas
diferentes).
El principal inconveniente de este tipo de columnas es su pequea capacidad de carga, lo
que obliga a utilizar sistemas de inyeccin especiales para introducir pequeas cantidades
de muestra y detectores de muy alta sensibilidad. No obstante, tanto las columnas SCOT
como las WBOT de dimetros mayores de 0,5 mm (columnas Wide Bore) ofrecen una
capacidad de carga suficiente como para poder inyectar cantidades del orden de 1 l sin
utilizar un splitter con una perdida de eficacia relativamente pequea. Las columnas de
este tipo tienen una utilizacin potencial muy alta en el campo del anlisis de trazas.

Fase estacionaria
Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son:
1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad )
adecuados al analito.
2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos
100 C mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno.
3. Baja reactividad.
4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin.
Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno,
debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor
polaridad deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas
actualmente (2005) son:

Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromticos,

polinucleares, drogas, esteroides y PCB.

Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para steres metlicos de cidos

grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.

Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.

Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromticos clorados, nitroaromticos,

bencenos alquilsustituidos.

Polietilenglicol,sirve para compuestos polares, tambin para compuestos

como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales.

Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres

y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y

entrecruzada para impedir su prdida durante las operaciones de elucin o lavado. De esta
forma se obtiene una monocapa adherida qumicamente a la superficie de la columna. La
reaccin implicada suele ser la adicin de un perxido al lquido a fijar, inicindose una

reaccin por radicales libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbonocarbono que adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la irradiacin
con rayos gamma.
Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver
mezclas enantiomricas. Este tipo de fases suelen ser aminocidos quirales o algn
derivado adaptado al trabajo en columna.

Cromatografa de lquidos HPLC

Introduccin
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna
que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o
la estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales
lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.
HPLC preparativa
Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las
industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La
cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el
aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de
un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

Columnas y precolumnas.

Las columnas de HPLC son usualmente tubos de acero inoxidable de entre 3 y 30 cm de

longitud y dimetro interno entre 1y 5 mm. La reduccin en el dimetro interno permite
menor consumo de solvente, que generalmente es costoso y tienen que desecharse una vez

usado. Los rellenos son generalmente de partculas esfricas de entre 3 y 10 m. Estas

columnas pueden alcanzar entre 30000 y hasta 100000 platos/metro.
El relleno ms comn en LC se prepara a partir de partculas de slice porosa, sintetizadas
por aglomeracin de partculas submicroscpicas en esferas regulares con una distribucin
de tamao muy estrecha. La superficie de este material (principalmente en el interior de los
poros) se modifica luego qumicamente para producir las fases enlazadas (ver ms abajo).
Otros materiales usados incluyen polmeros a base de estireno y divinilbenceno, o bien
partculas de almina o de xido de zirconio.
Con frecuencia se antepone una pre-columna a la columna analtica para extraer
contaminantes provenientes del solvente, de la muestra o bien partculas slidas que se
desprenden de la bomba. Esta pre-columna, que contiene el mismo tipo de relleno pero en
partculas ms grandes, protege la vida til de la columna.
En muchas aplicaciones el control de la temperatura de la columna no es estrictamente
necesario. Sin embargo se consiguen mejores reproducibilidades si la columna se
termostatiza a valores constantes. Muchos instrumentos actualmente cuentan con hornos
calefactores de la columna que permiten trabajar desde temperaturas de 10 hasta 100C.
Las columnas tambien pueden colocarse en camisas de agua alimentadas con un bao
termosttico para un control ms estricto de la temperatura.

Detectores.
Los detectores de HPLC deben tener un volumen muy pequeo, debe ser compatible con el
flujo permanente de un lquido, ser sensible y reproducible. Como no existe un detector
universal que sea suficientemente sensible, los tipos de detectores que se emplean
dependen de la naturaleza de la muestra. En la Tabla siguiente se enumeran los detectores
ms usados y sus caractersticas ms destacadas.

Detector de HPLC

Lmite tpicos de
deteccin de masa
(picogramos)

Rango lineal
(decenas)

Absorbancia

10

3-4

Fluorescencia

0.010

Electroqumico

100

4-5

Indice de refraccin

1000

Espectrmetro de masas

<1

FTIR

106

Dispersin de luz

106

Fotmetros y espectrofotmetros.

Los detectores ms comunes en HPLC se basan en la absorcin de radiacin uv o visible

(Figura 27). Poseen buena sensibilidad y amplio intervalo lineal, no es destructivo de la
muestra y puede usarse en elucin en gradiente. Estos detectores operan en el rango de
longitudes de onda de 190-350 nm (uv) o 190-700 nm (uv/visible). La seal producida es
directamente proporcional a la concentracin de analito que pasa por la celda. Existen dos
tipos de detectores: de longitud de onda fija o variable. El primero de ellos opera a las
longitudes de onda prefijadas por las lneas de emisin de su lmpara (usualmente
mercurio a baja presin que emite a 254 nm). El monocromador es la lmpara misma,
aunque se usan otros filtros para eliminar la interferencia de emisiones lejanas. La luz
monocromada incide sobre la muestra fluyendo por la celda (que es un compartimento de
entre 1 y 14 L) y luego sobre un fotomultiplicador.

Figura 27. Esquema de una celda de flujo

uv/visible

Los detectores de longitud de onda

variable
o
espectrofotmetros
emplean una fuente de emisin
contnua como una lmpara de
deuterio o de xenn. Una red de
difraccin permite escoger la longitud
de onda de mxima absorbancia del
analito a determinar. La luz
monocromtica atraviesa la celda de
medida y de all hacia el
fotomultiplicador. Actualmente se han
difundido los espectrofotmetros con
arreglo de diodos, en

los que se emplea un sistema ptico invertido: la celda se irradia con luz policromtica, la
luz emergente incide en la red de difraccin y all es dispersada hacia el elemento
fotosensible, que consiste en un conjunto de fotoclulas o fotodiodos montados sobre un
chip de silicio. De esta forma se logra no solo medir la intensidad de la luz transmitida a

una dada longitud de onda, sino todo el espectro de absorcin discreto en cada intervalo.
La informacin es luego procesada por un adquisidor de datos y software.

- El detector de fluorescencia es usado especficamente con analitos que fluorescen

naturalmente o bien previa derivatizacin con algn reactivo fluorognico. Su alta
sensibilidad lo convierte en ideal para el anlisis de trazas. La fuente de emisin ms usada
es una lmpara de xenn que produce un espectro contnuo entre 260 y 660 nm de muy alta
intensidad. Un monocromador selecciona una longitud de onda de excitacin que se dirige
hacia la celda. La emisin del haz luminoso que sale de la celda pasa al monocromador de
emisin y de all al fotomultiplicador.

- Otro detector de considerable aplicacin se basa en el cambio del ndice de refraccin del
solvente a causa de la presencia de molculas de analito. Se trata de un detector universal
que responde a la presencia de cualquier soluto sin selectividad alguna. Sus desventajas
son la baja sensibilidad y la imposibilidad de operar con gradientes de elucin.

- Los detectores electroqumicos se basan en medidas electroqumicas (amperometra,

conductimetra o voltametra). La Figura 28 muestra un esquema de un detector
amperomtrico.

Figura 28. Celda de flujo y detector amperomtrico

Este detector emplea tres

electrodos. El efluente de la
columna pasa por un electrodo de
trabajo mantenido a un potencial
que induce a la oxidacin o
reduccin
del
analito.
El
electrodo auxiliar provee la carga
de
neutralizacin
complementaria. Entre estos dos
electrodos se fija el voltaje
apropiado a la deteccin. El
electrodo de referencia, por su
parte produce un potencial fijo y
estable contra el cul se mide el
potencial
del
electrodo de
trabajo y un

potenciostato provee una diferencia de potencial estable entre el electrodo de trabajo y el

auxiliar. Se mide la corriente que se produce entre el electrodo de trabajo y el electrodo
auxiliar que se amplifica para producir la seal de salida. Su principal limitacin est dada
por el tipo de fase mvil a usar, que necesariamente tendr que ser conductiva (se usan
electrolitos o buffers en fase mvil). Es claro tambin que su naturaleza es destructiva
respecto del analito.

- La combinacin de LC y espectrometra de masas parece la fusin ideal para separar,

detectar e identificar componentes de una muestra no voltil, en analoga con GC/MS para
muestras voltiles. Sin embargo, el acoplamiento LC/MS no es sencillo porque, a
diferencia de GC/MS, primero debe vaporizarse y extraerse el solvente eluyente.

Inyectores
El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues un mal
sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatogrfica que
deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.
- Ser de fcil manejo.
- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el
ensanchamiento que origina en la banda cromatogrfica.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de
vlvula.

Inyectores de jeringa

En este tipo de inyectores, la introduccin de la muestra en la columna se realiza por medio

de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatogrfico a travs de una membrana
("septum"), lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna.
Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de construccin y en que
permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna; por el contrario, son
inyectores que presentan una gran falta de reproducibilidad, tienen una presin de trabajo
limitada y son de gran dificultad de manejo.

Inyectores de vlvula
Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos de las cuales estn
conectadas entre s por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un tubo de volumen
conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyeccin.
La introduccin de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la primera se
realiza a presin atmosfrica, y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una
jeringa; en la segunda, mediante un giro de la vlvula, se hace pasar el eluyente a travs de
la espira hacia la columna.

Cromatografa de capa fina (TLC)

Fundamento
La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o TLC) es una tcnica
analtica rpida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Qumica Orgnica. Entre
otras cosas permite: Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar
as, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin. Comparar muestras. Si dos
muestras corren igual en placa podran ser idnticas. Si, por el contrario, corren distinto
entonces no son la misma sustancia. Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible
estudiar cmo desaparecen los reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo que
es lo mismo, saber cundo la reaccin ha acabado. La muestra a analizar se deposita cerca
de un extremo de una lmina de plstico o aluminio que previamente ha sido recubierta de
una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lmina se coloca en una cubeta
cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase mvil). A medida
que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a travs del adsorbente, se produce
un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el
adsorbente.
Adsobentes y eluyentes
Los dos adsorbentes (fase estacionaria) ms ampliamente utilizados son la gel de slice
(SiO2) y la almina (Al2O3), ambas de carcter polar. La almina anhidra es el ms activo
de los dos, es decir, es el que retiene con ms fuerza a los compuestos; por ello se utiliza
para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, teres,
aldehdos y cetonas). El gel de slice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias ms
polares (alcoholes, aminas, cidos carboxlicos). El proceso de adsorcin se debe a
interacciones intermoleculares de tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el soluto
y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como
catalizador en reacciones de descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias
mediante interaccin dipolodipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo presentan.

El orden de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase

mvil o eluyente. Este puede ser un disolvente nico o dos miscibles de distinta polaridad.
En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los disolventes
ms comnmente empleados.
Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona < 2
propanol < metanol < agua
En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullicin y
viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un disolvente
ms polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en
proporcin variable; la polaridad de la mezcla ser el valor promediado en funcin de la
cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idneo para cada caso ha de encontrarse
por "el mtodo del ensayo y del error".
Concepto de Rf
El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de
adsorbente, eluyente, as como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de
saturacin, etc.) Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que es mejor correr
duplicados de la misma placa.
Determinacin del Rf
La retencin se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a
separar y la fase mvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria.
As, las molculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que
se produce la elucin van siendo desplazadas por la fase mvil. La retencin y la
selectividad en la separacin dependen de los valores respectivos de las constantes de los
diferentes equilibrios qumicos que tienen lugar, que estn en funcin de: la polaridad del
compuesto, determinada por el nmero y naturaleza de los grupos funcionales presentes.

Los solutos ms polares quedarn ms retenidos puesto que se adsorben ms firmemente a

los centros activos de la fase estacionaria, mientras que los no polares se eluirn con mayor
facilidad. naturaleza del disolvente. As, para un mismo compuesto, un aumento en la
polaridad del disolvente facilita su desplazamiento en la placa. La relacin entre las
distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa se conoce
como Rf, y tiene un valor constante para cada compuesto en unas condiciones
cromatogrficas determinadas (adsorbente, disolvente, tamao de la cubeta, temperatura,
etc.). Debido a que es prcticamente imposible reproducir exactamente las condiciones
experimentales, la comparacin de una muestra con otra debe realizarse eluyendo ambas en
la misma placa.
Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresin:
Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si sta es

excesivamente grande se obtendr un valor errneo del Rf. Se recomienda elegir un
eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten un Rf medio en torno a 0.30.5.
Para compuestos poco polares, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano. En el
caso de compuestos con polaridad media, se aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de
etilo en distintas proporciones. Los productos ms polares, requieren disolventes ms
polares como mezclas de diclorometano/metanol en distintas proporciones.

Cromatografa en capa fina

En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeo
espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascender, por capilaridad, por la placa
y arrastrar los componentes a lo largo de sta produciendo manchas de los componentes.
En la cromatografa en capa fina (ccf), el grado de elucin de las sustancias depende tanto
de su propia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado.
El adsorbente se coloca en forma de una capa delgada adherida sobre un soporte rgido, que
pueden ser placas de vidrio, aluminio o polister. Los tamaos de la placa para ccf
convencional son: 20 x 20; 10 x20 y 52 cm.
Hay adsorbentes que contienen un indicador de fluorescencia para facilitar la identificacin
de muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos, se requerirn otras
tcnicas de revelado.
Algunos eluyentes ms comunes para cromatografa en capa fina son:
-ter de petrleo
cloruro de metileno
n-hexano
acetato de etilo
ciclohexano
acetona
iso-propanol

 dietil-ter etanol
t-butil-ter
metanol
cloroformo
cido actico
Revelado de las placas
La mayor parte de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite
la visualizacin de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador
absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en el UV evita
que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto, y el resultado
es la visualizacin de una mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto. En
el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualizacin (o revelado) del
cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los
productos adsorbidos proporcionando compuestos coloreados.
Reveladores ms comunes para cromatografa en capa fina
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden
revelarse mediante:
a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria
impregnada con un indicador fluorescente (F25a o F366), el nmero que aparece como
subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.
b) La introduccin de la placa en vapores de yodo
c) El roco con una solucin de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extraccin de gases). Despus calentar
intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta carbonizar los compuestos.
Adsorbentes ms comunes para cromatografa en capa fina.
a) Gel de slice (se utiliza en el 80% de las separaciones)
b) Oxido de Aluminio Almina (cida, neutra o bsica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

d) Poliamidas
Para la seleccin del adsorbente deber tomar las siguientes consideraciones:
a) Polaridad
b) Tamao de partcula
c) Dimetro
d) rea Superficial
e) Homogeneidad
f) Pureza
Factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa fina.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms en la fase estacionaria.
b) La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes
plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequea escala, stas deben limpiarse corriendo
primero una mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar secar completamente antes de
aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.