FACULTAD DE CIENCIAS

ACTIVIDAD PRCTICA
N4
ACTIVIDAD ENZIMTICA Y CURVA DE
PROGRESO

Integrantes: Javier Flores Plaza

Nicols Fuentes Ugarte
Carrera: Ing. En biotecnologa molecular
Profesores: Victoria Guix
Ana Peller
Fecha: Jueves 02 de Octubre de 2014

Introduccin
La -galactosidasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de compuestos
galactsidos en monosacridos, pero a la vez se pueden usar sustratos artificiales
como l o-nitrofenil--galactsido que es hidrolizado por la -galactosidasa en onitrofenol que es un compuesto cromognico que absorbe a 420nm. Por lo cual en
esta actividad practica utilizaremos este sustrato artificial para el estudio de la
actividad de la enzima en cuestin, analizando trminos como unidad de enzima,
velocidad y actividad enzimtica, adems de realizar una curva de progreso para
la reaccin de dicha enzima y su sustrato artificial, en las condiciones de
incubacin que sern descritas posteriormente.
Para dicho anlisis mencionado anteriormente es fundamental tener un compuesto
que sea de fcil identificacin y cuya concentracin pueda ser determinada, por lo
cual ser utilizado el ONFG dado a que la reaccin produce ONF, un compuesto
que cumple con las caractersticas mencionadas anteriormente, siendo
identificado por la coloracin que presenta y adems podemos medir su
concentracin a travs de un espectrofotmetro el cual mide absorbancia la cual
est relacionada con la concentracin, para lo cual se har uso de la curva de
calibracin obtenida del primer practico.
Objetivos

Determinacin de la actividad enzimtica de la -galactosidasa.

Definir medio de incubacin o las condiciones experimentales para ensayar
un sistema enzimtico.
Estudiar la velocidad de la hidrlisis enzimtica del o-nitrofenil--galactsido
en funcin del tiempo de incubacin (curva de progreso)

Ecuaciones a utilizar
(1.0)
(2.0)
(3.0)

Materiales y mtodos
Materiales [1]
Experimentos 1.1 y 1.2

Amortiguador fosfato de sodio pH 7,2

o-nitrofenil- -galactsido (ONFG)
o-nitrofenol (ONF)
Carbonato de sodio
-galactosidasa
Gradilla
Tubos de ensayo
Agua
Cronometro
Espectrofotmetro

0,1M
0,01M
0,5mM
1,0M

Mtodos
Se procedi de la forma indicada en la gua de trabajos prcticos y el protocolo
adjuntado

Resultados brutos
Protocolo
Experimento 1.1
Se asigno un volumen de incubacin de 1,5mL donde se agregaron los
componentes del medio enzimtico, se incubo el sistema a temperatura ambiente
y se agrego el sustrato para iniciar la reaccin, tras lo cual al transcurrir 11minutos
se agreg carbonato para detener la reaccin y posteriormente agua hasta
completar 3,0mL. A la vez se realizaron dos blancos, un blanco enzima y un
blanco sustrato. Tras detener la reaccin y completar el volumen de 3.0mL se
procedi a medir absorbancia
Tabla I: Componentes del medio enzimtico
Tubo
A
Blanco enzima
Blanco sustrato

Enzima
(mL)
0,2
0,2

Buffer
(mL)
0,45
0,45
0,45

Agua (mL)
totales
1,9
2,1
2,05

ONFG
(mL)
0,15
0,15
-

Carbonato
(mL)
0,3
0,3
0,3

Experimento 1.2
Se procedi de igual forma que en el experimento 1.1 pero esta vez se realizaron
seis tubos, los cuales tuvieron diferentes tiempos de incubacin segn lo indicado
en la tabla II.
Tabla II: Protocolo experimento 1.2
Tubo
1
2
3
4
5
6

Enzima
(mL)
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

Buffer
(mL)
0,45
0,45
0,45
0,45
0,45
0,45

Agua (mL)
totales
1,9
1,9
1,9
1,9
1,9
1,9

ONFG
(mL)
0,15
0,15
0,15
0,15
0,15
0,15

Carbonato
(mL)
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3

Tiempo
(min)
0
5
15
30
40
60

*La temperatura de incubacin fue de 16C

Resultados
Experimento 1.1
Tras realizar lo indicado en el protocolo se midi la absorbancia a 420nm de los
tubos colectados, obtenindose los resultados ilustrados en la tabla III
Tabla III: Resultados experimentales del experimento 1.1
Tubo
A
Blanco enzima
Blanco sustrato

Absorbancia a 420nm
0,612
0,022
0,004

Experimento 1.2
Realizado lo indicado en el protocolo, se obtuvieron las siguientes absorbancias
para los diversos tiempos de incubacin.
Tabla IV: Resultados experimentales del experimento 1.2
Tubo
1
2
3
4
5
6

Tiempo de incubacin (min)

0
5
15
30
40
60

Absorbancia a 420nm
0,008
0,197
0,384
0,837
1,032
1,616

Anlisis de resultados
Experimento 1.1
Tras descontar la absorbancia del blanco enzima a la obtenida en el tubo A, se
obtiene una nueva absorbancia de 0,590 y utilizando la curva de calibracin del
practico 1 donde se tiene un coeficiente de extincin para el ONF igual a 3,9325 y
aplicando (1.0) nos indica una concentracin de 0,150 moles/mL, lo cual nos
indica que en los 3mL tenemos 0,450 moles de ONF. Y con lo cual si aplicamos
(2.0) nos indica que en el medio de incubacin tenemos 0,0409 unidades de
enzima o 0,0409 moles/min.
Dado a que en el medio de incubacin tenemos 0,0409 unidades de enzima, esto
nos indica que la actividad de la galactosidasa aplicando (3.0) es de 0,205
U/mL de protena.
Las condiciones del medio fueron: ONF 0,150mM, buffer fosfato pH 7,2 15mM y
carbonato de sodio 0,1M, en un volumen final de 3.0mL, a una temperatura de
incubacin de 16C, en un tiempo de incubacin de 11minutos.
Experimento 1.2
Descontando el blanco enzima a las absorbancias obtenidas en la tabla IV y si
adems utilizamos (1.0) para obtener las concentraciones de ONF, y con dichos
datos podemos confeccionar la tabla V
Tabla V: Anlisis de datos experimento 1.2
Tubo Tiempo
de Absorbancia
incubacin (min) 420nm
1
0
0
2
5
0,175
3
15
0,362
4
30
0,815
5
40
1,010
6
60
1,594

a moles
de ONF
0
0,134
0,276
0,622
0,771
1,216

Unidades de Actividad
enzima (U)
(U/ml)
0
0
0,027
0,134
0,018
0,092
0,021
0,104
0,019
0,096
0,020
0,101

Con los moles de ONF y el tiempo de incubacin podemos confeccionar una

grafica que relacione los moles de ONF producidos en funcin del tiempo.

Grafica 1: moles de ONF respecto el tiempo.

Dado a que unidad de enzima tambin significa velocidad (moles/min), entonces

podemos graficar la evolucin de la velocidad en funcin del tiempo, lo que queda
ilustrado en la grafica 2 :

Grafica 2: Evolucin de la velocidad de reaccin con el tiempo.

Velocidad moles/min

Velocidades iniciales
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010

Velocidades iniciales

0,005
0,000
0

10

20

30

40

Tiempo (min)

50

60

70

Discusin
Experimento 1.1
Al tener los resultados de absorbancia al reaccionar la enzima con el ONFG y este
resultado extrapolarlo con el grfico de calibracin del prctico n 1, es posible
obtener la concentracin de ONF, adems que las reacciones se realizaron en un
tiempo determinado, con eso se obtienen las unidades de enzima, agregando a
eso que se conoce la cantidad (volumen en este caso) de enzima, tambin se
calcula la actividad enzimtica. Pero hay que considerar que en la medicin de
absorbancia tanto para el blanco sustrato, como para el blanco enzima, no fueron
cero, lo que nos puede indicar que sin la enzima puede existir produccin de
producto, o que los componentes de la reaccin generen un absorbancia similar a
la analizada, lo que puede provocar un error en los resultados.
Experimento 1.2
Si analizamos la Curva de Progreso, vale decir el grfico de Cantidad de Producto
v/s Tiempo, se puede ver una relacin lineal proporcionalmente directa entre la
cantidad de producto y el tiempo, salvo algunos puntos que estn por debajo o
sobre lo esperado, pero se observa una tendencia lineal. Adems en este tipo de
grafico se observa una tendencia lineal entre la cantidad de producto y el tiempo,
hasta llegar a un tiempo donde la cantidad de producto se mantiene constante
indicando que la reaccin en cuestin llego al equilibrio qumico, en donde la
velocidad de formacin de es igual a la de la reaccin inversa. Pero porque no se
llego a este punto en este medio de reaccin, uno de los motivos puede ser una
mala prctica de las tcnicas de laboratorio y un mal uso de los reactivos
entregados, adems otro factor es que en las condiciones de incubacin
especialmente la temperatura es una variable que influye en el equilibrio qumico,
por lo cual a dicha temperatura debe transcurrir un mayor tiempo para que se
alcance el equilibrio.
Analizando el grfico Velocidad v/s Tiempo, podemos apreciar que de tiempo cero
a 5 minutos hay una gran variacin en la velocidad tendencia que sigue hasta los
15-20 min, tras lo cual baja y se estabiliza, adems en este tipo de grafico se
espera que la velocidad disminuya paulatinamente hasta estar prxima a cero en
el intervalo donde se est por alcanzar el equilibrio, cosa que no se pudo apreciar
en este caso, siendo mencionadas la posibles causas en el prrafo anterior.
La adicin del Carbonato de sodio, tambin puede haber aumentado el margen de
error de nuestros clculos, ya que pudo ocurrir que el carbonato de sodio, no
detuvo la reaccin en el tiempo que se estim debera realizarlo, lo cual pudo
producir una mayor formacin de cantidad de producto que el esperado.

Cuestionario
Experimento 1.1: Determinacin de la actividad enzimtica de la -galactosidasa
1. Qu funcin cumple el carbonato de sodio en el sistema de ensayo de la
-galactosidasa?
El Carbonato de Sodio, detiene la reaccin, al alcalinizar el medio denatura a la Galactosidasa
2. Cmo podra comprobar que una reaccin qumica determinada es una
reaccin enzimtica?
Para poder comprobar que una reaccin qumica determinada es una reaccin
enzimtica se puede hacer un grupo de control, y medir las velocidades de
formacin del producto. Conociendo sus velocidades podemos determinar si se
demora ms en un sistema biolgico que en el laboratorio, y as determinar si es
una reaccin qumica o enzimtica
Otra alternativa sera alterar el medio de reaccin, variando la temperatura o el pH,
inactivando a las enzimas, luego si ocurre una disminucin considerable en la
velocidad de reaccin podra indicar la presencia de una enzima es fundamental
para la velocidad de reaccin, y por consiguiente indicar que se trata de una
reaccin enzimtica.
3. Si desea determinar la actividad enzimtica cualquiera en un extracto de
tejido:
a) Qu controles hara?
b) Qu consideracin debe tener en cuenta para fijar el tiempo de
incubacin?
a) Los controles que utilizados serian:

Blanco de sustrato: Para poder determinar si los componentes del sistema,

con excepcin del sustrato, interfieren con el mtodo para medir el sustrato
o los productos.
Blanco de enzima: Para poder determinar si el sustrato es inestable y da
producto en ausencia de enzima.
Tiempo cero: Este control es utilizado para detectar cualquier interferencia
debida a cualquiera de los componentes, y es til para la cuantificacin de
la actividad enzimtica

b) Para fijar el tiempo de incubacin para determinar una actividad enzimtica se

debe considerar que en ese intervalo de tiempo se consuma una cantidad
mensurable de sustrato, que es el intervalo en donde la concentracin de producto
aumenta linealmente con el tiempo, ya que slo en este intervalo la velocidad de la
reaccin es proporcional a la concentracin de enzima.
Siempre se debe garantizar que exista un exceso de sustrato en la solucin, esto
es porque mientras no ha ocurrido la saturacin de la enzima por el sustrato, la
actividad es proporcional al tiempo de incubacin, la saturacin provoca la prdida
de la proporcionalidad, pero no se debe confundir la situacin en que se alcanza la
saturacin con la situacin en que se ha agotado el sustrato, es por esto que el
sustrato deben estar en exceso.
Experimento 1.2: Estudio de la velocidad de hidrlisis enzimtica del onitrofenil--galactsido en funcin del tiempo de incubacin (curva de
progreso).
1. Cmo afectan la forma de una curva de progreso: la concentracin
de sustrato, la concentracin de enzima?
La concentracin de sustrato, afecta a la pendiente de la curva de progreso, es
decir con una concentracin de sustrato mayor tendremos una pendiente mayor, y
la velocidad mxima tambin ser mayor, y en el caso de que la concentracin de
sustrato es pequea, el intervalo de tiempo durante el cual se mide la velocidad
inicial es menor.
En el caso de una variacin en la concentracin de enzima, variar la pendiente,
aunque la velocidad mxima ser la misma.
Por lo tanto si tengo la misma concentracin de sustrato y coloco el doble de
enzima, va a llegar en un menor tiempo al equilibrio y la pendiente va a ser mayor
y si tengo la misma concentracin de enzima con dos concentraciones distintas
de sustrato, se espera que la velocidad inicial sea menor y por lo tanto la
pendiente ser menor y llegar antes al equilibrio, porque la concentracin de
sustrato es menor.
2. Una reaccin enzimtica se detiene espontneamente despus de
transcurrido un cierto tiempo:
a) Qu explicacin podra dar para este fenmeno?
b) Cmo podra comprobar experimentalmente su hiptesis?

a) Que la reaccin enzimtica se detenga espontneamente puede deberse a que

la reaccin alcanz su equilibrio, un estado en donde la velocidad de formacin de
productos se iguala a la formacin de sustrato, posteriormente ocurre una
saturacin de la enzima.
b) Para comprobar experimentalmente esta hiptesis, podemos agregar ms
sustrato a la reaccin, lo que debera restablecer el equilibrio en el caso de que la
enzima no estuviera inactiva.

Conclusiones

A partir de la curva de calibracin, un grfico de absorbancia en funcin de

la concentracin de ONF, realizado en el primer practico, pudimos obtener
una ecuacin de la recta, la cual nos permiti determinar la concentracin
de o-nitrofenol, la cual permiti calcular los moles y determinar la actividad
enzimtica de la -galactosidasa.
La Curva de Progreso, indica el intervalo de tiempo en el cul se puede
medir la reaccin que es slo el intervalo de tiempo en que la concentracin
de un sistema enzimtico, ya que slo en este intervalo la velocidad es
proporcional a la concentracin de enzima, posteriormente la reaccin
llegar al equilibrio, lo que significa que la concentracin de sustrato variar
muy poco.
Adems la Curva de progreso tambin nos permite calcular la velocidad de
la reaccin, dado a que pendiente de esta curva al inicio de la reaccin
tambin indica la velocidad inicial de la reaccin.
Analizando nuestra curva de progreso, pudimos ver un aumento de
producto a medida que avanza el tiempo, la cual tiene una tendencia lineal
de formacin de producto en funcin del tiempo total de incubacin, pero no
se pudo apreciar una dependencia hiperblica con la concentracin de
sustrato y la velocidad.
Concluyendo el mtodo efectuado para estudiar la reaccin enzimtica de
la -galactosidasa fue efectiva, ya que obtuvimos resultados dentro de un
intervalo posible, siendo este el intervalo de relacin lineal, pero no se
alcanzo a apreciar el comportamiento hiperblico que dicta la ecuacin
Michaelis-Menten.

Bibliografa

[1] Guix V., Peller A., Gua de Trabajos Prcticos y de Ejercicios. Curso de
Bioqumica. 2014. Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Pgs. 16 - 19