Tesis 02

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS
PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA
ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA
BOGOT, NOVIEMBRE DE 2005

MONOGRAFIA
Presentado como requisito parcial
Para optar el ttulo de
ESPECIALISTA EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA
DIRECTOR
Dra. DIANA PATIO C. M.Sc
CODIRECTOR
Dra. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp.

Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas,

son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la Pontificia
Universidad Javeriana
(Artculo 9.18 del reglamento de trabajos de grado y
de investigacin. Agosto de 1989)

Dra. DIANA PATIO C. M.Sc

DIRECTORA
DRA. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp

CODIRECTORA


Dra. Diana Patio C. M.Sc.

COORDINADORA ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE
INMUNOLOGA CLNICA

A Dios que siempre esta a mi lado guindome.

A mis padres al igual que a mis hermanos y a Sof.
A Ricardo porque sin todo su amor y apoyo nunca lo hubiera
logrado..
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Diana Patio por permitirme trabajar con ella y brindarme siempre su
apoyo y amistad incondicional y a la Doctora Maria Claudia Ortega por su gran
ayuda y paciencia durante el desarrollo de este trabajo. A todas las personas del
laboratorio de Inmunolgia y Hematologa de la facultad de ciencias por toda su
colaboracin.
INDICE DE TABLAS
Pg.
Tabla 1.
Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002.
Tabla 2.
Inmunodeficiencias ligadas a X.
Tabla 3.
Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a

inmunodeficiencia combinada severa.
10
Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas

a inmunodeficiencia combinada severa.
11
Alteraciones en el extendido de sangre perifrica

observadas en las inmunodeficiencias primarias .
24
Tabla 4.
Tabla 5.
Tabla 6.
Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos

para la prueba de hipersensibilidad retardada.
31
INDICE DE FIGURAS
Pg.
Figura 1.
Distribucin de inmunodeficiencias primarias en 1428

pacientes reportados por la LAGID
Figura 2. Relacin entre el sistema NADPH oxidasa que esta

afectado en los pacientes con granulomatosis crnica
Figura 3.
Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad

de Antioquia Colombia
7
13
22
Figura 4.
Patrn de electroforesis para hipogammaglobulinemia 25
Figura 5.
Fundamento de la Citometra de Flujo
29
Figura 6.
Anlisis de puntos de LB (CD19+) por Citometra de Flujo
30
Figura 7.
Anlisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por

Citometra de Flujo.
32
Figura 8.
Prueba de liberacin de cromio
34
Figura 9.
Anlisis de clulas NK (CD16+/CD56+) por Citometra

de Flujo.
Figura 10. Quimiotaxis en filtro.
38
TABLA DE CONTENIDO
Pg
1. Definicin del problema
2. Justificacin
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
3.2 Objetivos especficos
4. Marco Terico
4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias
4.1.1 Epidemiologa
4.2 Clasificacin de las inmunodeficiencias primarias
4.3 Aspectos Clnicos de las inmunodeficiencias Primarias
12
4.3.1 Ligadas a X
12
4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crnica (EGC)
12
4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)
13
4.3.1.3 Sndrome de Hiper IgM
14
4.3.1.4 Sndrome de Wiskott Aldrich
15
4.3.2 Autosomicas recesivas
16
4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa
16
4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)
17
4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)
17
4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2
18
4.3.2.5 Deficiencia de Zap70
18
4.3.2.6 Deficiencia de Jak3
19
4.3.2.7 Deficiencia de Adhesin leucocitaria
19
4.3.2.8 Sndrome de Chediak Higashi
20
4.3.2.9 Sndrome linfoproliferativo autoinmune
20
10
4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia
21
4.4 Pruebas diagnosticas
22
4.4.1 Pruebas de primera etapa
23
4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa
26
4.4.2.1 Pruebas para medir la produccin de anticuerpos
26
4.4.2.1.1 Cuantificacin de Inmunoglobulinas
26
4.4.2.1.2 Medicin de subclases de inmunoglobulinas
27
4.4.2.1.3 Isohemaglutininas
28
4.4.2.1.4 Produccin de anticuerpos IgG especficos
28
4.4.2.1.5 Cuantificacin de LB por citometra
28
4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT
30
4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutnea retardada
30
4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometra
31
4.4.2.2.3 Cuantificacin de molculas de superficie por citometra
32
4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK
33
4.4.2.2.5 Cuantificacin de clulas NK
34
4.4.4.3 Pruebas para medir la funcin de las clulas fagocticas
35
4.4.4.3.1 Reduccin de NBT
36
4.2.2.3.2 Medicin de radicales libres de oxigeno
36
4.2.2.3.4 Quimiotaxis
37
4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrfilos
38
4.2.2.3.6 Adherencia
39
4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento
39
4.2.2.4.1 Cuantificacin de C3 y C4
39
4.2.2.4.2 Complemento hemoltico 50 (CH50)
40
11
4.2.2.4.3 CD59 en eritrocitos
40
4.2.3 Pruebas de tercera etapa
41
41
4.2.3.1.1 Produccin de anticuerpos in Vitro
41
4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO
41
4.2.3.1.3 Anlisis de polimorfismos conformacionales (SSCP)
42
42
4.2.3.2.1 Linfoproliferacin con mitgenos
42
4.2.3.2.2 Cuantificacin de la produccin de citocinas In Vitro
43
4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1
43
4.2.3.3 Pruebas para medir la funcin de clulas fagocticas
44
4.2.3.3.1 Western blot para protenas del sistema NADPH oxidasa
44
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
45
6. BIBLIOGRAFIA
46
12
1. Definicin del problema

Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogneo de desordenes
generalmente hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y
humoral (Linfocitos B) especifica o los mecanismos de defensa no especficos del
husped (Clulas fagocticas, citocinas, protenas del complemento, entre otros).
En la mayora de los casos se manifiestan en el primer ao de vida, no obstante,
pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos (Lim, 2004). Afectan
individuos de ambos sexos. Sin embargo, en los menores de cinco aos se
presenta ms en los varones con una relacin 5:1 con respecto a las mujeres,
mientras que en los adultos la frecuencia es muy similar (Montoya, 2004).
La incidencia de las inmunodeficiencias primarias se ha incrementado de 10 casos
reportados en 1969 a 1 en 10.000 nacidos vivos (Lim, 2004) y varia dependiendo
del tipo especifico de inmunodeficiencia primaria y de otros factores como la etnia
y la endogamia (Montoya, 2004).
Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto
molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias
autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100
enfermedades por deficiencia inmunolgica. Pero, esta cifra puede ser an mayor,
si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre, entre
1.000 y 10.000 podran estar involucrados en el desarrollo y la funcin de las
clulas del sistema inmune (Montoya, 2004).
Las manifestaciones clnicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy
variadas en funcin del defecto inmunolgico, muchos nios inmunodeficientes
pueden desarrollar sntomas como erupciones y alteraciones en la pigmentacin
13
de la piel, anomalas en el desarrollo de la cara, del sistema esqueltico y del

corazn, entre otros. Los defectos que implican alguna alteracin en la funcin de
la clula de B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes que a menudo y
segn el compromiso de la respuesta humoral pueden terminar en septicemia
bacteriana. La carencia de la produccin de anticuerpos puede tambin aumentar
la susceptibilidad a infecciones por enterovirus dando por resultado meningitis viral
crnica y giardiasis entre otras. Las clulas T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fngica, no obstante, tambin proporcionan la funcin de
colaboracin a las clulas B mediante la liberacin de citocinas como activadoras
de la respuesta inmune de tipo humoral garantizando as,
una respuesta
adecuada y efectiva. Enfermedades como la inmunodeficiencia combinada severa

(IDSC) de LT y LB da como resultado susceptibilidad aumentada a enfermedades
por patgenos virales, fngicos y bacterianos. Los pacientes con desrdenes de
granulocitos son susceptibles a las enfermedades por Estaphylococcus y a
infecciones por microorganismos Gram negativos (Lim, 2004).
Como se puede observar los pacientes con algn tipo de inmunodeficiencia
primaria, en especial los nios, son un blanco fcil para el desarrollo de
infecciones recurrentes por diferentes tipos de patgenos (bacterias, virus, hongos
y parsitos). Dado que el tratamiento de eleccin para el control de infecciones
recurrentes es el uso de antibiticos se ha observado la generacin de altas
resistencias a los mismos (Lim, 2004).
14
2. Justificacin
En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen pruebas
inmunolgicas
especificas
para
el
diagnostico
de
pacientes
con
inmunodeficiencias primarias. Razn por la cual los pacientes se ven sometidos a

estar por largos periodos en instituciones hospitalarias debido a las mltiples
infecciones que presentan y que ponen en riesgo su vida.
Esto se debe en gran parte a la poca informacin sobre la presentacin clnica de
las inmunodeficiencias primarias, al limitado acceso a las pruebas diagnosticas y
a los pocos laboratorios especializados que existen actualmente en el pas.
El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal medico
establecer un diagnostico acertado que podra prevenir o por lo menos disminuir la
estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias, evitando as los altos
costos con relacin a la demora en el diagnostico y manejo adecuado, tanto para
las entidades prestadoras de salud al igual que para el paciente y sus familiares
Las razones previamente expuestas nos llevan a revisar cules son las pruebas
de laboratorio que existen actualmente que puedan ser tiles para la confirmacin
diagnostica temprana por parte del personal medico que acompaa a pacientes
con algn tipo de inmunodeficiencia primaria y de esta manera proporcionar una
herramienta de consulta para llevar a cabo un diagnostico mas certero.
15
3. Objetivos
3.1 Objetivo General:
Realizar una revisin de la literatura cientfica lo ms actualizada posible sobre las
pruebas del laboratorio de inmunologa clnica tiles en el diagnostico de pacientes
con inmunodeficiencias primarias.
3.2 Objetivos especficos
1. Describir los aspectos clnicos ms relevantes de las inmunodeficiencias
primarias.
2. Revisar y definir cules son las pruebas de primera etapa que debe solicitar
el medico para aproximarse al diagnostico cuando hay sospecha de
inmunodeficiencia primaria.
3. Definir cuales son las pruebas de segunda etapa tiles para llegar a un
probable diagnostico de acuerdo al componente inmunolgico que se
presume se encuentra alterado.
4. Describir las pruebas de tercera etapa para llegar a un diagnostico
molecular confirmado de los pacientes con inmunodeficiencia primaria.
16
4. Marco Terico
4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias
Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogneo de desordenes
generalmente de origen hereditario que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T)
y humoral especifica (Linfocitos B) o los mecanismos de defensa no especficos
del husped (clulas fagocticas, citocinas, protenas del complemento, entre
otras). Estos desordenes en el sistema inmune causan una incrementada
susceptibilidad a las infecciones y posible desarrollo de enfermedades autoimunes
(Lim, 2004). En la mayora de los casos se manifiestan en los cinco primeros aos
de vida (90%), no obstante, pueden presentarse a cualquier edad incluyendo
adultos. Con respecto a su distribucin por sexo casi todos los registros
demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001). Se estima que
1 de cada 10.000 nios nacidos vivos presentan a lo largo de su infancia algn
tipo de inmunodeficiencia primaria (Lim, 2004).
Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto
molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias
autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100
enfermedades por deficiencia inmunolgica. Sin embargo, esta cifra puede ser an
mayor, si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre,
entre 1.000 y 10.000 podran estar involucrados en el desarrollo y la funcin de las
clulas del sistema inmune (Montoya, 2004).
Las manifestaciones clnicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy
variadas en funcin del defecto inmunolgico, en algunos nios se presenta
desmedro en el crecimiento y en el desarrollo como consecuencia de las
17
infecciones que presentan a repeticin. Otros sntomas que podran estar

asociados a las inmunodeficiencias primarias son; erupciones y alteraciones en la
pigmentacin de la piel, anomalas en el desarrollo de la cara, del sistema
esqueltico y del corazn. Los defectos que implican alguna alteracin en la
funcin de los linfocitos B dan lugar a infecciones pulmonares
recurrentes, a
menudo relacionados con septicemia bacteriana. La carencia de la produccin de

anticuerpos puede tambin aumentar la susceptibilidad a las infecciones por
enterovirus dando como resultado el desarrollo de meningitis viral crnica y
giardiasis gastrointestinal. Las clulas T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fngica ya que colaboran con
las clulas B mediante la
liberacin de citocinas que promueven una respuesta inmune adecuada y efectiva.

As, desrdenes como la inmunodeficiencia combinada severa de LT y LB da
como resultado una mayor susceptibilidad a los patgenos virales, fngicos y
bacterianos (Lim, 2004).
4.1.1 Epidemiologa:
La prevaleca de pacientes con inmunodeficiencias primarias se ha incrementado
de un caso reportado en 1969 a 1 por cada 10.000 nacidos vivos, este incremento
se puede deber particularmente a que son enfermedades de las cuales se
sospecha ms en la actualidad y al mejoramiento de las pruebas utilizadas en la
deteccin de anormalidades inmunolgicas. Algunas de estas pruebas permiten la
identificacin de algunas mutaciones en los genes responsables de estos
desordenes lo que permite detectar mas fcil y rpidamente a este tipo de
pacientes (Lim, 2003).
En la mayora de los casos las inmunodeficiencias primarias se manifiestan en los
primeros cinco aos de vida (90%), pero pueden presentarse a cualquier edad
incluyendo adultos. Con respecto a su distribucin por sexo casi todos los
registros demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001).
18
En cuanto a la prevalencia de inmunodeficiencias primarias se encuentran

diferentes reportes como el publicado por la asociacin latinoamericana de
inmunodeficiencias primarias LAGID en 1998 en el que se encontr que las
inmunodeficiencias primarias por defectos en los anticuerpos son las ms
frecuentes (Zelazko, 1998).
Desordenes de
fagocitos
(9%)
Inmunodeficiencia
combinada severa
(5%)
Deficiencias de
Complemento
(2%)
Anormalidades
asociadas
a defectos en los
granulocitos
(8%)
Sndromes
asociados con
otras
anormalidades
(18%)
Deficiencia de
anticuerpos
(58%)
Figura 1. Distribucin de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la

LAGID (Zelazko, 1998)
En Colombia actualmente los nicos datos de prevalencia de inmunodeficiencias

primarias, son los publicados por el Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la
Universidad de Antioquia, en este estudio se tomaron pacientes a los cuales se les
hizo seguimiento por varios aos, obtenindose que las deficiencias de
anticuerpos son las mas predominantes en nuestro pas seguidas por las
19
deficiencias
combinadas,
estos
datos
concuerdan
con
los
encontrados
mundialmente en otros estudios como los de LAGID en 1998. (Tabla 1)

Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002 (Montoya, 2002)
Fenotipo Predominante
Hombres
Mujeres
Total
Hipoagamaglobulinemia transitoria de la infancia
10
14
Inmunodeficiencia comn variable
11
Agamaglobulinemia congnita
Dficit de IgA
Sndrome de hiper IgM
Deficiencia de anticuerpos con Ig normales
Inmunodeficiencia comn variable con timoma
Deficiencias predominantes de anticuerpos
Subtotal (%)
40 (40.8)
Deficiencias combinadas
Inmunodeficiencia Combinada severa
13
Inmunodeficiencia combinada no severa
inmunodeficiencia celular con Igs normales
Subtotal (%)
21 (21.5)
Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas

con otros defectos mayores
Candidiasis mucocutanea crnica
Sndrome de Wiskott Aldrich
Ataxia Telangiectasia
Anomala de DiGeorge
Enanismo con extremidades cortas
Subtotal (%)
15 (15.3)
Sndromes de inmunodeficiencia asociados con

disfuncin de los fagocitos
Sndrome de hiper IgE con infecciones recurrentes
10
Sndrome de Chediak Higashi
Subtotal (%)
15 (15.3)
Defectos Primarios de las clulas fagocticas

Enfermedad Granulomatosa Crnica
Neutropenia Congnita Severa
Subtotal (%)
6 (6.1)
Deficiencias del complemento

Edema angioneurotico hereditario
55
43
Subtotal (%)
1 (1.0)
Total
20
98 100%
4.2 Clasificacin de las inmunodeficiencias primarias

El aumento reciente sobre el conocimiento de los defectos moleculares de muchas
de las inmunodeficiencias primarias ha llevado a grandes avances en el
diagnstico y manejo de estas patologas permitiendo clasificarlas de acuerdo al
tipo de defecto gentico que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X (Tabla
2) e inmunodeficiencias autosomicas recesivas que a su vez se subclasifican en
inmunodeficiencia
combinada
severa
Tabla
3)
en
no
asociadas
inmunodeficiencia combinada severa (Tabla 4)

Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X (Jones, 2000)
Desorden (ao de
definicin del defecto
molecular)
Enfermedad granulomatosa
crnica ligada a X (1986)
Agamaglobulinemia ligada a
X (1993)
Localizacin
cromosomica
Gen
Defecto
Prueba diagnostica
Componente de
fagocitosis NADPH
Nitro azul de tetrazolio

(NBT), inmunoblot para
gp91phox, anlisis de
mutaciones
Xp21
gp91phox
Xq22
Tirosin Kinasa
de Bruton
Va de sealizacin
intracelular esencial para
la maduracin de clulas
pre-B
Inmunoblot para Btk o

anlisis por citometra de
flujo, anlisis de
mutaciones
Expresin de CD154
sobre LT activados por
citometra de flujo, anlisis
de mutaciones
Expresin de CD145
sobre LT activados por
citometra de flujo, anlisis
de mutaciones
Inmunodeficiencia
combinada severa ligada a X
(1993)
Xq13
Cadena
comn
Componentes de los
receptores para IL-2, IL-4,
IL-7, IL-9, IL-15,
desarrollo de clulas T y
NK, funcin de clulas T y
B
Sndrome de Hyper-IgM
(deficiencia de CD40L)
(1993)
Xq26
CD40L
(CD154)
Cambio de Isotipo,
funcin de LT
Sndrome de Wistkott-Aldrich
(1994)
Xp11
WASP
Sndrome linfoproliferativo
ligado a X (Sndrome de
Duncan) (1998)
Xq25
SAP
Regulacin de la
respuesta de LT a EBV y
otras infecciones virales
Anlisis de mutaciones,
Expresin de SAP
Deficiencia de properdina
(1992)
Xp21
Properdina
Componente terminal del

complemento
Niveles de Properdina
21
Formacin del
Expresin de WASP por
citoesqueleto, movilidad y inmunoblot, anlisis de
trafico de clulas inmunes mutaciones
Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia

combinada severa (Jones, 2000)
Desorden (ao de definicin
del defecto molecular)
Deficiencia de adenosin
deaminasa (ADA) (1983)
Deficiencia de la fosforilasa de
purina (PNP) (1987)
Localizacin
cromosomica
Gen
20q12-13
Adenosin
deaminasa
Enzima en la va de las
purinas, acumulacin de
metabolitos txicos
Niveles de ADA y
metabolitos en eritrocitos,
anlisis de mutaciones
14q11
Fosforilasa
de purina
Enzima en la va de las
purinas, acumulacin de
metabolitos txicos
Niveles de PNP y
metabolitos en eritrocitos,
Defectos en la
recombinacin de DNA
afectando inmunoglobulinas
y el gen del receptor de de
LT
Anlisis de las mutaciones

en RAG1 y RAG2
Funcin y sealizacin del

receptor de LT
Intensidad de fluorescencia
de CD3, anlisis de
mutaciones
Defecto
Prueba diagnostica
Deficiencia del gen de

activacin de la recombinasa
(RAG 1 y 2) (1996) Sndrome
de Omenn
11p13
RAG1 y
RAG2
Deficiencia en el receptor de LT
(1987)
11q23
CD3/CD3
Deficiencia de Zap70 (1994)
2q12
Zap70
Funcin de LT, seleccin de Expresin y activacin de

LTCD8+ durante el
Zap70, anlisis de
desarrollo del timocito
mutaciones
Deficiencia de JAK3 (T-B+NKSCID) (1995)
19p13
JAK3
Receptor de sealizacin
de Il-2, Il-4, IL-7, IL-9, IL-15,
desarrollo de LT y NK,
Funcin de LT y LB
Activacin y expresin de
JAK3, anlisis de
mutaciones
Deficiencia en el receptor de IL7 (1998)
5p13
Receptor
de IL-7
Rol esencial en desarrollo y

funcin de LT
Expresin de IL-7 por

citometra, anlisis de
mutaciones
22
Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia

combinada severa (Jones, 2000)
Desorden (ao de
definicin del defecto
molecular)
Localizacin
cromosomica
Gen
Defecto
Prueba diagnostica
CD11/CD18
Anlisis de la expresin de
Defectos en la adhesin y CD18/CD11 por
migracin de leucocitos
citometra, anlisis de
mutaciones
p47phox,
p67phox,
p22phox
Defectos en la bolsa
respiratoria y muerte
intracelular de fagocitos
1q42
LYST
Anormalidades en los
Inclusiones gigantes en
microtubulos mediado por
los granulocitos, anlisis
las protenas lisosomales
de mutaciones
circulantes
Deficiencia de MHC clase II

(1993)
(1998)
(1995)
(1997)
16p13,
19p12,
1q21,
13q13
CIITA
(MHC2TA),
RFXANK,
RFX5,
RFXAP
Defecto en la regulacin
transcripcional de la
expresin de la
molculas de MHCII
Expresin de MHCII,
Deficiencia de MHC clase I

(1994)
(1999)
6p21
6p21
TAP2
TAP1
Defecto en el ensamblaje
del pptido y en la
presentacin de las
molculas de MHCI
Expresin de MHCI
APT1 (Fas)
Defectos en la apoptosis
de Linfocitos
expresin de Fas,
ensayos de apoptosis,
ATM
Control del ciclo celular y

respuesta de dao de
DNA
Sensibilidad del DNA a la

radiacin, anlisis de
mutaciones
Receptor de
Interfern
, IL-12
p40,
Receptor 1
de IL-12
Defecto en la produccin
de Interfern y en la
funcin de sealizacin
Expresin del receptor de

Interfern , expresin de
IL-12, Expresin del
receptor de IL-12, anlisis
de mutaciones
Deficiencia de adhesin
leucocitaria tipo I (1987)
Enfermedad granulomatosa
crnica (1990)
(1990)
(1988)
Sndrome de Chediak
Hisgashi (1996)
Sndromes autoinmunes
Linfoproliferativos (ALPS)
(1995)
21q22
7q11,
1q25,
16p24
10q24
11q22
Expresin de p47phox,
p67phox, p22phox por
inmunoblot, anlisis de
mutaciones
Ataxia telangiectasia (1995)
Susceptibilidad inherente a
micobacterias
(1996)
(1998)
(1998)
6q23
5q31
19p13
23
4.3 Aspectos Clnicos de las inmunodeficiencias Primarias

4.3.1 Ligadas a X
4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crnica (EGC)
La Enfermedad Granulomatosa Crnica (EGC) es la inmunodeficiencia primaria
por deficiencia de fagocitos ms comnmente diagnosticada, con una mayor
prevalenca en hombres que en mujeres (Cooper, 2003). La EGC es causada por
un defecto funcional en varios componentes de sistema NADPH oxidasa de los
fagocitos (Lim, 2004). Existen dos patrones de herencia: el primero ligado al sexo,
por mutacin en el gen de la phox 91 (Xp21.1), representa la forma ms frecuente
(65%), de comienzo ms temprano y curso ms severo y el segundo; autosmico
recesivo por mutaciones en los genes de la phox 22 (16q24), phox 47 (7q11.23) y
phox 67 (1q25) (Lim, 2004).
Las manifestaciones clnicas comprenden infecciones recurrentes severas y
supurativas; abscesos del tejido subcutneo, el hgado y los pulmones,
gingivoestomatitis,
periodontitis,
adenitis
pigena
supurativa,
osteomielitis
multifocal y enfermedad diarreica recurrente. La mala regulacin en la respuesta

inflamatoria lleva a la formacin de granulomas en muchos rganos que pueden
producir obstruccin de los aparatos digestivo y genitourinario (Rugeles, 2004).
El defecto molecular de la EGC es una deficiencia en la bolsa respiratoria. Los
componentes estructurales de sistema oxidativo NADPH se requieren para la
generacin de superoxido y otras especies reactivas importantes en la fagocitosis
de microorganismos. El sistema NADPH se compone de cuatro componentes, 2
de ellos (phox 91 y phox 22) ubicados en la membrana plasmtica del fagocito
formando el citocromo b558 y otros dos (phox 47 y phox 67) ubicados en el
citoplasma. La activacin del sistema requiere la movilizacin de los componentes
24
citoplasmticos hacia la membrana y su acople al citocromo. La ausencia o

disfuncin de alguno de estos componentes imposibilita el correcto funcionamiento
enzimtico
Figura 2. Relacin entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con
granulomatosis crnica (Mackay, 2000).
4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)

La Agamaglobulinemia ligada a X fue la primera inmunodeficiencia primaria
identificada
en
1952
por
Bruton,
por
lo
que
tambin
es
llamada
agammaglobulinemia de Bruton, en esta enfermedad hay ausencia de clulas B

en sangre perifrica y rganos linfoides debido a un defecto molecular que
imposibilita la supervivencia de la clula B (Rugeles, 2004). Esta enfermedad
afecta exclusivamente a varones, inicia sus manifestaciones clnicas ms
tempranamente que otras formas de deficiencias de anticuerpos. Las principales
25
manifestaciones clnicas son las infecciones recurrentes, pero adems de ellas los
pacientes pueden presentar cuadros de artritis crnica o cuadros semejantes a
dermatomiocitis. Las infecciones virales son controladas normalmente en su
mayora con excepcin de infecciones por enterovirus del sistema nervioso central
(meningoencefalitis crnica). El examen fsico muestra la ausencia de ganglios
linfticos
superficiales
amgdalas.
Las
inmunoglobulinas
sricas
son
indetectables o estn francamente disminuidas (por lo general la IgG es menor de

200 mg/dl) y los linfocitos B en sangre perifrica estn ausentes o muy
disminuidos (menor al 2 %). La inmunidad celular no est afectada (Oleastro,
2001).
Esta deficiencia est determinada por una alteracin en la protena kinasa Btk
(Bruton tirosin kinasa), protena relacionada con la maduracin y proliferacin del
linfocito B. La falta de actividad de esta protena como consecuencia de
mutaciones en el gen que la codifica genera un bloqueo en la maduracin a nivel
del estadio de clulas pre-B (Jones, 2000).
4.3.1.3 Sndrome de Hiper IgM
Se caracteriza por presentar tanto niveles normales como muy elevados de IgM
con marcada hipogammaglobulinemia IgG e IgA. Adems de las infecciones
recurrentes por grmenes extracelulares encapsulados, los pacientes suelen
presentar infecciones por Pneumocystis carinii, episodios de neutropenia,
manifestaciones de autoinmunidad (citopenias hemticas, artritis) y mayor
predisposicin a las neoplasias de estirpe linfoide (linfomas y leucemias). Estos
pacientes comnmente presentan
adenomegalias, hipertrofia amigdalina y
hepatoesplenomegalia. El recuento de linfocitos B circulantes es normal y la

inmunidad celular generalmente est conservada (Oleastro, 2001).
26
La falla molecular responsable se ubica en el ligando de CD40, molcula

normalmente expresada en linfocitos T activados, imprescindible para el cambio
de isotipo de IgM a IgG e IgA. Mutaciones en el gen de esta molcula condicionan
la falta de sntesis o la sntesis de una molcula no funcional (Jones, 2004).
4.3.1.4 Sndrome de Wiskott Aldrich
El sndrome de Wiskott Aldrich (WAS) es una enfermedad recesiva ligada al sexo
con una incidencia mundial de 4 enfermos por cada milln de nios varones
nacidos vivos (Chien, 2004). Se manifiesta por eczema, infecciones recurrentes y
trombocitopenia (Lim, 2004). Las manifestaciones suelen aparecer durante el
primer ao de vida. El eczema adquiere las caractersticas de una dermatitis
atpica
con
gran
tendencia
hemorrgica.
Las
infecciones
se
localizan
principalmente en el tracto respiratorio tanto superior (conjuntivitis, sinusitis, otitis

media) como inferior (bronquitis, neumonas). Los grmenes responsables son
especialmente
microorganismos
pigenos
(Streptococcus
pneumoniae,
Haemophilus influenzae). Las infecciones virales por herpes simple o por varicela
zoster suelen ser severas y condicionar una alta morbimortalidad. El cuadro clnico
puede completarse con manifestaciones de autoinmunidad como vasculitis,
glomerulonefritis o anemias (Lim, 2004).
Las concentraciones de IgM en suero son reducidas, mientras que las
concentraciones de IgA e IgE son elevadas y la IgG se encuentra normal (Lim,
2004). En algunos casos se puede encontrar un dficit de las subclases de IgG2 e
IgG4. La formacin de anticuerpos, especialmente a polisacridos capsulares
bacterianos se encuentra defectuosa, adems los pacientes presentan una pobre
respuesta a antgenos de tipo proteico
(Lim, 2004) como isohemaglutininas y
anticuerpos anti-neumococo (Oleastro, 2001).
27
El gen responsable del sndrome del Wiskott Aldrich codifica para la protena
WASP localizada en el cromosoma Xp11.22-p11.23, se han identificado diferentes
mutaciones localizadas a travs del gen, pero la ms comn envuelve la
sustitucin de nucletidos. La interaccin entre la protena WASP el Cdc42 de la
familia GTPasa Rho y el complejo organizador del citoesqueleto Arp2/3 es muy
importante en la transduccin de seales que cuando presentan algn tipo de
alteracin se refleja en problemas a nivel de sealizacin, polarizacin, movilidad y
fagocitosis de las clulas (Chien, 2004).
4.3.2 Autosomicas recesivas
4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa
Esta forma se presenta solamente en varones y se debe a la falta total de
diferenciacin de precursores linfoides pretmicos. Como consecuencia de ello se
observa una marcada linfopenia con ausencia de linfocitos T maduros. Los
linfocitos B, que se encuentran presentes en nmero normal o incluso aumentado;
son funcionalmente deficientes (agammaglobulinemia). Las clulas NK estn
ausentes o francamente disminuidas
con pobre actividad citotxica (Bonilla,
2003).
El defecto molecular responsable se encuentra en la cadena gamma comn,
cadena que comparten los receptores para varias citocinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e
IL-15). Esta cadena se encuentra asociada a la tirosina kinasa JAK3, unin
necesaria para transmitir la seal de activacin celular hacia el interior de la clula.
Mientras que la disfuncin de los receptores para IL-2 e IL-7 genera el bloqueo en
el desarrollo de LT, la alteracin del receptor para la IL-15 sera la responsable de
la deficiencia de clulas NK. Diferentes tipos de mutaciones en el gen que codifica
para la cadena gamma del receptor de IL-2 generan alteraciones en la
transcripcin necesaria para una sntesis proteica normal (Lim, 2004).
28
4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)

La deficiencia de adenosina deaminasa (ADA), representa aproximadamente el 20
% de todos los casos de Inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) y el 40 % de
los de transmisin autosmica recesiva. ADA, es una enzima que interviene en el
metabolismo de las purinas, transforma reversiblemente la adenosina en inosina y
2' - deoxiadenosina (dAdo) en 2' deoxiinosina. La acumulacin de adenina y dAdo
tiene efectos txicos sobre los linfocitos, especialmente en estados inmaduros
(timocitos). Adems, Ado es fosforilado en dATP, el cual ejerce un efecto
inhibitorio sobre la ribonucletido reductasa, enzima requerida para la sntesis del
ADN. La enzima S-adenosil homocistena hidrolasa (SAH hidrolasa), enzima
necesaria para la normal metilacin del ADN, tambin se ve inactivada por la
acumulacin de estos sustratos.
En el 85 % de los casos de deficiencia de ADA las manifestaciones clnicoinmunolgicas corresponden a una IDCS. Se observa una alta incidencia de
alteraciones neurolgicas y, en el 50 % de los casos, una displasia osteocondral
visible radiolgicamente. Estos individuos presentan una marcada linfopenia con
compromiso variable de las clulas NK. El diagnstico se establece documentando
una actividad enzimtica deficiente en eritrocitos y linfocitos y/o midiendo las altas
concentraciones de dATP (Jones, 2004).
4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)
La fosforilasa de purina (PNP) juega un papel importante en la va salvaje de
purina, la deficiencia de PNP es una enfermedad autosomica recesiva que causa
una deficiencia severa de LT con deficiencias variables en la inmunidad humoral,
los pacientes con deficiencia de PNP presentan infecciones bacterianas, virales y
fngicas recurrentes usualmente en los primeros aos de vida
29
4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2

Se hereda en forma autosmica recesiva y resulta de un defecto en el proceso de
recombinacin de los fragmentos VDJ en la recombinacin gentica de las
inmunoglobulinas, a consecuencia de esto se interrumpe totalmente la
diferenciacin de linfocitos T y B. La diferenciacin de clulas NK no se ve
afectada por lo cual el nmero y la funcionalidad de estas clulas se encuentra
conservado (Jones, 2004).
Rag1 y Rag2 (recombinase-activating gene 1 2) forman un complejo con
actividad endonucleasa requerido para iniciar el proceso de recombinacin de los
genes VDJ durante la formacin de los receptores para antgenos tanto de los
linfocitos T (TCR) como de los B (BCR). Estos receptores son necesarios para
transmitir seales de sobrevida en precursores linfoides durante el desarrollo de
las clulas T y B. Distintas mutaciones en los genes Rag1 o Rag2 son
responsables del desarrollo de la enfermedad (Jones, 2004).
4.3.2.5 Deficiencia de Zap70
Esta deficiencia se transmite en forma autonmica recesiva. La protena ZAP 70
(zeta associated protein 70), protena kinasa expresada exclusivamente en
linfocitos T y clulas NK, juega un papel esencial en el proceso de seleccin
positiva y negativa durante la maduracin tmica de los linfocitos T, principalmente
para los linfocitos que expresan el marcador CD8. Se encuentra unida a la cadena
del complejo CD3 interviniendo en la sealizacin de estas clulas.
Mutaciones en el gen ZAP 70 (o SRK) generan un cuadro de inmunodeficiencia
celular variable en cuanto a su severidad. Es Caracterstico encontrar en los nios
valores normales de linfocitos T CD3+ con predominio de CD4+ y ausencia o
30
disminucin marcada de los CD8+. A pesar de encontrarse en nmero total normal

o incluso elevado,
estos linfocitos CD4+ son incapaces de responder a la
estimulacin in vitro frente a mitgenos especficos o clulas alognicas. Los

linfocitos B y las clulas NK son normales tanto en nmero como en funcin (Lim,
2001).
4.3.2.6 Deficiencia de Jak3
Esta enfermedad se transmite con un patrn de herencia autosmico recesivo. El
defecto molecular se encuentra en la protena kinasa JAK 3 (Janus associated
kinase 3), protena asociada al dominio intracelular de la cadena gamma comn
que interviene en la transduccin de la seal generada tras la unin de las
citocinas a sus respectivos receptores, seal necesaria para que se complete el
desarrollo de linfocitos.
4.3.2.7 Deficiencia de Adhesin leucocitaria
Esta enfermedad de se debe a la falta de expresin de un grupo de protenas
expresadas en la superficie celular denominadas molculas de adhesin (LAD-1 y
LAD-2). LAD-1, de herencia autosmica recesiva, comprende defectos en las
cadenas (CD18) de las molculas LFA1 (CD11a-CD18), CR3 (CD11b-CD18) y
glucoprotena 150-95 (CR4 o CD11c-CD18). La edad de comienzo de las
manifestaciones clnicas y su gravedad dependen del grado de expresin de las
molculas. Las formas severas (menos del 1% de expresin) presentan sus
primeras manifestaciones en el perodo neonatal con retardo en la cada del
cordn umbilical y posterior onfalitis, piodermitis necrotizantes, neumona o sepsis
por S. aureus, Pseudomonas aeruginosa o Escherichia coli. Las formas
moderadas (expresin entre 10-20%) se presentan en edades ms avanzadas con
otitis media aguda, fstulas de tejido celular subcutneo (especialmente
perianales) y periodontitis. Es tpico encontrar lesiones carentes de pus y a nivel
hematolgico se encuentra una marcada neutrofilia.
31
El diagnstico se confirma demostrando por citometra de flujo la ausencia o

disminucin de la expresin de la molcula CD18 en la superficie celular. Las
formas severas tienen un curso fatal en los primeros aos de vida por lo cual
deben ser sometidas a un transplante de medula sea alognico. Para LAD-2 se
ha visto un nmero reducido de pacientes con manifestaciones similares a LAD 1,
acompaadas de talla baja y retardo mental, en los que se ha encontrado
deficiencia de otra molcula denominada Sialil-Lewis X (CD15s) (Oleastro, 2001).
4.3.2.8 Sndrome de Chediak Higashi
Es un desorden autosomico recesivo de todos los grnulos lisosomales contenidos
en las clulas con caractersticas clnicas que envuelven los sistemas
hematopoyeticos y neurolgicos (Mackay, 2000). Esta enfermedad es transmitida
como un rasgo autosomico recesivo que se origina por mutaciones del gen chs1
que codifica para la protena LYST, esta protena es muy importante para la
regulacin del transporte lisosomal y la funcin del citoesqueleto. Este defecto
impide la formacin normal de los fagolisosomas y de los melanosomas, vesculas
importantes en el proceso de fagocitosis (Rugeles, 2004).
Las caractersticas clnicas de este sndrome son infecciones bacterianas
recurrentes especialmente por S. aureus y estreptococos -Hemolticos, defectos
en los nervios perifricos, retardo mental, albinismo ocular y cutneo parcial,
disfuncin plaquetaria y enfermedad periodontal severa (Mackay, 2000).
4.3.2.9 Sndrome linfoproliferativo autoinmune
Se origina por mutaciones en el gen que codifica para la protena adaptadora
SH2D1A que acopla molculas que se encuentran en la superficie de los
leucocitos e interviene en las vas de sealizacin intracelular. La funcin principal
de esta molcula parece ser la regulacin negativa de las seales de activacin de
los linfocitos T, por lo tanto en estos pacientes se describe una proliferacin
linfocitaria descontrolada.
32
La enfermedad se manifiesta generalmente antes de los 5 aos, los nios

afectados no presentan sintomatologa hasta que desarrollan alguna infeccin por
microorganismos intracelulares como el virus de Epstein Barr el desencadenante
mas comn de la sintomatologa (Rugeles, 2004).
4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia
La ataxia telangiectasia es una enfermedad de transmisin autosmica recesiva
caracterizada por presentar ataxia cerebelosa, telangiectasias oculo- cutneas e
infecciones recurrentes. Estas ltimas se presentan por lo general en forma de
otitis, bronquitis purulentas o neumonas. La ataxia que suele hacerse evidente
cuando el nio empieza a caminar, tiene curso progresivo llevando a una gran
incapacidad. Las telangiectasias aparecen a edades variables, por lo general
antes de los 5 aos de edad en conjuntiva bulbar y/o pabellones auriculares
(Oleastro, 2001).
Es caracterstico encontrar la -feto protena elevada en un 95 % de los casos. La
IgG puede encontrarse dentro de los valores normales o incluso estar disminuida,
y puede estar asociada o no a deficiencias de IgG2 o IgG4. En la gran mayora de
los casos la IgA esta ausente al igual que la IgE. La IgM puede estar normal o
elevada. La inmunidad celular, inicialmente poco afectada, va mostrando con el
tiempo una franca linfopenia (Oleastro, 2001).
Una caracterstica muy particular de este cuadro es la hipersensibilidad a las
radiaciones ionizantes y la falla en los mecanismos normales de reparacin del
ADN responsables de rupturas cromosmicas que involucran particularmente a los
genes que codifican para los receptores para el antgeno en el linfocito T y para
las inmunoglobulinas de superficie en los linfocitos B. El pronstico es
desfavorable y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado. Los
33
pacientes suelen fallecer en la segunda dcada de sus vidas por secuelas

pulmonares o enfermedad linfoproliferativa (Lim, 2001).
4.4 Pruebas diagnosticas
La valoracin de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de
inmunodeficiencia primaria requiere de un anlisis cuantitativo, cualitativo o
estructural y de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus
mecanismos de defensa. De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere
evaluar existen diferentes estudios que se pueden organizar por niveles de
complejidad (Figura 3) (Rugeles, 2004)
Paciente con sospecha

De padecer Inmunodeficiencia
Evaluacin clnica + Pruebas de primera etapa
Estudios de segunda etapa
Deficiencias en la
produccin de
anticuerpos
Dosificacin de Igs
Determinacin de LB y LT CD19
Isohemaglutininas
Subclases IgG
Produccin de Antcs Especficos
Estudios de tercera etapa
Produccin anticuerpos in Vitro

Westren blot: Btk, etc
SSCP y Secuenciamiento
Deficiencias en la
Inmunidad mediada
por LT
Deficiencias en las
clulas Fagocticas
Reduccin NBT en placa

Explosin respiratoria por citometra
Beta 2 integrinas en granulocitos
Quimiotaxis en agarosa
Descartar Infeccin por VIH

Hipersensibilidad retardada cutnea
Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25
Dosificacin de Inmunoglobulinas
Deficiencias del
complemento
C3 y C4 Sricos
CH50
Inhibidor de C1 estereasa
CD59 en eritrocitos
Proliferacin y citocinas In Vitro

Determinar enzimas: ADA, PNP
Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc
Westren blot: Protenas NADPH oxidasa

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia

(Rugeles, 2004)
34
4.4.1 Pruebas de primera etapa

Adicional a los datos de la historia clnica y el examen fsico, los anlisis
paraclnicos bsicos aportan informacin valiosa para orientar los estudios
posteriores. Los estudios de primera etapa para estudiar inmunocompetencia son:
Cuadro hematico con velocidad de sedimentacin globular, frotis de sangre
perifrica (FSP) con recuento plaquetario, electroforesis de protenas sericas y
estudios imagenolgicos (Rugeles, 2004).
El FSP es el estudio de las clulas sanguneas por medio de la observacin en un
microscopio de preparaciones coloreadas, ha sido uno de los exmenes ms
antiguos e importantes en el laboratorio clnico y su prctica es de gran utilidad en
hematologa ya que permite visualizar la morfologa celular, estimar el nmero de
clulas en sangre perifrica y determinar la eventual presencia de elementos
atpicos. Los resultados obtenidos con este estudio son un reflejo del
funcionamiento de la mdula sea y de los factores que influyen en las diferentes
poblaciones celulares. Este mtodo permite la evaluacin del estado de
maduracin, las caractersticas tintoriales, el contenido de los grnulos, las
inclusiones y formas celulares, todo lo cual se correlaciona con la fisiopatologa de
ciertas enfermedades, y puede proporcionar una adecuada orientacin en la
evaluacin de la respuesta inmune y un manejo inicial simplificado de los
pacientes.
El FSP es una herramienta de gran valor en la evaluacin del paciente con
infeccin recurrente, sus hallazgos cualitativos y cuantitativos son claves para la
orientacin diagnstica inicial de una IDP (Tabla 5) (Castao, 2003)
35
Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre perifrica observadas en las

inmunodeficiencias primarias (Castao, 2003)
Neutropenia
* Enfermedad de Kostman
* Sndrome de Schwachman
* Neutropenia cclica
* Neutropenia familiar benigna
* Mielokatexis
* Sndrome Chediak-Higashi
* Hipoplasia cartlago-pelo
* Agamaglobulinemia ligada al X
* ID comn variable
* Sndrome Hiper-IgM
* Deficiencia de adhesin leucocitaria
* Tipo III
Linfopenia
* ID combinada severa
* Sndrome de DiGeorge completo
* Hipoplasia cartlago-pelo
* ID comn variable
* Ataxia telangiectasia
Trombicitopenia
* Sndrome Wiskott-Aldrich
* ID comn variable
* Sndrome de Schwachman
* Sndrome Hiper-IgM ligado al X
* Sndrome Chediak-Higashi
Neutrofilia
* Deficiencias de adhesin leucocitaria tipos 1,2,4

* Infecciones bacterianas recurrentes asociadas a las ID
con produccin normal de fagocitos
Linfocitosis
* Enfermedad proliferativa ligada al X

* Sndrome de Omenn
Monocitosis
* Neutropenia familiar benigna

* Enfermedad de Kostmann
Eosinofilia
* Sndrome de Omenn
* Sndrome de Job
* Sndrome Wiskott-Aldrich
* Sndrome Nezelof
* ID combinada severa
Trombocitosis
* Infecciones recurrentes asociadas a las diferentes

inmunodeficiencias
Aumento
* Anemia megaloblstica y clulas blsticas asociadas a

defectos en la maduracin o carencia de cofactores
enzimticos (vitaminas del complejo B)
Disminucin
* Anemia microcticas por infecciones crnicas y recurrentes

o prdidas sanguneas crnicas (Wiskott-Aldrich)
Microtrombocitos: Wiskott-Aldrich
Inclusiones
citoplasmticas
* Granulaciones txicas asociadas a infecciones

* Sndrome de Chediak-Higashi
DISMINUCIN
ALTERACIONES EN EL
NMERO DE CLULAS
AUMENTO
TAMAO
36
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente

elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y
carga
elctrica,
travs
de
una
matriz
gelatinosa
(www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electrof
oresis.html). Es muy til en el diagnstico de trastornos humanos paraprotenicos
como mieloma mltiple y algunas inmunodeficiencias primarias.
En algunas ocasiones se puede detectar con esta tcnica una notable disminucin
en las concentraciones de gamma globulinas sericas como en el caso de la
hipogammaglobulinemia (Figura 4). Por este mtodo no se puede detectar la
reduccin de IgA o IgM a valores muy bajos, ya que representan una fraccin
relativamente pequea del total de inmunoglobulinas sericas (Stites, 1999).
.
Albmina
Alb
Figura 4. Patrn de electroforesis para hipogammaglobulinemia (Stites, 1999)
37
4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa

Existe un nmero de defectos bien definidos en las clulas que participan en la
respuesta inmune humoral, ciertas caractersticas como son el desarrollo de
infecciones en las primeras etapas de la vida y fallas en la respuesta adecuada a
estas, an despus de un tratamiento farmacolgico, hacen pensar en algn tipo
de deficiencia de linfocitos B. La deficiencia de linfocitos B puede ser relativamente
moderada y no presentar sntomas mayores o puede llevar a una deficiencia
severa con una completa prdida en la sntesis y secrecin de anticuerpos (Folds,
2003).
La evaluacin en la produccin de anticuerpos incluye varias pruebas de
laboratorio, como: cuantificacin de los niveles sericos de inmunoglobulinas,
medicin de subclases en los isotipos que las presentan, produccin de
anticuerpos especficos y cuantificacin de linfocitos B entre otras.
4.4.2.1.1 Cuantificacin de Inmunoglobulinas
El estudio de las principales clases de inmunoglobulinas A, G y M, es de especial
inters
en
el
laboratorio
de
inmunologa.
La
determinacin
de
estas
inmunoglobulinas contribuye significativamente al diagnstico de diversas

enfermedades
como
inmunodeficiencias,
gammapatas
monoclonales,
enfermedades infecciosas crnicas y agudas entre otras. Sus cifras sricas

dependen de diversos factores del desarrollo, genticos y ambientales. stos
incluyen: caractersticas tnicas, edad, sexo, antecedentes de alergia, o
infecciones recidivantes y factores geogrficos (Ramos, 2004). Habitualmente en
el laboratorio se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA, los niveles de IgD e IgE
no se realizan de rutina.
38
Se han estandarizado varios mtodos para la cuantificacin serica de las

inmunoglobulinas. El clsico es la inmunodifusin radial que fue utilizada en por
varios aos. Actualmente el mtodo ms usado para la cuantificacin de
inmunoglobulinas es la turbidimetria, esta tcnica es la medida de la turbidez de
una solucin o suspensin en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica
con un espectrofotmetro o se estima mediante comparacin visual con
soluciones de turbidez conocida (www.iqb.es/diccio/t/tu.htm).
4.4.2.1.2 Medicin de subclases de inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas se han agrupado en diferentes subclases de acuerdo a
diferencias que se encuentran en las cadenas pesadas. La IgG se subdivide en
IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (Roit, 2000).
Una deficiencia en las subclases de IgG puede resultar en la produccin alterada
de ciertos tipos de anticuerpos. La deficiencia selectiva de anticuerpos ms
frecuentemente identificada, es una respuesta defectuosa a antgenos de
polisacridos, como los presentes en la cpsula de neumococo, meningococo y
Hemophilus influenzae tipo B. Dado que la IgG2 es el isotipo de anticuerpo
predominante en respuesta a determinados polisacridos, niveles disminuidos de
esta subclase de IgG es la razn de una pobre respuesta a infecciones por
bacterias encapsuladas. Su cuantificacin en el laboratorio se hace principalmente
por la tcnica de nefelometra (Hernandez, 2004).
La nefelometra se utiliza principalmente para medir las reacciones antgenoanticuerpo, la determinacin nefelomtrica de los antgenos se lleva a cabo por la
adicin de cantidades constantes de antisuero especfico a diversas cantidades de
antgeno. Los reactantes resultantes de antgeno y anticuerpo se colocan en un
recipiente bajo un rayo de luz y el grado de dispersin de la luz se mide en una
celda fotoelctrica como densidad ptica (Stites, 1999).
39
4.4.2.1.3 Isohemaglutininas
Dependiendo de la edad del paciente y su grupo sanguneo es posible medir la
presencia de anticuerpos naturales o isohemaglutininas anti-A y anti-B, estos
anticuerpos son predominantemente de clase IgM dirigidos contra antgenos del
grupo sanguneo. Es una prueba til en casos de inmunodeficiencias con falla
selectiva para la formacin de IgM por ejemplo el sndrome de Wiskott Aldrich.
4.4.2.1.4 Produccin de anticuerpos IgG especficos
Otra prueba funcional es la medicin de anticuerpos post-vacnales, con vacunas
de bacterias encapsuladas como Haemophilus influenzae y Neumococo. La
presencia de anticuerpos producidos en respuesta a estas vacunas son indicativos
de una buena respuesta inmune de tipo humoral; sin embargo, cuando existe
fallas a este nivel no se encuentran anticuerpos, especialmente de tipo IgG, contra
estos microorganismos y se asocia a una inmunodeficiencia primaria por
deficiencia de anticuerpos especficos (Folds, 2003).
Los mtodos de cuantificacin de anticuerpos especficos circulantes se realizan
en su mayora utilizando anlisis inmunoenzimaticos (ELISA) (Zielen, 2000;
Neldya, 1998; Wernette, 2003; Kolibab, 2005). En esta tcnica el componente de
fase slida es un antgeno, el anticuerpo por detectarse se une al antgeno y luego
se agrega un anti-anticuerpo unido a una enzima, posteriormente se agrega el
sustrato de la enzima y al reaccionar se forma un producto colorido que se mide
espectofotomtricamente (Stites, 1999). La tcnica de ELISA es una prueba
altamente sensible y especifica (Folds, 2003).
4.4.2.1.5 Cuantificacin de LB por citometra
Los LB expresan diversas molculas de superficie que se pueden detectar por
medio de anticuerpos monoclonales. Las clulas B maduras expresan CD19,
CD20 y HLA-DR. Las clulas B inmaduras pueden expresar molculas adicionales
40
como CD10. Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos se utilizan

para detectar clulas que tienen los marcadores de LB (Stites, 1999).
La cuantificacin de los LB se realiza mediante citometra de flujo. La Citometra
de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente
clulas) alineadas por delante de un haz de lser focalizado. El impacto de cada
clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes
parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores. Estos
convierten dichas seales en seales electrnicas que posteriormente sern
digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetros en una
misma
clula.
Estos
parmetros
son:
- Parmetros relacionados con caractersticas intrnsecas de la clula, como su

tamao
la
complejidad
de
su
ncleo
citoplasma.
- Parmetros relacionados con caractersticas antignicas de cada clula

(inmunofenotipo).
Por lo tanto, la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus
caractersticas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y
complejidad (Figura 5) (www.citometriadeflujo.com).
Figura 5. Fundamento de la Citometra de Flujo (www.citometriadeflujo.com)
41
La representacin grafica de las poblaciones celulares usualmente se realizan

utilizando diagramas de puntos. Estos diagramas son usados habitualmente tanto
en la adquisicin celular como en su anlisis y se presentan sobre un eje de
coordenadas X/Y. Las poblaciones celulares, representadas por agrupaciones
homogneas de puntos, se situarn dependiendo de sus caractersticas fsicas de
dispersin (SSC/FSC) y antignicas (Figura 6) (www.citometriadeflujo.com).
Figura 6. Anlisis de puntos de LB (CD19+) por Citometra de Flujo. Cortesa de Angela

Fonseca, Universidad Javeriana

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutnea retardada
La prueba de hipersensibilidad cutnea retardada es considerada como una
correlacin In Vivo de la inmunidad mediada por clulas, puede ser usada como
mtodo de monitoreo para defectos en la inmunidad mediada por clulas. El
procedimiento de esta prueba consiste en la inoculacin intracutanea de una
cantidad definida de un antgeno conocido como PPD (derivado proteico
purificado) o Candida Albicans. El sitio de la inyeccin se observa por
42
aproximadamente 48-72 horas, observando la aparicin de una ppula, si esta

ppula tiene un dimetro mayor de 2 mm se considera positiva (Folds, 2003).
La mayora de individuos inmunocompetentes presentan una prueba positiva a por
lo menos uno de los dos antgenos, mientras que los individuos con algn tipo de
inmunodeficiencia presentan resultados negativos (Tabla 6) (Stites, 1999).
Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de
hipersensibilidad retardada (Stites, 1999)
Deficiencias inmunitarias
Congnitas
Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral
Ataxia-telangiectasia
Sndrome de Nezelof
Inmunodeficiencia combinada severa
Sndrome de Wiskott-Aldrich
Celulares
Sndrome de DiGeorge
Candidiasis monocutanea
Adquirida
Sndrome de inmunodeficiencia adquirida
Sarcoidoisis
Leucemia linfocitica crnica
Carcinoma
4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometra

Los linfocitos T, poseen dos subgrupos que pueden distinguirse por dos protenas
de superficie especificas para cada uno; los linfocitos T ayudadores expresan en
su superficie la molcula CD4 y los linfocitos T citotxicos expresan CD8. La
mayor parte de los LT CD8+ tienen actividad citotxica es decir, tienen la
propiedad de destruir clulas que expresen molculas extraas en su superficie,
43
estos linfocitos son muy importantes en la defensa contra infecciones virales. Los
linfocitos CD4+ funcionan como clulas cooperadoras promotoras de la
proliferacin, maduracin y funcin inmunitaria de otros tipos celulares mediante la
secrecin de citocinas (Stites, 1999).
Aproximadamente el 70% de los linfocitos T de sangre perifrica son CD4+ o
CD8+ (Stites, 1999) y su cuantificacin se realiza principalmente por la tcnica de
citometra de flujo (Figura 7).
R1
Figura 7. Anlisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometra de Flujo. Cortesa

Dra. Adriana Cuellar. M.Sc, Universidad Javeriana
4.4.2.2.3 Cuantificacin de molculas de superficie por citometra

Los LT expresan en su superficie diversas molculas como molculas de adhesin
entre las que se
inmunoglobulinas, las
encuentran las Caherinas, la sper familia de las

Integrinas, Selectinas y el Proteoglicano. Tambin se
encuentran receptores como el TCR y los receptores tipo Toll al igual que
44
molculas coestimuladoras como el CD28. Todas estas molculas pueden ser

identificadas mediante citometra de flujo, siempre que exista el anticuerpo
monoclonal especfico para cada una.
4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK
La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de algunas
poblaciones celulares especializadas del sistema inmune. Consiste en la
capacidad para interaccionar con otras clulas y destruirlas. Este mecanismo de
respuesta interviene en la defensa frente a infecciones vricas y clulas
neoplsicas, as como en la destruccin de clulas alognicas en transplante de
rganos. Se consideran como prototipos de las clulas especializadas en dicha
funcin a los linfocitos T CD8+ y a las clulas natural killer (Lozano,
http://www.uco.es/grupos/inmunologiamolecula).
La prueba de citotoxicidad por liberacin de cromio se describi hace ms de dos
dcadas y ha sido la tcnica de mayor uso para la determinacin de LT CD8+
especficos de antgeno. Sin embargo, presenta una limitada sensibilidad y el uso
de un istopo radiactivo (51 Cr) puede ser complicado. El principio bsico de la
prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los LT CD8+ de lisar la clula
blanco mediante la liberacin de perforina. La clula blanco que a su vez presenta
el antgeno esta marcada con cromio. Una vez el complejo peptido/CMH es
reconocido por la clula efectora en este caso el linfocito T CD8+ se induce la lsis
mediada por perforina con la liberacin del 51Cr al medio. El sobrenadante es
recuperado y ledo en un contador gama, el resultado se obtiene en cuentas por
minuto (Figura 8) (Herrera, 1999).
45
Figura 8. Prueba de liberacin de cromio (Herrera, 1999).
4.4.2.2.5 Cuantificacin de clulas NK

Las clulas NK son un componente importante del sistema inmune innato, son
capaces de lisar las clulas infectadas por virus o clulas tumorales y son la fuente
de una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de
clulas se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a
infecciones virales.
La cuantificacin de las clulas NK se realiza por citometra de flujo, estas clulas
coexpresan en su superficie las molculas CD16/CD56 por lo que es bastante
sencilla su cuantificacin en sangre perifrica (Figura 9) (Folds, 2003).
46
Figura 9. Anlisis de clulas NK (CD16+/CD56+) por Citometra de Flujo. Cortesa Dra.

Adriana Cuellar.M.Sc, Universidad Javeriana.
4.4.4.3 Pruebas para medir la funcin de las clulas fagocticas

Los neutrfilos son leucocitos derivados de la medula sea con una vida media
finita, que tienen una funcin principal en la defensa contra infecciones
ocasionadas por diferentes microorganismos. El neutrfilo desempea una funcin
principal como clula efectora o asesina. Sin embargo, en el flujo sanguneo y en
los espacios extravasculares, los neutrfilos ejercen efectos antimicrobianos a
travs de interacciones con anticuerpos, complemento y factores quimiotacticos
(Stites, 1999).
Los defectos en la funcin de los neutrfilos se pueden clasificar como
cuantitativos o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el nmero total de
neutrfilos de funcin normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos
cualitativos el numero total de neutrfilos se encuentra normal pero no pueden
ejercer sus funciones microbicidas normales (Stites, 1999).
47
Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas clulas existen varias
clases de pruebas de laboratorio como la reduccin de NBT, la medicin de
radicales libre de oxigeno y la expresin de beta-2 integrinas, entre otras.
4.4.4.3.1 Reduccin de NBT
La muerte de un microorganismo despus de su fagocitosis se debe a la
produccin de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En
algunas enfermedades la fagocitosis no tiene ningn problema pero la produccin
de sustancias toxicas para el microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que
la destruccin no se lleva a cabo correctamente.
El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en
agua que al reducirse forma el formazan, tincin de color azul oscuro. Los
neutrfilos pueden reducir el colorante despus de la ingestin de ltex u otras
partculas, subsecuente a la descarga metablica abrupta generada por la va
derivada del monofosfato de hexosa. (Stites, 199).
La reduccin del NBT es una prueba til para analizar la integridad metablica de
los neutrfilos ya que la falla en la reduccin del colorante se asocia con
enfermedad granulomatosa crnica por lo tanto los neutrfilos de estos pacientes
no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar
radicales superoxido (Stites, 1999).
4.2.2.3.2 Medicin de radicales libres de oxigeno
El desbalance en la produccin de especies reactivas de oxgeno y la defensa
antioxidante provoca un dao oxidativo conocido como estrs oxidativo, que lleva
a una gran cantidad de cambios fisiolgicos y bioqumicos, los cuales provocan el
deterioro y muerte celular. Se puede medir este tipo de dao mediante mtodos
directos e indirectos.
48
Entre los mtodos directos est la medicin de la concentracin de agentes

oxidantes, que es muy difcil debido a su corta vida media. El uso de la
espectrometra de la resonancia de rotacin (espn) de electrones, es la nica
tcnica analtica que mide directamente las especies oxgeno reactivas, pero
debido a su costo y complejidad su aplicacin en el ser humano es difcil. Los
mtodos indirectos se realizan mediante la determinacin de los productos finales
de la accin oxidante sobre algunas molculas biolgicas tales como los lpidos,
cidos nucleicos y protenas. Los mtodos para medir perxidos lipdicos son el
patrn de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algn tipo de
dao celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del cido
araquidnico mediante espectrofotometra UV, los hidroperxidos lipdicos
mediante cromatografa lquida de alta presin (Gastell)
4.2.2.3.4 Quimiotaxis
La
locomocin
direccional
de
los
neutrfilos
hacia
diversos
estmulos
quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cmara de boyden. Las clulas

por analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cmara inferior que
contiene la sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro
pequeo. Los neutrfilos pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el trnsito
hacia la membrana y luego de un periodo de incubacin, el filtro se tie y se
observa al microscopio (Figura 10) (Stites, 1999).
49
Cmara superior con

clulas fagocticas
Filtro
Cmara inferior con
agente quimiotctico
Figura 10. Quimiotaxis en filtro. Cortesa Dra. Diana Patio C. M.Sc. Pontificia Universidad
Javeriana.
4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrfilos

La ingestin de microorganismos por neutrfilos es un proceso que requiere la
produccin de energa por parte de la clula fagoctica. La internacin de
microorganismos recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy
rpido despus del contacto con neutrfilos ya que los procesos intracelulares
subsecuentes dependen del xito de la fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis
proporcionan un mtodo rpido y relativamente simple para evaluar el proceso
fagoctico en general (Stites, 1999).
50
4.2.2.3.6 Adherencia
En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesin de las
clulas fagocticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrfilo se
encuentra en un estado de patrullaje permanente y que el mecanismo de
adherencia esta mediado por una serie de citocinas y factores qumicos que lo
inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis.
4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento
El sistema del complemento trabaja en asocio con otros componentes del sistema
inmune innato y adaptativo, proporcionando vas y mecanismos para la
destruccin de microorganismos o clulas daadas. Esta conformado por ms de
40 glicoproteinas que trabajan en cascada y existen en el plasma en forma de
precursores.
La mayora de las protenas del complemento son codificadas por genes
autosomicos. Sin embargo, individuos con defectos heterocigticos usualmente
son asintomticos, en contraste los pacientes que presentan condicin homocigota
son sintomticos y pueden ser detectados mediante la realizacin de pruebas
funcionales. Las pruebas de laboratorio especificas para los componentes del
complemento incluyen: CH50, cuantificacin de C3 y C4 e inhibidor de C1
estereasa entre otros (Folds, 2003).
4.2.2.4.1 Cuantificacin de C3 y C4
Muchas de las protenas del complemento pueden ser cuantificadas por mtodos
inmunoquimicos como nefelometra, inmunoprecipitacin, turbidimetria, RIA y
ELISA (Wen, 2004). Actualmente la tcnica ms utilizada es la turbidimetria.
51
4.2.2.4.3 Complemento hemoltico 50 (CH50)

La prueba de CH50 esta basada en un ensayo hemoltico, en el que un complejo
inmune es formado por la adicin de anticuerpos que interactan con antgenos de
la superficie de los glbulos rojos de carnero.
Cuando el complemento es activado por los anticuerpos que se encuentran fijados
sobre la superficie de los glbulos rojos, estos son lisados y la hemoglobina es
liberada. Los resultados son expresados en base a la ltima dilucin del suero que
causa lisis del 50% de las clulas.
4.2.2.4.4 CD59 en eritrocitos

El antgeno CD59 es un regulador fisiolgico de la activacin del complemento, se
encuentra disminuido o ausente en ciertas poblaciones de las clulas sanguneas,
condicionando una mayor susceptibilidad a hemlisis intravascular, mediada por
complemento.
La tcnica de citometra de flujo es la ms utilizada para El empleo de anticuerpos
monoclonales fluorescentes especficos y su deteccin por citometra de flujo
permite la demostracin de deficiencias, an cuando las poblaciones celulares
afectadas sean escasas. Por ello, es comn que en pacientes con esta
enfermedad, la citometra de flujo sea diagnstica, aun cuando las pruebas
tradicionales de hemlisis en medio cido o en presencia de inulina, que requieren
de abundancia de clulas deficientes, arrojen resultados negativos (Argelles,
2002)
52
4.2.3 Pruebas de tercera etapa

4.2.3.1.1 Produccin de anticuerpos in vitro
La activacin de los LB por antgenos o mitgenos genera cantidades pequeas,
pero detectables de inmunoglobulinas policlonales. Despus de 7-10 das de
cultivo, estos productos se miden mediante RIA o ELISA (Stites, 1999). El RIA es
una tcnica de anlisis en el que una pequea cantidad de sustancia marcada
radiactivamente, es desplazada de su unin especfica por otra similar no marcada
que va a competir con la sustancia marcada radiactivamente. Al sistema de
fijacin elegido se le agrega una cantidad indeterminada de antgeno marcado,
posteriormente se le agrega una cantidad de antgeno sin marcar o sea el suero
problema, as se establece la competencia por los sitios de unin del anticuerpo,
sigue la incubacin a 37 grados Celsius, procediendo a los lavados mediante los
cuales se realiza la separacin del antgeno unido y del libre, de la cantidad de
antgeno marcado fijado a diferentes concentraciones se hace una curva que
permite encontrar cualquier concentracin de antgeno no marcado que sea
desconocido (Arano, 2002). Sin embargo, esta prueba ya no se realiza de rutina
en el laboratorio.
4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO
Las Btk, BLNK y NEMO, estn relacionadas con la maduracin y proliferacin del
linfocito B, y se pueden determinar por Western Blot.
En la prueba de Western blot primero se debe hacer una electroforesis en gel de
duodecil sulfato sodico poliacrilamida (SDS-PAGE), luego las proteinas obtenidas
se transfieren a una matriz de soporte por ejemplo nitrocelulosa donde se emplea
un anticuerpo primario para localizar la protena de inters en este caso Btk, BLNK
o NEMO, un segundo anticuerpo marcado con una enzima y contra la especie en
53
la que se produjo el anticuerpo monoclonal que usualmente es ratn. El anticuerpo

secundario se puede marcar de diversas formas con el fin de producir una seal
detectable, que va a ser observada como bandas en el papel de nitrocelulosa
(Stites, 1999)
4.2.3.1.3 Anlisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP)
SSCP es el mtodo ms simple y ms usado para la deteccin de mutaciones. El

PCR se utiliza para amplificar la regin del inters y el DNA resultante es separado
como una molcula de cadena sencilla por electroforesis en un gel de
poliacrilamida no denaturante. Cada uno de los filamentos de DNA migrara de
manera diferencial de los otros si presenta alguna mutacin as sea de una sola
base, se cree que estos diferentes patrones de migracin se deben a cambios en
la estructura terciaria del DNA. Estas mutaciones son detectadas como bandas
nuevas en los autoradiogramas (deteccin radiactiva) ya sea por tincin de plata
o por el uso de primers fluorescentes que posteriormente se analizaran en un
secuenciador automatizado (Youil, 1996)

4.2.3.2.1 Linfoproliferacin con mitgenos
En esta prueba se busca medir la habilidad de los linfocitos para proliferar en
respuesta a una variedad de estmulos como son los mitgenos. Se han empleado
diversas lectinas de plantas y otras sustancias como la fitohemaglutinina y la
concavalina A para evaluar la funcin de linfocitos humanos. En esta tcnica se
obtienen linfocitos mediante gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se establecen
cultivos por triplicado en microplacas a una concentracin de 1x 106 linfocitos por
mililitro, se aaden los mitgenos a diversas concentraciones, los cultivos se
incuban a 37C al 5% de CO2 durante 72 horas. En este tiempo los mitgenos han
54
producido su efecto mximo sobre la sntesis de DNA. La sntesis de DNA se mide

mediante el marcaje de los cultivos con intermitencias de timidina tritiada (3H-Tdr),
este es un precursor de nuclesido que se incorpora en el DNA que se acaba de
sintetizar. La cantidad de 3H-Tdr incorporada es relativa a la velocidad de sntesis
del DNA y se determina por la cuenta de centelleos en un espectrofotmetro de
lquido de centelleo (Stites, 1999).
4.2.3.2.2 Cuantificacin de la produccin de citocinas In vitro
Esta tcnica consiste en el cultivo de clulas mononucleares de sangre perifrica
con
un
antgeno
especifico
anticuerpos
coestimuladores,
luego
de
aproximadamente 6-8 horas se pueden medir las citoquinas en el sobrenadante

del cultivo. La proporcin de citoquinas secretadas por las clulas en el cultivo se
puede determinar por ELISA, ELISPOT y mas recientemente por citometra de
flujo (Folds, 2003).
El ELISPOT o ensayo de inmunospot conjugado a actividad enzimtica, esta
diseado para cuantificar clulas individuales que estn secretando una protena
concreta in vitro. Est basado en el protocolo bsico de ELISA, originalmente
diseado para el anlisis de clulas secretoras de anticuerpos determinados, se
ha adaptado para poder medir frecuencia de clulas produciendo y secretando
molculas efectoras (citocinas), en estado de reposo, tras estimulacin o en
estados patolgicos.
4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1
La protena ZAP-70 se encuentra expresada exclusivamente en linfocitos T y
clulas NK y juega un papel esencial en el proceso de seleccin positiva y
negativa durante la maduracin tmica de los linfocitos T. la protena kinasa JAK3
esta asociada al dominio intracelular de la cadena gamma comn que interviene
en la transduccin de la seal generada tras la unin de las citocinas a sus
respectivos receptores, seal necesaria para que se complete el desarrollo de
55
linfocitos, estas protenas se encuentran alteradas principalmente en la

inmunodeficiencia combinada severa, por lo que su analisis se hace muy
importante en el diagnostico de esta patologa. Su cuantificacin se puede realizar
mediante la prueba de western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti- ZAP70, JAK3 y STAT-1.
4.2.3.3 Pruebas para medir la funcin de clulas fagocticas

4.2.3.3.1 Western blot para protenas del sistema NADPH oxidasa
Para realizar la prueba de Western Blot para evaluar el sistema NADPH oxidasa
se realiza primero una electroforesis en gel de poliacriamida (SDS-PAGE) de la
membrana del neutrfilo y sus fracciones citosolicas. A las bandas obtenidas de
esta electroforesis se le agregan anticuerpos monoclonales del ratn contra
gp91phox, gp22phox, p47phox o p67phox y se detectan con un anticuerpo anti
IgG de ratn conjugada con fosfatasa alcalina (Boer,1998).
56
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen

pruebas inmunolgicas especificas para el diagnostico de pacientes con
inmunodeficiencias primarias.
Se halla poca informacin sobre las pruebas clnicas de laboratorio que

existen para un adecuado manejo de pacientes con inmunodeficiencias
primarias.
El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal

medico establecer un diagnostico acertado que podra prevenir o disminuir
la estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias llevando a que
estos presenten una mejor calidad de vida.
57
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62
63

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GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS

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Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas,

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A Dios que siempre esta a mi lado guindome.

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Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas

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Fundamento de la Citometra de Flujo

Anlisis de puntos de LB (CD19+) por Citometra de Flujo

Anlisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por

Prueba de liberacin de cromio

Anlisis de clulas NK (CD16+/CD56+) por Citometra

Figura 10. Quimiotaxis en filtro.

3.1 Objetivo General

3.2 Objetivos especficos

4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias

4.2 Clasificacin de las inmunodeficiencias primarias

4.3 Aspectos Clnicos de las inmunodeficiencias Primarias

4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crnica (EGC)

4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)

4.3.1.3 Sndrome de Hiper IgM

4.3.1.4 Sndrome de Wiskott Aldrich

4.3.2 Autosomicas recesivas

4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)

4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2

4.3.2.5 Deficiencia de Zap70

4.3.2.6 Deficiencia de Jak3

4.3.2.7 Deficiencia de Adhesin leucocitaria

4.3.2.8 Sndrome de Chediak Higashi

4.3.2.9 Sndrome linfoproliferativo autoinmune

4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia

4.4 Pruebas diagnosticas

4.4.1 Pruebas de primera etapa

4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa

4.4.2.1 Pruebas para medir la produccin de anticuerpos

4.4.2.1.1 Cuantificacin de Inmunoglobulinas

4.4.2.1.2 Medicin de subclases de inmunoglobulinas

4.4.2.1.4 Produccin de anticuerpos IgG especficos

4.4.2.1.5 Cuantificacin de LB por citometra

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutnea retardada