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Instituto Politcnico Nacional

Escuela nacional de Ciencias Biolgicas


Laboratorio de Mtodos de Anlisis

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry

Profesor: Francisco Fernndez Lpez


Alumna:
Chato morris gutierrez
Grupo: 4IM1

Semestre: 15/2

Seccin: 3

OBJETIVOS:
a) Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas
empleando un mtodo fotomtrico.
b) Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa en la
precisin y exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.
c) Conocer el efecto de sustancias no proteicas, en el desarrollo de color.

d) Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry, con respecto a


otros mtodos para la cuantificacin de protenas.
FUNDAMENTO:
El mtodo de Lowry utiliza tres sistemas para producir coloracin por la
presencia de protenas. En primer lugar, el Cu +, forma complejos de
coordinacin con dos enlaces peptidicos consecutivos de las protenas, dando
lugar a un compuesto coloreado azul. En segundo lugar, este compuesto es
capaz de reducir el reactivo de Folin-Ciocalteu (cido fosfotungstico y
fosfomolibdico), dando un color mas azulado. Por ltimo, el reactivo de FolinCiocalteu tambin reacciona con los restos tirosinil (residuos de tirosina) de la
cadena polipeptidica, produciendo as mismo un color azul por la reduccin de
fosfomolibdato en medio bsico.
RESULTADOS:
Tabla 1. Curva de calibracin de albmina
Tubo
No.

Cantidad de
protena

A595
Serie a

Serie b

(g)
1

25

0.023

0.029

50

0.080

0.043

75

0.119

0.110

100

0.142

0.130

125

0.186

0.188

Tabla 2. Resultados de la regresin lineal


Aplicando la regresin lineal a la curva graficada
R

0.9815

0.001586

-0.0139

Curva de calibracin (Lowry)


f(x) = 0x - 0.01
R = 0.96

Grafica 1. Representacin de la curva de calibracin.


De la ecuacin de la curva y=0.001586x - 0.0139 donde y es la absorbancia
y x la concentracin de protena, despejando a x obtenemos; x=
( y +0.0139) 0.001586 .
Tabla 3. Replicas para el anlisis estadstico obtenidas con la ecuacin de la
curva.
Tubo No.

A595

Cantidad de
protena
(x); (g)

0.132

92.0239

0.110

78.1525

0.124

86.9798

0.121

85.0882

0.107

76.2610

0.104

74.3648

0.108

76.8915

0.108

76.8915

0.108

76.8915

10

0.109

77.5215

Tabla 4. Resultados del anlisis estadstico realizado con las concentraciones


obtenidas.
XX
80.1070

= XX

S2

%C.V.

5.8051

33.6991

7.2466

75.95-84.25

= 80.10
%C.V. =

t: t tablas (2.262)

ts/ n

S
XX

(2.262 x 5.80)/ 10
x 100

%C.V. =

= 80.10 4.12

5.80
80.10

x 100 = 7.24 %

Tabla 5. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el mtodo


de Bradford.
Tubo No.

sustancia

A595

Cantidad de
protena

Tipo de
interferenci
a generada

Tris 1M, pH
7.0

0.156

107.15

Positiva

Glicerol al
1% (v/v)

0.147

101.48

Positiva

Detergente
comercial al
1%

0.161

110.30

Positiva

Dodecil
sulfato de
sodio al 1%

0.134

93.28

Positiva

cido
tricloroacti
co al 5%

0.129

90.13

Positiva

Tabla 6. Comparacin del mtodo de Lowry con otros mtodos de


determinacin de protena (ventajas y desventajas)
Mtodo de Biuret

Mtodo de Bradford

Mtodo de absorcin
en uv (280nm)

ventajas

desventaja
s

En un
mtodo
general

Es menos
sensible

Su A
mxima
es a
540nm

Tiene que
ser en medio
alcalino

Es ms
rpido

No
detecta
N2 de
fuentes
no
proteicas

ventajas
Es ms
rpido

desventaj
as

ventajas

desventa
jas

Reacciona
con los
iones
amonio

Es rpido

Los cidos
nucleicos
tambin
absorben
a 280nm

Es ms
sensible
detecta
1g/ml

El color
varia con
diferentes
tipos de
protena

Es ms
sensible

La
solucin
debe ser
lo ms
clara
posible

Necesita
ms
cantidad de
muestra

Reacciona
con los 20
aminocido
s

Los
detergente
s
interfieren

No existe
interferenci
as con los
Buffer

Se
requiere
un
sistema
puro

Presenta
opalescencia
por
presencia de
carbohidrato
s

Su A
mxima es
a 595nm

El color
puede
unirse a las
celdas de
cuarzo

No
destruye
las
protenas

Es solo
para
aminocid
os
aromatico
s

La reaccin
se puede
completar
en 2 min.

Preguntas:
a) Cumple su curva la Ley de Bouguer y Beer?
R: Si
b) Entre qu lmites de cantidad de protena?
R: En las concentraciones ms bajas y ms altas de la protena
determinada (25-125g).
DISCUSIN:
En la prctica me toco realizar la curva de calibracin en la cual se obtuvo un
coeficiente de correlacin de .9815 el cual es aceptable, pero al visualizar la
grafica se observan los puntos alejados de la linealidad y esto puede deberse a
que el da de la realizacin de la practica me encontraba con gripa y esto

genero un poco de distraccin en mi manera de trabajar lo cual ocasiono que


agregara algunas gotas de mas en los tubos.
Para el anlisis estadstico le correspondi elaborar las repeticiones a mi
compaero en las cuales obtuvo un %C.V. de 7.24 pero ya que la concentracin
obtenida para las concentraciones viene de el despeje de la ecuacin de la
curva y esta nos dio una ordenada al origen negativa la cual se esperaba
positiva, dicho resultado tambin se debe a la forma de trabajar que tuve en el
momento del desarrollo de la prctica, teniendo en cuenta no solo que tenia
gripa sino que esta es la primer practica que realizo en un ao tena un poco
olvidado el manejo de el material en el laboratorio.
De la obtencin de la ecuacin de la curva es de donde provienen los
resultados obtenidos en cuanto a las concentraciones de las interferencias y
estas nos dieron como resultado para la prctica una interferencia positiva lo
que quiere decir que entonces nuestras concentraciones en las repeticiones
nos dieron elevadas por causa de dichas interferencias. Pero al tener en cuenta
que l %C.V. es de 7.24 se tiene un poco en duda los resultados obtenidos de
esta determinacin.
CONCLUSINES:

El mtodo de Lowry cumple la ley de Bouguer y Beer y sirve para la


cuantificacin de protenas
Es un mtodo especfico ya que identifica solo aminocidos aromticos.
El mtodo de Lowry es un mtodo ms utilizado en cuanto a los otros
mtodos y es ms sensible que el mtodo de Biuret.
El mtodo de Lowry con respecto a Bradford es menos sensible y ms
tardado con el mismo nivel de confiabilidad.

BIBLIOGRAFA:

Voet, Donald. Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel


molecular. 2 edicin. Editorial Panamericana, p.c. 99.
Roca, Pilar. Bioqumica. Tcnicas y mtodos. Editorial Hlice, 2003,
p.c. 155-158
http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf

ANEXO

Pruebas para establecer diferencias en exactitud y precisin entre los mtodos


de Lowry y Bradford.

Prueba de la t

tcalculada = D x

n
SD

XX1
SD XX2 tcalculD
prueba estn
ada ( XX1(Bradfo
dar
XX2)
rd)
(Lowr
y)

tcalcul
t
confianza
1.89
diferencia
entre los

79.9896

Fcalculada=
S2 Lowry
209.280

10
8.52

= 1.89

89.5006

78.152 11.348
5 1

83.4298

86.979 -3.55
significativa en la exactitud
8

<2.262 por lo tanto no hay una


mtodos.

83.227
4
90.1077

85.088 -1.8608
2
76.261 6.9664

la F

74.364 15.742 S 2 mayor


8 9
2

S menor

88.0841
S2
Bradford
86.8699
248.769
80.799
86.8689

existen
precisin

= 5.1 x

tablas: 2.262 al 95% de

83.2274

Prueba de

92.023 ada
9 12.034
3

76.891 11.192
F
5 6

tablas: 4.03 al 95% de


confianza

76.891 9.9784
5

76.891 3.9075Fcalculada= 248.769 =1.188


209.280
5
77.521 9.34731.188<4.03 por lo tanto no
diferencias significativas en la
5

de los dos mtodos.

DX
5.10
38

8.518
1

1.89

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