Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Gua de Laboratorio
2002
2002
ANTECEDENTES GENERALES
Profesor Responsable: Sr. Alejandro Riquelme E.
Colaboradores: Sr.
Srta.
Manuel Pinto C.
Maritza Berti D.
Semestre:
primer semestre
Duracin: 5 semanas
Tipo de asignatura: Electiva
Requisito: Bioqumica General
N horas prcticas: 4 horas semanales
(la parte terica ser entregada en una gua de laboratorio)
Nmero de Unidades Docentes: 3
Horario de clases: Mircoles de 16 a 19 h
Prctico 1
Introduccin
8 de Mayo
Un solo grupo de 15 alumnos
Determinacin de pH
Espectroscopia
Centrifugacin
15 de Mayo
Prctico 2
Enzimologa
Grupo I
22 de
Mayo
Grupo II
29 de
Mayo
Grupo III
Grupo II
Grupo III
Grupo I
Grupo III
Grupo I
Grupo II
Fecha
Ponderacin
15 de Mayo
22 de Mayo
29 de Mayo
(25%)
(25%)
(25%)
05 de Junio
(25%)
McGraw-Hill-
Introduccin
Tcnicas de Analticas Cuantitativas
Pipetas:
1. Pipetas Pasteur
Llenar hasta los dos tercios del volumen como mximo
Remover la ultima gota desde la punta
2. Pipetas Graduadas
-Con graduacin milimtrica sin marcacin del final, llenar hasta la marca mas
alta
Remover hasta la ultima gota.
-Con graduacin milimtrica con marcacin del volumen final, llenar hasta la
marca mas alta.
Detenerse en la marca inferior. No remover el liquido hasta ultima gota
3. Pipetas Volumtricas
Mejor precisin.
Posee un solo volumen, con solo dos marcas, superior e inferior.
No remover la ultima gota, se debe llegar hasta la marca inferior.
4. Sistemas para pipetear
Existen un sistema de "pera de goma" que se coloca en la boca superior de la
pipeta y permite succionar el liquido, tambin existen sistemas similares a las
jeringas que por medio de un vstago se succiona el liquido y tambin hay
sistemas elctricos y automticos de bombeo.
5. Micropipetas
Son pipetas automticas que sirven para tomar volmenes muy pequeos
(0,1-1000 L)
Mediante un sistema de pistn se hace vaco para succionar la muestra.
Se emplean puntas desechables para la toma de muestras
Clculos de Concentracin
Molar = moles / litro = M (molaridad)
mol = numero de Avogadro = 6,023 x 10
23
tomos o molculas
Nomenclatura
Prefijo
Abreviatur Factor
megakilo-
a
M
K
milimicronanopico-
n
p
10 6
10 3
10 0
10-3
10-6
10-9
10-12
Otras Concentraciones
8
Problemas:
1. Dado un compuesto X que posee la siguiente masa molecular
que 1 mmol = 37 mg y se realiza una solucin 0,02 mg / ml.
Cual es la molaridad?
1 mol = 37 g ,
as
Experimento 1A.
Calibracin de Micropipetas
9
10
Calibracin de Micropipetas
El volumen tomado por la micropipeta es determinado por el peso de la cantidad
tomada y dividida por la densidad del agua.
-Colocar la micropipeta en 100 l, llenar la punta de la micropipeta con agua a
temperatura ambiente y depositarlo en un pequeo recipiente (puede ser un tubo
Eppendorf). Colocarlo en una balanza analtica y anotar el peso. Repetir esto 10
veces.
-Calcular el volumen tomado y tabular los resultados (Estar seguro de anotar la
temperatura del agua).
Repetir el procedimiento usando esta vez agua con hielo (Recuerde anotar la nueva
temperatura usando un termmetro).
Determine el volumen
soluciones.
11
Laboratorio 1B.
Anlisis Espectrofotomtrico de Clorofila
Informacin General:
La clorofila extrada con acetona al 80% v/v de hojas verdes son verdes. El extracto de
clorofila puede variar en la profundidad o intensidad del verde dependiendo del material
vegetal desde el cual fue extrado. Anlisis cuidadoso basado en la inspeccin visual
es un mejor medida cualitativa y permite realizar algunas mediciones cuantitativas o
capacita para distinguir entre las variaciones de la molcula de clorofila.
Para entender mas acerca de la clorofila extrada, un espectrofotmetro es necesario
para realizar anlisis electrnico de los posibles extractos y darnos un mayor
informacin cuantitativa basado en la luz absorbida a longitudes de onda especificas.
En Angiospermas (la mayora de las plantas terrestres) hay tpicamente dos tipos de
molculas de Clorofila (Chl), llamadas, clorofila a (Chl a) and clorofila b (Chl b). Estos
pigmentos absorben fotones de luz en la regin del espectro azul y rojo, pero las
longitudes de onda especificas que ellos absorben son diferentes. Ser determinada la
absorbancia de fotones a 663 nm y 645 nm, especifico para Chl a y Chl b,
respectivamente. Debido que el espectro de absorcin
(figura que integra las
longitudes de onda de la luz absorbida) de estas dos molculas de Chl se sobreponen,
usted usar una ecuacin simultanea para determinar la cantidad de ambos pigmentos.
La ecuacin para esto es conocida como ecuacin de Arnon. La ecuacin de Arnon
dar la informacin cuantitativa acerca de la Chl a y Chl b.
Materiales:
Los materiales necesarios para este procedimiento incluye un mortero y vstago, papel
filtro, embudo y un espectrofotmetro. Hay varios modelos de espectrofotmetros
disponibles. Las instrucciones sobre el correcto uso de ellos son dadas en el apndice
de este manual.
Mtodo.
Los estudiantes trabajarn en pares y coordinaran su actividad con un segundo par de
estudiantes. Habr una variedad de plantas disponibles en el laboratorio. Planear su
trabajo para que usted y su compaero estn trabajando con plantas diferentes al otro
grupo. Usted y su compaero tomarn muestras de diferentes plantas y determinar la
cantidad de Chl en las hojas. Cuando usted haya terminado su trabajo compartir su
informacin con el otro par de estudiantes.
En esta experiencia de laboratorio usted usar cubetas para contener los extractos
basados en acetona durante la medicin de absorcin. La acetona daa algunos
materiales plsticos. por eso el uso de cubetas de vidrio es recomendable. Vidrio Pirex
funciona bien para las determinaciones con luz de longitud de onda en el visible.
Algunas cubetas son hechas de cuarzo y son como el vidrio pero son mucho mas caras
y requieren gran cuidado.
12
Usted tomar una pequea cantidad de la hoja; en la realidad usted necesita solamente
una pequea cantidad de tejido as que la planta no es destruida. La muestra ser
pesada as que la cantidad de Chl puede ser determinada en base del peso fresco de
la hoja. La muestra de hoja ser homogeneizada en acetona al 80%; este es un
solvente que extrae las molculas hidrofobicas de Chl desde su medioambiente en la
membrana y la hace soluble. La muestra estar turbia debido a las protenas
desnaturadas y las fibras de paredes celulares, as que ser filtrada para producir una
solucin limpia pticamente.
Protocolo:
1. Tomar aproximadamente 50 a 100 mg de tejido foliar de una planta con una
tijera. No use los tallos o venas gruesas por que ellas son muy duras para moler.
Determine el peso exacto con una balanza analtica. Los ayudantes de
laboratorio demostrarn el uso correcto de las balanzas. Todos sus datos
debern ser anotados en un cuaderno, no confe en su memoria!
2. Colocar el tejido en un mortero y agregar 10 ml de acetona al 80 %
(acetona : agua 80:20 v/v). Moler el tejido con un vstago. Usted debe moler
completamente el tejido. Un poco de arena de cuarzo puede ayudar a una buena
molienda de los tejidos.
3. Colocar un embudo en un tubo de ensayo y colocar un papel filtro en el cono.
Pasar el homogenato a travs del papel filtro. Lo retenido es eliminado y el
filtrado es colectado en el tubo de ensayo. El filtrado puede ser llamado un
extracto.
4. Si usted necesita mas informacin sobre el uso de un espectrofotmetro en
particular, usted deber consultar el apndice del manual o preguntar al profesor
o al ayudante.
5. Obtenga una cubeta limpia y llene dos tercios con acetona 80% acetona; este es
llamado el blanco. Poner la cubeta en el espectrofotmetro y fije la longitud de
onda en 663 nm. El haz de luz pasa a travs del compartimiento de la muestra
en una direccin particular, de esta forma los lados transparentes deben estar
orientados de acuerdo a esto. Usted limpiara con un papel suave (tis) los lados
transparentes de la cubeta, para asegurarse que ellos estn secos antes de
insertarlos en compartimiento de la muestra. Presione apropiadamente los
botones para que el espectrofotmetro se ajuste a 0 de absorbancia con la
cubeta blanco colocada. Sacar la cubeta blanco y colocarla en un lugar seguro
para ser usada mas tarde.
6. Agitar el filtrado en el tubo de ensayo y usarlo para llenar hasta los dos tercios la
segunda cubeta y limpiar con el papel tis, si es necesario. Colocar esta cubeta
muestra en el espectrofotmetro. La lectura ser dada como A663. Escribir este
nmero. Sacar la cubeta muestra y guardarla para los siguientes pasos.
7. Cambiar la longitud de onda a 645 nm. Reinserte la cubeta blanco y coloque
nuevamente el cero en el espectrofotmetro en la nueva longitud de onda. Sacra
la cubeta blanco e inserte la cubeta muestra. Lea la A645.
8. Enjuague las cubetas con agua destilada y squelas colocndolas invertidas
sobre una toalla Nova y djelas en un lugar seguro. No las deje en el borde de
los mesones!
13
Clculos:
La ecuacin de Arnon es til para convertir las mediciones de absorbancia a mg de
Chl / g de hoja.
((12,7 x A663) - (2,6 x A645)) x mL de acetona
Chl a (mg / g de hoja) =
mg de hoja
((22,9 x A645) - 4,68 x A663)) x mL de acetona
Chl b (mg / g de hoja) =
mg de hoja
Total Chl = Chl a + Chl b
Estas ecuaciones fueron publicadas por D.I. Arnon (1949) Plant Physiol. 24: 1.
Anlisis:
Usted ahora tiene la capacidad para informar el contenido de Chl de las plantas
escogidas. Usted ser capaz de determinar el contenido de Chl de casi todas las
plantas. Si usted no esta conforme con lo realizado, y si aun hay tiempo usted podra
repetir el experimento para obtener mejores datos
1. Convenza al instructor que usted ha determinado cuidadosamente el contenido
de Chl total por gramo de hoja para las dos plantas suministradas.
2. Comparta sus resultados con el otro par de estudiantes en su equipo. Escriba un
resumen o haga una tabla de las cuatro plantas estudiadas por su equipo.
3. Las plantas normales tienen una razn de Chl a /Chl b de aproximadamente 3.
Algunos mutantes son deficientes en Chl b y tienen valores de Chl a / Chl b
mayores de 3. Tambin hay algunas condiciones tanto biticas (enfermedades)
como abiticas (estrs ambientales) que afectan esta relacin obteniendo
valores de Chl a /Chl b menores de 3. Que es lo que piensas con respecto a las
plantas que usted analiz?
Preguntas Especificas:
[P1.] Por que las plantas tienen Clorofila?
[P2.] Por que fue necesario moler las hojas con acetona al 80% en vez de agua?
[P3.] Cual es el propsito de la cubeta blanco?
[P4.] Cual es la relacin entre la concentracin de la molcula absorbedora y el
valor de absorbancia?
[P5.] Que colores son las longitudes de onda medidas para clorofila? Por que
no usar la luz verde (550 nm) para medir clorofila?
14
APENDICE 1:
A. Gua general para todos los espectrofotmetros.
1. Un adecuado tiempo de calentamiento aumentar el rendimiento del
instrumento. Espectrofotmetros mas viejos pueden requerir seleccionar la
lmpara y espejos apropiados para la longitud de onda usada. Los
espectrofotmetros mas nuevos tienden a ser mas automticos.
2. Los instrumentos de doble haz son usualmente menos susceptibles a trabajar
sobre tiempo como los instrumentos de un solo haz. Nunca coloque una cubeta
en el haz de referencia de un instrumento de doble haz a menos que lo hayas
definido como necesario y entiendes los posibles artefactos.
3. Aumentando el ancho de la ranura dars lecturas mas estables para muestras
con alta absorbancia. Una ancha ranura subestimar la absorbancia de
compuestos con
picos
de absorcin angostos. Los mas baratos
espectrofotmetros tienen un solo y fijo ancho de ranura.
4. Estar seguro que tu estas usando cubetas de cuarzo cuando estas trabajando
con longitudes de onda en el UV.
5. Los mas viejos espectrofotmetros son inexactos sobre 1.0 de absorbancia, los
mas nuevos espectrofotmetros son exactos por lo menos para 2 unidades de
absorbancia.
6. Manteniendo la misma orientacin de una cubeta usada para mltiples lecturas
mejorar la precisin y exactitud.
7. No tocar las superficies pticas de la cubeta. Guardar apropiadamente en su
caja.
8. Enjuagar las cubetas inmediatamente despus de usar con agua destilada o
desionizada y secar con un papel suave.
9. Si las cubetas estn sucias, tratar de limpiarlas con detergente y agua. Si es
necesario, use cido ntrico al 50% (Con mucho cuidado!).
10. No llenar las cubetas ni dentro ni sobre el equipo.
11. Estar seguro del uso correcto o el blanco apropiado para hacer el cero en el
instrumento.
Bausch & Lomb Spectronic 21
Es un buen ejemplo de los espectrofotmetro con un solo haz de luz.
1. Encender el instrumento POWER ON y permitir que se caliente por 20 minutos
aproximadamente.
2. Cambiar la longitud de onda a 663 nm girando la perilla que se encuentra en al
parte superior del equipo. (Recuerde que cuando quiera usar longitudes menores
que 340 nm debe cambiar el espejo y encender la lmpara de Deuterio
presionando por unos segundos el botn correspondiente).
3. Seleccionar el modo de medicin mediante la perilla que se encuentra en la
parte frontal superior derecha seleccionando en el modo Absorbancia.
4. Colocar una mezcla de acetona / agua (80:20 v/v) en una cubeta de vidrio
(cubeta blanco), limpiar con un papel suave, y colocar el blanco en el equipo
15
Instrucciones:
1. Encienda colocando en ON el interruptor. El interruptor esta en el costado
posterior izquierdo. Espere que se complete el AUTO TEST.
2. Colocar el cursor en la palabra FIJA. En la pantalla aparecer una serie de
parmetros que se pueden modificar. El MODO aparecer como prefijado en
ABS (Absorbancia). Existen otras posibilidades como %T (Transmitancia) y CON
(multiplica por un factor).
3. Modificar la longitud de onda. Colocando el cursor en la palabra LONGITUD DE
ONDA. Presione el botn EDIT y coloque el nuevo valor para finalizar presione
ENTER.
4. Ambas lmparas, (Deuterio para luz UV; Tungsteno para luz visible), estn
ahora encendidas. Si usted esta usando una longitud de onda de 350 nm o
menor, debe asegurarse que esta encendida la lmpara de Deuterio. El paso de
una lmpara a otra se hace en forma automtica.
5. Abrir la puerta del compartimiento; insertar la cubeta con la solucin blanco en el
espectrofotmetro y cerrar la puerta.
6. Presionar el botn de ZERO/BASE
7. Abrir el compartimiento y sacar el blanco
8. Insertar la muestra y cerrar la puerta del compartimiento.
9. Presionar el botn RUN y leer los datos.
B. Espectrofotometra
16
UV
400nm
800nm
IR
Visible
= c/v
E = hv = hc/
Principios:
Ley de Beer-Lambert
Anlisis cualitativo, porque los compuestos absorben luz en longitudes de onda
caractersticas (nm, )
Absorbancia
longitud de onda
17
b
It
I0
Se establece que :
log It/I0= - a b c
Donde :
Io = Intensidad incidente
It = Intensidad transmitida
b = longitud del paso de luz
c = concentracin del compuesto
a = absortividad caracterstica del compuesto
Para eliminar los nmeros negativos, la ecuacin anterior puede ser transformada como
- log It / Io = a b c
log
I o / It = a b c
A= a b c
Ley de Beer-Lambert
Unidades:
"A" no debe tener unidades
"b" usualmente es 1 cm
"c" puede tener unidades de mg/ml, g/l, mol/l, etc.
"a" debe tener unidades reciprocas de "b c"
ejemplo: c tiene unidades de mg/ml
b = 1 cm
a debe tener unidades de (mg/ml) -1 (cm) -1
a b c = (mg/ml) -1 (cm) -1 (mg/ml) cm = sin unidades
Coeficiente Absortividad
18
pendiente = a b
(c)oncentracin
19
Laboratorio 1C.
Anlisis de Titulacin de un aminocido
20
Introduccin:
Los aminocidos son ejemplos comunes de una biomolcula simple que tiene dos o
mas grupos titulables. Al igual que el buffer HEPES tiene dos grupos titulables. Esto es
importante para comprender muchos procesos bioqumicos de molculas ionizables. La
ionizacin de cada grupo sigue la ecuacin de Henderson-Hasselbalch. Por ejemplo,
glicina tiene dos grupos ionizables: un grupo carboxilo y un grupo amino, con valores
de pKa de 2,4 y 9,6 respectivamente. En agua a pH 6, la glicina existe como un ion
dipolar, o zwitterion, en el cual el grupo carboxilo esta desprotonado (-COO-) y el grupo
amino esta protonado para dar un ion amonio (-NH 3+).
Adicionando cido a una solucin de glicina, la solucin bajar de pH rpidamente
primero y luego mas lentamente debido a la accin ejercida por el grupo carboxilo. A pH
2,4 el pKa es alcanzado, una mitad del cido ha sido consumido, y el grupo carboxilo
esta medio ionizado y en este punto es mas efectivo como buffer. La adicin de mas
cido resultara en la titulacin de los grupos carboxilos remanentes. La titulacin de los
grupos de ion amonio (amino) con base sigue una curva similar en la regin alcalina.
Especficamente , la concentracin de las especies protonadas y desprotonadas de
cada ion en algn pH pueden ser calculadas por la ecuacin de HendersonHasselbalch. La interseccin entre la titulacin del grupo carboxilo y el grupo amino esta
el punto en el cual la glicina no tiene carga neta, y este punto es llamado punto
isolectrico o pI.
Curva de titulacin de glicina
14
pKa2= 9,6
pH
pI = 6
pKa1= 2,4
21
Materiales:
En cualquier laboratorio hoy en da, un pH-metro es usado para determinar el pH de
una solucin. El profesor y los ayudantes demostrar el uso correcto de un pH-metro.
Cada grupo calibrar su pH-metro de acuerdo a las instrucciones dadas por los
ayudantes.
Parte Experimental
Este ejercicio los introducir a las propiedades cido / base de los aminocidos. El
aminocido usado aqu ser la glicina.
El plan general es subir el pH de una solucin de glicina (0,4 M) a aproximadamente 1,5
por la adicin de 1,0 M de HCl, y entonces agregar alcuotas de 2,0 ml de 1,0 M de
KOH a la solucin de glicina para proceder a la curva de titulacin.
Protocolo.
1. Comenzar el experimento con la adicin del HCl 1.0 M a 40-mL de solucin de
Glicina agitando constantemente hasta obtener un pH de aproximadamente 1,5.
Si el equipamiento del laboratorio lo permite, colocar una barra magntica dentro del
vaso que contiene la muestra y colocarlo en una agitador magntico.
2. Colocar en una tabla de datos en tu cuaderno de laboratorio con el siguiente
encabezado.
mL de KOH pH de la solucin de
Glicina
0
*
1
*
2
*
etc.
*
pH del agua
22
0
1
2
etc.
*
*
*
*
mmol KOH
Preguntas:
1) Cul es el rango de pH en el cual cada solucin es amortiguado?
2) Diga las diferencias significativas entre las dos curvas de valoracin
3) Dibujar las 4 posibles formas inicas de glicina
4) Identificar cuales de estas formas son predominantes a pH 1, pH 6, y pH 11, y que
no existen en el agua.
5) Identificar los dos pKa's de la glicina.
6) Escriba las ecuaciones mostrando como la glicina puede tamponar las soluciones en
su pKa por consumo de pequeas cantidades agregadas de iones hidrogeno o
hidrxido.
Apndice 2.
I. Consideraciones tericas
En este experimento se desarrollar bajo el fenmeno de disociacin cido - base. La
definicin general de un cido es una molcula que puede disociarse y liberar iones
hidrogeno. De la misma forma , una base es una molcula que puede aceptar iones
hidrogeno. La siguiente ecuacin muestra la disociacin del cido dbil, cido actico:
23
CH3COOH
CH3COO- + H+
La disociacin de un cido dbil tal como el cido actico obedece la ley de accin de
masas que es descrita por la ecuacin:
CH3COO- H+
K =
CH3COOH
donde K es la constante de disociacin y los trminos entre parntesis cuadrado
representan la concentracin de las molculas indicadas en moles por litro. La cantidad
de iones hidrogeno que son liberados cuando un cido o base dbil es disuelto en una
solucin puede ser descrito por la siguiente ecuacin:
[H+] = KC
donde C es la concentracin del cido dbil en sus formas protonada y desprotonada.
Que es,
C = [CH3COO-] + [CH3COOH]
A. Derivacin de la ecuacin Henderson-Hasselbalch.
La ecuacin de Henderson-Hasselbalch es usada para describir la accin de un
"buffer" cuando un cido o una base fuerte es adicionada a un cido o base dbil.
Rearreglando la ecuacin de accin de masas dada anteriormente:
1
CH3COO-
CH3COOH
=
H+
24
Amortiguadores
PIPES, sal sdica
Imidazol-HCl
MOPS
HEPES
Tris
Peso Formula
pKa a 20 C
pKa/C
A250 of 0.1M
335.3
104.5
209.3
238.3
121.1
6.81 0.15
7.04 0.15
7.20 0.15
7.55 0.15
8.30 0.15
-0.009
-0.017
-0.006
-0.014
-0.031
<0.05
<0.005
<0.01
<0.005
<0.01
25
II. pH-Metro
1. El pH Metro, posee la precisin de un mili voltmetro, mide potenciales de
electrodo y los transforma a unidades de pH y corresponde a la siguiente
equivalencia:
59mv => 1 pH
2. El electrodo para medir pH (figura 1)
1) Es un bulbo de vidrio sensible al pH (permeable a los H +), que detecta
el voltage producido entre las soluciones que se encuentran en la parte
externa e interna del bulbo de vidrio.
cable
LABORATORIO N2
CINTICA ENZIMTICA
Srta. Maritza Berti
26
INTRODUCCIN.
Funcin y clasificacin de las enzimas
Las enzimas son protenas que tienen la funcin de catalizar todas las
reacciones qumicas que ocurren dentro de los organismos vivos. Estas se designan y
se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan. Los seis grupos
principales son: Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, y Ligasas (Sintetasas).
Cada enzima se designa con un nombre sistemtico y por un nmero que la
identifica de acuerdo a los grupos y subgrupos. Tambin tienen un nombre mas comn
que muchas veces resulta ms prctico y ms conveniente de usar que el nombre
sistemtico.
Sustancia
transformada, s
27
b
a
Tiempo, t
1 U = 1 mol min-1
1 katal = 1 mol s-1
1 U = kat/60 = 16,67 nkat.
La pureza de la enzima se expresa en trminos de actividad especfica que se
define como el nmero de unidades enzimticas por milgramo de protena. La actividad
especfica en unidades SI se expresa como katals por kilogramo de protena
V s__
s + Km
V = Velocidad mxima
Km = Concentracin de sustrato correspondiente a la
mitad de la velocidad mxima
Actividad
enzimtica, v
Vmax
Vmax
28
Km
Concentracin de sustrato, s
y cuando
_s_ = 0,
v
= - Km
s_
v
Km
V
Pendiente
1_
V
29
- Km
Figura 4: Recta correspondiente a los recprocos de la ecuacin de MichaelisMenten multiplicados por s, para la determinacin de las constantes Km y Vm.
Sustrato
transformado
en el tiempo
30
T
Temperatura
Figura 5: Temperatura ptima (T) de una enzima
Modelo enzimtico
La enzima que se utilizar en todos los ensayos de este prctico es la a-amilasa
de cebada. Esta enzima cataliza la hidrlisis de los enlaces a 1-4 del almidn
produciendo azcares reductores que pueden detectarse mediante el reactivo 3,5 dinitrosaliclato el cual se reduce a cido 3-amino-5-dinitro saliclico produciendo una
coloracin que se mide a 540 nm. Otra forma de detectar la actividad a-amilasa es a
travs del reactivo de Iodo I 3, obtenido haciendo una mezcla entre ioduro de potasio e I 2
(lugol) el cual forma un complejo con el almidn dando un color azul detectado a 620
nm. En este caso se mide la disminucin de la absorbancia ya que a medida que la
enzima acta la concentracin de almidn va disminuyendo. En este prctico se usar
este ltimo mtodo debido a su mayor simplicidad.
MATERIALES Y MTODOS
Extraccin de a- amilasas
Pesar 5 semillas de cebada previamente peladas. Homogenizar el tejido en un
mortero con 1,5 mL de buffer de extraccin (Acetato de sodio 0,01 M pH 5,0 + CaCl 2
0,1 M) y luego centrifugar en un tubo eppendorf a 15.000 rpm por 10 min. Trasvasijar
31
NOTA: Los valores de las constantes fueron obtenidos de una curva de calibracin de
Absorbancia versus grs de almidn donde p=0,00125 y a = 0,0359. (gpf= gramos de
peso fresco).
32
x _10_ x __1__
gpf
1000
LABORATORIO N 3
BIOENERGTICA
Los Procesos de Fotosntesis y Respiracin en Vegetales
Sr. Manuel Pinto.
33
Introduccin
El crecimiento en los vegetales es el producto de la sntesis y acumulacin de nuevas
biomolculas que se producen por la transformacin, al interior de la clula, de dos
tipos de sustratos: uno orgnico y otro mineral. El sustrato orgnico es el ms
abundante y proporciona tanto las estructuras carbonadas que servirn de base para la
nueva sntesis como la energa necesaria para efectuarla. Este sustrato corresponde
por lo general a hidratos de carbonos dentro de los cuales la glucosa es el ms
importante. Por su parte el sustrato mineral, menos abundante pero igualmente
importante, corresponde a los elementos minerales absorbidos por las races que
durante la sntesis se unen a las molculas orgnicas para permitirles cumplir diversas
funciones, Figura 6.
Sustrato
Mineral
Fotosntesis Sustrato
Orgnico
SUSTRATO
TOTAL
Respiracin
Estructuras
Carbonadas
Energa
ATP
CRECIMIENTO
VEGETAL
34
SOL
4 fotones
PSII
PS I
4e-
2H2O
O2 + 4 e- + 4H+
3ADP + Pi
2 NADPH2
3ATP
35
lo que significa que en este tipo de plantas el requerimiento energtico mnimo para la
reduccin de una molcula de CO2 el ciclo de Calvin es de 2 NADPH+ y 3 ATP que
a la postre significa una Exigencia cuntica mnimo (Eq) de 8 fotones por cada CO 2
reducido u O2 desprendido desde el agua.
B) en las plantas con metabolismo C4 ,
6 CO2 + 12 NADPH+ + 30 ATP
lo que significa que en este tipo de plantas el requerimiento energtico mnimo para la
reduccin de una molcula de CO 2 es de 2 NADPH+ y 5 ATP que a la postre
significan una Exigencia cuntica mnima de aproximadamente 12 fotones por CO 2
reducido u O2 desprendido desde el agua. Los 2 ATP de diferencia respecto de lo
necesitado por una planta C 3 corresponden a las necesidades energticas extras del
ciclo C4 que opera en conjunto con el ciclo de Calvin en este tipo de plantas.
La glucosa as sintetizada puede ser utilizada para proporcionar cadenas carbonadas
para servir de esqueleto en la sntesis de nuevas molculas (hidratos de carbono de
reserva y estructuras, protenas, cidos nucleicos, lpidos etc.) y para proporcionar la
energa (ATP) necesaria para dicha sntesis, Figura 1. Este tipo de trabajo biolgico los
organismos vivos y por lo tanto, tambin las plantas lo efectan a travs del
metabolismo respiratorio.
la Gliclisis,
36
Reservas
Fotosntesis
GLUCOSA
Gliclisis
4 NADH2
2 ATP
CO2
Ciclo de
Krebs
6 NADH2
2 FADH2
2 ATP
O2
Fosforilacin Oxidativa
1NADH2 = 3 ATP
1FADH2 = 2 ATP
1 Glucosa = 38 ATP
Figura 8.- Esquema del proceso de la Respiracin
La Gliclisis
La gliclisis es el punto de partida de la oxidacin de la glucosa que en el caso de las
semillas de cereales proviene de la hidrlisis del almidn de reserva.
Amilasas
37
Almidn + H2O
( Glucosas ) n
Fosforilacin oxidativa
La fosforilacin oxidativa es el proceso que ocurre en las mitocondrias mediante el cual
los compuestos reducidos, producidos en la Gliclisis y en le ciclo de Krebs (NADH 2 y
FADH2) se oxidan por accin del O 2 liberando energa que es finalmente utilizada para
la sntesis de ATP . Por cada NADH2 y FADH2 oxidados se producen 3 ATP y 2 ATP
respectivamente.
La produccin energtica final de la oxidacin de un mol de Glucosa en la respiracin
es por lo tanto, de 38 moles de ATP producindose al mismo tiempo la liberacin de 6
moles de CO2 y consumindose 6 moles de O2.
C6H12O6 + 6 O2
Este balance ilustra bien la importancia del oxgeno durante la germinacin de la semilla
ya que sin el suministro adecuado de este elemento el metabolismo energtico de la
semilla se ver afectado y por lo tanto, no habr suficiente ATP ni estructuras
38
Fase I
Fase II
Fase III
Crecimiento
por reservas
+ fotosntesis
Crecimiento
por reservas
20
(mg)
40
Consumo
de reservas
10
15
20
30
39
Figura 9.- Evolucin del peso seco de las distintas partes de la plntula de
trigo durante las tres fases energticas de sus primeros estados
de desarrollo
En la primera fase, hasta los 15 das despus de siembra, todas las estructuras carbonadas y la
energa necesaria para el crecimiento provienen del desdoblamiento de las reservas seminales que
dan origen al denominado sustrato orgnico total (ST) . Este sustrato, por lo tanto, se puede
dividir, en aquel destinado a proporcionar estructuras (St) y aquel destinado a proporcionar
nicamente energa (Se). Por lo tanto:
ST = St +
Se
La eficiencia del crecimiento durante la germinacin
Durante la fase hetertrofa se produce, en consecuencia, el consumo de las reservas
de las que solo St va a quedar incorporado como ganancia neta en las estructuras de
la parte area (tallos y hojas) y de la raz, y Se va a ser totalmente oxidado en la
respiracin para producir la energa para la transformacin de St. As la eficiencia (Ec)
a la cual se produce este consumo de reservas se puede calcular a partir de:
Ec = St (St + Se)
40
este valor revela que el trigo, durante la fase hetertrofa, es bastante eficiente en
transformar sus reservas en estructuras radiculares y de la parte area. Esto es
consecuencia de que las molculas constituyentes de la plntula son probablemente
de estructura muy similar a la del almidn de reserva, por lo que las transformaciones
de este son menores y por lo tanto, no requieren de un gran consumo energtico. En el
caso del frejol en cambio esta eficiencia es cercana a 0,60 indicando que el consumo
energtico es mayor, cercano al 40 % de las reservas. Esto es probablemente debido al
alto contenido proteico de sus estructuras lo cual requiere una mayor inversin
energtica para la transformacin del sustrato. En el caso de oleaginosas como la
maravilla, por el hecho de tener reservas ms bien lipdicas, con mayor contenido
energtico que los hidratos de carbono y las protenas, el consumo de reservas con
fines energticos es considerablemente menor lo que hace que en estas semillas Ec
sea superior a 0,85. Es decir en este caso menos de un 15% de las reservas son
destinadas a la produccin energtica y por lo tanto, la mayor parte de ellas se usan
para formar estructuras.
El metabolismo encargado de sustentar todas las transformaciones descritas es la
respiracin y por lo tanto, es importante analizar en forma general algunas de sus
reacciones.
41
O2
Pt
Ag
Membrana
Pt
Ptox + HOH + 2 e-
42
El electrodo se sita en la base (a) de una cmara hermtica, compuesta de tres partes
y bajo la parte (b) donde se sita el tejido foliar al que se le va a medir la tasa de
evolucin de O2 , Figura 11.
Fuente de luz
(c)
Cmara de medicin
(b)
(d)
Cmara del electrodo
(a)
Computador
43
20
A, mol O2 m-2 s-1
Amax
0
Ro
PCL
500
1000
1500
2000
Intensidad Luminosa ( mol fotones m-2 s-1)
Figura 12.- Curva caracterstica de la evolucin de la fotosntesis neta (A, mol O 2 m-2
s-1) en funcin de la intensidad luminosa
Objetivo: el objetivo de este trabajo de laboratorio ser analizar los fundamentos del
mtodo usado para cuantificar el O2 desprendido por un disco de hoja de 10 cm 2 en
funcin de la intensidad de radiacin incidente con el fin de determinar los parmetros
descritos en la Figura 7.
Materiales y Equipos:
Oxgrafo (Hansatech, UK)
Computador dotado de sofware LeafDisc (Hansatech, UK)
Manual de calibracin del Oxgrafo
Sistema de control de temperatura por circulacin de agua
Solucin de KOH saturada
Cilindro de CO2 10.000 ppm
Jeringas de 1 y 10 mL
Sacabocados de 10 cm2
Plantas de poroto con hojas desarrolladas
Procedimiento
Luego de calibrar el oxgrafo segn lo sealado en el manual del equipo procdase de
la siguiente manera:
a) corte un disco de hoja de 10 cm2 con el sacabocados
b) abra la cmara del oxgrafo y deposite el disco de hoja en el comportamiento
especial sobre la gradilla
c) cierre hermticamente la cmara
d) abra las vlvulas laterales e inyecte 10 mL de CO 2 (10.000 ppm) extrados con una
44
e)
f)
g)
h)
i)
ALMIDN + H2O
C6H12O6 + 6O2
(180 g )
(GLUCOSA)n
6CO2 + 6H2O + 38 ATP
(192g )
( 264g )
(108g )
45
Materiales y Equipos:
Estos materiales son para un grupo de seis alumnos en que tres alumnos trabajarn
midiendo la respiracin en semillas germinando a 15C y los otros tres en semillas
germinando a 30C.
Cmara de cultivo con control de temperatura
Equipo de circulacin de agua con control de temperatura
Analizador Infrarrojo de CO2
Registrador o Computador con software apropiado
12 placas Petri
2 pinzas
30 semillas de trigo pregerminadas
12 discos de papel filtro estril de dimetro similar a la placa Petri
3 picetas con agua destilada estril
1 rollo de film plstico (eurofilm)
12 jeringas plsticas de 1 mL
6 marcadores de tinta
1 rollo de cinta de papel engomado
Procedimiento
a) Pregerminar semillas de trigo en papel hmedo por 48 horas a temperatura
ambiente.
b) Cada alumno dispondr de dos placas Petri que deber identificar con las letras A y
B ms el subndice 15 o 30 C segn la temperatura que le toque analizar.
c) Colocar dos discos de papel por placa Petri y luego humedecerlas con agua
destilada estril. Colocar sobre el papel las semillas pregerminadas (2 3) y dejar
equilibrar a la temperatura correspondiente por espacio de 15 minutos.
d) Cubrir la placa con film plstico de manera que queden hermticamente cerradas.
e) Registrar el tiempo y extraer una muestra de aire (0,5 mL) desde cada placa con
una jeringa de 1 mL perforando el film plstico con la aguja y marcar la jeringa con el
papel engomado con la marca To (tiempo cero), Figura 13.
f) Guardar la jeringa insertada en una goma, a temperatura ambiente, hasta el
momento del anlisis y tapar la perforacin con otro pedazo de film plstico.
46
47
Jeringa de muestreo
Semillas en germinacin
Figura 13.- Extraccin de muestra de gas desde placa Petri con semillas
g) Colocar las placas con las semillas en la cmara de cultivo regulando previamente la
temperatura al nivel deseado.
h) Muestrear tres veces cada 15 minutos
i) Inyectar las muestras de gas al sistema de medicin IRGA, segn Figura 14.
j) Determinar la altura de la seal y luego calcular la concentracin de CO 2 en funcin
de una curva de calibracin previamente establecida usando muestras con
concentraciones conocidas de CO2, Figura 15
k) Calcular la cantidad de CO2 respirado por semilla en cada tratamiento de
temperatura
Registrador
IRGA
30 ppm
Referencia
Muestra
N2
48
Volts
1,5
1,0
0,5
300
600
CO2 ppm
900
Clculos
Gc = CR x 180 / 264
49
LABORATORIO N4
EXTRACCIN Y ANLISIS DEL DNA
Sr. Alejandro Riquelme
INTRODUCCIN
En este laboratorio ustedes podrn extraer el DNA de una variedad de clulas y ver las
molculas que resultan con sus propios ojos. Para aprovechar mejor la prctica usted
deber entender la teora celular debido que es esencial para adquirir los conceptos
de bioqumica y gentica que se desarrollarn en el laboratorio. Esta actividad ser una
manera eficaz de reforzar lo que ustedes ya saben sobre las clulas y podrn ver sus
posibles aplicaciones al campo de la agronoma.
METODOLOGA:
-
Las clulas sern tratadas qumicamente para romper la clula y las membranas
nucleares.
La porcin de la mezcla que contienen el DNA (la porcin acuosa) ser separada de
la porcin que contiene las membranas y las protenas asociadas (la porcin
lipdica) .
Sern analizadas las protenas que protegen el DNA y que la mantienen firmemente
en un estado enrollado.
La solucin que contiene el DNA disuelto ser alterada de modo que el DNA
precipite.
50
PROTOCOLO GENERAL
1. LISIS \ HOMOGENEIZACIN: 1 ml reactivo de Chomczynski + 25 - 50 mg de
clulas del tejido 0,1 ml de muestra lquida.
2. Centrifugacin (Opcional): 10.000 g x 10 minutos.
3. PRECIPITACIN DEL DNA: lisado + 0,5 ml de etanol al 100%.
4. LAVADO DEL DNA: 1 ml de etanol de 75% (2x).
5. SOLUBILIZACIN DEL DNA: 8 mM NaOH o agua.
El procedimiento se realiza a la temperatura ambiente, a menos que est indicado de
otra manera. Reactivo requeridos: etanol y 8 mM NaOH.
51
1. LISIS / HOMOGENIZACIN
En General.
Homogenice los tejidos en un homogeneizador manual de vidrio-Tefln. Utilice un
homogenizador con una tolerancia mayor de 0,1-0,15 mm. Homogenice el tejido (25-50
mg) en 1 ml de reactivo de Chomczynski aplicando la menor cantidad de movimientos
posibles. Tpicamente, 5-10 movimientos se requieren para la homogeneizacin
completa. Las cantidades pequeas (5-10 mg) de tejidos suaves, tales como bazo o
cerebro se pueden dispersar y lisar por repetitivos pipeteos con una micropipeta.
Guardar el homogenato por 5-10 minutos a temperatura ambiente.
a) Tejidos: Homogenice las muestras de tejido con 1 ml de la Solucin de
Chomczynski por 50-100 mg de tejido, usando un homogenizador de vidrio con
tefln (uno en el que el mbolo encaje con soltura) y homogenice
completamente con el mnimo de golpes (normalmente se necesitan de 5-10
golpes). Si se trata de pequeas de un tejido suave (como el bazo y el
cerebro), se puede fragmentar y lisar por pipeteo repetido con una micropipeta.
los tejidos de plantas deben ser pulverizados antes mezclarlos con la solucin
de Chomczynski, lo que se puede hacer eficientemente si primero se congelan
en nitrgeno lquido o hielo seco con etanol.
b) Clulas crecidas como monocapa: Lise las clulas directamente en la placa de
cultivo, aadiendo 0.75-1.0. ml de Solucin de Chomczynski por cada 10 cm 2
del rea de la placa de cultivo (1 ml en una placa de 3.5 cm de dimetro),
agitando la placa y pasando suavemente con una pipeta el lisado celular a un
tubo nuevo.
c) Clular crecidas en suspensin: Aada 1 ml de Solucin de Chomczynski por
cada 1-3 x 107 clulas, sedimentadas o en suspensin, cuyo volumen no
exceda o.1 ml, y lise las clulas por pipeteo suave y repetido.
d) Ncleos de clulas: Aada 1ml de Solucin de Chomczynski por cada 1-3 x 10 7
ncleos de clulas, sedimentados o en suspensin, cuyo volumen no exceda
0,1 ml, y lise los ncleos por inversin del tubo o pipeteo suave y repetido
e) Sangre: Con muestras de hasta 100l de sangre, aada 1 ml de Solucin de
Chomczynski y lise las clulas por pipeteo suave y repetido. Si el volumen de
la muestra es mayor de 100l, entonces mezcle la sangre, en proporcin 1.5,
con un buffer de lisis (Sacarosa 0.32 M, tris 10 mM pH 7.5, MgCl 2 5 mM y
Tritn X-100 1%), y agite suavemente hasta lograr la lisis celular. Centrifugue a
4000 rpm (1000xg) por 10 min a 2-8C y deseche el sobrenadante (puede
usar una pipeta Pasteur). Aada 1ml de Solucin de Chomczynski y lise el
precipitado o sedimento de ncleos por pipeteo suave y repetido.
2. Centrifugacin (Opcional)
Sedimente el homogenato por centrifugacin a 10.000 g por 10 minutos a 4-25 C.
Luego, transfiera el sobrenadante viscoso que resulta a un tubo limpio.
Este paso quita los fragmentos insolubles del tejido, el RNA parcialmente hidrolizados
y el exceso de los polisacridos del lisado/homogenato. Se requiere solamente para el
52
aislamiento del DNA de tejidos tales como hgado, msculos y la mayora de tejidos de
planta que contienen una cantidad grande de material celular y/o extracelular y tambin
se recomienda para el aislamiento de RNA libre de DNA.
3. PRECIPITACIN DEL DNA
i.
Precipite el DNA del lisado/homogenato por la adicin de 0,5 ml de etanol al
100% por cada ml de reactivo de Chomczynski usado para la extraccin.
ii.
Mezcle las muestras invirtiendo los tubos 5-8 veces y mantngalas a la
temperatura ambiente por 1-3 minutos. Cercirese de que el reactivo de
Chomczynski y el etanol se mezclen bien para formar una solucin homognea.
El DNA debe llegar a ser rpidamente visible como precipitado blancuzco.
iii.
Si el precipitado de DNA es suficientemente grande, se puede pescar con una
punta de pipeta o una bagueta, enrollarlo sobre sta, y moverlo hacia la boca del
tubo, dejndolo en la pared del tubo cerca de la boca (otra alternatva es
transferirlo a un tubo nuevo). Deseche el sobrenadante con mucho cuidado,
coloque el tubo verticalmente por 1 min y elimine por aspiracin el resto del
sobrenadante que quede en el fondo del tubo.
iv.
Si se pipete mucho para lograr la lisis y homogenizacin, y por esa causa el
DNA se fragment o si hay poco DNA en la muestra (<15 g), el DNA no formar
el precipitado nebuloso visible. En estos casos se debe centrfugar a 4000 5.000 x g por 1-5 min a temperatura ambiente o a 4C para precipitar el DNA.
4. LAVADO DEL DNA
Lave el precipitado de la DNA dos veces con 0,8 - 1,0 ml de etanol 75%. En cada
lavado, resuspenda el DNA en etanol invirtiendo los tubos 3 - 6 veces. Coloque los
tubos verticalmente por 0,5 - 1 minuto para permitir que el DNA sedimente en el fondo
de los tubos y quite el etanol con una micropipeta.
En caso de necesidad, sedimente la pella de DNA a 1.000 g por 1 - 2 minutos a
4 - 25 C. Para quitar mejor los contaminantes al aislar la DNA de los tejidos, la primera
lavada de etanol se puede sustituir por lavado en una solucin que contiene 70% de
reactivo de Chomczynski y 30% de etanol
5. SOLUBILIZACIN DEL DNA
Seque el precipitado al aire y a temperatura ambiente por 5-15min, removiendo el
alcohol desde el fondo del tubo usando una micropipeta.
Despus, disuelva el DNA en 8 mM NaOH, pasando lentamente la pella a travs de la
pipeta. Alternativamente, disuelva el DNA en agua. Sin embargo, la solubilizacin del
DNA ocurre ms rpidamente en medio alcalino y asegura la completa solubilizacin del
DNA precipitado. Agregue una cantidad adecuada de 8 mM NaOH o agua para alcanzar
una concentracin del DNA de 200 - 300 ng/l. Tpicamente, agregar 200 - 300 l de 8
mM NaOH o agua al DNA aislado de 10-20 mg de tejido animal.
Las preparaciones del DNA aisladas de tejidos tales como hgado, msculos y plantas
contienen un poco de material insoluble (sobre todo polisacridos). Quite el material
insoluble por centrifugacin a 12.000 g por 10 minutos. Las soluciones alcalinas
dbiles son neutralizadas por el CO2 del aire. Una vez al mes, preparar 8 mM NaOH de
la solucin stock de 2 - 4 M NaOH que no debe tener mas de 6 meses de antigedad.
53
54
55
Protocolo
1. Prepare un gel de agarosa, segn las recetas enumeradas abajo,
combinando la agarosa (la agarosa de baja temperatura de gelificacin
puede tambin ser utilizado) y el agua en un frasco de 500 ml Erlenmeyer,
y calentndolos en una microonda por 2-4 minutos o en un bao de agua
hirviendo hasta que se disuelve el agarosa.
Tapar el matraz Erlenmeyer con papel alusaplast y perforarlo varias veces
con una aguja, o si es una botella, taparla a amedia rosca. Es recomendable
agitar de tiempo en tiempo la solucin de Agarosa, teniendo mucho cuidado,
porque la solucin de Agarosa se puede sobrecalentar y ebullir
violentamente. Tambien es recomendable verificar que el volumen de la
solucin no haya disminuido apreciablemente por la evaporacin. Esto se
verifica facilmente marcando el nivel del lquido en el recipiente antes de
calentarlo. En caso de que haya disminuido apreciablemente, rellenar con
agua.
agarosa
10X TAE
ddH2O
EtBr (10 mg/ml)
0,7%
1,05 g
15
ml
135
ml
10
l
1,0%
1,5 g
15 ml
135 ml
10 l
2,0%
3,0 g
15 ml
135 ml
10 l
vol. total
150
150 ml
150 ml
ml
56
57
APENDICE 3.
I.
Tamao (kb)
10.0
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.5
1.2
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
58
19
0.1
59