Universidad Andrs Bello

Departamento de Ciencias Qumicas

Laboratorio de Bioqumica general

INFORME N1
Determinacin de protenas

Nombres: Reynaldo Gutirrez T.

Christopher Espinoza E.
Carole Silva G.
Fecha de entrega: 11/09/2015

INTRODUCCIN
Existen varios mtodos para la determinacin de la concentracin de protenas de una
muestra, tales como el mtodo de la absorcin ultravioleta a 280 nm, mtodo
colorimtrico, en el cual se forman coloreados de las protenas (Biuret y Bradford) y el
mtodo turbidimtrico en el cual ocurre un precipitado de protenas.1
De los mtodos mencionado anteriormente, ocuparemos para este prctico el de
coloreados de las protenas, especficamente los reactivos de Biuret y Bradford.
El mtodo de Biuret se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH que reaccionan con el enlace peptdico de las protenas en medio alcalino.
Este reactivo da un color violeta el cual se cuantifica espectrofotomtricamente a 540 nm.
La reaccin es bastante especfica, de manera que son pocas las sustancias que
interfieren. Como estndar se utiliza una solucin de albmina.2
El mtodo de Bradford se basa en la unin de un colorante azul de Comassie G 250 en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y compuestos aromticos. Esta unin del
colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante
que se cuantifica desde 465 nm a 595 nm.
El colorante en solucin cida existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas
se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante. Este mtodo es
sensible, simple y rpido, y pocas son las sustancias que interfieren en su determinacin,
entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.3

OBJETIVOS

Construir curva de calibracin Absorbancia v/s concentracin

Cuantificacin de protenas con el reactivo de Biuret

Cuantificacin de protenas con el reactivo de Bradford

Encontrar la concentracion de muestra problema a partir de las curvas de

calibracion

MATERIALES Y MTODOS

Experiencia A: Cuantificacin de protenas por el mtodo de BIURET

El desarrollo de este trabajo prctico se llevo a cabo, en primera instancia, con la
cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret. Para ello, enumeramos con plumn
marcador, 7 tubos de ensayo, de los cuales del 1 al 5 contienen 800, 600, 400, 200, 0 L
de agua destilada y 200, 400, 600, 800 y 1000 L de protena albumina respectivamente.
Ambas mediciones se aadieron con una micropipeta. El sexto tubo lo usamos como
blanco aadindole solo agua destilada (1000 L) y el Sptimo tubo es la muestra
problema, conteniendo solo 500 L de agua destilada y 500 L de protena. A cada uno
de los tubos detallados anteriormente, se les aadi finalmente 4 mL de reactivo de Biuret
con una pipeta y dejamos desarrollar el color durante 30 minutos aproximadamente,
depositando cada tubo en su gradilla, para luego medir su absorbancia a 540 nm en un
espectrofotmetro UV-visible. Es importante recalcar, que para obtener unos resultados
ptimos, debemos aadir: agua destilada, protena y luego reactivo.

Experiencia B: Cuantificacin de protenas por el mtodo de BRADFORD

Para el desarrollo de esta segunda parte del trabajo practico, utilizamos 8 tubos de
ensayo, de los cuales del 1 al 6 aadimos 760, 720, 680, 640, 600 y 560 L de agua
destilada y 5, 10, 15, 20, 25, 30 L de protena respectivamente. El sptimo tubo de
ensayo se utiliza como blanco, conteniendo solo agua destilada (800 L) y el octavo
corresponde al tubo muestra problema que contiene protena y 700 L de agua
destilada. A cada uno de los tubos de ensayo descritos anteriormente, se les aade 200
L de reactivo Bradford y se depositan en unas gradillas de plstico para que desarrollen
el color durante 10 minutos aproximadamente. Trascurrido el tiempo requerido, se mide
su absorbancia a 595 nm mediante un espectrofotmetro.

RESULTADOS

Experiencia A: Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret

TABLA 1:
N tubo

mg/mL BSA

L protena

L H2O

mL Biuret

ABS 540nm

200

800

0,106

400

600

0,197

600

400

0,293

800

200

0,353

10

1000

0,489

Blanco

1000

0,000

Muestra

500

500

0,224

Para calcular el volumen de muestra de que hay que verter en cada tubo usamos la
ecuacin
V1 X C1 = V2 X C2
Donde cada variante corresponde a:
V1: Es la incgnita la cual estamos calculando
C1: Es la concentracin de Biuret o Bradford que en este caso es de 10mg/ml
V2: volumen que se toma de la solucin que corresponde a 1 ml
C2: concentracin de la solucin
10 mg/mL x V1 = 2 mg/mL x 1 mL

V1 = 0,2 mL = 200 L

En base a las absorbancias obtenidas por medio del espectrofotmetro graficamos los
datos de estas para relacionarlas con la concentracin de protenas en mg/mL.

Grfico 1
Absorbancia 540nm

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

10

12

Concentracin de BSA mg/ml

A partir del grafico presentado anteriormente se obtuvo la ecuacin de la recta:

Y=0,0461x + 0,011

R2:0,9878

De donde sabemos que:

Pendiente: 0,0461
Intercepto: 0,011
Absorbancia muestra problema: 0,224
Luego, con los datos encontrados, ser posible obtener la concentracin de la BSA en
muestra problema utilizando como Y la absorbancia obtenida por medio de la medicin
con espectrofotmetro.
Y=0,0461x + 0,011
0,224= 0,0461x + 0,011
X = 0,224 0,011
0,0461
[BSA] muestra problema: 4,62 mg/mL

Experiencia B: cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford

TABLA 2:
N Tubos

g/ L BSA

L protena

L H2O

L Bradford

ABS 595nm

40

760

200

0,301

10

80

720

200

0,319

15

120

680

200

0,359

20

160

640

200

0,395

25

200

600

200

0,467

30

240

560

200

0,493

Blanco

800

200

0,000

Muestra

700

200

0,278

En base a las absorbancias obtenidas por medio del espectrofotmetro graficamos los
datos de estas para obtener la ecuacin de la recta y poder calcular la concentracin de
BSA en la muestra problema.

Grfico 2
Absorbancia 595nm

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

10

15

20

Concentracin de BSA g/l

25

30

A partir del grafico N2 se obtuvo la ecuacin de la recta:

Y=0,0082x + 0,2458

R2:0,9512

Donde sabemos que:

Pendiente: 0,0082
Intercepto: 0,2458
Absorbancia muestra problema: 0,278
Con los datos encontrados, ser posible obtener la concentracin de la BSA en muestra
problema utilizando como Y la absorbancia obtenida por medio de la medicin con
espectrofotmetro, quedando:
Y=0,0082x + 0,2458
0,278= 0,0082x + 0,2458
X = 0,278 - 0,2478
0,0082
[BSA] muestra problema: 3,68 g/ L

DISCUSIN

A travs del trabajo practico se realizaron los mtodos de cuantificacin de protenas por
el mtodo de Biuret y de Bradford, al analizar los resultados obtenidos a travs del primer
mtodo, se obtuvo una concentracin de protena igual a 4,62 mg/mL, lo que podemos
tomar como un resultado aceptable ya que este mtodo permite valorar protenas dentro
de un rango de 1 a 10 mg 4 , al observar el coeficiente de correlacin de nuestra regresin
lineal (r2) que es igual a 0,9878, podemos apreciar que no se acerca lo suficiente a 1 por
lo que podemos inferir que el resultado obtenido pudo haber sido afectado por los errores
determinados (errores humanos, errores metdicos, errores instrumentales)4 que estn
presente en los procesos analticos. Finalmente si analizamos los resultados obtenidos a
travs del mtodo de Bradford podemos observar que se obtuvo una concentracin igual
a 3,68 g/L, al observar el grafico y la ecuacin de la recta, se puede apreciar que en
este caso el coeficiente de correlacin no se acerca a 1 por lo que se asume que el
resultado no es del todo aceptable, esto se debe a los errores mencionados anteriormente
y tambin se puede atribuir al tiempo de espera que quizs fue ms del recomendado, por
lo que parte de la protena pudo haber precipitado debido al medio acido.

CONCLUSIN

A travs de esta actividad prctica se logr cumplir satisfactoriamente los objetivos

propuestos, ya que se construyeron de las curvas de calibracin para cada mtodo, para
as poder calcular las concentraciones de protenas presentes en cada muestra.

BIBLIOGRAFA
1.- http://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf
2.-http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalumno.pdf
3.-http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol
4.-libro Analitical Biochemistry, capitulo 72, pags 248 254.