Tcnica de Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos tipo LAMP

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Arroyo A Mara Isabel, Morales L Gloria Patricia, Sosa V Paula Andrea,

Carmona Fonseca Jaime, Maestre Buitrago Amanda Elena.
Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos tipo LAMP para la deteccin de
Plasmodium:
nueva tcnica diagnstica
Mdicas UIS 2008; 21(3) : 158-175

Resumen

Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una tcnica

llamada amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, que usa el material
gentico plasmodial. Este escrito revisa la informacin disponible sobre
amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, especialmente en el campo del
paludismo.

Metodologa: Se revisaron las bases electrnicas Lilacs, Scielo, PubMed

(Medline) y Ovid.

Resultados: Solo se encontraron tres referencias sobre amplificacin

isotrmica de cidos nucleicos y malaria pero hubo abundante informacin
sobre amplificacin isotrmica de cidos nucleicos en otras infecciones y
campos de la medicina, en especial la infectologa. La reaccin de
amplificacin isotrmica de cidos nucleicos requiere de una ADN
polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena y cuatro cebadores
especialmente diseados para reconocer seis secuencias distintas. Esto
garantiza alta especificidad para la amplificacin. Varias alternativas de
amplificacin isotrmica de cidos nucleicos se han desarrollado para la
identificacin de virus, bacterias, micoplasmas, protozoos, hongos y
levaduras. Ventajas de amplificacin isotrmica de cidos nucleicos son
capacidad de amplificar cidos nucleicos bajo condiciones isotrmicas (6065C); posibilidad de lectura y semicuantificacin a simple vista y de
cuantificacin con un turbidmetro; altas sensibilidad y especificidad y, en
general, capacidad diagnstica; rapidez, bajo costo y facilidad de aplicacin;

tolera los componentes de los medios de cultivo y las sustancias biolgicas.

Entre las desventajas estn que la baja concentracin de ADN molde
disminuye la eficacia del reconocimiento de los cebadores; la observacin
de la turbidez fue menos sensible que la visualizacin de los productos en
gel de agarosa teidos con bromuro de etidio y es crtica la prevencin de la
contaminacin.
http://www.imbiomed.com.mx/1/1/articulos.php?
method=showDetail&id_articulo=55889&id_seccion=1828&id_ejemplar=56
57&id_revista=114 imbiomed
Autor: Arroyo A, Mara Isabel; Morales L, Gloria Patricia; Sosa V, Paula
Andrea; Carmona-Fonseca, Jaime; Maestre B, Amanda.
Ttulo:Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos tipo LAMP para la
deteccin de Plasmodium: nueva tcnica diagnstica: [revisin] / Isothermal
nucleic acid amplifi cation type LAMP for the detection of Plasmodium: a
new diagnostic technique: [review]
Fonte:Med. UIS;21(3):158-175, sept.-dic. 2008. graf, ilus, tab.
Idioma:

es.

Resumo:
Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una
tcnica llamada amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, que usa el
material gentico plasmodial. Este escrito revisa la informacin disponible
sobre amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, especialmente en el
campo del paludismo. Metodologa: se revisaron las bases electrnicas
Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) y Ovid. Resultados: solo se encontraron tres
referencias sobre amplificacin isotrmica de cidos nucleicos y malaria
pero hubo abundante informacin sobre amplificacin isotrmica de cidos
nucleicos en otras infecciones y campos de la medicina, en especial la
infectologa. La reaccin de amplificacin isotrmica de cidos nucleicos
requiere de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de
cadena y cuatro cebadores especialmente diseados para reconocer seis
secuencias distintas. Esto garantiza alta especificidad para la amplificacin.
Varias alternativas de amplificacin isotrmica de cidos nucleicos se han
desarrollado para la identificacin de virus, bacterias, micoplasmas,
protozoos, hongos y levaduras. Ventajas de amplificacin isotrmica de
cidos nucleicos son capacidad de amplificar cidos nucleicos bajo
condiciones isotrmicas (60-65 C); posibilidad de lectura y
semicuantificacin a simple vista y de cuantificacin con un turbidmetro;
altas sensibilidad y especificidad y, en general, capacidad diagnstica;
rapidez, bajo costo y facilidad de aplicacin; tolera los componentes de los
medios de cultivo y las sustancias biolgicas. Entre las desventajas estn
que la baja concentracin de ADN molde disminuye la eficacia del
reconocimiento de los cebadores; la observacin de la turbidez fue menos
sensible que la visualizacin de los productos en gel de agarosa teidos con
bromuro de etidio y es crtica la prevencin de la contaminacin...(AU)

Introduction: isothermal nucleic acid amplification (LAMP) was recently

reported in the diagnosis of malaria. This uses plasmodial DNA to confi rm
the diagnosis. This paper reviews the most relevant available information on
LAMP, especially in the field of malaria. Methodology: the electronic
databases Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) and Ovid, were reviewed.
Results: only three references were found on LAMP and malaria but there
was abundant information on LAMP and other infections in fields of
medicine, mainly in infectious diseases. The LAMP reaction requires a strand
displacement DNA polymerase and a system of four primers specifically
designed to recognize a total of six different sequences in the DNA target.
This guarantees high specificity. Several alternatives of LAMP have been
developed to identify viruses, bacteria, mycoplasma, protozoa, fungi and
yeast. Advantages of LAMP: ability to amplify nucleic acids under isothermal
conditions (60 and 65 C9; possibility of semi-quantitative reading by
observation and quantitative interpretation using a turbidimeter; high
sensitivity and specificity and, in general, diagnostic capacity, speed, low
cost and ease of implementation; better performance than PCR when
culture media and biological substances are processed. Disadvantages: the
low concentration of DNA template reduces the primers effi cacy
recognition; turbidimetry was less sensitive than the agarose gel and
ethidium bromide analysis, prevention of contamination is critical...(AU)
Descritores: Malria
Plasmodium
Diagnstico
Tipo de Publ:

Reviso

Responsvel:

CO48.1 - Biblioteca Mdica

http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?
IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&e
xprSearch=613749&indexSearch=ID
613749
Autor: Arroyo A, Mara Isabel; Morales L, Gloria Patricia; Sosa V, Paula
Andrea; Carmona-Fonseca, Jaime; Maestre B, Amanda.
Ttulo:Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos tipo LAMP para la
deteccin de Plasmodium: nueva tcnica diagnstica: [revisin] / Isothermal
nucleic acid amplifi cation type LAMP for the detection of Plasmodium: a
new diagnostic technique: [review]
Fonte:Med. UIS;21(3):158-175, sept.-dic. 2008. graf, ilus, tab.
Idioma:

es.

Resumo:
Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una
tcnica llamada amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, que usa el
material gentico plasmodial. Este escrito revisa la informacin disponible
sobre amplificacin isotrmica de cidos nucleicos, especialmente en el
campo del paludismo. Metodologa: se revisaron las bases electrnicas
Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) y Ovid. Resultados: solo se encontraron tres
referencias sobre amplificacin isotrmica de cidos nucleicos y malaria
pero hubo abundante informacin sobre amplificacin isotrmica de cidos
nucleicos en otras infecciones y campos de la medicina, en especial la
infectologa. La reaccin de amplificacin isotrmica de cidos nucleicos
requiere de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de
cadena y cuatro cebadores especialmente diseados para reconocer seis
secuencias distintas. Esto garantiza alta especificidad para la amplificacin.
Varias alternativas de amplificacin isotrmica de cidos nucleicos se han
desarrollado para la identificacin de virus, bacterias, micoplasmas,
protozoos, hongos y levaduras. Ventajas de amplificacin isotrmica de
cidos nucleicos son capacidad de amplificar cidos nucleicos bajo
condiciones isotrmicas (60-65 C); posibilidad de lectura y
semicuantificacin a simple vista y de cuantificacin con un turbidmetro;
altas sensibilidad y especificidad y, en general, capacidad diagnstica;
rapidez, bajo costo y facilidad de aplicacin; tolera los componentes de los
medios de cultivo y las sustancias biolgicas. Entre las desventajas estn
que la baja concentracin de ADN molde disminuye la eficacia del
reconocimiento de los cebadores; la observacin de la turbidez fue menos
sensible que la visualizacin de los productos en gel de agarosa teidos con
bromuro de etidio y es crtica la prevencin de la contaminacin...(AU)

Introduction: isothermal nucleic acid amplification (LAMP) was recently

reported in the diagnosis of malaria. This uses plasmodial DNA to confi rm
the diagnosis. This paper reviews the most relevant available information on
LAMP, especially in the field of malaria. Methodology: the electronic
databases Lilacs, Scielo, PubMed (Medline) and Ovid, were reviewed.
Results: only three references were found on LAMP and malaria but there
was abundant information on LAMP and other infections in fields of
medicine, mainly in infectious diseases. The LAMP reaction requires a strand
displacement DNA polymerase and a system of four primers specifically
designed to recognize a total of six different sequences in the DNA target.
This guarantees high specificity. Several alternatives of LAMP have been
developed to identify viruses, bacteria, mycoplasma, protozoa, fungi and
yeast. Advantages of LAMP: ability to amplify nucleic acids under isothermal
conditions (60 and 65 C9; possibility of semi-quantitative reading by
observation and quantitative interpretation using a turbidimeter; high
sensitivity and specificity and, in general, diagnostic capacity, speed, low
cost and ease of implementation; better performance than PCR when
culture media and biological substances are processed. Disadvantages: the
low concentration of DNA template reduces the primers effi cacy

recognition; turbidimetry was less sensitive than the agarose gel and
ethidium bromide analysis, prevention of contamination is critical...(AU)
Descritores: Malria
Plasmodium
Diagnstico
Tipo de Publ:

Reviso

Responsvel:

CO48.1 - Biblioteca Mdica

http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?
IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&e
xprSearch=613749&indexSearch=ID

Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos tipo LAMP

para la deteccin de Plasmodium: nueva tcnica
diagnstica
Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una tcnica llamada amplifi cacin isotrmica de cidos
nucleicos, que usa el material gentico plasmodial. Este escrito revisa la informacin disponible sobre amplifi
cacin isotrmica de cidos nucleicos, especialmente en el campo del paludis...
Resumen completo

Ttulo de la
revista:

Revista Mdicas UIS

Autor
principal:

Mara Isabel Arroyo A

Otros
autores:

Gloria Patricia Morales L;

Paula Andrea Sosa V;
Jaime Carmona-Fonseca;
Amanda Maestre B;

Palabras
clave:

Amplificacin isotrmica. Malaria. Plasmodium.

Diagnstico.;

Idioma:

Espaol

Enlace del
documento:

http://www.medicasuis.org/publicaciones/volumenxxi/numero-iii/131-articulo-de-revisionamplificacion-isotermica-de-acidos-nucleicos-tipolamp-para-la-deteccion-de-plasmodium-nueva-

tecnica-diagnostica.html
Tipo de
recurso:

Documento de revista

Fuente:

Revista Mdicas UIS; Vol 21, No 3 (Ao 2008).

Entidad
editora:

Universidad Industrial de Santander

Derechos de
uso:

Sin permisos preestablecidos

Materias:

Ciencias Aplicadas --> Medicina Interna y General

Resumen

Bibliografa

Resumen:

Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una

tcnica llamada amplifi cacin isotrmica de cidos nucleicos, que
usa el material gentico plasmodial. Este escrito revisa la
informacin disponible sobre amplifi cacin isotrmica de cidos
nucleicos, especialmente en el campo del paludismo. Metodologa:
se revisaron las bases electrnicas Lilacs, Scielo, PubMed (Medline)
y Ovid. Resultados: solo se encontraron tres referencias sobre
amplifi cacin isotrmica de cidos nucleicos y malaria pero hubo
abundante informacin sobre amplifi cacin isotrmica de cidos
nucleicos en otras infecciones y campos de la medicina, en
especial la infectologa. La reaccin de amplifi cacin isotrmica
de cidos nucleicos requiere de una ADN polimerasa con actividad
de desplazamiento de cadena y cuatro cebadores especialmente
diseados para reconocer seis secuencias distintas. Esto garantiza
alta especifi cidad para la amplifi cacin. Varias alternativas de
amplifi cacin isotrmica de cidos nucleicos se han desarrollado
para la identifi cacin de virus, bacterias, micoplasmas, protozoos,
hongos y levaduras. Ventajas de amplifi cacin isotrmica de
cidos nucleicos son capacidad de amplifi car cidos nucleicos
bajo condiciones isotrmicas (60-65 C); posibilidad de lectura y
semicuantifi cacin a simple vista y de cuantifi cacin con un
turbidmetro; altas sensibilidad y especifi cidad y, en general,
capacidad diagnstica; rapidez, bajo costo y facilidad de
aplicacin; tolera los componentes de los medios de cultivo y las
sustancias biolgicas. Entre las desventajas estn que la baja
concentracin de ADN molde disminuye la efi cacia del
reconocimiento de los cebadores; la observacin de la turbidez fue
menos sensible que la visualizacin de los productos en gel de
agarosa teidos con bromuro de etidio y es crtica la prevencin

de la contaminacin.
/www.redib.org/recursos/Record/oai_articulo180813-amplificacionisotermica-acidos-nucleicos-tipo-lamp-deteccion-plasmodium-tecnicadiagnostica
Registro completo de metadatos
Campo DC

Valor

dc.contributor.advisor

Cevallos Falquez, Orly

dc.creator

Cedeo Jimnez, Pablo Ramn

dc.date.accessioned

2015-08-06T15:03:49Z

dc.date.available

2015-08-06T15:03:49Z

dc.date.issued

2013

dc.identifier.citation

Cedeo Jimnez Pablo Ramn (2013). Determinacin de la brucelosis en humanos mediante la tcnica de lam
municipales de la provincia de Los Ros. Quevedo. UTEQ. 69 p.

dc.identifier.uri

http://repositorio.uteq.edu.ec/handle/43000/566

dc.description

This research was conducted in the Laboratory of Biotechnology Quevedo State Technical University. The overa

research was to determine the incidence of human brucellosis in slaughterhouses by LAMP technique in the mu

province of Los Rios. In this study a comparison was made of the technique of isothermal nucleic acid amplifica

serology Rose Bengal (RB) in the diagnosis of human brucellosis. A total of 84 blood samples were collected fr

slaughterhouses in the province of Los Rios with high historical prevalence of brucellosis in animals. An averag

for the analysis of RB, meanwhile that LAMP was 0%, and is also performed with PCR, suggesting that the mol
traditional LAMP is more sensitive RB. The results show that the positive sample detection by LAMP technique

sensitive than the serological test for Rose Bengal, therefore in this paper, we consider the LAMP as a useful to

brucellosis and their use for future programs of prevention and eradication of the disease. Keywords: LAMP, Ro
abortus, and brucellosis.
dc.description.abstract

Esta investigacin se la realiz en el Laboratorio de Biotecnologa de la Universidad Tcnica Estatal de Queved

esta investigacin fue: Determinar la incidencia de brucelosis humana, en los camales mediante la tcnica de L

de la provincia de Los Ros. En este estudio se hizo la comparacin de la tcnica de Amplificacin isotrmica d

(LAMP) versus la prueba serolgica Rosa de Bengala (RB) en el diagnstico de la brucelosis humana. Un total

sangre fueron recolectadas de tres camales municipales de la provincia de Los Ros con una alta tasa de preva

brucelosis en animales. Un promedio del 0.84% dio positivo para el anlisis de RB, mientras tanto que con LAM

tambin se le realiz con PCR, lo que sugiere que la tcnica molecular de LAMP versus la tradicional de RB es

resultados muestran que la deteccin de la muestra positiva mediante la tcnica de LAMP fue ms especfica y

serolgica de Rosa de Bengala, por lo tanto en este trabajo se considera a la LAMP como una herramienta mu

de brucelosis y su uso para futuros programas de prevencin y erradicacin de la enfermedad. Palabras clave:

bengala, Brucella abortus, y brucelosis.

dc.format.extent

69 p.

dc.language.iso

spa

dc.publisher

Quevedo: UTEQ

dc.rights

openAccess

dc.rights.uri

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ec/

dc.subject

Brucelosis en humanos

dc.subject

Tcnica de lamp

dc.title

Determinacin de la brucelosis en humanos mediante la tcnica de lamp en camales municipales de la provinc

dc.type

bachelorThesis

Aparece en las

Tesis - Ingeniera Agropecuaria - Semipresencial

colecciones:

http://repositorio.uteq.edu.ec/handle/43000/566?mode=full

BIOLOGIA MOLECULAR PARA PROFESIONALES DE LA SALUD II Luz Esmeralda

Murcia Urrego Bacteriloga Esp. Administracin en salud
2. Retomando Estructura celular, organelos y funciones.
Estructura del ADN y ARN. Replicacin . Transcripcin. Traduccin.
Postraduccin. Tcnicas: electroforsis y PCR.
3. Pendientes Telmeros. Telomerasa, ARN. Diskeratosis congnita,
sndromes mielodisplsicos, histiocitosis. Neuroblastoma.
4. Pendientes ADN ribosomal ADNr. Secuencia de ADN contenida en los
cromosomas del ncleolo que codifica ARN ribosomal, muy utilizado en
estudios filogenticos por su bajo porlimorfismo gentico.
5. MUTACIONES MOLECULARES Silenciosas Neutra Cambio de sentido o
missense (cancer colorectal) Sin sentido o non sense (Talasemia) Adicin
delecin o frame shift (Fibrosis quistica) AGG x CGG (Arg) AAA x AGA

(Lys Arg) UCA x UUA (Ser Leu) AGA x STOP AGA TCT AGG GAA
AGA TCC TAG GGA AT AGA TTA GGG AAT
6. Programas para biomodelos Jmol, Chime, RasMol.
http://www.biorom.uma.es/contenido/bi omodel/model1j/dna/inicio.htm
7. AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
8. Clonado ADN - - ADN - Vector (plsmido) Ligacin (ADN ligasa)
Insercin (Transformacin o transfeccin). - Propagacin (seleccin,
miniprep) - Purificacin
9. AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS IN VITRO Amplificacin del ADN
diana. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la autorreplicacin de la
secuencia (3SR) y la amplificacin por desplazamiento de la hebra (SDA).
Amplificacin de la sonda, que incluye la replicasa Q o la reaccin en
cadena de la ligasa (LCR). Amplificacin de la seal, en los cuales la seal
generada por cada sonda es aumentada.
10. Variaciones de la PCR RT-PCR RT-PCR
http://www.biorom.uma.es/contenido/U IB/pcresp/index.html Q-PCR
http://www.youtube.com/watch?v=e74Y YdSHraY
11. Variaciones de la PCR PCR DESCRIPCCION PCR anidada A partir de un
amplicn se aplican nuevos primes. Aumenta la sensibilidad. PCR de
extensin solapada Cambios de secuencia introducidos dentro de
fragmentos (clonados) de ADN. 4 primers con productos de ADN mutado
solapados. PCR in situ En portaobjetos sobre tejido o clulas. Se hace
amplificacin del ADN e hibridacin in situ. PCR mltiple Amplificacin
simultnea de ms de una secuencia. RT-PCR ARN es el molde inicial y la
enzima es transcriptasa inversa que forma cADN. Q -PCR Cuantifica ADN o
ARN en tiempo real. Se detecta basndose en fluorocromos o sondas. Otras
e-PCR, AFLP, Colonia, Asimtrica, Especfica de alelo, Hot start, ISSR,
Touchdown, Tail, MLPA, Inversa.
12. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO
13. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO Electroforsis de agarosa.
Southern blot
14. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO Hibridacin en micro placas de
ELISA.
15. Amplificacin isotrmica de cidos nucleicos LAMP Sistema que utiliza
una polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena (Bst) y un
sistema de dos cebadores internos y dos cebadores externos para reconocer
un total de seis secuencias distintas en el ADN blanco -produccin material
inicial -Ciclos de amplificacin y elongacin. -Reciclaje.
16. LAMP

17. Deteccin por bioluminiscencia

18. OTRAS NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 3SR.
19. SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS
20. SECUENCIACION Determinacin de la secuencia de nucletidos de una
molcula especfica. -Mtodo qumico -Mtodo enzimtico Deteccin
de mutaciones, aplicaciones forenses, ADN fsiles, diagnstico de
enfermedades.
21. SECUENCIACION Di-deoxi-nucletidos
http://www.youtube.com/watch?v=fNIG 2KROxYA Pirosecuenciacin
http://www.youtube.com/watch?v=a0qB RjwGAbE
22. REFERENCIAS ADICIONALES
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/PCR/AplicacionesPCRAmplificacion%20de%20acidos%20nucleicos%20in%20vitro.pdf
http://www.fiiaiafp.com/neo_2012/pdf/presentaciones/Sesion%20Paralela
%208%20Los %20peligros%20en%20alimentacion/Deteccion%20Molecular
%20de%20p atogenos%20por%20amplificacion%20isotermica%20Alejandro
%20Rojas. pdf http://www.scielo.cl/scielo.php?
pid=S071610182002000100003&script=sci_arttext

http://es.slideshare.net/Luzesme/biologa-molecular-para-profesionales-de-lasalud-ii

Cite this Article

Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for
the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens. J. Vis. Exp. (96), e52552, doi:10.3791/52552
(2015).

Introduction
La produccin mundial de pollo se ha multiplicado por diez en los ltimos 50 aos, con el mundo en desarrollo al
acoger a casi cuatro veces la expansin presenciado en el mundo desarrollado (www.faostat.org) . Como la
importancia de la produccin de pollo a la seguridad alimentaria mundial ha crecido tambin lo ha hecho el perfil
de los agentes patgenos que pueden causar enfermedades graves en los pollos. Un buen ejemplo son las
especies de Eimeria, parsitos protozoarios omnipresentes que pueden causar la coccidiosis enfermedad
entrica 1. Dondequiera que se cran pollos son propensos a ser comn 2-4 una o ms especies de Eimeria. En el
mundo desarrollado Eimeria son controlados principalmente por la quimioprofilaxis, empleando programas de
transporte o de rotacin para minimizar el impacto de la resistencia 5. Las vacunas vivas tambin se utilizan en
sistemas en los que el valor de aves es suficiente para justificar el costo (por ejemplo, reproductores, capas y
algunos pollos de engorde 5). Como result de estas medidas coccidiosis clnica a menudo se controla bien,

aunque la infeccin subclnica es comn 5. En el mundo en desarrollo la vacunacin es rara y la aplicacin del
frmaco con frecuencia menos informados. Como consecuencia coccidiosis subclnica y clnica es ms comn y
ejerce un impacto econmico significativo 3.
El diagnstico de infeccin Eimerian ha dependido tradicionalmente de lesin anotando post mortem, aunque
incluso los autores del sistema de puntuacin ms utilizados comentaron que para algunas especies ", parece
dudoso que tal procedimiento se debe intentar en ningn pero moderadamente graves infecciones" 6. Evidencia
complementaria puede ser obtenida a travs de deteccin microscpica de la etapa del ciclo de vida de
ooquistes resistentes al medio ambiente en las muestras fecales o de basura, aunque la morfologa de la
superposicin puede confundir a todos, pero el experto en 6,7. Alternativas moleculares utilizando la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR), amplificatio azarn de ADN polimrfico PCR (RAPD-PCR) y las tecnologas de
PCR cuantitativa han estado disponibles por hasta 20 aos

8-10,

pero hasta la fecha no han llegado a ser

populares. Gasto relativo y el requisito de que el equipo de laboratorio especializado o procesamiento han
limitado su aceptacin, a pesar de la naturaleza a menudo subjetiva y tcnicamente exigente de la Patologa
mayor y microscopa basada aproxima a 10,11. Estas limitaciones pueden ser exagerados en muchas de las
regiones ms pobres del mundo, como el sudeste de Asia, donde el impacto de la coccidiosis en la pobreza
puede ser proporcionalmente mayor 12. En respuesta hay una clara demanda de nuevo, los ensayos de
diagnstico especficos de las especies de Eimeria sencillo y sensible, pero rentable.
Loop mediada amplificacin isotrmica (LAMP) es una tcnica fcil de preparar polimerasa impulsado ADN que
es capaz de amplificar grandes cantidades de ADN. Lo ms importante, LAMP utiliza una Polymera DNA BstSE
en lugar de la ADN polimerasa Taq comnmente utilizado en la PCR, lo que facilita la amplificacin de ADN a
una nica temperatura constante sin el requisito de ciclos trmicos 13,14. Lmpara puede ser susceptible de
aplicacin en el laboratorio incluso ms rudimentario o en el campo. Caracterizado por resistencia relativa a
muchos inhibidores de la PCR, una alta sensibilidad y especificidad, los ensayos de LAMP se han desarrollado
para una amplia gama de patgenos, incluyendo virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, Clostridium
perfringens y Cryptosporidium 15-17. En respuesta a la demanda de nuevos diagnsticos de cada especie de
Eimeria rentables un panel de ensayos de LAMP especficas para cada una de las siete especies de Eimeriaque
infectan los pollos se ha desarrollado 18. Las solicitudes de los nuevos ensayos incluyen monitoreo aparicin de
parsitos, de especial valor dada la asociacin de especies como mximos Eimeria o Eimeria necatrix con mala
pe econmicarformance 3,4. Otras aplicaciones incluyen la evaluacin de la eficacia de la estrategia anticoccidial
de una granja, el diagnstico de la infeccin subclnica o enfermedad clnica y la evaluacin de riesgo planteado
por Eimeria a una granja.

Protocol
1. Plantilla Preparacin
NOTA: Cualquier plantilla de ADN genmico se sospecha que contiene ADN derivado de una de las siete
especies de Eimeria que infectan a los pollos puede ser utilizado como plantilla para la identificacin de
especies de Eimeria basados en LAMP. Muestras de tejido intestinal para el anlisis de diagnstico de campo
deben recogerse durante la rutina post mortem como se describe aqu.

1.

Elige la seccin (o secciones) de intestino para ser probado. Ver Tabla 1 para una gua para la
seleccin del sitio de la muestra y las especies con ms probabilidades de estar presente

el 18

y en la

Figura 1 para el rango de distribucin y ubicacin de los sitios de muestreo especfico de la

especie de Eimeria.
NOTA: Esto es de vital importancia ya que Eimeria son notablemente sitio host especfico. Cada
especie que infecta pollos se define por la regin intestinal que se dirige a

19.

La decisin puede estar

influenciada por la experiencia previa de la finca, el inters en una o more determinadas

especies de Eimeria u otros indicadores de diagnstico 6.
2.

Impuestos Especiales 5 cm o longitudes ms largas de la seccin (s) intestinal seleccionada para la

prueba de Eimeria utilizando tijeras estriles o un escalpelo. Opcionalmente, almacenar las
muestras para su posterior anlisis en un fijador tal como, por ejemplo, en RNAlater

18

o 95% de

etanol.
NOTA: Si el almacenamiento de etanol en la muestra se debe lavar a fondo en cido
etilendiaminotetraactico-tris estril (TE) tampn antes de usar.
3.

Cortar la muestra abierto longitudinalmente, eliminar el contenido ms intestinales (si est presente)
y raspar las clulas de la capa de la mucosa libre utilizando el borde de un portaobjetos de
microscopio de vidrio estril o un cuchilla de tijera etanol / llama esterilizado. Opcionalmente para
una muestra colectiva incluir clulas de los cuatro sitios intestinales especficas de las especies en
un solo tubo.

4.

Ponga el material raspado en un tubo de microcentrfuga de 1,5 ml con tapa de rosca estril que
contiene 100 l de tampn TE estril incluyendo 10% (w / v) Chelex 100 de resina.

5.

Agitar cada muestra vigorosamente durante 1 min. Asegrese de que la parte superior del tornillo
est firmemente cerrada y luego se incuba en un bao de agua hirviendo durante 10 minutos.

6.

Despus de hervir permitir que cada muestra se enfre a la temperatura ambiente durante 1-2 min.

7.

Centrifugar cada muestra utilizando una microcentrfuga a velocidad mxima (por ejemplo, ~ 10.000
xg) durante 1 min.

8.

Recoger 2 l del sobrenadante resultado es la plantilla en cada ensayo LAMP se vayan a realizarse.
Opcionalmente, agrupar ms de un sitio intestinal en un solo tubo para proporcionar un ensayo de
sitio mltiple.

2. Eimeria LMPARA Preparacin Primer (Pre-ensayo)

1.

Preparar Eimeria LMPARAS stocks de cebadores adecuados para 100 ensayos:

1.

Reconstituir cada cebador Eimeria LMPARA liofilizada aadiendo agua de grado

molecular a una concentracin de 100 mM (segn lo especificado por el fabricante). Si

no se especifica, calcular el volumen de agua requerido usin de grado molecularg los

pesos fsicas y moleculares de cada cebador.
2.

Pipeta 60 l de agua de grado molecular en un tubo de microcentrfuga de 0,5 ml flip-top

separado para cada especie de Eimeria a ensayar.

3.

Aadir cebadores FIP, BIP, F3, B3, LF y LB especfica a las especies de Eimeria de
destino al agua usando las cantidades se muestran en la Tabla 2, la creacin de una
serie de mezclas especficas de especies de siete cebadores.

4.

Vrtice brevemente mezclar la solucin de imprimacin, luego pulso microfuge y

congelar hasta que sea necesario.

2.

Prepare una mezcla maestra reaccin LAMP para cada especie de Eimeria a ensayar. Multiplique
las cantidades se muestran en la Tabla 3 por el nmero de muestras y aadir tres a un control
positivo, control negativo y repuesto pipeta. Pipetear en un 0,5 o 1,5 ml flip-top de tubo de
microcentrfuga.

3. Eimeria LMPARA Ensayo

1.

Especies especficas de ADN polimerasa BST / LAMP pipeta 23 l Eimeria Mastermix en un 0.5 ml
tubo de microcentrfuga.

2.

Aadir plantilla de ADN 2 l (preparado en el apartado 1), por lo que un volumen final de reaccin de
25 l.

3.

Aadir ADN genmico especfico de la especie de Eimeria 2 l de una reaccin (control positivo).
Aadir 2 l de agua de grado molecular a la reaccin (control negativo).
NOTA: Si el ADN genmico especfico de la especie no se encuentra disponible una lmpara
positiva previa o producto de PCR estndar se pueden usar en su lugar.

4.

Incubar en un bao de agua o bloque de calor a 62 C durante 30 min. Opcionalmente, de-activar la

ADN polimerasa Bst por calentamiento a 80 C durante 10 min si la reaccin no va a ser ledo
inmediatamente.

4. LMPARA Ensayo de lectura

1.

Al trmino de la incubacin evaluar el color de cada reaccin por debajo de los ojos la luz interior.
Los resultados negativos aparecen de color rosa y violeta, los resultados positivos aparecen cielo
azul 20.

2.

Opcionalmente, confirmar el resultado LAMP ensayo en un laboratory mezclando 5 l producto LAMP

reaccin con 1 l de tampn de carga en gel de ADN para la electroforesis en gel de agarosa usando

un gel de agarosa al 2% en 1 x Borato EDTA tampn Tris / / (TBE), pre-teidas utilizando un

colorante de cidos nucleicos (5 l por 50 ml de agarosa). Aadir 5 l de una escalera de ADN de 1 Kb
de tamao molecular con el carril 1 del gel para permitir el clculo del tamao de fragmento.

Representative Results
Validacin del ensayo
Durante la validacin cada ensayo LAMP-especfica de la especie Eimeria se ensay usando un panel de
muestras de ADN puro que representan todas las siete especies de Eimeria que infectan el pollo, as como ADN
genmico de pollo como un control host. Electroforesis en gel de agarosa se utiliz para resolver cada ensayo y
demostr la especificidad de especie absoluta sin anfitrin reactividad cruzada

18.

A continuacin, una serie de

diez veces la dilucin en serie prepar usando tenella purificado Eimeria ADN genmico revel un lmite de
sensibilidad del ensayo de entre uno y diez copias del genoma

18.

No hay lmite superior se determin con

resultados positivos alcanzados hasta e incluyendo la concentracin ms alta (100.000 copias del genoma) 18.
Aplicacin con muestras de campo
Las muestras recogidas para las pruebas de Eimeria es probable que se deriva de pollos encontrados muertos,
sacrificados como consecuencia de poor salud o sacrificadas para la vigilancia centinela de la salud, lo que
indica un tamao de muestra probable de entre uno y tres, cuando parte de una rutina. Prueba de tres aves
recogidas de una granja de pollos de Estados Unidos como parte de un programa de vigilancia produjo tres
series de muestras intestinales. Aplicacin de los ensayos de LAMP especficas de la especie objetivo, dar
prioridad a los sitios intestinales preferidos para cada especie de Eimeria (Tabla 1), permiti la identificacin
visual de la infeccin Eimerian en todas las aves a prueba utilizando azul hidroxinaftol como un indicador(Figura
2). El color conseguido con una reaccin LAMP negativo al usar azul hidroxinaftol puede oscilar desde el violeta
al rosa, pero siempre es distinto del azul alcanzado por un resultado positivo. Confirmacin por electroforesis en
gel de agarosa proporcion resultados comparables (Figura 2B). Durante la aplicacin de campo el usuario
puede optar por aplicar la pantalla completa contra las siete especies, o de destino slo aquellas especies
priorizadas comoimportante o conocido que circulan en la granja o alrededores.
El fracaso de los enfoques basados en la PCR para establecerse como diagnstico para la ocurrencia
deEimeria hace hincapi en la necesidad de simplicidad en cualquier nueva prueba. Mientras que la lmpara
ofrece una preparacin simple y procesamiento de PCR, la obligacin de probar mltiples sitios intestinales por
ave sigue siendo desalentador. Produccin de una sola muestra de ADN agrupado por ave, que luego puede ser
probado con uno o ms ensayos de LAMP, es probable que sea ms atractivo. Procesamiento de una muestra
conjunta por ave, el material recogido de cada uno de los sitios intestinales especficos descritos en la Tabla 1 y
se agruparon antes de la preparacin de ADN, para las pruebas con los siete ensayos de LAMP representa
siempre el mismo resultado que cuando cada sitio intestinal se proces por separado (Figura 2 en comparacin
con la Figura 3).

Figura 1. sitios de muestreo intestinales para la deteccin LMPARA de Eimeria parsitos de especies
que infectan a los pollos. Las regiones intestinales dirigidos por cada especie de Eimeria se destaca por las
lneas de color, con los sitios preferidos de muestreo indicado por el nmero entre las lneas negras
punteadas (E. acervulina: amarillo / 1, E. Brunetti: rosa / 2, E. maxima: azul / 3, E. mitis: naranja / 4, E.
necatrix:rojo / 5, E. praecox: verde / 6 y E. tenella: gris / 7). Haga clic aqu para ver una versin ms grande de
esta figura.

Figura 2. LMPARA diagnstico de infeccin Eimerian from tres pollos de engorde comerciales. LAMP
reacciones resuelven utilizando (A) hidroxinaftol azul, donde un azul cielo reaccin fue positiva y una violeta a la
reaccin de color rosa fue negativa, y la electroforesis en gel (B) de agarosa. Los sitios muestreados intestinales
fueron como se muestra en la Tabla 1 para cada especie del parsito. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E.
maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox y T = E. tenella. El carril 1 contiene la escalera del ADN
1Kb GeneRuler. Haga clic aqu para ver una versin ms grande de esta figura.

Figura 3. LMPARA diagnstico de infeccin Eimerian utilizando reac LMPARAS muestras agrupados
de tres pollos de engorde comerciales separados.ciones resolver utilizando azul hidroxinaftol, donde un azul
cielo reaccin fue positiva y violeta a la reaccin de color rosa fue negativo. A = E. acervulina, B = E. Brunetti,Ma
= E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox y T = E. tenella. Haga clic aqu para ver una versin
ms grande de esta figura.

Sitio de la
muestra

Ensayo de especies deEimeria (lo ms probable)

Duodeno (D)

E. acervulina, E. praecox

Yeyuno /
ileon * (J / I)

E. maxima, E. necatrix

Ciegos (C)

E. necatrix, E. tenella

leon
terminal (TI)

E. Brunetti, E. mitis

Muestra
conjunta (P)

E. acervulina, E. brunetti, E. maxima,

E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E.
tenella

Tabla 1. Intestinal seleccin especfica de la regin de ensayos de especies de Eimeria candidato. La

eleccin de la regin a muestrear vara para cada especie de Eimeria como se ilustra en la Figura 1. Las

muestras combinadas incluyen material recogido de los cuatro sitios especficos que a continuacin se
combinaron para la preparacin de ADN.

Primer *

Stock concentracin (M)

Volumen (l)

Agua

60

Delantero Interior Primer (FIP)

100

40

Backward Pri Interiormer (BIP)

100

40

Delantero exterior Primer (F3)

100

10

Backward Outer Primer (B3)

100

10

Loop Forward (LF)

100

20

Loop Backward (LB)

100

20

Total

200

Tabla 2. Preparacin de una premezcla de imprimacin LAMP. Los componentes y proporciones requeridas
para preparar una premezcla cebador para LAMP. Los volmenes que se muestran son para 100 LAMP
reacciones. * Primer identidades como se muestra en los Materiales y Barkway et al (2011) 18.

Stock conc

Reaccin final conc

Volumen por reaccin (l)

DDW

10.1

Tampn ThermoPol

10 x

1x

2.5

MgSO

100 mM

2 mM

0.5

Mezcla de cebadores *

Tabla 2

2.5

dNTPs

25 mM

400 uM

0.4

La betana

5M

1M

Azul de hidroxinaftol

3 mM

120 mM

ADN polimerasa Bst

8000 U / ml

8U

Total

23

Tabla 3. Preparacin de un LAMMastermix reaccin P. * Especfico de la especie de Eimeria.

Disclosures
Materials

Name

Company

Catalog
Number

RNAlater

Ambion

AM7024

Ethanol

VWR
Chemicals

20821.321

100 x Tris-EDTA (TE)

buffer concentrate

SigmaAldrich

T9285

Chelex 100 resin

Bio-Rad

142-1253

Molecular grade water

Invitrogen

10977035

E. acervulina F3

SigmaAldrich

VC00021

Comments

Caution, highly flammable

*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC

E. acervulina B3

SigmaAldrich

VC00021

*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG

E. acervulina FIP

SigmaAldrich

VC00021

*AGAGCACAGTGGCAGTGCAGCAGACAGCATGGCTTACCT

E. acervulina BIP

SigmaAldrich

VC00021

*GAAGACCCTCTGAAGAACGGACCTTCTCACCGCTTACCGG

E. acervulina LB

SigmaAldrich

VC00021

*TAAGGTTACACCCGTGGAGG

E. acervulina LF

SigmaAldrich

VC00021

*GCCATGCACAAAGCGACTT

E. brunetti F3

SigmaAldrich

VC00021

*GGCCATCAAGTTCCATGAGC

E. brunetti B3

SigmaAldrich

VC00021

*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT

E. brunetti FIP

SigmaAldrich

VC00021

*GAAAATGCCTTCGTAGCTGCTGCTGGGTACGGAGCGTCTT

E. brunetti BIP

SigmaAldrich

VC00021

*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGCAGTTTCGCTGCCGCCTC

E. brunetti LB

SigmaAldrich

VC00021

*GAAACGCTCGAACATGGC

E. brunetti LF

SigmaAldrich

VC00021

*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT

E. maxima F3

SigmaAldrich

VC00021

*ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT

E. maxima B3

SigmaAldrich

VC00021

*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG

E. maxima FIP

SigmaAldrich

VC00021

*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA
AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG

E. maxima BIP

SigmaAldrich

VC00021

*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGCAGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA

E. maxima LB

SigmaAldrich

VC00021

*CAAGCCTACGCGGACATC

E. maxima LF

SigmaAldrich

VC00021

*TTATGCAGCTGGGTCAACG

E. mitis F3

SigmaAldrich

VC00021

*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG

E. mitis B3

SigmaAldrich

VC00021

*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA

E. mitis FIP

SigmaAldrich

VC00021

*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT

E. mitis BIP

SigmaAldrich

VC00021

*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG

E. mitis LB

SigmaAldrich

VC00021

*TCCATGCATCCCCTTGTT

E. mitis LF

SigmaAldrich

VC00021

*CGTGGGCACAGATTGATTC

E. necatrix F3

SigmaAldrich

VC00021

*TGGCTTTCCCGCGTACC

E. necatrix B3

SigmaAldrich

VC00021

*CGGCCCAACACAAAGACTG

E. necatrix FIP

SigmaAldrich

VC00021

*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA

E. necatrix BIP

SigmaAldrich

VC00021

*CGCCATGCCATTCAATGAACG*GAGGCATACCGGCGTTGTC

E. necatrix LB

SigmaAldrich

VC00021

*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT

E. necatrix LF

SigmaAldrich

VC00021

*GAACAGCCGGAGCCTCTC

E. praecox F3

SigmaAldrich

VC00021

*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT

E. praecox B3

SigmaAldrich

VC00021

*GCGCACGAATCTGAATCACAC

E. praecox FIP

SigmaAldrich

VC00021

*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG

E. praecox BIP

SigmaAldrich

VC00021

*GCTCTCGTGGCATACTTGCGCCAGGAGCCACTGATTGT

E. praecox LB

SigmaAldrich

VC00021

*GAATAGCATTGCCAGGTGG

E. praecox LF

SigmaAldrich

VC00021

*GTCCACTGTCATTAATATTGC
TGC

E. tenella F3

SigmaAldrich

VC00021

*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG

E. tenella B3

SigmaAldrich

VC00021

*GCTGAGTCCATACGTACTTCCT

E. tenella FIP

SigmaAldrich

VC00021

*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT

E. tenella BIP

SigmaAldrich

VC00021

*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT

E. tenella LB

SigmaAldrich

VC00021

*CGCATGTGCAGTTGAAGACA

E. tenella LF

SigmaAldrich

VC00021

*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG

10 x ThermoPol reaction
buffer

New England
Biolabs

B9004S

MgSO4

SigmaAldrich

M7506

dNTPs

Promega

U1330

Betaine solution (5 M)

SigmaAldrich

B0300

Bst polymerase

New England
Biolabs

M0275S

Hydroxynaphthol blue

SigmaAldrich

33936

UltraPure agarose

Invitrogen

16500-500

10 x Tris/Borate/EDTA
(TBE) buffer

Invitrogen

AM9863

Blue/Orange DNA
loading dye (x6)

Promega

G1881

GeneRuler 1Kb DNA

ladder

Thermo
Scientific

SM0313

SafeView nucleic acid

stain

NBS
Biologicals

NBS-SV

Dissolved in molecular grade water.

References
1.

Chapman, H. D., et al. A selective review of advances in coccidiosis research. Adv Parasitol. 83, 93171 (2013).

2.

Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their
control by vaccination. Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).

3.

Fornace, K. M., et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken
farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE. 8, (12), e84254 (2013).

4.

Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations
in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J
Parasitol. 95, (4), 871-880 (2009).

5.

Peek, H. W., Landman, W. J. Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other
prevention strategies. Vet Q. 31, (3), 143-161 (2011).

http://www.jove.com/video/52552/isotrmico-de-amplificacin-lamp-ensayosloop-mediada-para-la-deteccin?language=Spanish

Rapid and Sensitive Detection of Vibrio parahaemolyticus

and Vibrio vulnificus by Multiple Endonuclease Restriction
Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification
Technique.
Wang Y1, Li D2, Wang Y3, Li K4, Ye C5.
Author information

Abstract
Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus are two marine seafood-borne pathogens causing
severe illnesses in humans and aquatic animals. In this study, a recently developed novel
multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology
(MERT-LAMP) were successfully developed and evaluated for simultaneous detection of V.
parahaemolyticus and V. vulnificus strains in only a single reaction. Two MERT-LAMP primer
sets were designed to specifically target toxR gene of V. parahaemolyticus and rpoS gene of V.
vulnificus. The MERT-LAMP reactions were conducted at 62 C, and the positive results were
produced in as short as 19 min with the genomic DNA templates extracted from the V.
parahaemolyticus and V. vulnificus strains. The two target pathogens present in the same
sample could be simultaneously detected and correctly differentiated based on distinct

fluorescence curves in a real-time format. The sensitivity of MERT-LAMP assay was 250 fg and
125 fg DNA per reaction with genomic templates of V. parahaemolyticus and V. vulnificus
strains, which was in conformity with conventional LAMPdetection. Compared with PCR-based
techniques, the MERT-LAMP technology was 100- and 10-fold more sensitive than that of PCR
and qPCR methods. Moreover, the limit of detection of MERT-LAMP approach for V.
parahaemolyticus isolates and V. vulnificus isolates detection in artificially-contaminated oyster
samples was 92 CFU and 83 CFU per reaction. In conclusion, the MERT-LAMP assay
presented here was a rapid, specific, and sensitive tool for the detection of V. parahaemolyticus
and V. vulnificus, and could be adopted for simultaneous screening of V. parahaemolyticus and
V. vulnificus in a wide variety of samples.

Trad
Deteccin rpida y sensible de Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus
por Mltiple Restriccin Endonucleasa Real-Time Loop mediada amplificacin
isotrmica Tcnica.
Wang Y1, Li D2, Wang Y3, Li K4 Vosotros C5.
Informacin del autor
abstracto
Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus son dos agentes patgenos
transmitidos por los mariscos marinos que causan enfermedades graves en
los seres humanos y los animales acuticos. En este estudio, una novela de
restriccin mltiple endonucleasa recientemente desarrollado en tiempo
real la tecnologa de amplificacin isotrmica mediada por bucle (MERTLAMP) se han desarrollado y evaluado para la deteccin simultnea de V.
parahaemolyticus y V. vulnificus en las cepas de una sola reaccin con xito.
Dos conjuntos de primer MERT-LMPARA fueron diseados para dirigirse
especficamente a genes toxR de V. parahaemolyticus y el gen rpoS de V.
vulnificus. Las reacciones de LAMP-MERT se realizaron a 62 C, y los
resultados positivos fueron producidos en tan corto como 19 min con las
plantillas de ADN genmico extrado de la V. parahaemolyticus y V.
vulnificus cepas. Los dos patgenos diana presentes en la misma muestra
se pudieron detectar de forma simultnea y correctamente diferencian
sobre la base de curvas de fluorescencia distintas en un formato en tiempo
real. La sensibilidad del ensayo MERT-LAMP fue de 250 y 125 fg fg de ADN
por reaccin con plantillas genmicas de V. parahaemolyticus y las cepas de
V. vulnificus, que estaba de acuerdo con la deteccin de lmpara
convencional. En comparacin con tcnicas basadas en PCR, la tecnologa
MERT-LAMP fue de 100 y 10 veces ms sensible que el de los mtodos de
PCR y qPCR. Por otra parte, el lmite de deteccin del mtodo MERT-LAMP
para V. parahaemolyticus y V. vulnificus asla asla la deteccin en muestras
de ostras artificialmente contaminadas era 92 CFU y 83 UFC por reaccin.
En conclusin, el ensayo MERT-LAMP presenta aqu era una herramienta
rpida, especfica y sensible para la deteccin de V. parahaemolyticus y V.

vulnificus, y podra adoptarse para la deteccin simultnea de V.

parahaemolyticus y V. vulnificus en una amplia variedad de las muestras.
Wang Y, Li D, Wang Y, Li K, Ye C.
Molecules. 2016 Jan 19;21(1). pii: E111. doi: 10.3390/molecules21010111.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26797596

Front Microbiol. 2016 Jan 12;6:1548. doi: 10.3389/fmicb.2015.01548. eCollection 2015.

A Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for

Serogroup Identification of Neisseria meningitidis in
Cerebrospinal Fluid.
Lee D1, Kim EJ1, Kilgore PE2, Takahashi H3, Ohnishi M3, Tomono J4, Miyamoto
S4, Omagari D5, Kim DW1, Seki M5.
Author information
Abstract
We have developed a novel Neisseria meningitidis serogroup-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
assay for six of the most common meningococcal serogroups (A, B, C, W, X, and Y). The assay was evaluated using a
set of 31 meningococcal LAMP assay positive cerebrospinal fluid (CSF) specimens from 1574 children with suspected
meningitis identified in prospective surveillance between 1998 and 2002 in Vietnam, China, and Korea. Primer
specificity was validated using 15 N. meningitidis strains (including serogroups A, B, C, E, W, X, Y, and Z) and 19 non-N.
meningitidis species. The N. meningitidis serogroup LAMP detected down to ten copies and 100 colony-forming units
per reaction. Twenty-nine CSF had N. meningitidis serogroup identified by LAMP compared with two CSF in which N.
meningitidis serogroup was identified by culture and multi-locus sequence typing. This is the first report of a serogroupspecific identification assay for N. meningitidis using the LAMP method. Our results suggest that this assay will be a
rapid, sensitive, and uniquely serogroup-specific assay with potential for application in clinical laboratories and public
health surveillance systems.

KEYWORDS:
Neisseria meningitidis; cerebrospinal fluid; children; loop-mediated isothermal
amplification; meningitis; serogroup identification
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26793181
trad
Microbiol frontal. 2016 12 de enero; 6: 1548. doi: 10.3389 /
fmicb.2015.01548. eCollection 2015.
Un ensayo de amplificacin isotrmica Novela Loop mediada por serogrupo
Identificacin de Neisseria meningitidis en el lquido cefalorraqudeo.

Lee D1, Kim EJ1, Kilgore PE2, Takahashi H3, Ohnishi M3, Tomono J4,
Miyamoto S4, Omagari D5, Kim DW1, Seki M5.
Informacin del autor
abstracto
Hemos desarrollado un nuevo amplificacin isotrmica mediada por bucle
(LAMP) ensayo de especificidad de serogrupo Neisseria meningitidis para
seis de los serogrupos de meningococos ms comunes (A, B, C, W, X, e Y). El
ensayo se evalu utilizando un conjunto de 31 LAMP ensayo meningoccica
positiva lquido cefalorraqudeo (LCR) especmenes de 1574 nios con
meningitis sospechosos identificados en vigilancia prospectiva entre 1998 y
2002 en Vietnam, China y Corea. Primer especificidad fue validada
utilizando 15 cepas de N. meningitidis (incluyendo los serogrupos A, B, C, E,
W, X, Y, y Z) y 19 no-N. especies meningitidis. La N. meningitidis del
serogrupo LMPARA detecta hasta diez copias y 100 unidades formadoras
de colonias por reaccin. Veintinueve CSF tena N. meningitidis del
serogrupo identificado por lmpara en comparacin con dos CSF en el que
N. meningitidis del serogrupo fue identificado por la cultura y la multi-locus
secuencia de mecanografa. Este es el primer informe de un ensayo de
identificacin de serogrupo especfico para N. meningitidis utilizando el
mtodo LAMP. Nuestros resultados sugieren que este ensayo ser un ensayo
rpido, sensible, y nicamente serogrupo-especfico con potencial de
aplicacin en los laboratorios clnicos y sistemas de vigilancia de salud
pblica.
PALABRAS CLAVE:
Neisseria meningitidis; fluido cerebroespinal; nios; bucle mediada
amplificacin isotrmica; meningitis; identificacin del serogrupo


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ORIGINAL RESEARCH ARTICLE

Front. Microbiol., 12 January 2016 | http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2015.01548
Keywords: Neisseria meningitidis, serogroup identification, loop-mediated isothermal amplification, meningitis,
cerebrospinal fluid, children
Citation: Lee D, Kim EJ, Kilgore PE, Takahashi H, Ohnishi M, Tomono J, Miyamoto S, Omagari D, Kim DW and Seki
M (2016) A Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Serogroup Identification of Neisseria
meningitidis in Cerebrospinal Fluid. Front. Microbiol. 6:1548. doi: 10.3389/fmicb.2015.01548
Received: 07 August 2015; Accepted: 21 December 2015;
Published: 12 January 2016.
Keywords: Neisseria meningitidis, serogroup identification, loop-mediated isothermal amplification, meningitis,
cerebrospinal fluid, children
Citation: Lee D, Kim EJ, Kilgore PE, Takahashi H, Ohnishi M, Tomono J, Miyamoto S, Omagari D, Kim DW and Seki
M (2016) A Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Serogroup Identification of Neisseria
meningitidis in Cerebrospinal Fluid. Front. Microbiol. 6:1548. doi: 10.3389/fmicb.2015.01548
Received: 07 August 2015; Accepted: 21 December 2015;
Published: 12 January 2016.
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full

A Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for

Serogroup Identification of Neisseria meningitidis in
Cerebrospinal Fluid
DoKyung Lee ,
1,2

Takahashi ,
4

6,7

Paul E. Kilgore ,

1,2

Makoto Ohnishi ,

Daisuke Omagari ,

Eun Jin Kim ,

Jun Tomono ,
5

Dong Wook Kim and

1,2*

Hideyuki

Shigehiko Miyamoto ,

Mitsuko Seki

6,7*

Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Hanyang University, Ansan, South Korea

Institute of Pharmacological Research, Hanyang University, Ansan, South Korea
Department of Pharmacy Practice, Eugene Applebaum College of Pharmacy & Health Sciences,

Wayne State University, Detroit, MI, USA

Department of Bacteriology I, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan

Kaneka, Co., Ltd., Osaka, Japan

Nihon University School of Dentistry, Tokyo, Japan

Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry, Tokyo, Japan

We have developed a novel Neisseria meningitidis serogroup-specific loopmediated isothermal amplification (LAMP) assay for six of the most common
meningococcal serogroups (A, B, C, W, X, and Y). The assay was evaluated using
a set of 31 meningococcal LAMP assay positive cerebrospinal fluid (CSF)
specimens from 1574 children with suspected meningitis identified in
prospective surveillance between 1998 and 2002 in Vietnam, China, and Korea.
Primer specificity was validated using 15 N. meningitidis strains (including
serogroups A, B, C, E, W, X, Y, and Z) and 19 non-N. meningitidis species.
The N. meningitidis serogroup LAMP detected down to ten copies and 100
colony-forming units per reaction. Twenty-nine CSF had N.
meningitidis serogroup identified by LAMP compared with two CSF in which N.
meningitidis serogroup was identified by culture and multi-locus sequence
typing. This is the first report of a serogroup-specific identification assay for N.
meningitidis using the LAMP method. Our results suggest that this assay will be
a rapid, sensitive, and uniquely serogroup-specific assay with potential for
application in clinical laboratories and public health surveillance systems.

Introduction
Neisseria meningitidis is a gram-negative -proteobacterium and member of the
bacterial family Neisseriaceae (Stephens et al., 2007). The meningococcal
polysaccharide capsule and outer membrane proteins have been identified as N.
meningitidis virulence factors (Stephens, 2009). N. meningitidis is principally
subdivided into 12 serogroups based on the capsular polysaccharide type (A, B, C, E, H,
I, K, L, W, X, Y, and Z; Harrison et al., 2013). Globally, the majority of invasive
meningococcal disease has been attributable to six serogroups designated A, B, C, W, X,
and Y (Stephens et al., 2007; Stephens, 2009; Verma and Khanna, 2012).
The geographic distribution and epidemic potential of N. meningitidis may vary by
serogroup. In Europe and other industrialized countries, serogroups B and C are major
causes of invasive meningococcal disease (Harrison et al., 2009). The majority of
meningococcal disease in European countries, which ranges in incidence from 0.2 to 14
cases per 100,000 (Harrison et al., 2009), is caused by serogroup B strains, particularly
in countries that have introduced meningococcal serogroup C conjugate vaccines. More
recent reports have noted increases in serogroup W and Y meningococcal disease
(Campbell et al., 2009; Ladhani et al., 2012). In the Americas, the majority of
meningococcal disease is caused by serogroups B and C (Stephens et al., 2007). The
emergence of serogroup W and Y has been noted in some countries where surveillance
is present (Chiavetta et al., 2007). In Africa, N. meningitidis is the leading cause of
severe, life-threatening meningitis and has been responsible for thousands of cases and
scores of deaths across sub-Saharan meningitis belt countries (Alonso et al., 2006).
Seasonal large-scale epidemics caused by N. meningitidis serogroup A have been
frequent in Sub-Saharan Africa ranging from Senegal to Ethiopia (WHO, 2011). The
introduction of meningococcal serogroup A conjugate vaccines in countries of SubSaharan Africa has led to significant reductions in serogroup A epidemics (Kristiansen
et al., 2014). Serogroup C, serogroup X and, most recently, serogroup W disease have
also been reported (Harrison et al., 2009). The emergence of serogroup W
meningococcal disease in Africa was associated with a large epidemic among Hajj
pilgrims in 2000 and a large-scale meningitis outbreak in Burkina Faso during 2002
(Alonso et al., 2006). In Asia, serogroup B has been identified as the leading cause of
meningococcal disease in Thailand and Taiwan (Harrison et al., 2009). N.
meningitidis serogroups A, C, X, and Y have been identified in these and other Asian
countries (Stephens et al., 2007; Harrison et al., 2009; Kim et al., 2012b).
Traditionally, invasive disease due to N. meningitidis has been diagnosed using
specialized bacterial culture media and reagents (e.g., anti-sera) used for identifying N.
meningitidis serogroups (Corless et al., 2001). While traditional gram staining and
observation using light microscopy are used for N. meningitis detection, these

techniques do not permit serogroup identification (Chanteau et al., 2006). The

diagnosis of N. meningitidisinvasive disease by culture testing requires a well-equipped
laboratory with appropriate biosafety equipment and procedures (Borrow et al., 2014).
In some settings, rapid immunochromatographic antigen detection testing has been
applied for detection of N. meningitidis but these assays are limited by relatively low
diagnostic sensitivity (Chanteau et al., 2006). Traditional diagnostic assays also have
limited utility in many populations and health systems where inappropriate use of
antibiotics continues despite global increases in antibiotic resistance (Levy and
Marshall, 2004). In such settings, detection of N. meningitidis may be problematic due
to inhibition of bacterial growth due to antibiotics present in human clinical samples
(Laxminarayan et al., 2013). In such cases, isolation of bacteria from patients
cerebrospinal fluid (CSF) is time-consuming and may yield little or no growth.
Given the geographic and temporal variations in meningococcal strains causing both
epidemic and sporadic disease, the serogroup identification of N. meningitidis to
identify circulating serogroups is important as a part of disease control and surveillance
programs. Efforts to improve diagnostics for N. meningitidis have included
development of a rapid immunochromatographic assay that uses monoclonal
antibodies against polysaccharides for identification of serogroups A, W, C, and Y. Use
of this assay has been most prominent in endemic regions of Africa (Chanteau et al.,
2006). A number of PCR-based methods have been developed to identify major N.
meningitidis serogroups by targeting the polysialyltransferase siaD gene or other genes
involved in serogroup-specific capsule synthesis (Taha et al., 2005; Fraisier et al.,
2009). In addition, real-time and multiplex PCR assays for serogroup identification
of N. meningitidis have been developed (Fraisier et al., 2009; Zhu et al., 2012; Doyle
and Jennison, 2013). However, equipment required for conventional and real-time
PCR assays is relatively expensive, and PCR methods are complex to perform in
resource-limited laboratory settings found in many developing countries where N.
meningitidis infections have been reported.
The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method (Notomi et al.,
2000, 2015) offers an attractive alternative to bacterial cultivation and PCR. The LAMP
assay uses four different primers to identify six distinct regions on the target gene,
resulting in a greater specificity than conventional PCR. Additional primers (i.e., the
loop primers designated LF and LB) designed to anneal the loop structure in LAMP can
be used to increase sensitivity and specificity of the LAMP reaction (Tomita et al.,
2008). During the LAMP reaction, a small amount of DNA can be detected due to the
high amplification capacity of the assay. In addition, the LAMP assay does not require
the use of complicated procedures, equipment, or machines. For these reasons, the
LAMP assay is considered more rapid, efficient, simpler, and more economical than
other diagnostic methods.

Recently, we developed a LAMP-based assay (Lee et al., 2015) that demonstrated high
sensitivity and specificity for N. meningitidis detection in CSF. In the present study, we
report the development of a LAMP-based N. meningitidis serogroup identification
assay and the evaluation of this assays ability to detect specific N.
meningitidis serogroups in CSF. This is the first report of N. meningitidis serogroupspecific identification using the LAMP method.

Materials and Methods

Bacterial Strains
This study used 35 standard reference strains, including 15 N. meningitidis; serogroups
A (HY0001 and NIID1), B (HY0002, H44/76, and NIID2), C (HY0003 and NIID3), E
(NIID8), W (HY0006 and NIID93), X (HY0004 and NIID4), Y (HY0005 and NIID5),
and Z (NIID6): nine non-meningococcal Neisseria species; N. gonorrhoeaeNIID9, N.
flavescens NIID10, N. denitrificans NIID11, N. elongata NIID12, N. canis NIID13, N.
cinerea NIID14,N. lactamica NIID85, N. mucosa NIID16, and N. sicca NIID17: and 10
other bacterial strains; Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Staphylococcus
aureus ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, K. oxytoca ATCC
700324, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC
25922, Enterococcus faecalis ATCC 700324, Mycobacterium tuberculosis ATCC
27294, and Haemophilus influenzae ATCC 9007 and IID984 (Lee et al., 2015;
Supplemental Materials, Table 1).
TABLE 1

TABLE 1. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets for

serogroup identification of N. meningitidis.
For the detection limit study; we used six N. meningitidis strains; serogroups A
(HY0001), B (HY0002), C (HY0003), W (HY0006), X (HY0004), and Y (HY0005).
Bacterial colony forming unit (CFU) was determined as follows: bacteria were
inoculated on chocolate agar culture plate (Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes,
NJ, USA) and further incubated in 5% CO2 at 37C for 24 h. The bacteria were collected

in 1 ml PBS and CFUs were determined by serial dilutions of culture suspensions

inoculated on chocolate agar plate.
Preparation of Chromosomal DNA
Genomic DNA was extracted from the 35 standard reference strains by the phenolchloroform method (Lee et al., 2015). For detection limit analysis, genomic DNAs
from N. meningitidis serogroups A (HY0001), B (HY0002), C (HY0003), W (HY0006),
X (HY0004), and Y (HY0005) were used, and the concentration was determined using
a NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Approximately
2.5 fg/2 l of a DNA template was taken as one copy of the N. meningitidis genome per
reaction, based on the genome of N. meningitidis serogroup B strain MC58 [accession
number AE002098; 2272351 bp (Tettelin et al., 2000)]. To ascertain the detection limit
of the LAMP assay, serial 10-fold dilutions of the genomic DNA were tested in each
LAMP reaction, and the results were compared with those of each culture test as
described previously (Kim et al., 2012b).
For the detection limit study, triplicate LAMP testing was performed using 10-fold
dilutions of genomic DNA. Two technicians tested the same samples independently to
confirm the reproducibility of LAMP results as described previously (Kim et al.,
2012a; Lee et al., 2015).
LAMP Primer Design
Using PrimerExplorer V4 software1, we designed six serogroup identification LAMP
primer sets (Table 1) targeting the genome sequence of each serogroup-specific gene
identified (Taha et al., 2005; Fraisier et al., 2009): sacB (GenBank accession number
FR774048) for serogroup A, siaD (GenBank accession number CP002424) for
serogroup B, siaD (GenBank accession number AM421808) for serogroup
C, synG (GenBank accession number AY234197) for serogroup W, ctrA (GenBank
accession number AY289931) for serogroup X, and synF (GenBank accession number
AY234201)for serogroup Y.
Due to a high level of sequence identity between synF and synG genes (Zhu et al.,
2012; Doyle and Jennison, 2013), we used the LAMP method along with an
amplification refractory mutation system (ARMS; Newton et al., 1989; Ikeda et al.,
2007) to detect the specific sequences of synF (Table 1). The ARMS uses uniquely
designed primers that enable detection of mutations (Newton et al., 1989). As a target
of the present investigation, we chose two specific sequences of the serogroup
Y synF gene. Based on the principle of ARMS, one of the two specific sequences was
designed in the 5 end of the BIP primer, and the other was designed in the second
sequence of the 5 end of the FIP primer (Table 1). We then added one mutation in the

third sequence of the 5 end of the BIP primer (from G to C), and an additional
mutation in the fourth sequence of the 5 end of the FIP primer (from C to G).
LAMP and PCR Reactions
The LAMP reaction was performed with 25 l of a mixture containing 1.6 M each of
primers FIP and BIP, 0.2 M of primers F3 and B3, 0.4 M of primers LF and LB, 8 U
of the Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA),
1.4 mM each of the four deoxynucleoside triphosphates, 0.8 M betaine, 20 mM TrisHCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4, 0.1% Tween 20, and 2 l of
template. The high-performance liquid chromatography-purified primers were
dissolved in Tris-EDTA buffer. The mixture was incubated at 6365C (Table 1) for 60
min and then heated at 80C for 2 min to terminate the reaction. For the detection
limit study, PCR was performed as described previously (Fraisier et al., 2009).
Analysis of LAMP Products
Neisseria meningitidis serogroup detection was observed by the visual inspection
based on its generation of turbidity proportional to the amount of amplified DNA (Mori
et al., 2004; Lee et al., 2015). A Loopamp real-time turbidimeter (LA-200 real-time
turbidimeter; Eiken Chemical, Co., Ltd., Tokyo, Japan) was used to monitor the
turbidity in the reaction tube in real-time by reading the OD650 every 6 s. According to
the manufacturers protocol (Mori et al., 2004), we used the application software for
the turbidimeter to obtain the amplification time required to exceed a turbidity level of
0.1 (Tt). For the detection limit and specificity study, we also used electrophoretic
analysis and a colorimetric visual inspection dye, Leuco Crystal Violet (LCV; D-Quick;
Kaneka, Co., Ltd., Osaka, Japan; Miyamoto et al., 2015). LCV was dried down in the
caps of the reaction tubes. After reactions were completed, the LAMP amplicons were
mixed by inverting the tubes, and changes in color were observed to obtain test results
(negative, remained colorless; positive, color change to blue: Figure 1).
FIGURE 1

FIGURE 1. Visual inspection of dye-mediated monitoring of the N.

meningitidis serogroup-specific loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) assay. The original colorless appearance of the visual inspection dye

(Kaneka, Co., Ltd., Osaka, Japan) changed to blue if the reaction was positive; if
reaction was negative, the dye remained colorless. (A), Results of N.
meningitidis serogroup A-LAMP assay. (B), Results of N. meningitidis serogroup BLAMP assay. (C), Results of N. meningitidis serogroup C-LAMP assay. (W), Results
of N. meningitidis serogroup W-LAMP assay. (X), Results of N. meningitidis serogroup
X-LAMP assay. (Y), Results of N. meningitidis serogroup Y-LAMP assay. NC, negative
control.
To verify the structure of LAMP amplified products, the amplified LAMP products were
sequenced using a BigDye Terminator v. 3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) and an ABI PRISM 377 DNA sequencer (Applied Biosystems)
according to the manufacturers instructions (Kim et al., 2012a; Lee et al., 2015). The
target region was between F2 and B2, and the primer sequences were from the F2 and
B2 regions.
Clinical CSF Specimens
Children with suspected meningitis who were less than 5 years of age were
prospectively enrolled at the participating hospitals between 1998 and 2002 (Kim et al.,
2012b). CSF was streaked on commercial blood agar culture medium (Becton,
Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ, USA), incubated in 5% CO 2 at 37C for 3 days, and
checked daily for bacterial growth (Kim et al., 2012b). Isolates were identified using
standard microbiological criteria (Isenberg, 1998). The established multi-locus
sequence typing (MLST) scheme2 forNeisseria sp. was used for further genotype
identification.
As described previously (Kim et al., 2012a; Lee et al., 2015), to extract bacterial DNA,
CSF specimens were heated at 95C for 3 min and centrifuged at 13,000 g for 5 min.
The samples were stored at -80C. Two microliters of the supernatant were used for
LAMP assays. In the previous study (Lee et al., 2015), we had tested 1,574 randomly
selected CSF specimens in Korea (n = 470), China (n = 536), and Vietnam (n = 568)
using the Nm-LAMP assay targeting specific sequences of N. meningitidis ctrA gene. In
this study, we evaluated the serogroup identification LAMP assay using the set of 31
Nm-LAMP positive CSF specimens.
Ethics Statement
We utilized CSF specimens preserved from our previous surveillance study (Kennedy et
al., 2007). All CSF specimens utilized in this study were de-identified prior to
laboratory processing and analysis. Ethical approvals for patient specimen collection
during surveillance were obtained from the following ethics review committees: the
Institutional Review Board of International Vaccine Institute, Seoul, Korea; the

Institutional Review Board at National Institute of Hygiene and Epidemiology, Hanoi,

Vietnam; and the Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control,
Nanning, China. Each institution participated in prospective, population-based
surveillance for childhood meningitis from 1999 to 2002 (Kim et al., 2004; Anh et al.,
2006). During those surveillance studies, written consent was not obtained as the CSF
collection was considered routine standard care for hospitalized children with
suspected bacterial meningitis. For this reason, verbal consent of the parent or legal
guardian present with the child during the period of hospitalization was recorded in the
patients medical chart at the time of the clinical lumbar puncture procedure. This
consent procedure was approved by these local scientific ethics review committees of
the participating institutions.

Results
Specificity of the Serogroup Identification LAMP Assay
To evaluate the species specificity of the N. meningitidis LAMP primer set, we tested 35
reference strains, as described above. When approximately 1-ng whole-cell DNA
(106 copies of genomic DNA of each strain) was used in the LAMP reaction,
amplification products from each of the related serogroup strains were observed within
30 min, whereas none of the other strains resulted in amplification products even after
60 min of incubation (Figure1). We confirmed that the amplification products
corresponded to the selected sequence target by sequencing using primers F2 and B2.
The LAMP reaction is highly specific for each serogroup.
Detection Limits of the Serogroup Identification LAMP and PCR Assays
The detection limits for the LAMP assays were 10 or 100 genome copies and 100 to
1,000 CFUs (25 L of reaction mix, triplicate trials) as described in Table 2. The
detection limits of the PCR assays were 103 to 104genome copies per reaction (Table 2).
Throughout the study, the evaluation of the LAMP reactions showed complete
agreement between a white precipitate recorded by visual inspection, the real-time
turbidimeter, electrophoretic analysis, and LCV. Using LCV, the colorless dye changed
to blue color indicating a positive reaction. These results were evaluable under natural
light without the need for UV light (Figure 1).
TABLE 2

TABLE 2. Detection limits of the N. meningitidis serogroup-specific LAMP

assay.

LAMP Applied to Analysis of Clinical CSF Specimens

A group of 31 known Nm-LAMP-positive specimens (Lee et al., 2015) were also
analyzed by N. meningitidisserogroup-specific LAMP tests. The LAMP assay
identified N. meningitidis serogroup for 29 of the 31 N. meningitidis-positive CSF
specimens (Table 3). Using a novel LAMP assay based on the ARMS principle, we
succeeded in differentiating N. meningitidis serogroup Y from N.
meningitidis serogroup W (Figure 1). Five serogroup A (5/31, 16.1%), five serogroup B
(5/31, 16.1%), three serogroup C (3/31, 9.7%), five serogroup X (5/31, 16.1%), five
serogroup Y (5/31, 16.1%), and six serogroup W (6/31, 19.4%) specimens were
identified. Two samples were non-typable for N. meningitidis (2/31, 6.5%). Each
serogroup-specific LAMP-amplified product was confirmed by sequencing, and the
sequence results were identical to the reference sequences.
TABLE 3

TABLE 3. Results of the serogroup-specific LAMP assay of 31 CSF samples

of N. meningitidisctrA positive.
In the previous study (Kennedy et al., 2007), three N. meningitidis culture-positive
(3/31, 9.7%) were confirmed and two of the three specimens were serogroup B positive
using MLST (Table 3). The MLST scheme and database of Neisseria sp. are wellestablished and publically available at http://pubmlst.org/neisseria/. The MLST
scheme and methods previously described were applied to the N. meningitidis isolates.
Seven MLST loci were amplified by using PCR primers and the DNA sequences of each
locus were compared to the same locus from the database. Two serogroup B N.
meningitidis isolates contained an allele type 140, 5, 9, 173, 175, 34, 165 (in the
order abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC, and pgm), which has been designated as
sequence type 1576 (ST1576).
Compared to the culture method, the sensitivity and specificity of the N.
meningitidis serogroup B LAMP assay were 100% (2/2) and 89.7% (26/29).

Discussion
The novel N. meningitidis serogroup-specific LAMP assay reported here demonstrated
high detection rates as well as high test specificity and sensitivity. These higher
detection rates found with the LAMP assay compared with conventional PCR is
consistent with previous studies of LAMP assays (Kim et al., 2011, 2012a). The robust
performance of the LAMP assay is made possible by the use of four different primers to

identify six distinct regions on the target gene. The design of our primers for the assay
described here are unique and enable clear differentiation between six major
serogroups of N. meningitidis responsible for invasive meningococcal disease
(including meningitis) found around the world.
We successfully differentiated N. meningitidis serogroup Y from N.
meningitidis serogroup W using the ARMS principle (Newton et al., 1989). The first
application of ARMS in LAMP primer design to detect a point mutation of target
sequences was reported by Ikeda et al. (2007). The investigator added one mutation at
the 5 end of BIP primer that permitted successful detection of the point mutation. In
our experiments, optimizing the design of the LAMP primer set for serogroup Y proved
to be challenging because key target gene sequences (synF from serogroup Y
and synG from serogroup W) share a high degree of similarity that has been also noted
by other investigators (Zhu et al., 2012; Doyle and Jennison, 2013). To successfully
differentiate and accurately identify serogroup Y and W strains, we created mutations
at the 5 end of both the FIP and BIP primers.
The detection limits for the serogroup-specific LAMP assays were 10 or 100 genome
copies and 100 to 1,000 CFUs, and the conventional PCR assays had much lower
sensitivity (103 to 104 genome copies) than LAMP. The evaluation of the LAMP reactions
showed complete agreement between a white precipitate recorded by visual inspection,
the real-time turbidimeter, electrophoretic analysis, and LCV. The results of LCV were
evaluable under natural light without the need for UV light and the color change
remained visible for at least 1 week (Lee et al., 2015). The experience using LCV
colorimetric visual inspection dye reported here can inform and facilitate future
development and application of the LAMP assay in resource-limited settings.
We used preserved de-identified CSF specimens that were collected between 1998 and
2002 in our previous study of bacterial meningitis (Kim et al., 2012b). In the previous
study (Lee et al., 2015), using 1574 randomly selected CSF specimens, we detected 31
Nm-LAMP assay positive CSF specimens including three N. meningitidisculturepositive (3/31, 9.7%). Two of the three specimens were confirmed as serogroup B
positive using MLST.
Using the meningococcus serogroup-specific LAMP assay, 29 of the 31 known NmLAMP-positive specimens (Lee et al., 2015) were one of six serogroup-specific positive
CSF specimens. Five serogroup A (5/31, 16.1%), five serogroup B (5/31, 16.1%), three
serogroup C (3/31, 9.7%), five serogroup X (5/31, 16.1%), five serogroup Y (5/31,
16.1%), and six serogroup W (6/31, 19.4%) specimens were identified and two samples
were non-typable for N. meningitidis (2/31, 6.5%). In these results, the observation of
two non-typable specimens may be due to potential discrepancies in the sensitivity of
the Nm-LAMP (10 copies; Lee et al., 2015) compared with the N.

meningitidis serogroup-specific LAMP (10 or 100 copies) assays. Other possible

explanations for the observation of non-typable strains include the degradation of DNA
material in stored specimens as well as the presence of N. meningitidis serogroups not
covered by designed LAMP assays.
In settings of many developing countries where empiric use of broad-spectrum
antibiotics is common, conventional bacterial culture methods have low yield and are
likely to underestimate the true burden of N. meningitidis serogroups. During the
original prospective surveillance studies, field surveys showed that over-the-counter
use of antibiotics without a prescription was common in each country (Kim et al.,
2012b). Thus, to better understand the epidemiology bacterial meningitis pathogens
such as N. meningitidis, the meningococcal serogroup-specific LAMP offers an accurate
alternative diagnostic test. Our results suggest that the meningococcal serogroup LAMP
may provide a useful tool in areas where public health agencies wish to measure the
burden of N. meningitidis following introduction of meningococcal vaccines.
Based on our experience in this study, the N. meningitidis serogroup-specific LAMP
assay was easy to set-up and required no special equipment. In addition, this LAMP
assay provides high-quality test results within 2 h that make it feasible and costeffective for use. Given the simple format for the LAMP assay, this test also has
potential for performance in district-level health facilities in developing countries. To
confirm the LAMP assay performance characteristics compared with bacterial culture,
antigen detection and PCR, further evaluation of the N. meningitidis serogroup
identification LAMP in prospective studies are now planned.

Author Contributions
PK, HT, MO, DK, MS, contributed the conception of this study; SM, JT, DK, MS
designed the experiments; DL, EK, SM, DK, MS, DO performed the experiments; PK,
HT, MO acquired samples; DL, EK, JT, SM, DO, PK, DK, MS analyzed data; DL, EK,
JT, SM, DO, PK, DK, MS interpreted data; DL, EK, PK, HT, DK, MS drafted the
manuscript; and DO, MO, SM, JT approved the manuscript.

Funding
This work was supported by Japan Society for the Promotion of Science (JSPS)
KAKENHI Grant Number 10201004, the grant 2015R1A2A2A01007297 from National
Research Foundation (NRF) of Korea, and the JSPS and NRF under the Japan Korea
Basic Scientific Cooperation Program (NRF-2014K2A2A4001480).

Conflict of Interest Statement

Mitsuko Seki has received research grant funding from Kaneka, Co., Ltd. Jun Tomono
and Shigehiko Miyamoto are employees of Kaneka, Co., Ltd. Paul E. Kilgore serves on
meningococcal vaccine speakers bureau for Pfizer, Inc. The following authors have no
conflict of interests or financial disclosures to declare: DoKyung Lee, Eun Jin Kim,
Hideyuki Takahashi, Makoto Ohnishi, and DongWook Kim. These statements do not
alter our adherence to the journal policies on sharing data and materials.

Acknowledgments
We are grateful to Dr. Soon Ae Kim for her helpful advice. We are especially grateful to
Dr. Dang Duc Anh, National Institute of Hygiene and Epidemiology, Hanoi, Vietnam;
Dr. Bai Qing Dong, Guangxi Zhuang Autonomous Region Health Bureau, Nanning,
Guangxi, China; and Prof. Jung Soo Kim, Chonbuk National University School of
Medicine, Jeonju, Korea for their support in this study.

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Traduccin
Hemos desarrollado un nuevo amplificacin isotrmica mediada por bucle
(LAMP) ensayo de especificidad de serogrupo Neisseria meningitidis para
seis de los serogrupos de meningococos ms comunes (A, B, C, W, X, e Y). El
ensayo se evalu utilizando un conjunto de 31 LAMP ensayo meningoccica
positiva lquido cefalorraqudeo (LCR) especmenes de 1574 nios con
meningitis sospechosos identificados en vigilancia prospectiva entre 1998 y
2002 en Vietnam, China y Corea. Primer especificidad fue validada
utilizando 15 cepas de N. meningitidis (incluyendo los serogrupos A, B, C, E,
W, X, Y, y Z) y 19 no-N. especies meningitidis. La N. meningitidis del
serogrupo LMPARA detecta hasta diez copias y 100 unidades formadoras
de colonias por reaccin. Veintinueve CSF tena N. meningitidis del
serogrupo identificado por lmpara en comparacin con dos CSF en el que

N. meningitidis del serogrupo fue identificado por la cultura y la multi-locus

secuencia de mecanografa. Este es el primer informe de un ensayo de
identificacin de serogrupo especfico para N. meningitidis utilizando el
mtodo LAMP. Nuestros resultados sugieren que este ensayo ser un ensayo
rpido, sensible, y nicamente serogrupo-especfico con potencial de
aplicacin en los laboratorios clnicos y sistemas de vigilancia de salud
pblica.

Introduccin
Neisseria meningitidis es una -proteobacteria y miembro de la familia de
bacterias gram-negativo Neisseriaceae (Stephens et al., 2007). La cpsula
polisacrida meningoccica y protenas de membrana externa han sido
identificados como factores de virulencia N. meningitidis (Stephens, 2009).
N. meningitidis se subdivide principalmente en 12 serogrupos basados en el
tipo polisacrido capsular (A, B, C, E, H, I, K, L, W, X, Y, y Z; Harrison et al,
2.013.). A nivel mundial, la mayora de la enfermedad meningoccica
invasiva ha sido atribuible a seis serogrupos designados A, B, C, W, X, e Y
(Stephens et al., 2007; Stephens, 2009; Verma y Khanna, 2012).

La distribucin geogrfica y potencial epidmico de N. meningitidis pueden

variar segn el serogrupo. En Europa y otros pases industrializados, los
serogrupos B y C son las principales causas de enfermedad meningoccica
invasiva (Harrison et al., 2009). La mayora de la enfermedad
meningoccica en los pases europeos, que se extiende en la incidencia de
0,2 a 14 casos por 100.000 (Harrison et al., 2009), es causada por cepas del
serogrupo B, especialmente en los pases que han introducido las vacunas
conjugadas serogrupo C meningoccica. Informes ms recientes han
observado incrementos en el serogrupo W y la enfermedad meningoccica Y
(Campbell et al, 2009;. Ladhani et al, 2012).. En las Amricas, la mayora de
la enfermedad meningoccica es causada por los serogrupos B y C
(Stephens et al., 2007). La aparicin de serogrupo W e Y se ha observado en
algunos pases donde la vigilancia est presente (Chiavetta et al., 2007). En
frica, N. meningitidis es la principal causa de graves, meningitis
potencialmente mortales y ha sido responsable de miles de casos y decenas
de muertes entre los pases cinturn de la meningitis subsaharianos (Alonso
et al., 2006). Grandes epidemias estacionales causadas por N. meningitidis
del serogrupo A han sido frecuentes en el frica subsahariana desde
Senegal hasta Etiopa (OMS, 2011). La introduccin del serogrupo
meningoccica A las vacunas conjugadas en los pases de frica
subsahariana, ha dado lugar a reducciones significativas de las epidemias
del serogrupo A (Kristiansen et al., 2014). El serogrupo C, serogrupo X y,
ms recientemente, tambin se han reportado serogrupo W enfermedad
(Harrison et al., 2009). La aparicin de la enfermedad meningoccica del
serogrupo W en frica se asoci con una gran epidemia entre los peregrinos

del Hajj en 2000 y un brote de meningitis en gran escala en Burkina Faso en

2002 (Alonso et al., 2006). En Asia, el serogrupo B se ha identificado como
la causa principal de la enfermedad meningoccica en Tailandia y Taiwn
(Harrison et al., 2009). N. meningitidis serogrupos A, C, X, e Y se han
identificado en estos y otros pases asiticos (Stephens et al, 2007;..
Harrison et al, 2009; Kim et al, 2012b.).

Tradicionalmente, la enfermedad invasiva debido a N. meningitidis se ha

diagnosticado usando medios especializados bacteriana de cultivo y
reactivos (por ejemplo, anti-sueros) que se utiliza para la identificacin de
los serogrupos de N. meningitidis (Corless et al., 2001). Mientras que la
tincin de Gram tradicional y la observacin mediante microscopa de luz se
usan para N. meningitis deteccin, estas tcnicas no permiten la
identificacin del serogrupo (Chanteau et al., 2006). El diagnstico de N.
meningitidis enfermedad invasiva por pruebas de la cultura requiere un
laboratorio bien equipado con equipo de bioseguridad adecuado y
procedimientos (Borrow et al., 2014). En algunos lugares, pruebas rpidas
de deteccin de antgeno inmunocromatogrfico se ha aplicado para la
deteccin de N. meningitidis, pero estos ensayos estn limitadas por la
sensibilidad de diagnstico relativamente baja (Chanteau et al., 2006).
Ensayos de diagnstico tradicionales tambin tienen utilidad limitada en
muchas poblaciones y sistemas de salud donde el uso inadecuado de
antibiticos contina a pesar de los aumentos globales de resistencia a los
antibiticos (Levy y Marshall, 2004). En tales contextos, la deteccin de N.
meningitidis puede ser problemtica debido a la inhibicin del crecimiento
bacteriano debido a los antibiticos presentes en muestras clnicas humanas
(Laxminarayan et al., 2013). En tales casos, el aislamiento de bacterias de
lquido cefalorraqudeo de los pacientes (CSF) es mucho tiempo y puede
producir poco o ningn crecimiento.

Dadas las variaciones geogrficas y temporales en las cepas de

meningococo que causan tanto epidemia y enfermedad espordica, la
identificacin del serogrupo de N. meningitidis serogrupos circulantes de
identificar es importante como parte del control de la enfermedad y de los
programas de vigilancia. Los esfuerzos para mejorar diagnsticos para N.
meningitidis han incluido el desarrollo de un ensayo inmunocromatogrfico
rpido que utiliza anticuerpos monoclonales contra polisacridos para la
identificacin de los serogrupos A, W, C, y Y. El uso de este ensayo ha sido
ms prominente en regiones endmicas de frica (Chanteau et al., 2006).
Una serie de mtodos basados en la PCR se han desarrollado para
identificar los principales serogrupos de N. meningitidis por la orientacin
del gen siaD polysialyltransferase u otros genes involucrados en la sntesis
especfica del serogrupo-cpsula (Taha et al, 2005;. Fraisier et al., 2009).
Adems, en tiempo real y los ensayos de PCR multiplex para la
identificacin del serogrupo de N. meningitidis se han desarrollado (Fraisier

et al, 2009;. Zhu et al, 2012;. Doyle y Jennison, 2013). Sin embargo, el
equipo necesario para los ensayos de PCR en tiempo real convencional y es
relativamente caro, y los mtodos de PCR son complejos para llevar a cabo
en el laboratorio de recursos limitados que se encuentran en muchos pases
en desarrollo, donde se han reportado N. meningitidis infecciones.

El mtodo de amplificacin isotrmica mediada por bucle (LAMP) (Notomi et

al., 2000, 2015) ofrece una alternativa atractiva al cultivo bacteriano y PCR.
El ensayo de lmpara utiliza cuatro cebadores diferentes para identificar
seis regiones distintas en el gen diana, lo que resulta en una especificidad
mayor que PCR convencional. Cebadores adicionales (es decir, los
cebadores bucle designados LF y LB) diseados para recocer la estructura
de bucle en lmpara se puede utilizar para aumentar la sensibilidad y la
especificidad de la reaccin LAMP (Tomita et al., 2008). Durante la reaccin
LAMP, una pequea cantidad de ADN se puede detectar debido a la alta
capacidad de amplificacin del ensayo. Adems, el ensayo LMPARA no
requiere el uso de complicados procedimientos, equipos o mquinas. Por
estas razones, el LAMP ensayo se considera ms rpida, eficiente, ms
simple y ms econmico que otros mtodos de diagnstico.

Recientemente, hemos desarrollado un ensayo basado-LAMP (Lee et al.,

2015) que demostr una alta sensibilidad y especificidad para la deteccin
de N. meningitidis en el LCR. En el presente estudio, se presenta el
desarrollo de un ensayo de identificacin de N. meningitidis del serogrupo
basado en LAMP y la evaluacin de la capacidad de este ensayo para
detectar N. meningitidis serogrupos especficos en el LCR. Este es el primer
informe de N. meningitidis serogrupo identificacin especfica utilizando el
mtodo LAMP.

Materiales y mtodos
Las cepas bacterianas
Este estudio utiliz 35 cepas de referencia estndar, incluyendo 15 N.
meningitidis; serogrupos A (HY0001 y NIID1), B (HY0002, H44 / 76, y NIID2),
C (HY0003 y NIID3), E (NIID8), W (HY0006 y NIID93), X (HY0004 y NIID4), Y
(HY0005 y NIID5) y Z (NIID6): nueve especies de Neisseria no
meningoccicas; N. gonorrhoeae NIID9, N. flavescens NIID10, N.
denitrificans NIID11, N. elongata NIID12, N. canis NIID13, N. cinerea NIID14,
N. lactamica NIID85, N. mucosa NIID16 y N. sicca NIID17: 10 y otra
bacteriana son; Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Staphylococcus
aureus ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, K. oxytoca ATCC
700324, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC
25922, Enterococcus faecalis ATCC 700324, ATCC 27294 Mycobacterium

tuberculosis, Haemophilus influenzae y ATCC 9007 y IID984 (Lee et al,

2015;. Materiales Suplementarios

Para el estudio del lmite de deteccin; utilizamos seis cepas de N.

meningitidis; serogrupos A (HY0001), B (HY0002), C (HY0003), W (HY0006),
X (HY0004) y Y (HY0005). Unidad formadora de colonia bacteriana (CFU) se
determin como sigue: Las bacterias se inocularon en la placa de cultivo de
agar de chocolate (Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se
incubaron adicionalmente en 5% de CO2 a 37 C durante 24 h. Las
bacterias se recogieron en 1 ml de PBS y se determinaron las UFC por
diluciones en serie de suspensiones de cultivo inoculados en la placa de
agar chocolate.

Preparacin de ADN cromosmico

El ADN genmico se extrajo de las cepas de referencia estndar 35 por el

mtodo de fenol-cloroformo (Lee et al., 2015). Para el anlisis lmite de
deteccin, ADN genmicos de N. meningitidis serogrupos A (HY0001), B
(HY0002), C (HY0003), W (HY0006), X (HY0004) y Y (HY0005) fueron
utilizados, y la concentracin se determin utilizando un NanoDrop 1000
(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU.). Aproximadamente 2,5
fg / 2 l de una plantilla de ADN se tom como una copia del genoma de N.
meningitidis por reaccin, basada en el genoma de la cepa N. meningitidis
serogrupo B MC58 [nmero de acceso AE002098; 2272351 pb (Tettelin et
al., 2000)]. Para determinar el lmite de deteccin del ensayo LAMP,
diluciones en serie de 10 veces de ADN genmico fueron probados en cada
reaccin LAMP, y los resultados se compararon con los de cada prueba de
cultivo como se describi previamente (Kim et al., 2012b).

Para el estudio lmite de deteccin, se realiz la prueba LAMPARA triplicado

usando diluciones de 10 veces de ADN genmico. Dos tcnicos probaron las
mismas muestras de forma independiente para confirmar la reproducibilidad
de los resultados lmpara como se ha descrito previamente (Kim et al,
2012a;. Lee et al, 2.015.).

LMPARA Primer Diseo

Usando PrimerExplorer V4 software1, diseamos y seis serogrupo conjuntos
de primer LMPARA identificacin (Tabla 1) dirigidos a la secuencia del
genoma de cada gen-serogrupo especfico identificado (Taha et al, 2005;
Fraisier et al., 2009).: Nmero de acceso sacB (GenBank FR774048 ) para el
serogrupo A, siaD (GenBank nmero de acceso CP002424) para el
serogrupo B, siaD (nmero de acceso GenBank AM421808) para el
serogrupo C, Syng (GenBank nmero de acceso AY234197) para el
serogrupo W, ctrA (GenBank nmero de acceso AY289931) para el
serogrupo X, y synth (GenBank nmero de acceso AY234201) para Y.
serogrupo

Debido a un alto nivel de identidad de secuencia entre los genes synth y

Syng (Zhu et al, 2012;. Doyle y Jennison, 2013), se utiliz el mtodo LAMP,
junto con un sistema de mutacin refractaria amplificacin (ARMS; Newton
et al., 1989; Ikeda et al., 2007) para detectar las secuencias especficas de
synth (Tabla 1). El BRAZOS utiliza un diseo nico cebadores que permiten
la deteccin de mutaciones (Newton et al., 1989). Como un objetivo de la
presente investigacin, se opt por dos secuencias especficas del gen
serogrupo Y synth. Basado en el principio de ARMS, una de las dos
secuencias especficas fue diseado en el extremo 5 'del cebador BIP, y el
otro fue diseado en la segunda secuencia del extremo 5' del cebador FIP
(Tabla 1). A continuacin, aade una mutacin en la tercera secuencia del

extremo 5 'del cebador BIP (de G a C), y una mutacin adicional en la cuarta
secuencia del extremo 5' del cebador FIP (de C a G).

Lmpara y PCR Reacciones

La reaccin LAMP se llev a cabo con 25 l de una mezcla que contiene 1,6
mM de cada uno de los cebadores FIP y BIP, 0,2 M de cebadores F3 y B3, 0,4
M de cebadores LF y LB, 8 U del fragmento grande de ADN polimerasa Bst
(New England Biolabs , Ipswich, MA, EE.UU.), 1,4 mM de cada uno de los
cuatro desoxinuclesidos trifosfato, 0,8 M de betana, mM Tris-HCl 20 (pH
8,8), KCl 10 mM, 10 mM (NH4) 2SO4, 8 mM MgSO4, 0,1% de Tween 20 y 2 l
de plantilla. Los cebadores de cromatografa purificados lquidos de alto
rendimiento se disolvieron en tampn Tris-EDTA. La mezcla se incub a 6365 C (Tabla 1) durante 60 min y despus se calent a 80 C durante 2 min
para terminar la reaccin. Para el estudio lmite de deteccin, la PCR se
realiz como se describi previamente (Fraisier et al., 2009).

Anlisis de la lmpara de los productos

Deteccin de Neisseria meningitidis serogrupo fue observada por la
inspeccin visual en base a su generacin de turbidez proporcional a la
cantidad de ADN amplificado (Mori et al., 2004; Lee et al, 2.015.). Un
turbidmetro en tiempo real Loopamp (LA-200 turbidmetro en tiempo real;
Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japn) se utiliz para controlar la turbidez en
el tubo de reaccin en tiempo real mediante la lectura de la OD650 cada 6
s. De acuerdo con el protocolo del fabricante (Mori et al., 2004), se utiliz el
software de aplicacin para el turbidmetro para obtener el tiempo de
amplificacin requerida para superar un nivel de turbidez de 0,1 (Tt). Para el
lmite de deteccin y estudio de especificidad, que tambin se utiliza el
anlisis de electroforesis y un tinte inspeccin visual colorimtrica, Leuco
Crystal Violet (LCV; D-Quick; Kaneka, Co., Ltd., Osaka, Japn;. Miyamoto et
al, 2015). LCV se sec en las tapas de los tubos de reaccin. Despus se
completaron las reacciones, los amplicones de LAMP se mezclaron
invirtiendo los tubos, y no se observaron cambios en el color para obtener
resultados de la prueba (negativos, se mantuvieron incoloro; positivo,
cambio de color a azul

Para verificar la estructura de la lmpara de productos amplificados, los

LAMP productos amplificados fueron secuenciados utilizando un kit BigDye
Terminator v. 3.1 ciclo de secuenciacin (Applied Biosystems, Foster City,
CA, EE.UU.) y un ABI PRISM 377 secuenciador de ADN (Applied Biosystems)
de acuerdo con la instrucciones del fabricante (Kim et al, 2012a;.. Lee et al,
2015). La regin diana fue entre F2 y B2, y las secuencias de cebador eran
de la F2 y de las regiones B2.
Las muestras clnicas de LCR
Los nios con sospecha de meningitis que tenan menos de 5 aos de edad
fueron inscritos prospectivamente en los hospitales participantes entre 1998
y 2002 (Kim et al., 2012b). CSF estaba manchado de sangre comercial
medio de cultivo agar (Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes, Nueva
Jersey, EE.UU.), se incubaron en 5% de CO2 a 37 C durante 3 das, y se
comprueba a diario para el crecimiento bacteriano (Kim et al., 2012b). Los
aislamientos se identificaron utilizando criterios microbiolgicos estndar
(Isenberg, 1998). La establecida multi-locus secuencia de mecanografa
(MLST) esquema 2 para Neisseria sp. se utiliz para su posterior
identificacin del genotipo.

Como se ha descrito previamente (Kim et al, 2012a;.. Lee et al, 2015), para
extraer el ADN bacteriano, las muestras de LCR fueron calentadas a 95 C
durante 3 min y se centrifugaron a 13.000 xg durante 5 min. Las muestras
se almacenaron a -80 C. Dos microlitros del sobrenadante se utilizaron
para los ensayos de la lmpara. En el estudio anterior (Lee et al., 2015), que
haba probado 1.574 muestras de LCR seleccionados al azar en Corea (n =
470), China (n = 536) y Vietnam (n = 568) utilizando el ensayo Nm-LAMP
orientacin secuencias especficas del gen N. meningitidis CTRA. En este
estudio, se evalu el ensayo LMPARA identificacin serogrupo utilizando el
conjunto de 31 Nm-LMPARA muestras de LCR positivo.
Declaracin de tica
Hemos utilizado muestras de LCR conservados de nuestro estudio de
vigilancia anterior (Kennedy et al., 2007). Todas las muestras de LCR
utilizados en este estudio se identificaron-des antes de la elaboracin de
laboratorio y anlisis. Aprobaciones ticas para la recogida de muestras del
paciente durante la vigilancia se obtuvieron de los siguientes comits de
revisin tica: la Junta de Revisin Institucional del Instituto Internacional de
Vacunas, Sel, Corea; la Junta de Revisin Institucional del Instituto Nacional
de Higiene y Epidemiologa, Hani, Vietnam; y el Centro de la Regin
Autnoma de Guangxi Zhuang de Control de Enfermedades, Nanning, China.
Cada institucin particip en la vigilancia prospectivo basado en la
poblacin para la meningitis infantil 1999 a 2.002 (Kim et al, 2004;.. Anh et
al, 2006). Durante esos estudios de vigilancia, no se obtuvo el
consentimiento por escrito como la recoleccin de LCR se consider la
atencin estndar de rutina para los nios hospitalizados con sospecha de
meningitis bacteriana. Por esta razn, el consentimiento verbal del padre o
tutor legal presente con el nio durante el periodo de hospitalizacin fue
registrado en la historia clnica del paciente en el momento del
procedimiento de puncin lumbar clnico. Este procedimiento de
consentimiento fue aprobado por los comits de revisin tica cientfica
locales de las instituciones participantes.
Resultados
Especificidad del ensayo serogrupo Identificacin LMPARA
Para evaluar la especificidad de especie del conjunto de cebadores N.
meningitidis LAMP, hemos probado 35 cepas de referencia, como se
describe anteriormente. Cuando el ADN de clulas enteras
aproximadamente 1-ng (106 copias de ADN genmico de cada cepa) se
utiliz en la reaccin LAMP, los productos de amplificacin de cada una de
las cepas del serogrupo relacionados se observaron dentro de 30 min,
mientras que ninguno de los dems cepas result en la amplificacin
productos incluso despus de 60 min de incubacin (Figura 1). Se confirm
que los productos de amplificacin correspondan a la secuencia diana
seleccionada mediante la secuenciacin utilizando los cebadores F2 y B2. La
reaccin LAMP es altamente especfico para cada serogrupo.

Lmites de Deteccin del serogrupo Identificacin lmpara y PCR ensayos

Los lmites de deteccin para los ensayos de LAMP eran 10 o 100 copias del
genoma y de 100 a 1000 UFC (25 l de mezcla de reaccin, los ensayos por
triplicado) tal como se describe en la Tabla 2. Los lmites de deteccin de los
ensayos de PCR fueron 103 a 104 copias de genoma por reaccin ( Tabla 2).
Durante todo el estudio, la evaluacin de las reacciones de LAMP mostr
completa acuerdo entre un precipitado blanco registrado por inspeccin
visual, el turbidmetro en tiempo real, anlisis electrofortico, y LCV. Usando
LCV, el tinte incoloro cambi al color azul que indica una reaccin positiva.
Estos resultados fueron evaluables con luz natural, sin la necesidad de que
la luz UV

LMPARA Aplicada al Anlisis de muestras clnicas de LCR

Un grupo de 31 conocidos especmenes Nm-LAMP-positivos (Lee et al.,
2015) tambin se analizaron por N. meningitidis del serogrupo pruebas de
LAMP-especfica. El ensayo LMPARA identificado N. meningitidis del
serogrupo para 29 de las 31 muestras de LCR N. meningitidis-positivos
(Tabla 3). El uso de un nuevo ensayo LMPARA basado en los BRAZOS
principio, tuvimos xito en la diferenciacin de N. meningitidis del serogrupo
Y de N. meningitidis del serogrupo W (Figura 1). Cinco serogrupo A (05/31,
16,1%), cinco B serogrupo (05/31, 16,1%), tres del serogrupo C (3/31, 9,7%),
cinco serogrupo X (05/31, 16,1%), cinco serogrupo y (5/31, 16,1%), y seis de
serogrupo W se identificaron (6/31, 19,4%) especmenes. Dos muestras
fueron no tipificable para N. meningitidis (2/31, 6,5%). Cada producto LAMPamplificado por serogrupo especfica se confirm mediante secuenciacin, y
los resultados de la secuencia fueron idnticos a las secuencias de
referencia.

En el estudio anterior (Kennedy et al., 2007), se confirmaron tres N.

meningitidis con cultivo positivo (3/31, 9,7%) y dos de los tres especmenes
eran serogrupo B positivo utilizando MLST (Tabla 3). El esquema MLST y
base de datos de Neisseria sp. estn bien establecidos y pblicamente

disponibles en http://pubmlst.org/neisseria/. El esquema de MLST y los

mtodos descritos anteriormente se aplicaron a los aislamientos de N.
meningitidis. Siete MLST loci fueron amplificados por PCR utilizando los
cebadores y las secuencias de ADN de cada locus se compararon con el
mismo locus de la base de datos. Dos meningitidis del serogrupo B de N.
aislados contena un tipo de alelo 140, 5, 9, 173, 175, 34, 165 (en el orden
abcZ, ADK, aroE, FUMC, gdh, PDHC y PGM), que ha sido designado como
secuencia Tipo 1576 (ST1576).

En comparacin con el mtodo de cultivo, la sensibilidad y especificidad del

ensayo B de N. meningitidis serogrupo LAMPARA eran 100% (2/2) y 89,7%
(26/29).

Discusin
La novela de N. meningitidis ensayo LAMP-serogrupo especfica inform aqu
demuestra altas tasas de deteccin, as como una alta especificidad y
sensibilidad de la prueba. Estas tasas de deteccin ms altas se encuentran
con el ensayo LMPARA comparacin con PCR convencional es consistente
con estudios previos de los ensayos de la lmpara (Kim et al., 2011, 2012a).
Se hace posible El slido rendimiento del ensayo lmpara por el uso de
cuatro cebadores diferentes para identificar seis regiones distintas en el gen
diana. El diseo de nuestros cebadores para el ensayo descrito aqu son
nicas y permiten una diferenciacin clara entre los seis principales
serogrupos de N. meningitidis responsables de la enfermedad
meningoccica invasiva (incluyendo meningitis) que se encuentran en todo
el mundo.

Nos diferenciamos con xito N. meningitidis del serogrupo Y de N.

meningitidis serogrupo W usar los brazos principales (Newton et al., 1989).
La primera aplicacin de las armas en primer diseo LMPARA para detectar
una mutacin puntual de secuencias diana se inform por Ikeda et al.
(2007). El investigador aadi una mutacin en el extremo 5 'del cebador
BIP que permita la deteccin exitosa de la mutacin puntual. En nuestros
experimentos, la optimizacin del diseo de la cartilla LMPARA fijado para
el serogrupo Y result ser un reto porque los principales secuencias de
genes diana (synth del serogrupo Y y Syng del serogrupo W) comparten un
alto grado de similitud que ha sido tambin observado por otros
investigadores ( Zhu et al, 2012;. Doyle y Jennison, 2013). Para diferenciar
con xito e identificar las cepas del serogrupo Y y W precisin, hemos
creado mutaciones en el extremo 5 'tanto de la FIP y los cebadores BIP.

Los lmites de deteccin para los ensayos de LAMP-serogrupo especfica

eran 10 o 100 copias del genoma y de 100 a 1000 UFC, y de los ensayos de
PCR convencionales tenido sensibilidad mucho menor (103 a 104 copias del
genoma) que LAMP. La evaluacin de las reacciones de LAMP mostr
completa acuerdo entre un precipitado blanco registrado por inspeccin
visual, el turbidmetro en tiempo real, anlisis electrofortico, y LCV. Los
resultados de LCV fueron evaluables con luz natural, sin la necesidad de que
la luz UV y el cambio de color se mantuvieron visibles por al menos 1
semana (Lee et al., 2015). La experiencia en el uso de vehculos comerciales
colorimtrico tinte inspeccin visual inform aqu puede informar y facilitar
el desarrollo futuro y la aplicacin de la prueba LAMP de entornos con
recursos limitados.

Utilizamos preservados muestras de LCR de-identificados que fueron

recogidos entre 1998 y 2002 en nuestro estudio anterior de la meningitis
bacteriana (Kim et al., 2012b). En el estudio anterior utilizando 1574
muestras de LCR seleccionados al azar (Lee et al., 2015),, detectamos 31
Nm de ensayo-LAMP muestras de LCR positivo entre ellos tres de N.
meningitidis con cultivo positivo (31.3, 9.7%). Dos de los tres especmenes
fueron confirmados como serogrupo B positiva utilizando MLST.

Usando el ensayo LAMP-serogrupo especfica meningococo, 29 de los 31

conocido especmenes Nm-LAMP-positivos (Lee et al., 2015) fueron una de
las seis muestras de LCR positivos-serogrupo especfico. Cinco serogrupo A
(05/31, 16,1%), cinco B serogrupo (31/05, 16,1%), tres del serogrupo C
(3/31, 9,7%), cinco serogrupo X (05/31, 16,1%), cinco serogrupo Y (5/31,
16,1%), y seis de serogrupo W (6/31, 19,4%) especmenes fueron
identificados y dos muestras eran no tipificable para N. meningitidis (2/31,
6,5%). En estos resultados, la observacin de dos muestras no tipificables
puede ser debido a los posibles discrepancias en la sensibilidad del NmLAMP (10 copias;. Lee et al, 2.015) en comparacin con la N. meningitidis
serogrupo-especfico de la lmpara (10 o 100 copias) ensayos. Otras
posibles explicaciones para la observacin de cepas no tipificables incluyen
la degradacin del material de ADN en muestras almacenadas, as como la
presencia de N. meningitidis serogrupos no cubierto por ensayos de lmpara
diseada.

En la configuracin de muchos pases en desarrollo, donde es comn el uso

emprico de antibiticos de amplio espectro, los mtodos convencionales de
cultivo bacteriano tienen bajo rendimiento y son propensos a subestimar la
verdadera carga de N. meningitidis serogrupos. Durante los estudios de
vigilancia futuros originales, estudios de campo mostraron que ms de
venta libre uso de antibiticos sin receta era comn en cada pas (Kim et al.,

2012b). Por lo tanto, para entender mejor la epidemiologa patgenos

meningitis bacterianas como N. meningitidis, el LAMP-serogrupo especfica
meningoccica ofrece una prueba diagnstica alternativa precisa. Nuestros
resultados sugieren que la lmpara serogrupo meningoccica puede
proporcionar una herramienta til en reas donde las agencias de salud
pblica desean medir la carga de N. meningitidis tras la introduccin de las
vacunas meningoccicas.

Basndonos en nuestra experiencia en este estudio, el ensayo LMPARA N.

meningitidis del serogrupo-especfico fue fcil de instalar y no requiere
equipo especial. Adems, este ensayo LMPARA ofrece resultados de
pruebas de alta calidad dentro de 2 h que hacen que sea factible y rentable
para su uso. Dado el formato simple para el ensayo de LAMP, esta prueba
tambin tiene potencial de actuacin en los centros de salud a nivel de
distrito en los pases en desarrollo. Para confirmar las caractersticas de
rendimiento del ensayo LMPARA comparacin con cultivo bacteriano,
deteccin de antgeno y la PCR, una evaluacin adicional de la lmpara de
identificacin de N. meningitidis del serogrupo en estudios prospectivos
ahora se plane.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25853422
Evaluacin clnica de una amplificacin isotrmica mediada por bucle
(LAMP) de ensayo para la deteccin rpida de Neisseria meningitidis en el
lquido cefalorraqudeo.
Lee D1, Kim EJ1, Kilgore PE2, Kim SA3, Takahashi H4, Ohnishi M4, Anh DD5,
Dong BQ6, Kim JS7, Tomono J8, Miyamoto S8, Notomi T9, Kim DW1, Seki
M10.
Informacin del autor
Fe de erratas en el
Correccin: Evaluacin clnica de un Loop mediada amplificacin isotrmica
(LAMP) Ensayo para la deteccin rpida de Neisseria meningitidis en el
lquido cefalorraqudeo. [Ms uno. 2015]
abstracto
FONDO:
Neisseria meningitidis (Nm) es un agente causal de la lder de la meningitis
bacteriana en los seres humanos. Tradicionalmente, la meningitis

meningoccica ha sido diagnosticada por cultivo bacteriano. Sin embargo, el

aislamiento de bacterias de lquido cefalorraqudeo de los pacientes (CSF)
es mucho tiempo y, a veces produce resultados negativos. Recientemente,
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basado en mtodos de
diagnstico para detectar Nm se han considerado el estndar de oro debido
a su mayor sensibilidad y especificidad en comparacin con la cultura. En
este estudio, hemos desarrollado un mtodo de bucle mediada amplificacin
isotrmica (LAMP) y se evalu su capacidad para detectar Nm en el lquido
cefalorraqudeo (LCR).
Metodologa / Principales conclusiones:
Hemos desarrollado un ensayo LMPARA meningoccica (Nm LAMP) que se
dirige el gen CTRA. La especificidad del cebador fue validada utilizando 16
cepas de N. meningitidis (serogrupo A, B, C, D, 29-E, W-135, X, Y, y Z) y 19
no-N. especies meningitidis. Dentro de 60 min, la lmpara Nm detecta hasta
diez copias por reaccin con sensibilidad 1.000 veces ms que la de la PCR
convencional. Los ensayos de LAMP se evaluaron utilizando un conjunto de
1574 muestras de LCR seleccionados al azar de los nios con sospecha de
meningitis recogidos entre 1998 y 2002 en Vietnam, China y Corea. El
mtodo LAMP ha demostrado ser ms sensible que los mtodos de PCR para
muestras de LCR (31 muestras de LCR fueron positivos LAMP vs. 25 por
PCR). La tasa de deteccin del mtodo LAMP fue sustancialmente mayor
que la del mtodo de PCR. En un anlisis comparativo de los ensayos de
PCR y la lmpara, la sensibilidad clnica, especificidad, valor predictivo
positivo y valor predictivo negativo del ensayo LAMP se fueron del 100%,
99,6%, 80,6% y 100%, respectivamente.
Conclusiones / Importancia:
En comparacin con PCR, LAMP detecta Nm con una mayor sensibilidad
analtica y clnica. Este mtodo LAMP sensible y especfica ofrece ventajas
significativas para el cribado de los pacientes en una base de la poblacin y
para el diagnstico en la prctica clnica.
1

Lee D , Kim EJ , Kilgore PE , Kim SA , Takahashi H , Ohnishi M , Anh DD , Dong BQ , Kim JS , Tomono J , Miyamoto
8

S , Notomi T , Kim DW , Seki M

10

otro

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26793181

Un ensayo de amplificacin isotrmica Novela Loop mediada por serogrupo

Identificacin de Neisseria meningitidis en el lquido cefalorraqudeo.
Lee D1, Kim EJ1, Kilgore PE2, Takahashi H3, Ohnishi M3, Tomono J4,
Miyamoto S4, Omagari D5, Kim DW1, Seki M5.

Informacin del autor

abstracto
Hemos desarrollado un nuevo amplificacin isotrmica mediada por bucle
(LAMP) ensayo de especificidad de serogrupo Neisseria meningitidis para
seis de los serogrupos de meningococos ms comunes (A, B, C, W, X, e Y). El
ensayo se evalu utilizando un conjunto de 31 LAMP ensayo meningoccica
positiva lquido cefalorraqudeo (LCR) especmenes de 1574 nios con
meningitis sospechosos identificados en vigilancia prospectiva entre 1998 y
2002 en Vietnam, China y Corea. Primer especificidad fue validada
utilizando 15 cepas de N. meningitidis (incluyendo los serogrupos A, B, C, E,
W, X, Y, y Z) y 19 no-N. especies meningitidis. La N. meningitidis del
serogrupo LMPARA detecta hasta diez copias y 100 unidades formadoras
de colonias por reaccin. Veintinueve CSF tena N. meningitidis del
serogrupo identificado por lmpara en comparacin con dos CSF en el que
N. meningitidis del serogrupo fue identificado por la cultura y la multi-locus
secuencia de mecanografa. Este es el primer informe de un ensayo de
identificacin de serogrupo especfico para N. meningitidis utilizando el
mtodo LAMP. Nuestros resultados sugieren que este ensayo ser un ensayo
rpido, sensible, y nicamente serogrupo-especfico con potencial de
aplicacin en los laboratorios clnicos y sistemas de vigilancia de salud
pblica.
PALABRAS CLAVE:
Neisseria meningitidis; fluido cerebroespinal; nios; bucle mediada
amplificacin isotrmica; meningitis; identificacin del serogrupo

Lee D, Kim EJ, Kilgore PE, Takahashi H, Ohnishi M, Tomono J, Miyamoto

S, Omagari D, Kim DW, Seki M.
Front Microbiol. 2016 Jan 12;6:1548. doi: 10.3389/fmicb.2015.01548. eCollection 2015.

Otrto
El ensayo LMPARA neumoccica mejorada: una herramienta clnica para el
diagnstico de meningitis por Streptococcus pneumoniae.
Kim DW1, Kilgore PE, Kim EJ, Kim SA, Anh DD, Dong BQ, Kim JS, Seki M.
Informacin del autor
abstracto

FONDO:
Streptococcus pneumoniae es una causa principal de enfermedad
bacteriana invasiva en los pases desarrollados y en desarrollo. Se estudi la
amplificacin isotrmica (LAMP) tcnica mediada por bucle para evaluar su
idoneidad para la deteccin de cido nucleico de S. pneumoniae en el
lquido cefalorraqudeo (LCR).
Metodologa / Principales conclusiones:
Establecimos un ensayo LAMP se mejora la orientacin del gen lytA
(Streptococcus pneumoniae [Sp] LAMP). La especificidad analtica de los
cebadores se valid mediante el uso de 32 cepas de referencia (10
Streptococcus y siete especies no Streptococcus), adems de 25 cepas de
estreptococos alfa-hemoltico clnicos, incluyendo cuatro cepas de S.
pneumoniae y otros 21 cepas (3 S. oralis, 17S. mitis, y una especie
Streptococcus) que albergan genes de factores de virulencia que codifica
(LYTA o capas). Dentro de los 30 minutos, el ensayo podra detectar tan
poco como 10 copias de ambos ADN purificado y LCR de pinchos muestras
con mayor sensibilidad que la reaccin en cadena de polimerasa
convencional (PCR). El rango de determinacin lineal para este ensayo es de
10 a 1.000.000 microorganismos por mezcla de reaccin utilizando
turbidimetra en tiempo real. Se evalu la sensibilidad clnica y la
especificidad del ensayo LMPARA Sp usando 106 muestras de LCR
seleccionados al azar de los nios con sospecha de meningitis en Corea,
China y Vietnam. Para la comparacin, las muestras de LCR tambin se
ensayaron frente a pruebas de PCR y de cultivo convencionales. La tasa de
deteccin del mtodo LAMP fue sustancialmente ms alta que las tasas de
PCR y pruebas de cultivo. En esta pequea muestra, en relacin con el
ensayo de LAMP, la sensibilidad clnica de las pruebas de PCR y el cultivo
fue 54,5% y 33,3%, respectivamente, mientras que la especificidad clnica
de las dos pruebas fue de 100%.
Conclusiones / Importancia:
En comparacin con PCR, Sp LAMP se detect S. pneumoniae con una
mayor sensibilidad analtica y clnica. Este mtodo especfico y sensible
LMPARA ofrece ventajas significativas para el cribado de los pacientes en
una base de la poblacin y para el diagnstico en la prctica clnica.

El anlisis electrofortico de los productos amplificados-LAMP Sp.

Carril M, escalera de 100 pb (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.),
utilizado como un marcador de tamao; carril 1, LAMP producto Sp de carril
2 tras la digestin con TasI (Fermentas, Inc.). Los fragmentos digeridos
fueron 107 y 108 pb; carril 2, 106 copias del DNA genmico de S.
pneumoniae ATCC 6305; carril 3, ninguna plantilla.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22900070

OTRO

Development and Evaluation of Loop-Mediated Isothermal

Amplification Method for Rapid Detection of Aspergillus fumigatus.
Tang Q, Tian S, Yu N, Zhang X, Jia X, Zhai H, Sun Q, Han L.
J Clin Microbiol. 2016 Jan 20. pii: JCM.01751-15. [Epub ahead of print]

Desarrollo y Evaluacin de Loop mediada amplificacin isotrmica Mtodo

para la deteccin rpida de Aspergillus fumigatus.
Tang Q1, Tian S2, Yu N3, Zhang X2, Jia X2, Zhai H3, Sun Q4, Han L5.
Informacin del autor
abstracto
Aspergillus fumigatus es un patgeno condicional y la principal causa de
amenaza para la vida aspergilosis invasiva (IA) en pacientes
inmunocomprometidos. La deteccin temprana y rpida de la infeccin por
A. fumigatus sigue siendo un gran desafo. En este estudio, el nuevo
miembro de la familia de hongos anexina C4 anexina fue elegido como el
objetivo de disear amplificacin isotrmica mediada por bucle (LAMP)
ensayos para la deteccin rpida, especfica y sensible de A. fumigatus.
Evaluacin de la especificidad de la lmpara desarrollado mostr que no se
observaron resultados falsos positivos para el 22 de no-A. fumigatus cepas
incluyendo cinco especies de Aspergillus gnero. Su lmite de deteccin fue
de aproximadamente 10 copias por reaccin en los plsmidos de referencia,
con una sensibilidad ms alta que la de-PCR cuantitativa en tiempo real
(qPCR) en 102 copias para el mismo objetivo. Un total de 69 pacientes
clnicos compone de probable IA (n = 14) y los posibles pacientes de
infeccin IA (n = 55) fueron sometidos al ensayo LMPARA desarrollado, y
14 pacientes probables IA (100%) y 34 posibles pacientes IA (61,82% ) se
detectaron positivo. Cuando la deteccin utilizacin de la lmpara
desarrollado se compar con que el uso de qPCR en 69 muestras clnicas,
LAMP demostr una sensibilidad del 89,19% y la tasa concordantes de los
dos mtodos fue de hasta 72,46%. Por consiguiente, un LAMP ensayo
valioso para la deteccin rpida, especfica y sencilla de A. fumigatus en los
ensayos clnicos se ha desarrollado.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26791368

OTRO

Systematic review: Comparison of Xpert MTB/RIF, LAMP and SAT

methods for the diagnosis of pulmonary tuberculosis.
Yan L, Xiao H, Zhang Q.
Tuberculosis (Edinb). 2016 Jan;96:75-86. doi: 10.1016/j.tube.2015.11.005. Epub 2015 Nov 30. Review.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26786658
Revisin sistemtica: Comparacin de Xpert MTB / RIF, lmpara y SAT
mtodos para el diagnstico de la tuberculosis pulmonar.
Yan L1, Xiao H1, Zhang Q2.
Informacin del autor
abstracto
Los avances tecnolgicos en la amplificacin de cidos nucleicos han dado
lugar a avances en la deteccin temprana de parto prematuro en
comparacin con las pruebas de esputo tradicionales. Se evalu la
sensibilidad y especificidad de la amplificacin isotrmica mediada por
bucle (LAMP), las pruebas de amplificacin simultnea (SAT), y Xpert MTB /
RIF para el diagnstico de tuberculosis pulmonar. Una revisin crtica de los
estudios previos de LAMP, SAT, y el Xpert MTB / RIF para el diagnstico de
tuberculosis pulmonar que utiliza el cultivo de laboratorio como mtodo de
referencia se llev a cabo junto con un meta-anlisis. En 25 estudios
previos, la sensibilidad agrupada y la especificidad del diagnstico de la
tuberculosis fueron 93% y 94% para LAMP, 96% y 88% para el SAT, y el 89%
y el 98% para la Xpert MTB / RIF. Las I (2) valores de los datos combinados
fueron> 80%, lo que indica heterogeneidad significativa. En el anlisis de
subgrupos con baciloscopia positiva de LAMP, la sensibilidad aument de
93% a 98% (I (2) = 2,6%), y la especificidad fue del 68% (I (2) = 38,4%). En
el anlisis de subgrupos infectados por el VIH de Xpert MTB / RIF, la
sensibilidad agrupada y la especificidad fueron 79% (I (2) = 72,9%) y 99% (I
(2) = 64,4%). En el anlisis de subgrupos VIH-negativa para Xpert MTB / RIF,
la sensibilidad agrupada y la especificidad fueron del 72% (I (2) = 49,6%) y

99% (I (2) = 64,5%). LAMP, SAT y Xpert MTB / RIF tenan comparativamente
altos niveles de sensibilidad y especificidad para el diagnstico de la
tuberculosis. La sensibilidad y especificidad diagnstica de tres mtodos
fueron similares, con lmpara de ser altamente sensible para el diagnstico
de la PTB con baciloscopia positiva. La rentabilidad de LAMP y SAT les hacen
pruebas particularmente adecuados para el diagnstico de PTB en los pases
en desarrollo.