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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

JLIO DE MESQUITA FILHO


FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
CMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

DESENVOLVIMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE


FORMULAO COSMTICA CONTENDO DIGLUCONATO
DE CLOREXIDINA

Mestranda: Flvia Anglica Msquio Fiorentino


Orientadora: Profa. Dra. Hrida Regina Nunes Salgado
Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corra

Araraquara, SP 2009

ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
JLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
CMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

DESENVOLVIMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE


FORMULAO COSMTICA CONTENDO DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Dissertao
Graduao
Pesquisa

apresentada
em
e

Medicamentos,

Cincias

ao

Programa

Farmacuticas,

Desenvolvimento
da

de

Faculdade

de

Ps-

rea

de

Frmacos

de

Cincias

Farmacuticas, UNESP, como parte dos requisitos para


obteno

do

Ttulo

de

Mestre

em

Cincias

Farmacuticas.

Orietandor: Profa. Dra. Hrida Regina Nunes Salgado


Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corra

Araraquara, SP, 2009

iii

Ficha Catalogrfica
Elaborada Pelo Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao
Faculdade de Cincias Farmacuticas
UNESP Campus Araraquara

Fiorentino, Flvia Anglica Msquio


F518d

Desenvolvimento e controle de qualidade de formulao cosmtica


contendo digluconato de clorexidina / Flvia Anglica Msquio Fiorentino.
Araraquara, 2009.
194 f.
Dissertao (Mestrado) Universidade Estadual Paulista. Jlio de
Mesquita Filho. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Programa de Ps
Graduao em Cincias Farmacuticas
Orientador: Hrida Regina Nunes Salgado
Co-orientador: Marcos Antonio Corra

1.Controle de qualidade Clorexidina. 2. Sabonete lquido.


3.Clorexidina. 4.Cosmetologia. I. Salgado, Hrida Regina Nunes, orient. II.
Corra, Marcos Antonio, co-orient.. III.Ttulo.

CAPES: 403000005

iv

Toda sabedoria vem do Senhor e est com ele para sempre


Quem poder contar a areia das praias, as gotas da chuva e
os dias do mundo?
Quem poder explorar a altura do cu, a extenso da terra e
a profundeza do abismo?
A sabedoria foi criada antes de todas as coisas, e a
inteligncia prudente foi criada antes dos sculos
A quem foi revelada a raiz da sabedoria?
Quem conhece os seus projetos?
Somente um sbio, e por demais terrvel quando se
assenta em seu trono: o Senhor, ele que criou a sabedoria, a
conheceu, a enumerou e a derramou sobre todas as suas
obras
Ele a repartir entre os seres vivos, conforme sua
generosidade, e a concedeu a todos aqueles que o amam

Eclesitico 1.

Aos meus queridos e amados pais Celso e Clia...

Pelo amor em todos os dias de minha vida, pelo


apoio em todos os momentos em que foi preciso, pelos
incentivos, pelo carinho, pela preocupao, pelas oraes,
pela ajuda financeira, pela confiana de que eu seria capaz
desta conquista, por sempre cuidarem do meu grande amor
para que eu ficasse tranquila e realizasse minha dissertao
da melhor maneira possvel.
Desculpem-me pelos momentos em que ausncia e a falta
de ateno estiveram presentes.
Obrigada por serem meus pais. Amo vocs!!!

... Por toda a minha vida eu vou amar vocs ...

vi

Ao meu grande amor, meu filho Gabriel...

Sua existncia e seu amor so os motivos para


persistir e nunca desistir dos sonhos...
A distncia fsica nunca me fez deixar de pensar
em voc um dia que fosse. A saudade me colocou em dvida
muitas vezes, mas lembrar do seu rostinho lindo a fora e a
coragem para continuar a caminhar...
Perdoe-me pela falta de pacincia e pelos momentos
ausentes, e olha que no foram poucos...
Amo voc mais do que tudo!!!

... Eu tenho tanto pra te falar


Mas com palavras no sei dizer
Como grande o meu amor por voc ...

vii

minha querida irm, Camila...

Por sempre me incentivar na realizao deste


trabalho, por sempre dizer palavras de coragem quando
foram necessrias, pelas oraes, por sempre estar presente e
ter me ajudado e apoiado.
Obrigada!!!

... H certas horas que s queremos a mo no ombro, o abrao


apertado ou mesmo o estar ali, quietinho, ao lado...
Sem nada dizer...
Algum que ria de nossas piadas sem graa...
Que ache nossas tristezas as maiores do mundo...
E que apesar de todas essas mentiras teis, nos seja de uma sinceridade
inquestionvel...

Willian Shakespeare

viii

Prof. Dr. Hrida Regina Nunes Salgado...

Por ter sido minha orientadora!


Obrigada

pela

confiana,

pelos

ensinamentos,

incentivos e por ter-me dado a chance da realizao deste


trabalho.
Obrigada por ser exemplo de uma profissional
extremamente competente e determinada.

ix
... Depois de algum tempo voc aprende a construir todas as suas
estradas no hoje, porque o terreno do amanh incerto demais ...
Aprende que verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a
longas distncias
Descobre que as pessoas com quem voc mais se importa na vida so
tomadas de voc muito depressa... por isso sempre devemos deixar as
pessoas que amamos com palavras amorosas; pode ser a ltima vez que
as vejamos. Aprende que as circunstncias e os ambientes tm
influncia sobre ns, mas ns somos responsveis por ns mesmos.
Comea a aprender que no se deve comparar com os outros, mas com o
melhor que pode ser. Descobre que se leva muito tempo para se tornar
a pessoa que quer ser, e que o tempo curto
Aprende que, ou voc controla seus atos, ou eles o controlaro...
Aprende que heris so pessoas que fizeram o que era necessrio fazer,
enfrentando as conseqncias
Aprende que pacincia requer muita prtica
Aprende que maturidade tem mais a ver com os tipos de experincia
que se teve e o que voc aprendeu com elas do que com quantos
aniversrios voc celebrou. Aprende que h mais dos seus pais em voc
do que voc supunha e que nunca se deve dizer a uma criana que
sonhos so bobagens...
Aprende que nem sempre suficiente ser perdoado por algum...
Algumas vezes voc tem de aprender a perdoar a si mesmo
E voc aprende que realmente pode suportar... que realmente forte, e
que pode ir muito mais longe depois de pensar que no se pode mais. E
que realmente a vida tem valor e que voc tem valor diante da vida!
Nossas dvidas so traidoras e nos fazem perder o bem que poderamos
conquistar se no fosse o medo de tentar.
William Shakespeare

x
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar comigo todos os dias me protegendo e
fortalecendo, mas especialmente naqueles em que os momentos mais
difceis e complicados somados saudade dos meus queridos me davam
vontade de jogar tudo para o alto e desistir. Mas a f, a esperana, o
otimismo, a luz do Esprito Santo me iluminaram para que conseguisse
dar mais este passo. Guarda-me Deus, pois eu me abrigo em ti (Salmo
16)
Ao meu querido filho Gabriel, por compreender e perdoar os
momentos de ausncia, pelo seu carinho, amor e torcida para que este
trabalho fosse concludo.
Aos

meus

queridos

pais,

por

serem

exemplos

de

pessoas

batalhadoras e principalmente pelo amor.


Camila, pelos incentivos para que eu tivesse coragem de
comear este trabalho.

Prof. Dra. Hrida Regina Nunes Salgado, pela orientao,


compreenso, confiana e acima de tudo, pela amizade.
Ao Prof. Dr. Marcos Antonio Corra, pela co-orientao,
colaborao e sugestes para melhoria deste trabalho.
Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias
Farmacuticas da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita
Filho, pelos ensinamentos compartilhados.

Faculdade

de

Cincias

Farmacuticas

Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho.

da

Universidade

xi

Ao

Departamento

de

Frmacos

Medicamentos

da

FCF

(UNESP).
Prof. Dra. Tas Maria Bauab, pela colaborao nos ensaios de
atividade antimicrobiana realizados neste trabalho.
Profa. Dra. Vera Lcia Isaac Borges e Profa. Dra. Maria Jos
Vieira Fonseca por participarem da banca de qualificao e pelas
observaes pertinentes.
Prof Dra. Maria Jos Vieira Fonseca e Prof Dra Maria
Stella Gonalves Raddi por participarem da banca de defesa desta
dissertao e pelas sugestes e crticas para melhoria deste trabalho.
Ao Renato e Francisco, da SAEPE, pelo apoio tcnico com as
fotografias utilizadas neste trabalho.
Aos funcionrios da biblioteca, Max, Ana Cristina, Rita, Moacir,
Natalina, Irani e tambm aos demais, por sempre terem me ajudado
prontamente nos momentos de dvida.
s funcionrias da Ps-graduao, Cludia, Laura e Snia, pelos
esclarecimentos necessrios.
Aos amigos e colegas deste Curso de Ps-Graduao.
Aos amigos do Laboratrio de Controle Biolgico de Qualidade de
Frmacos e Medicamentos, Andria Moreno, Cristina Laignier, Dbora
Perez, Sandra Monteiro, Patrcia Ricarte, Daniela Vieira, Cristiani
Lopes, Jaqueline Perez, Marcelo Hiene, Mariana Passoni, Adam de
Oliveira, pelas conversas, dicas, criticas, auxlios e momentos de
descontrao para que esta caminhada fosse menos difcil.
Maria de Ftima Rodrigues, pelo apoio tcnico e acima disso
pela amizade, companheirismo, conselhos e momentos de diverso. Voc
muito especial !
minha querida estagiria Jaqueline, que muito me auxiliou na
realizao do teste desafio e nos ensaios de atividade antimicrobiana, e

xii

alm disso sempre foi muito companheira, dedicada e querida. Muito


obrigada, Jaque!

minha

querida

amiga

Cristina

Laignier

pela

amizade

conquistada em um dos momentos mais difceis deste Curso de PsGraduao, por muitas vezes reservar um pouquinho do seu tempo
para me auxiliar contribuindo com idias e sugestes e principalmente
ter ajudado os dias serem menos cansativos com suas brincadeiras. Cris,
obrigada por sua amizade, voc muito querida!
Aos meus tios Zilda e Gilberto, pelas oraes, apoio e por sempre
terem estado junto de mim.
A todos os outros tios, tias e primos que me fortaleceram com suas
oraes e apoio.
Ao meu querido amigo Wendel Cleber Soares, que, mesmo sem
saber, sempre foi exemplo de dedicao, determinao, organizao,
competncia e acima de tudo, humildade.
querida tia Clarice, pelas oraes e amizade desde os meus
primeiros anos.
Ao meu querido amigo Marcelo Tozette, pelas descontraes para
me encorajar, apoio e torcida para que tudo desse certo.
CAPES, pelo apoio financeiro.

Palavras afveis aumentam os amigos, e fala amvel encontra acolhida.


Tenha muitos conhecidos, mas um s confidente entre mil ...
... Amigo fiel no tem preo e o seu valor incalculvel. Amigo fiel remdio
que cura, e os que temem ao Senhor o encontraro. Quem teme ao Senhor tem
amigos verdadeiros, pois tal e qual ele , assim ser o seu amigo

Eclesitico. 6-5.

xiii
SUMRIO

AGRADECIMENTOS......................................................................................................

ix

SUMRIO.......................................................................................................................

xii

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................

xvii

LISTA DE TABELAS.......................................................................................................

xx

LISTA DE MATERIAIS E EQUIPAMENTOS..................................................................

xxiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS....................................................................

xxvii

RESUMO........................................................................................................................

xxix

ABSTRACT.....................................................................................................................

xxxi

1. INTRODUO..........................................................................................................

2. OBJETIVOS..............................................................................................................

2.1. Objetivos gerais.......................................................................................................

2.2. Objetivos especficos...............................................................................................

3. REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................................ 7
3.1. Microbiota ou flora normal da pele...........................................................................

3.2. Lavagem e desinfeco das mos........................................................................... 9


3.3. Sabonetes................................................................................................................

10

3.4. Anti-spticos............................................................................................................

13

3.5. Clorexidina...............................................................................................................

14

4.

CONTROLE DE QUALIDADE DA SOLUO

DE DIGLUCONATO

DE

CLOREXIDINA................................................................................................................

34

4.1. Descrio ................................................................................................................

35

4.1.2. Substncia qumica de referncia.........................................................................

35

4.1.3. Forma farmacutica..............................................................................................

35

4.2. Anlise qualitativa da soluo de digluconato de clorexidina..................................

36

4.2.1. Caracteres fsicos.................................................................................................

36

4.2.2. Cromatografia em camada delgada.....................................................................

36

4.2.2.1. Material .............................................................................................................

36

4.2.2.2. Mtodo...............................................................................................................

36

4.2.2.3. Resultados.........................................................................................................

37

4.2.3. Determinao de pH.............................................................................................

38

4.2.3.1. Material .............................................................................................................

38

4.2.3.2. Resultados.........................................................................................................

38

4.2.4. Determinao da faixa de fuso..........................................................................

38

xiv
4.2.4.1. Material..............................................................................................................

38

4.2.4.2. Mtodo...............................................................................................................

38

4.2.4.3. Resultados.........................................................................................................

39

4.2.5. Densidade relativa................................................................................................

39

4.2.5.1. Material..............................................................................................................

39

4.2.5.2. Mtodo...............................................................................................................

39

4.2.5.3. Resultados.........................................................................................................

39

4.2.6. Espectrofotometria de absoro na regio de infravermelho...............................

40

4.2.6.1. Material..............................................................................................................

40

4.2.6.2. Mtodo...............................................................................................................

40

4.2.6.3. Resultados.........................................................................................................

40

4.2.7. Espectrofotometria na regio ultravioleta.............................................................. 42


4.2.7.1. Material..............................................................................................................

42

4.2.7.2. Mtodo...............................................................................................................

43

4.2.7.2.1. Preparo do padro..........................................................................................

43

4.2.7.3. Resultados.........................................................................................................

43

4.2.7.4. Discusso........................................................................................................... 45
4.3. Anlise quantitativa da soluo de digluconato de clorexidina ...............................

46

4.3.1. Ensaio microbiolgico...........................................................................................

46

4.3.1.1. Material e mtodo..............................................................................................

46

4.3.1.2. Execuo do ensaio...........................................................................................

47

4.3.1.3. Preparo das solues-padro de digluconato de clorexidina............................

48

4.3.1.4. Preparo das solues de digluconato de clorexidina substncia-amostra........

48

4.3.1.5. Material..............................................................................................................

48

4.3.1.6. Preparo do inculo.............................................................................................

48

4.3.1.7. Ensaio ...............................................................................................................

48

4.3.1.8. Resultados.........................................................................................................

49

4.3.1.9. Clculos.............................................................................................................

50

4.3.1.9.1. Curva analtica................................................................................................

50

4.3.1.9.2. Clculo da potncia do anti-sptico................................................................

51

4.3.1.10. Anlise estatstica............................................................................................

52

4.3.1.11. Teste de recuperao......................................................................................

53

4.3.1.11.1. Preparo das solues...................................................................................

53

4.3.1.11.2. Clculo do teste de recuperao..................................................................

55

4.3.1.12. Discusso........................................................................................................

55

5. DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAES DOS SABONETES LQUIDOS


CONTENDO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA E SEU CONTROLE DE

xv
QUALIDADE..................................................................................................................

58

5.1. Desenvolvimento das formulaes de sabonete lquido com diferentes


concentraes de digluconato de clorexidina.................................................................

59

5.1.2. Material.................................................................................................................

59

5.1.3. Mtodo..................................................................................................................

60

5.2. Anlise qualitativa das formulaes desenvolvidas.................................................

61

5.2.1. Aspectos fsicos....................................................................................................

61

5.2.1.1. Discusso..........................................................................................................

62

5.2.1.1.1. Formulaes...................................................................................................

62

5.2.1.1.2. Formulao 1..................................................................................................

62

5.2.1.1.3. Formulao 2..................................................................................................

63

5.2.1.1.4. Formulao 3..................................................................................................

63

5.2.1.1.5. Formulao 4..................................................................................................

63

5.2.2. Determinao de pH.............................................................................................

64

5.2.2.1. Material e mtodo..............................................................................................

64

5.2.2.2. Resultados.........................................................................................................

64

5.2.3. Determinao da viscosidade...............................................................................

64

5.2.3.1. Resultados.........................................................................................................

64

5.2.3.2. Discusso..........................................................................................................

65

5.3. Controle microbiolgico das formulaes desenvolvidas........................................

66

5.3.1. Material e mtodo.................................................................................................

66

5.3.1.1. Contagem total de microrganismos viveis.......................................................

66

5.3.1.2. Pesquisa de Salmonella spp e Escherichia coli.................................................

66

5.3.1.3. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa...................

67

5.3.2. Resultados............................................................................................................

67

5.3.3. Discusso.............................................................................................................

68

6. ENSAIOS DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS SABONETES LQUIDOS


DESENVOLVIDOS CONTENDO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA.........................

69

6.1. Mtodos...................................................................................................................

70

6.1.1. Tcnica de difuso em gar..................................................................................

70

6.1.2. Tcnica de microdiluio....................................................................................... 70


6.1.3. Microrganismos utilizados.....................................................................................

71

6.2. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar........................................

71

6.2.1. Material e mtodo.................................................................................................

71

6.2.1.1. Preparo do inculo.............................................................................................

71

6.2.1.1.1. Padronizao da suspenso bacteriana.........................................................

71

6.2.1.1.2. Padronizao da suspenso fngica..............................................................

71

xvi
6.2.1.1.3. Padronizao e adaptao dos ensaios de atividadee antimicrobiana doss
diferentes sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina a 1, 2, 3, e 4% peloo
mtodo de difuso em gar............................................................................................. 72
6.2.2. Resultados............................................................................................................

73

6.2.3. Discusso.............................................................................................................

77

6.2.4. Concluso.............................................................................................................

79

6.3. Determinao da atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes


lquidos desenvolvidos contendo digluconato de clorexidina, atravs do mtodo da
microdiluio...................................................................................................................

80

6.3.1. Preparo do inoculo................................................................................................

80

6.3.1.1. Padronizao da suspenso bacteriana............................................................

80

6.3.1.2. Padronizao da suspenso fngica.................................................................

80

6.3.1.3. Padronizao e adaptao dos testes de verificao da atividade


antimicrobiana dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina, pelo
mtodo da microdiluio.................................................................................................

80

6.3.1.4. Leituras..............................................................................................................

83

6.3.2. Resultados................................................................................................

84

6.3.3. Discusso..................................................................................................

99

6.3.4. Concluso.................................................................................................

104

7. TESTE DE EFICCIA DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.......................................

107

7.1. Microrganismos utilizados........................................................................................

108

7.2. Conservao dos microrganismos-teste..................................................................

108

7.3. Reativao dos microrganismos..............................................................................

108

7.4. Repiques dos microrganismos para utilizao nos testes.......................................

108

7.5. Obteno de suspenses-me de microrganismos-teste e contagem do nmero


de microrganismos viveis..............................................................................................

109

7.6. Avaliao da neutralizao na inibio da atividade antimicrobiana.......................

1110

7.7. Teste de eficcia do sistema conservante propriamente dito..................................

111

7.8. Resultados...............................................................................................................

113

7.8.1. Avaliao da neutralizao na inibio da atividade antimicrobiana....................

113

7.8.2. Teste de eficcia do sistema conservante propriamente dito..............................

115

7.9. Discusso................................................................................................................

122

7.10. Concluso..............................................................................................................

126

8. ANLISE QUANTITAVA DE SABONETE LQUIDO DESENVOLVIDO CONTENDO


3% DE DIGLUCONATO DE CLOREXINA......................................................................

127

8.1. Material....................................................................................................................

128

xvii
8.1.1. Preparo da substncia qumica padro secundrio..............................................

128

8.1. 2. Mtodo.................................................................................................................

128

8.1.2.1. Obteno da curva de Ringbom........................................................................

129

8.1.2.1. Obteno da curva analtica..............................................................................

131

8.2. Anlise estatstica....................................................................................................

133

8.3. Determinao de digluconato de clorexidina no sabonete lquido..........................

134

8.3.1. Preparo do padro................................................................................................

134

8.3.2. Preparo da amostra..............................................................................................

134

8.3.3. Resultados............................................................................................................

135

8.4. Teste de recuperao..............................................................................................

136

8.4.1. Preparo das solues...........................................................................................

136

8.4.2. Clculo do teste de recuperao..........................................................................

137

8.4.3. Resultados............................................................................................................

137

8.5. Validao.................................................................................................................

138

8.5.1. Linearidade...........................................................................................................

138

8.5.2. Preciso................................................................................................................

138

8.5.3. Exatido................................................................................................................

139

8.5.4. Especificidade e seletividade................................................................................

139

8.5.5. Robustez...............................................................................................................

140

8.6. Discusso................................................................................................................

140

8.7. Concluso................................................................................................................

142

9. DISCUSSO GERAL..................................................................................................

143

10. CONCLUSES.........................................................................................................

149

11. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................... 152

xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura qumica do digluconato de clorexidina.............................................

16

Figura 2. Cromatograma em camada delgada de soluo de digluconato de


clorexidina.......................................................................................................................

37

Figura 3. Espectro na regio de infravermelho obtido com cristais da soluo-amostra


de digluconato de clorexidina.......................................................................................... 40
Figura 4. Espectro na regio de infravermelho obtido com cristais da soluo-padro
secundrio de digluconato de clorexidina.......................................................................

41

Figura 5. Sobreposio dos espectros obtidos com cristais da soluo-amostra e


soluo-padro secundrio de digluconato de clorexidina.............................................

41

Figura 6. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina a


0,002% em gua deionizada de 200 a 400 nm............................................................... 44
Figura 7. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina a
0,002% em etanol de 200 a 400 nm...............................................................................

44

Figura 8. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina a


0,002% em cido clordrico 0,1 M de 200 a 400 nm.......................................................

44

Figura 9. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina a


0,002% em hidrxido de sdio 0,1 M de 200 a 400 nm..................................................

45

Figura 10. Espectro de absoro na regio de ultravioleta da soluo de digluconato


de clorexidina, soluo amostra a 0,002% em etanol, de 200 a 400 nm.......................

45

Figura 11. Esquema do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar,


delineamento 3 x 3..........................................................................................................

49

Figura 12. Representao grfica da curva analtica de soluo de digluconato de


clorexidina no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar..........................

51

Figura 13. Resultado do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar, da


soluo de digluconato de clorexidina............................................................................

51

Figura 14. Esquema da disposio dos sabonetes lquidos na placa de Petri para o
ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar............................

73

Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. aureus
(a) e E. faecalis (b)..........................................................................................................

75

Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a E. coli (c)
e C. albicans (d)..............................................................................................................

75

Figura 17. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a


Salmonella spp (e) e P. aeruginosa (f)...........................................................................

76

Figura 18. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S.


epidermidis (g)................................................................................................................

76

xix
Figura 19. Esquema da realizao do ensaio de atividade antimicrobiana pelo
mtodo de microdiluio.................................................................................................

82

Figura 20. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando P. aeruginosa..................................

93

Figura 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando P. aeruginosa................................... 93
Figura 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da
formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. aureus.........................................

94

Figura 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. aureus.........................................

94

Figura 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando Salmonella spp................................

95

Figura 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando Salmonella spp................................

95

Figura 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. epidermidis..................................

96

Figura 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. epidermidis..................................

96

Figura 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. faecalis........................................

97

Figura 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. faecalis........................................

97

Figura 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. coli...............................................

98

Figura 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. coli...............................................

98

Figura 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando C. albicans.......................................

99

Figura 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido dos sabonetes da


formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando C. albicans.......................................

99

Figura 34. Esquema da realizao do teste de neutralizante ........................................

111

Figura 35. Esquema da execuo das anlises microbiolgicas do sabonete lquido


contendo digluconato de clorexidina durante o teste desafio.........................................

113

Figura 36. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de P.


aeruginosa sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana,
no sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina.........................................
Figura 37. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de E.

116

xx
coli sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no
sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................

117

Figura 38. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de S.


aureus sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no
sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................

119

Figura 39. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de C.


albicans sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no
sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................

120

Figura 40. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de A.


niger sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no
sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................

121

Figura 41. Espectro de absoro na regio de ultravioleta da soluo de digluconato


de clorexidina padro secundrio em etanol, a 0,002%, de 200 a 400 nm....................

129

Figura 42. Curva de Ringbom obtida pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de


ultravioleta para soluo de digluconato de clorexidina, utilizando etanol como
solvente, no comprimento de onda de 260 nm...............................................................

131

Figura 43. Representao da curva analtica da soluo de digluconato de


clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente......................................................................................

133

Figura 44. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina


padro secundrio, soluo de sabonete com clorexidina e soluo de sabonete sem
clorexidina, utilizando etanol como solvente...................................................................

140

xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina e seus
sais..................................................................................................................................

Tabela 2. Mtodos descritos na literatura para anlise de impurezas e produtos de


degradao da clorexidina..............................................................................................

24

Tabela 3. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em fluidos


biolgicos........................................................................................................................

26

Tabela 4. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes


farmacuticas..................................................................................................................

29

Tabela 5. Absoro de digluconato de clorexidina substncia-teste e substncia


padro

secundrio

em

espectro

de

infravermelho

em

pastilhas

de

KBr..................................................................................................................................

42

Tabela 6. Parmetros testados para avaliao de soluo de digluconato de


clorexidina no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar .........................

47

Tabela 7. Parmetros definidos para o ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso


em gar, a serem utilizados para anlise quantitativa de soluo de digluconato de
clorexidina.............................................................................................................

47

Tabela 8. Valores dos dimetros dos halos de inibio de crescimento obtidos com a
soluo de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiolgico pelo mtodo difuso
em gar..... .....................................................................................................................

50

Tabela 9. Valores experimentais obtidos para o doseamento de soluo de


digluconato de clorexidina no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em
gar........................ ........................................................................................................

52

Tabela 10. Anlise da varincia dos dados obtidos no ensaio microbiolgico pelo
mtodo de difuso em gar, da soluo de digluconato de clorexidina........ ................

53

Tabela 11. Preparao das amostras de soluo de digluconato de clorexidina no


teste de recuperao no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar.........

54

Tabela 12. Teste de recuperao de amostras de digluconato de clorexidina, no


ensaio microbiolgico pelo mtodo difuso em gar............................................ .........

55

Tabela 13. Materiais utilizados para as diferentes formulaes de sabonete lquido e


seus nomes na INCI.......................................................................................................

59

Tabela 14. Preparo da formulao codificada como Formulao 1..............................

59

Tabela 15. Preparo da formulao codificada como Formulao 2..............................

60

Tabela 16. Preparo da formulao codificada como Formulao 3..............................

60

Tabela 17. Preparo da formulao codificada como Formulao 4..............................

60

Tabela 18. Valores de viscosidade obtidos com os sabonetes lquidos contendo


digluconato de clorexidina em viscosmetro de Brookfield.............................................

65

xxii
Tabela 19. Valores em milmetros dos halos de inibio, obtidos no ensaio de
atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.............................................

74

Tabela 20. Diluies utilizadas para os sabonetes lquidos no ensaio de atividade


antimicrobiana em meio lquido pelo mtodo da microdiluio...................................... 83
Tabela 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido
da formulao 1 contendo 1% de digluconato de clorexidina,........................................

84

Tabela 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................

85

Tabela 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 3 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................

85

Tabela 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 4 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................

86

Tabela 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 1 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................

86

Tabela 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 2 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................

87

Tabela 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 3 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................

87

Tabela 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 4 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................

88

Tabela 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 1 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................

88

Tabela 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 2 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................

89

Tabela 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................

89

Tabela 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 4 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................

90

Tabela 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 1 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................

90

Tabela 34. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 2 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................

91

Tabela 35. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 3 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................

91

Tabela 36. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido


da formulao 4 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................
Tabela 37. Valores de CIM encontrados para os sabonetes lquidos desenvolvidos

92

xxiii
com as diferentes concentraes de digluconato de clorexidina....................................

100

Tabela 38. Contagem do nmero de microrganismos viveis de P. aeruginosa aps


neutralizao do sistema conservante............................................................................

114

Tabela 39. Contagem do nmero de microrganismos viveis de E. coli aps


neutralizao do sistema conservante............................................................................

114

Tabela 40. Contagem do nmero de microrganismos viveis de S. aureus aps


neutralizao do sistema conservante............................................................................

114

Tabela 41. Contagem do nmero de microrganismos viveis de C. albicans aps


neutralizao do sistema conservante............................................................................

115

Tabela 42. Contagem do nmero de microrganismos viveis de A. niger aps


neutralizao do sistema conservante............................................................................

115

Tabela 43. Log de UFC/g de P. aeruginosa, nas formulaes com e sem a presena
da clorexidina, em funo do tempo...............................................................................

115

Tabela 44. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando P.
aeruginosa......................................................................................................................

116

Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................

117

Tabela 46. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando E.
coli...................................................................................................................................

118

Tabela 47. Log de UFC/g de S. aureus, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................

118

Tabela 48. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando S.
aureus.............................................................................................................................

119

Tabela 49. Log de UFC/g de C. albicans, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo............................................................................................................

1179

Tabela 50. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando C.
albicans...........................................................................................................................

120

Tabela 51. Log de UFC/g de A. niger, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................

120

Tabela 52. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando A.
niger................................................................................................................................
Tabela 53. Preparo da curva de Ringbom de digluconato de clorexidina por

121

xxiv
espectrofotometria na regio de ultravioleta a 260 nm...................................................

130

Tabela 54. Preparo da curva analtica de digluconato de clorexidina por


espectrofotometria na regio de ultravioleta a 260 nm...................................................

131

Tabela 55. Valores de absorvncias determinados para a curva analtica de


digluconato de clorexidina padro secundrio por espectrofotometria na regio de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente................................................... 132
Tabela 56. Anlise da varincia (ANOVA) das absorvncias determinadas na
obteno

da

curva

analtica

de

digluconato

de

clorexidina

pelo

mtodo

espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como


solvente...........................................................................................................................

133

Tabela 57. Parmetros analticos utilizados na determinao de digluconato de


clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente......................................................................................

134

Tabela 58. Valores determinados para o doseamento de sabonete lquido com


digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente.....................................................................

136

Tabela 59. Preparo das solues para o teste de recuperao do sabonete lquido
com digluconato de clorexidina pelo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a
260 nm, utilizando etanol como solvente........................................................................

137

Tabela 60. Valores obtidos no teste de recuperao do mtodo espectrofotomtrico


na regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete
lquido com digluconato de clorexidina...........................................................................

138

Tabela 61. Valores obtidos para a reprodutibilidade do mtodo espectrofotomtrico


na regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete
lquido com digluconato de clorexidina...........................................................................

139

Tabela 62. Valores obtidos para a robustez do mtodo espectrofotomtrico na regio


de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete lquido com
digluconato de clorexidina..............................................................................................

140

xxv
LISTA DE MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
1. Cromatografia em camada delgada da soluo de digluconato de clorexidina
 Placa cromatogrfica Merck (Darmstadt), TLC com slica-gel 60 F254 (20 x 20
cm), com espessura de 0,25 mm.
 Estufa Fanem 315 SE.
 Cuba de vidro.
 Fase mvel: acetato de etila: amnia concentrada: gua destilada: etanol
(1:1:3:5 v/v/v/v). Os reagentes utilizados foram: acetato de etila, Synth (Diadema), amnia
Synth (Diadema), etanol, Synth (Diadema).
 Fase estacionria: gel de slica F254 (Merck, Darmstadt).
 Agente revelador: soluo de dicromato de potssio 50 g/L em soluo de
cido sulfrico 40%. Os reagentes utilizados foram: dicromato de potssio (Comercial), cido
sulfrico (Chemis).
2. Determinao de pH da soluo de digluconato de clorexidina
 Peagmetro Micronal, B 474.
3. Determinao do ponto de fuso dos cristais obtidos com da soluo de digluconato
de clorexidina
 Papel de filtro, tubos capilares com 1 mm de espessura e 6 cm de
comprimento.
 Estufa Fanem 315 SE.
 Hidrxido de sdio (Synth, Diadema), amarelo titnio (Merck, Darmstadt).
 Equipamento: LS Logen Scientific, LS III Basic.
4. Determinao da densidade relativa da soluo de digluconato de clorexidina
 Picnmetro (Hexis).
 Estufa Fabbe, 116.
5. Espectrofotometria de absoro na regio de infravermelho dos cristais obtidos com
da soluo de digluconato de clorexidina
 Equipamento: espectrofotmetro de infravermelho Shimadzu FTIR-8300.
 Brometo de potssio (KBr) (Reagen, Rio de Janeiro).
6. Espectrofotometria na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina
 Equipamento: espectrofotmetro de ultravioleta KAYAK XA modelo HP 8453.

xxvi
 Cubeta de quartzo com 1 cm de caminho ptico.
 Solventes: etanol (Synth, Diadema), cido clordrico 0,1 M (Synth, Diadema),
hidrxido de sdio 0,1 M (Synth, Diadema).

7. Doseamento microbiolgico da soluo de digluconato de clorexidina
 Meio de cultura: gar Casoy (Acumedia, Lansing); gar Brain Heart Infusion
(BHI) (Acumedia, Lansing), caldo Brain Heart Infusion (BHI) (BD, Le Pont de Claix).
 Equipamentos: espectrofotmetro Quimis Q798 DRM, estufa de esterilizao
Nova tica 400/5ND, paqumetro digital Mitotoyo IP 65, estufa bacteriolgica Odonto Bras
ECB 1.2 digital, autoclave vertical Phoenix AV 60.
8. Determinao de pH dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina
 Peagmetro Micronal, B 474.
9. Determinao da viscosidade dos sabonetes lquidos
 Equipamento: viscosmetro de Brookfield, P selecta modelo visco star-L.
10. Anlise microbiolgica das formulaes desenvolvidas
 Equipamentos: estufa de esterilizao a 180 C Nova tica 400/5ND, autoclave
vertical Phoenix AV 60, estufa bacteriolgica Odonto Brs ECB 1.2 digital, estufa Fanem 315
SE.
 Meios de cultura: gar tioglicolato (Himedia), gar Sabouraud (Acumedia,
Lansing), caldo lactosado (Acumedia, Lansing), caldo tetrationato (Acumedia, Lansing), caldo
selenito cisitina (Merck, Darmstadt), gar verde brilhante (Difco, Le Pont de Claix), gar
xilose-lisina-desoxicolato (Merck, Darmstadt), gar bismuto sulfito (Acumedia, Lansing), gar
Mac Conkey (Merck, Darmstadt), gar eosina-azul de metileno (Difco, L Pont de Claix),
caldo soja-casena (Acumedia, Lansing), gar Vogel Johnson (Acumedia, Lansing), gar
cetrimida (Acumedia, Lansing), gar trplice acar e ferro (Acumedia, Lansing).
11. Ensaios de atividade antimicrobiana
 Equipamentos:

estufa

bacteriolgica

Odonto

Bras

ECB

1.2

digital,

espectrofotmetro Beckman DU 530, autoclave vertical Phoenix AV 75, paqumetro digital


Mitutoyo IP 65, estufa de esterilizao Nova tica 400/5ND, estufa Fanem 315 SE.
 Meios de cultura: gar Brain Heart Infusion (BHI) (Acumedia, Lansing), caldo
Brain Heart Infusion (BHI) (BD, L Pont de Claix), gar Sabouraud (Acumedia, Lansing), caldo
Sabouraud (Merck, Darmstadt).

xxvii
12. Teste de eficcia de atividade antimicrobiana

Equipamentos: estufa bacteriolgica Odonto Bras ECB 1.2 digital, autoclave

vertical Phoenix AV 75, estufa Fanem 315 SE, estufa de esterilizao Nova tica 400/5ND.

Meios de cultura: gar Sabouraud (Acumedia, Lansing), gar Casoy

(Acumedia, Lansing).
13. Espectrofotometria na regio de ultravioleta para o sabonete lquido com 3% de
digluconato de clorexidina

Solvente: etanol (Synth, Diadema).

Equipamentos: espectrofotmetro de ultravioleta Shimadzu, UV mini-1240

(para realizao do teste) e espectrofotmetro de ultravioleta Hitachi U2001 (para


parmetro de reprodutibilidade).

xxviii
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
A. niger

Aspergillus niger

ABS

absorvncia

ANOVA

anlise de varincia

ANVISA

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

APIC

Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology

ATCC

American Type Culture Collection

B. subtilis

Bacillus subitilis

BHI

gar brain infusion

BP

British Pharmacopoeia

BS

gar bismuto sulfito

C. albicans

Candida albicans

CAS

Chemical Abstracts Service

CBM

concentrao bactericida mnima

CCD

cromatografia em camada delgada

CDC

Centros de Controle e Preveno de Doenas

CFM

concentrao fungicida mnima

CIM

concentrao inibitria mnima

cP

Centi Poise

DCB

Denominao Comum Brasileira

DCI

Denominao Comum Internacional

DMSO

dimetilsulfxido

DPR

desvio padro relativo

E. coli

Escherichia coli

E. faecalis

Enterococcus faecalis

e.p.m

erro padro da mdia

EP

European Pharmacopoeia

F. Bras

Farmacopia Brasileira

HIPAC

Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee

IAL

Instituto Adolfo Lutz

KBr

brometo de potssio

L.E.S.S

laurilter sulfato de sdio

L.M.S.S

lauroilmiristilsarcosinato de sdio

NCCLS

National Committee for Clinical Laboratory Standards

P. acnes

Propioniobacterium acnes

xxix
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
PF

ponto de fuso

p/v

peso/volume

Rf

fator de refrao

S. aureus

Staphylococcus aureus

T%

transmitncia

TSI

gar trplice acar-ferro

UFC

unidade formadora de colnia

UI

Unidades Internacionais

USP

United States Pharmacopoeia

UV

ultravioleta

v/v

volume/volume

VB

gar verde brilhante

VJ

gar Vogel Johnson

XLD

gar xilose lisina desoxicolato

comprimento de onda

xxx
RESUMO
Os sabonetes so preparaes destinadas higiene e conhecidos h mais de
4000 anos. So constitudos por sais de cidos graxos com propriedades
detergentes, resultantes da saponificao entre cidos graxos superiores e seus
glicerdeos custa de um material alcalino. Podem ser incorporados com diversas
substncias que possuem algum efeito teraputico ou preventivo sobre a pele, por
facilitarem o contato de tais substncias com o tecido alvo. Porm, isto nem sempre
possvel. Por tratar-se de um tensoativo aninico carboxilado e ter elevada
alcalinidade, muitos dos materiais ou ativos a serem incorporados a este tipo de
preparao podem apresentar instabilidade. Com o advento dos detergentes
sintticos tal situao pode ser contornada, e apesar de constiturem-se tambm em
tensoativos aninicos, e por terem origem em cidos fortes, permitem o preparo de
sabonetes lquidos no alcalinos e apresentam maior compatibilidade frente a
diversos

ativos.

Entre

as

diversas

possibilidades

de

ativos,

os

agentes

antimicrobianos, merecem ateno especial, uma vez que encontra nos sabonetes
um excelente veculo para desempenhar sua funo na assepsia da pele. A
clorexidina um anti-sptico de amplo espectro de ao, sendo ativo frente a
bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, leveduras e vrus. Atua sobre a
membrana celular causando perda de material intracelular, tais como cido nuclico e
potssio, inibio respiratria e coagulao citoplasmtica. Pode apresentar-se na
forma de diversos sais como acetato, cloridrato, gluconato e digluconato. Neste
trabalho foram estudadas formulaes contendo soluo de digluconato de
clorexidina. A soluo amostra utilizada para preparao dos sabonetes foi avaliada
quanto a alguns parmetros como pH, densidade relativa, ponto de fuso,
cromatografia

em

camada

delgada,

espectroscopia

no

infravermelho

espectroscopia no ultravioleta. Foi desenvolvida metodologia analtica para a


determinao de digluconato de clorexidina por ensaio microbiolgico, pelo mtodo
da difuso em gar, templates em placas, utilizando S. aureus. O mtodo
microbiolgico foi validado pelos parmetros de linearidade, exatido, preciso e
reprodutibilidade. Os resultados foram analisados estatisticamente pela anlise da
varincia (ANOVA). As formulaes desenvolvidas foram avaliadas quanto a
parmetros de pH, viscosidade, ensaio de atividade antimicrobiana, demonstrando
que as formulaes empregando detergentes sintticos possuem melhor atividade
antibacteriana. Porm, a tcnica de difuso em gar no foi satisfatria para

xxxi
avaliao

de

atividade

antimicrobiana,

visto

que

as

formulaes

eram

demasiadamente viscosas. Os resultados corroboram com a literatura, pois os


microrganismos Gram-positivos mostraram-se mais susceptveis. Foi realizada
metodologia de ensaio de teste desafio para a formulao com melhor desempenho
antimicrobiano e econmico. No foi observado melhora significativa da formulao
contendo digluconato de clorexidina em relao formulao isenta de clorexidina.
Foi desenvolvida metodologia analtica em espectrofotometria na regio de
ultravioleta a 260 nm, na faixa de concentrao de 0,001% a 0,002% para a
formulao que apresentou melhores resultados microbiolgicos e econmicos. A
metodologia foi validada pelos parmetros de linearidade, preciso, exatido,
especificidade e robustez. Os resultados foram analisados estatisticamente pela
anlise de varincia (ANOVA).

Palavras-chave: controle de qualidade, clorexidina, sabonete lquido, anlise


microbiolgica, ensaio de atividade antimicrobiana, teste desafio, espectrofotometria
de ultravioleta.

xxxii
ABSTRACT
The soaps are preparation for hygiene and they are well known for 4000 years
ago. They are constituited by salts of fatty acids with detergent properties, resulting
from saponification of fatty acids superiorities and glycerides using an alkaline
material. They may be incorporated with several substances that have a preventive or
therapeutic effect on the skin, by facilitating the contact of such substances with the
target tissue. However, this is not always possible. The soaps are anionic surfactant
and carboxylic and they have high alkalinity, many of the materials or activities to be
incorporated into this type of preparation may be instable. With the advent of synthetic
detergents such situation can be avoided, and despite of they be also anionic
surfactants, and are based on strong acids, allow the preparation of liquid soaps and
alkali not have greater compatibility front of several assets. Among the various
possibilities of active, antimicrobial agents deserve special attention, since the soap is
an excellent vehicle to perform its function in the asepsis of the skin. The
chlorhexidine is an antiseptic of wide spectrum of action, being active against the
bacteria Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Chlorhexidine is
an excellent antiseptic of wide spectrum of action, being active against the bacteria
Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Acts on the cell
membrane causing loss of intracellular material, such as nucleic acid and potassium,
respiration inhibition and cytoplasmic coagulation. The salts of chlorhexidine can be
acetate, hydrochloride, gluconate and digluconate. In this work formulation were
studied with solution of chlorhexidine digluconate. The sample solution employed to
prepare the liquid soaps was evaluated for some parameters such as pH, relative
density, melting point, thin-layer chromatography, spectroscopy in the infrared and
ultraviolet spectroscopy. Analytical methodology was developed for the determination
of chlorhexidine digluconate solution for microbiological assay, through agar diffusion
bioassay, using S. aureus. The microbiological method was validated by the
parameters of linearity, accuracy, precision and reproducibility. The results were
statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA). The developed formulations
were analyzed for parameters of pH, viscosity, assay of antimicrobial activity,
indicating that the formulations using synthetic detergents have better antibacterial
activity. However, the technique of diffusion in agar was not satisfactory to analyze
antimicrobial activity, since the formulations presented higher viscosity. . The results
corroborate the literature, since the Gram-positive microorganisms were more likely. It

xxxiii
was performed the test methodology for testing challenge for the formulations with
antimicrobial and better economic performance. There was no significant improvement
of the formulations containing chlorhexidine digluconate on the free formulations of
Chlorhexidine. Analytical methodology was developed by spectrophotometry in the
ultraviolet region of 260 nm in the range of concentration of 0.001% to 0.002% for the
formulation which had better microbiological and economic. The method was validated
by the parameters of linearity, precision, accuracy, specificity and robustness. The
results were statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA).

Key-words: quality control, liquid soap, chlorhexidine digluconate, microbiological


assay, antimicrobial activity, challenge test, UV-spectrophotometry.

1. INTRODUO

Introduo

Os sabonetes so preparaes apropriadas para a limpeza da pele,


fornecendo ao detergente gua, na qual se dissolvem durante o uso. So
conhecidos h mais de 4000 anos, sendo o produto de higiene mais antigo utilizado
pelo homem. H documentos da sia Menor mostrando seu uso pelos babilnios,
hebreus e romanos, que o produziam misturando substncias graxas com cinzas
ricas em carbonato de potssio ou hidrocarbonetos cidos de sdio (BONADEO,
1963; DRAELOS, 1999).
Os sabonetes so constitudos por sais de cidos graxos com propriedades
detergentes, resultantes da saponificao entre um produto alcalino com cidos
graxos superiores e seus glicerdeos. De acordo com o produto alcalino empregado,
podem se obter sabonetes slidos ou lquidos (DRAELOS, 1999; PEYREFITTE et al.,
1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999).
Os sabonetes so produtos alcalinos, mas no danificam a pele, porque esta
capaz de retornar ao pH normal, devido ao mecanismo de tamponamento que possui.
(PEYREFITTE et al., 1998). Para melhorar o pH dos sabonetes, detergentes
sintticos como laurilsulfato de sdio, laurilter sulfato de sdio, cocoamidopropil
betana, laurilisoetionato de sdio, laurilsulfosuccinato dissdico, entre outros, esto
sendo utilizados na preparao destes produtos (DRAELOS, 1999),
Alm dos glicerdeos a serem saponificados, os sabonetes podem conter
outros aditivos, entre eles, os agentes anti-spticos (PEYREFITTE et al., 1998).
Anti-spticos referem-se s substncias qumicas utilizadas como bactericidas
ou bacteriostticas em tecidos vivos, sendo designadas de desinfetantes quando
usadas em objetos inanimados (Brasil, 1999)
Os anti-spticos compreendem grande variedade de estruturas qumicas e,
consequentemente tm diversos mecanismos de ao, como coagulao ou
desnaturao de protenas protoplasmticas, lise celular por alterao estrutural da
membrana celular, diminuio da tenso de superfcie, inibio de enzimas
essenciais aos microrganismos e sua eficcia dependente de concentrao
utilizada, pH, temperatura, tempo de exposio e presena de material orgnico como
pus, sangue e tecido necrtico (KOROLKOVAS, 2001; GENARO, 2005). Quando
aplicado pele, reduzem a microbiota residente, uma vez que a ao degermante
apenas temporria e aps alguns minutos ou horas h a multiplicao dos
microrganismos que permaneceram (GENARO, 2005).

Flvia Anglica Msquio Firoentino

Introduo

Os ativos anti-spticos podem ser utilizados sozinhos ou incorporados a


detergentes, sabes, desodorantes, aerossis, talcos, dentifrcios, antiinfecciosos
urinrios entre outras preparaes, enquanto que os desinfetantes so utilizados em
saneamento caseiro e hospitalar, para desinfetar gua e utenslios, para esterilizar
vacinas, produtos sangneos e enxertos teciduais (KOROLKOVAS, 2001). A
clorexidina, um tipo de anti-sptico, utilizada em tecidos vivos, para lavagem das
mos e para tratamento de feridas (MAZZOLA et al., 2003), mas este ltimo emprego
discutido, pois alguns autores, como Korolkovas (2001) e Alcamo (2001), discordam
desta aplicao, porque a clorexidina retarda a cicatrizao e pode danificar o tecido.
De acordo com Genaro (2005), os anti-spticos melhores e mais eficazes so
o iodo e a clorexidina em combinao com etanol. No entanto, a clorexidina
amplamente empregada em diversas reas com diferentes finalidades por ter amplo
espectro de atividade e relativamente poucos efeitos adversos e por ser possvel
incorpor-la em vrias formas farmacuticas (BRITISH CODEX, 1973, THOMAS et
al., 2001, MARTINDALE, 2007).
No comrcio brasileiro, h diversos produtos contendo clorexidina, sendo eles
soluo de gluconato de clorexidina, como, por exemplo, Peridex, Periochip,
Chlorohex soluo alcolica (Johnson Diversey), Chlorohex Dermo Suave sabonete
lquido (Johnson Diversey), Noplak (Daudt), Marchlorex, sabonete lquido com
gluconato de clorexidina 2% (Cristlia). Soluo de digluconato de clorexidina, como
por exemplo: Merthiolate (DM), Prododi (Deshydrater), Asseptic, soluo tpica
1% (Neo Qumica), Perioxidin enxagatrio bucal (Gross), Perioxidin gel bioadesivo
(Gross), PerioGard elixir oral com digluconato de clorexidina 0,2% (Colgate),
Hibitane soluo tpica 4% (AstraZeneca), Riohex 2% degermante (Rioqumica),
Riohex 4% degermante (Rioqumica), Riohex soluo aquosa 0,2% (Rioqumica),
Riohex soluo aquosa 0,5% (Rioqumica), Riohex soluo aquosa 2,0%
(Rioqumica), Riohex soluo alcolica 0,5% (Rioqumica), Vetriderm clorexidina,
(Bayer Pet) e Sabonete gel bactericida clorexidina (Trilha), Savlon, Sommacare,
Sabonete lquido com 2% de clorexidina (LM Farma), Sommacare loo anti-sptica
com 0,5% de clorexidina (LM Farma), Sommacare soluo anti sptica com 0,2% de
clorexidina (LM Farma), Sommacare escova (escova e esponja embebida em
sabonete lquido de digluconato de clorexidina 2,0% (LM Farma), Handex
degermante 2,0% clorexidina (Saneativo), Handex alcolico 0,5% (Saneativo),

Flvia Anglica Msquio Firoentino

Introduo

Cariax (clorexidina com fluoreto de sdio) (Pharmakin) e Megatrat Clorexidina


veterinrio (Centagro).
Este trabalho teve a finalidade de desenvolver formulaes de sabonete lquido
com diversas concentraes de clorexidina e, avaliar sua atividade antimicrobiana,
bem como desenvolver e validar metodologias analticas para o controle da qualidade
tanto da soluo utilizada para preparo das formulaes, quanto das formulaes
finais, uma vez que na literatura no foram encontrados trabalhos com tal proposio.

Flvia Anglica Msquio Firoentino

2. OBJETIVOS

Objetivos

2.1. Objetivos gerais


O objetivo deste trabalho foi desenvolver quatro formulaes diferentes
de sabonete lquido com concentraes de 1, 2, 3 e 4% de digluconato de
clorexidina, totalizando 16 formulaes, e desenvolver mtodos de avaliao
microbiolgica e fsico-qumica.
2.2. Objetivos especficos
Os objetivos especficos so:
1. Realizar o controle de qualidade qualitativo da soluo de digluconato de
clorexidina utilizada no preparo das formulaes.
2. Preparar formulaes de sabonete lquido com diferentes concentraes de
digluconato de clorexidina.
3. Realizar o controle microbiolgico e fsico-qumico das formulaes
desenvolvidas.
4.

Avaliar

comparar

atividade

antimicrobiana

das

formulaes

desenvolvidas.
5. Realizar o teste desafio para a formulao que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.
6. Desenvolver e validar metodologia de anlise de espectrofotometria na
regio de ultravioleta da formulao que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

3. REVISO DA LITERATURA

Reviso da Literatura

3.1. Microbiota ou flora normal da pele


A pele ntegra um dos maiores rgos do corpo, em termos de rea, e
responsvel por aproximadamente 16% do peso corporal. o manto de revestimento
do organismo e tem por funo isolar componentes orgnicos do meio exterior,
impedir a ao de agentes externos, evitar a perda de gua, eletrlitos e outras
substncias do meio interno, dar proteo imunolgica, fazer termo-regulao,
propiciar a percepo e funo secretria (BRASIL, 1989; TORTORA et al., 2006).
A estrutura bsica da pele inclui, da camada externa para a interna, epiderme,
derme e hipoderme (BRASIL, 2008b). A epiderme, quando ntegra, funciona como
barreira fsica eficaz contra microrganismos, por estar em contato direto com o
ambiente externo. A derme contm os folculos pilosos, ductos de glndulas
sudorparas e sebceas, os quais possibilitam a passagem de microrganismos da
pele para os tecidos mais profundos. A superfcie ntegra da epiderme saudvel
raramente penetrada por microrganismos, porm, quando rompida, infeco
subcutnea, muitas vezes, se desenvolve (ALCAMO, 2005; TORTORA et al., 2006).
Devido sua extenso e localizao, constantemente a pele exposta a
diversos microrganismos do meio ambiente. A fim de prevenir a transmisso de
microrganismos pelas mos, so essenciais alguns cuidados como: uso de agente
tpico com eficcia antimicrobiana, procedimento adequado ao utiliz-lo e adeso
regular no seu uso (BRASIL, 2008b).
A maioria das bactrias cutneas reside na superfcie do estrato crneo, parte
superior dos folculos pilosos, sulcos da pele e ductos das glndulas sebceas (flora
transitria). Entretanto, a microbiota residente se encontra mais profundamente. O
simples ato de lavar as mos com gua e sabo pode diminuir em 90% o nmero de
microrganismos pertencentes principalmente microbiota transitria. No entanto, em
mdia 8 horas aps este procedimento, a populao bacteriana reconstituda pela
flora residente (TRABULSI, ALTERTHUM, 2005; BUCALEM, WEI, 2008).
A microbiota cutnea residente, estende-se por toda a pele, concentrando-se
nas reas mais midas e quentes como axilas e perneo, chegando em torno de 106
UFC/cm2 e nas demais regies, em torno de 104 UFC/cm2. Os microrganismos da
flora residente no so totalmente removidos atravs do processo de lavagem das
mos, no entanto alguns autores relatam que os anti-spticos conseguem inativ-los.
Fazem parte da flora residente os gneros Staphylococcus, Corynebacterium e
Propioniobacterium, sendo os microrganismos mais comuns o S. epidermidis, o S.
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

aureus e o P. acnes. A flora residente possui baixa virulncia e raramente causa


infeco,

contudo

pode

ocasionar

infeces

sistmicas

em

pacientes

imunodeprimidos e aps procedimentos invasivos, sendo responsvel por infeces


cirrgicas (BRASIL, 1989; ALCAMO, 2001; TRABULSI, ALTERTHUM, 2005;
BUCALEM, WEI, 2008).
A flora transitria adere fracamente pele por contato e encontra-se mais
superficialmente, junto gordura e s sujidades e sobrevive por curto perodo de
tempo, sendo freqentemente constituda

por S. aureus, Escherichia coli,

Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella (BRASIL, 2007;


BUCALEM, WEI, 2008) e responsvel pelas infeces hospitalares de origem
cruzada (BRASIL, 1989).
3.2. Lavagem e desinfeco das mos
O hbito de lavar as mos constitui uma medida primria mais importante,
mais simples e menos dispendiosa que existe para a reduo dos riscos de
transmisso de microrganismos. Destaca-se como sendo um dos pilares para
preveno tanto de infeco hospitalar de origem cruzada, disseminao de doenas
infecciosas quanto para o controle de infeco cruzada em consultrios mdicos,
odontolgicos, clnicas, hospitais e demais unidades de sade (BRASIL, 1989;
MARTINS, SOARES, 1993; SILVA et al., 2000; HAAS et al., 2005; BRASIL, 2008b).
Deste modo, a lavagem das mos consiste no simples ato que deve ser
seguido por todos os profissionais de sade que mantm contato direto ou indireto
com os pacientes, fluidos corpreos, procedimentos invasivos, que atuam na
manipulao de medicamentos, alimentos e material estril ou contaminado (COHEN
et al., 2003; BRASIL, 2007; BRASIL, 2008b).
Para a lavagem das mos, preferencialmente, deve-se utilizar sabonete
lquido, pois a probabilidade de contaminao atravs de seu uso menor em relao
ao sabonete em barra. No entanto, se o sabonete slido for empregado, deve ter
tamanho pequeno, para que seja substitudo mais frequentemente (BRASIL, 1989;
BRASIL, 2007).
H estudos demonstrando que, nem todos os profissionais da sade aderiram
prtica de higienizao das mos de maneira constante em sua rotina de trabalho,
devendo este hbito ser conscientizado e estimulado (COHEN et al., 2003; BRASIL,
2008b).
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

10

Entre 1975 e 1985, foram publicados guias sobre prticas de lavagem das
mos em hospitais pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), que
recomendavam lavar as mos com sabonete no associado a anti-sptico antes e
aps contato com pacientes e lav-las com sabonete associado a anti-sptico antes e
aps a realizao de procedimentos invasivos ou contato com pacientes de alto risco.
Entre 1988 e 1995, guias para lavagem e anti-sepsia de mos, publicados pela
Associao para Profissionais de Controle de Infeces (APIC, Association for
Professionals in Infection Control and Epidemiology), foram similares s orientaes
dos CDC. Em 1995 e 1996, o Comit Consultivo em Prticas de Controle de
Infeces (HIPAC, Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee) dos
CDC recomendava que um sabonete associado a anti-sptico ou um agente nohidratado fosse empregado para higienizar as mos ao deixar os quartos de
pacientes com patgenos multirresistentes (BRASIL, 2008b).
Em 1989, o Ministrio da Sade, no Brasil, publicou o manual Lavar as mos:
Informaes para profissionais de sade, a fim de orientar quanto s normas e aos
procedimentos de lavagem das mos, visando a preveno e o controle de infeces.
Recentemente a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), disponibilizou o
guia Higienizao das mos em servios de sade, com atualizaes sobre o tema
(BRASIL, 2008b).
Em 2002, o CDC substituiu o termo lavagem das mos por higienizao das
mos, devido maior abrangncia deste procedimento. O termo engloba a
higienizao simples (lavagem simples das mos usando sabo), a higienizao antisptica (lavagem simples das mos com uso de anti-sptico), a frico anti-sptica
(para remoo microbiana, aps remoo de sujidade, com uso de soluo alcolica
a 70%, por exemplo) e a anti-sepsia cirrgica das mos (elimina a microbiota
transitria e diminui a residente, alm de efeito residual, empregando degermante e
maior tempo de procedimento) (BRASIL, 2007; BRASIL, 2008a; BRASIL, 2008b).
A anti-sepsia inadequada da pele pode resultar na perda de atividade
antimicrobiana do anti-sptico utilizado propiciando o surgimento de patgeno
resistente (WEBER et al., 2007).
3.3. Sabonetes
Existem vrios tipos e apresentaes de sabo: em barra, p, lquido e
escamas. O sabonete um tipo de sabo em barra destinado limpeza corporal,
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

11

fornecendo ao detergente gua na qual se dissolve durante o uso. conhecido


h mais de 4000 anos, sendo o produto de higiene mais antigo utilizado pelo homem.
H documentos da sia Menor mostrando seu uso pelos babilnios, hebreus e
romanos, que o produziam misturando substncias graxas com cinzas ricas em
carbonato de potssio ou hidrocarbonetos cidos de sdio (BONADEO, 1963;
DRAELOS, 1999).
Nos sculos VIII e IX, passou a ser produzido na Itlia, Espanha, Frana e
Inglaterra (BONADEO, 1963). Durante a Idade Mdia, a Igreja Catlica proibiu seu
uso, por crer que expor a pele, mesmo durante o banho, era demonaco. Todavia, a
necessidade de medidas sanitrias e conhecimentos sobre processos infecciosos
induzidos por bactrias valorizaram sua utilizao (DRAELOS, 1999).
Quimicamente, os sabonetes so constitudos por sais alcalinos de cidos
graxos com propriedades detergentes, resultantes da saponificao entre um produto
alcalino com cidos graxos superiores e seus glicerdeos. De acordo com o produto
alcalino empregado podem-se obter sabonetes duros ou lquidos (DRAELOS, 1999;
PEYREFITTE et al., 1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999).
Os corpos gordurosos ou triglicerdeos podem ser de origem animal ou vegetal.
Alm dos triglicerdeos a serem saponificados, os sabonetes podem conter
sobreengordurantes, umectantes, opacificantes, corantes, perfumes, antioxidantes e
anti-spticos (PEYREFITTE et al., 1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999;
FONSECA, PRISTA, 1993).
Os sabonetes assim obtidos so tensoativos aninicos e alcalinos. A
alcalinidade, apesar de indesejvel pela pele, no capaz de danific-la graas ao
mecanismo de tamponamento existente que faz com que o pH da pele retorne ao
normal, em mdia, 2 horas aps o uso do sabonete (PEYREFITTE et al., 1998).
De acordo com Draelos (1999), tem-se tentado ajustar o pH dos sabonetes
para diminuir a irritao cutnea. Deste modo, os detergentes sintticos, materiais
que permitem o preparo de sabonetes lquidos ou slidos no alcalinos, com valores
de pH condizentes aos da pele, vm sendo acrescentados ao arsenal de materiais
importantes para obteno de preparaes de limpeza. Os principais detergentes
empregados na obteno de sabonetes com estas caractersticas so: laurilsulfato de
sdio, laurilter sulfato de sdio, cocoamidopropilbetana, laurilisoetionato de sdio,
lauroilsarcosinato de sdio, entre outros.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

12

Quando lanados nos anos de 1940, os sabonetes lquidos eram baseados em


sabo de potssio e se destinavam ao uso industrial e institucional e, embora nas
dcadas de 1950 e 1960, tenham ocorrido melhoras nos detergentes empregados
nestes produtos, foi apenas nos anos de 1970 que chegaram ao mercado domstico
(LUNDMARK, 1992).
Inicialmente, os sabonetes eram uma mistura de detergentes sintticos,
condicionadores e agentes finalizantes sendo utilizados apenas para limpeza. Aps
anos de evoluo, a tecnologia destes produtos inclui cuidados especiais para a pele
como ao microbiana, realce da suavidade e enfatizam a sua esttica (que passou
de sabo transparente para perolado, o chamado soft soap), alm de possurem
agentes engordurantes e melhor caracterstica espumgena. Vale lembrar que o
advento de embalagens mais sofisticadas e do tipo refil ajudou a melhorar a
aceitao destes produtos e mant-los no mercado com vendas crescentes
(LUNDMARK, 1992).
Segundo Martins e Soares (1993), os sabes comuns tm apenas ao
mecnica de remoo dos microrganismos, por reduzirem a tenso superficial, o que
eleva o poder umectante da gua na qual esto dissolvidos. Outro fator importante
o tempo de contato necessrio para que o sabo possa remover as bactrias
contaminantes presentes nas mos, que de 7 a 8 minutos ou ainda quando se trata
de microrganismos presentes nas camadas mais profundas da pele, estes s podem
ser removidos aps 15 minutos de lavagem com gua e sabo.
Os sabonetes medicinais so preparados pela adio de frmacos e ou ativos
aos sabonetes base para ao sobre a superfcie cutnea. No entanto, os produtos a
incorporar devem ser compatveis qumica e fisicamente e no devem perder eficcia
durante armazenamento e uso. Os sabonetes lquidos podem ser usados com maior
facilidade como sabonetes medicinais e podem ser incorporados com substncias
antiparasitrias e antimicrobianas usadas na prtica mdica e veterinria (BONADEO,
1963). O primeiro sabo lquido antibacteriano foi lanado em 1987 e continha
triclosan como agente ativo (LUNDMARK, 1992).
Haas e colaboradores (2005) referem que produtos tpicos para as mos
contendo antimicrobianos tm sido cada vez mais utilizados pelo pblico em geral e
sabes com agentes antimicrobianos so mais eficazes que sabonetes regulares. Os
autores referem tambm que os sabonetes contendo gluconato de clorexidina foram
mais eficazes que outros antimicrobianos como, por exemplo, o triclosan.
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

13

3.4. Anti-spticos
A palavra sepsis vem do grego seps e significa ptrido. Refere-se
contaminao por microrganismos e o passo inicial para septicemia. Desta forma,
anti-sptico significa contra infeco (ALCAMO, 2001).
A anti-sepsia um processo de desinfeco em que se empregam usualmente
substncias qumicas (anti-spticos).Tais substncias devem destruir ou inibir os
microrganismos nocivos vegetativos, no formadores de endosporos em tecidos
vivos, pele e mucosas (TRABULSI, ALTERTHUM, 2005; TORTORA et al., 2006).
Anti-spticos so substncias geralmente bactericidas, mas ocasionalmente
podem ser bacteriostticos, com baixa causticidade e hipoalergenicidade, destinados
a aplicaes em pele e mucosa, podendo estar incorporados em sabes e
impregnados em cateteres (ALCAMO, 2001; IMBERT et al., 2003; BRASIL, 2008a).
O uso de anti-spticos iniciou-se em 1847, quando Semmelweis comprovou a
diminuio de casos de febre puerperal empregando soluo de hipoclorito na
lavagem das mos antes de procedimentos clnico-cirrgicos (SILVA et al., 2000). A
tcnica anti-sptica em cirurgias foi introduzida por Joseph Lister, em 1867, que
utilizou o vapor de fenol dirigido para o campo cirrgico, o que reduziu o nmero de
infeces ps-operatrias (SILVA et al., 2000; TRABULSI, ALTERTHUM, 2005).
As unidades de sade utilizam anti-spticos a fim de reduzir a microbiota
transitria das mos dos trabalhadores, diminuir a transmisso de microrganismos,
preparar a pele para procedimentos invasivos e anti-sepsia cirrgica das mos
(WEBER et al., 2007).
Os anti-spticos devem atender aos seguintes requisitos: amplo espectro de
ao antimicrobiana; ao rpida; efeito residual cumulativo; baixa ou nenhuma
toxicidade;

no

possuir

absoro

sistmica;

no

causar

hipersensibilidade,

ressecamento, manchas, irritao, corroso ou fissuras; possuir odor agradvel ou


ausente; boa solubilidade; adequada estabilidade qumica, para impedir sua
decomposio por efeito da luz e calor; baixo custo e veiculao funcional em
dispensadores ou embalagens de pronto uso (BRASIL, 2008a).
Existem surtos de doenas relacionados ao uso de preparaes anti-spticas
contaminadas que ocorrem principalmente por uso de gua no esterilizada para seu
preparo, reutilizao de frascos para armazenamento sem que tenham sido
completamente esvaziados e limpos adequadamente, erro de preparo (diluio acima
do indicado) sendo, portanto, indispensveis as normas de Boas Prticas de
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

14

Fabricao (BPF) e Boas Prticas de Laboratrio (BPL) no momento do preparo do


anti-sptico bem como seu armazenamento e uso (WEBER et al., 2007)
Atualmente, os procedimentos cirrgicos so realizados de maneira assptica,
pelo uso de instrumental cirrgico e aventais esterilizados, escovao das mos do
cirurgio com anti-spticos e uso de luvas estreis. A lavagem das mos e
antebraos com sabes e anti-spticos indispensvel antes do calamento das
luvas, pois este material fura-se com grande freqncia durante as cirurgias. Alm
disto, a perfurao das luvas aumenta aps duas horas de trabalho. descrito que
por um nico furo de agulha na luva podem passar at 18.960 estafilococos num
perodo de 20 minutos (SILVA et al., 2000; BUCALEM, WEI, 2008).
A lavagem das mos utilizando sabes degermantes primordial para
diminuio do risco de infeces e desse modo, o ideal o emprego de sabes
degermantes (associao de anti-sptico a um detergente) de clorexidina 2% a 4%
(CYRILLO, 2008).
Em estudos comparativos de ao microbiolgica de anti-spticos empregados
para lavagem das mos, a clorexidina tem demonstrado resultados satisfatrios em
relao a outros anti-spticos como PVPI, lcool 70% e triclosan, inclusive devido
sua ao residual (SILVA et al., 2000; MAGRO-FILHO et al., 2000).
Em relao ao custo, os produtos anti-spticos possuem valores maiores que
os sabonetes comuns. Entretanto, claro at o momento, que elevar a adeso da
higienizao das mos pode reduzir infeces e conseqentemente os custos, na
maioria dos servios de sade (BRASIL, 2008b).
3.5. Clorexidina
A clorexidina um composto qumico biguandico catinico com molcula
simtrica, consistindo de dois anis 4clorofenil e dois grupos biguanida conectados
por uma cadeia de hexametileno central (1,1hexametilenobis{5(4-p-clorofenil)
biguanida)} (EP, 2005; MARTINDALE, 2007; USP, 2007). Foi sintetizada em
laboratrio em 1954 por Davies, Francis, Martin, Rose e Swain e aprovada para uso
nos Estados Unidos em 1976 (SILVA et al., 2000).
A clorexidina um anti-sptico, desinfetante no especfico de segunda
gerao e conservante. Embora seja bactericida de uso tpico com largo espectro de
ao, sua eficcia difere em relao aos tipos de microrganismos. efetiva contra
bactrias Gram-positivas e menos eficaz para bactrias Gram-negativas, fungos e
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

15

algumas espcies de Proteus. Quanto aos vrus, possui atividade apenas para alguns
tipos de vrus envelopados, entre eles vrus da hepatite, herpes simples, HIV,
citomegalovrus, influenza e vrus sincicial respiratrio. Para as micobactrias, a
clorexidina apresenta mnima atividade; contra endsporos e cistos de protozorios a
atividade nula (BRITISH CODEX, 1973; NEIDLE, YAGIELA, 1991; BONACORSI et
al., 2000; THOMAS et al., 2000; TORTORA et al., 2006; MARTINDALE, 2007;
WEBER et al., 2007; BRASIL, 2008b).
A atividade antimicrobiana contra esporos bem discutida, uma vez que
alguns autores dizem que possui pouca ao (NEIDLE, YAGIELA, 1991; TORTORA
et al., 2006), enquanto outros dizem que no possui (BRITISH CODEX, 1973; WU,
LIU, 2007; BRASIL, 2008b). Bambace e colaboradores (2003) e MARTINDALE (2007)
complementam que a clorexidina efetiva contra esporos apenas em elevadas
temperaturas.
Atua sobre a membrana celular causando seu rompimento e conseqente
perda de material intracelular como potssio (quando a clorexidina est em baixa
concentrao), inibio respiratria e perda de cido nuclico (quando a clorexidina
est em alta concentrao) e coagulao citoplasmtica (coagulao ou precipitao
de protenas e cidos nuclicos), em razo da interao da clorexidina com protenas
citoplasmticas (BONACORSI et al., 2000; THOMAS et al., 2000). As ligaes na
membrana celular provavelmente ocorrem entre a carga positiva da clorexidina com a
carga negativa dos grupos carboxilas disponveis dos proteoglicanos e os grupos
fosfatos dos cidos teicico e lipoteicico na parede interna bacteriana. Em relao
ao

metabolismo,

clorexidina

inibe

os

sistemas

glicosiltransferase

2-

fosfoenolpiruvato fosfotransferase, sendo esta ltima, uma enzima vital para o


processamento e a manuteno da via glicoltica, uma vez que integra o sistema de
fosfotransferncia, responsvel pela incorporao de glicose s clulas bacterianas
(ARAJO et al., 2001).
Embora tenha ao residual, sua atividade reduzida na presena de pus e
sangue. Entre as bactrias Gram-negativas, a P. aeruginosa mais resistente, por
restringir seu acesso ao alvo de ao, devido adaptao fisiolgica da parede
celular, que previne a entrada do biocida (por aumentar os componentes do envelope
celular tais como lipopolissacardeos ou fosfolipdeos causado pela mutao
progressiva e tambm trocas nos processos biomecnicos intracelulares) e h um

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

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16

mecanismo para eliminar as substncias nocivas de seu interior (BRITISH CODEX,


1973; THOMAS et al., 2000).
A atividade antimicrobiana imediata mais lenta em relao aos lcoois e por
isso considerada de nvel intermedirio, entretanto, seu efeito residual (por ter forte
afinidade aos tecidos), torna-a o melhor dos anti-spticos disponveis (BRASIL,
2008b). De acordo com Southern e colaboradores (2006), considerada como
padro de referncia em cremes orais antimicrobianos devido ao largo espectro de
ao e substantividade (8 a 12 horas).
A ao biocida da clorexidina inibida pelo cido nicotnico e, embora no se
saiba exatamente como ocorre esta inibio, acredita-se que seja pelo bloqueio dos
receptores de clorexidina pelo cido (BAKER et al., 1994).
Pode apresentar-se na forma de diversos sais como acetato, cloridrato,
gluconato, digluconato, sendo este ltimo mais solvel em gua e em pH fisiolgico,
liberando o componente catinico. As solues aquosas dos sais alcanam sua
mxima atividade microbiolgica e estabilidade qumica em pH 5 a 8 (THOMAS et al.,
2000; GLUCONATO, 2006).
A soluo de digluconato de clorexidina uma soluo aquosa, que contm
no menos que 19% (190 g/L) e no mais que 21% (210 g/L) de digluconato de
clorexidina. um lquido amareloplido lmpido, quase inodoro, miscvel em gua e
cido actico glacial, solvel em lcool e em acetona. Em soluo aquosa a 5% v/v
tem pH 5,5 a 7,0. Sua densidade relativa a 20 C 1,06 a 1,07 g/mL; deve ser
armazenada protegida da luz e em temperatura mxima de 25 C (BP, 2005;
MARTINDALE, 2007; USP, 2008).
A Figura 1 apresenta a estrutura do digluconato de clorexidina.

Figura 1. Estrutura qumica do digluconato de clorexidina


Fonte: EP, 2005.
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

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17

Por se tratar de um material com carter catinico, apresenta incompatibilidade


com preparaes aninicas inorgnicas como sulfato, carbonato e fosfato e orgnicos
como os sabes, podendo resultar em turvao, precipitao e perda do poder antisptico. Desta maneira, os tensoativos indicados para formulaes com digluconato
de clorexidina so os catinicos, os anfteros e os no-inicos (BRITISH CODEX,
1973; BONACORSI et al., 2000; MARTINDALE, 2007).
Os sais de clorexidina podem ter atividade reduzida em presena de agentes
suspensores e compostos insolveis de clcio, magnsio e zinco. A decomposio
dos sais de clorexidina em solues aquosa, influenciada pela temperatura elevada e
pH alcalino, evidencia traos de 4-cloroanilina (MARTINDALE, 2007; USP, 2008).
De acordo com a literatura, o uso da clorexidina bastante amplo e tem sido
empregada para limpeza de superfcies, equipamentos e roupas em hospitais,
consultrios odontolgicos e outras unidades de sade (GAJADHAR et al., 2003);
para anti-sepsia da pele, mos e membranas mucosas; para tratamento de feridas e
queimaduras. Combinada a um detergente ou lcool, usada para escovao
cirrgica das mos e preparo pr-operatrio da pele em pacientes (BRITISH CODEX,
1973; TORTORA et al., 2006).
Trabulsi e Alterthum (2005) relatam que usada para preparo de pacientes em
urologia, obstetrcia e ginecologia e de acordo com Galice e col. (2006) para lavagem
vaginal antes e durante o parto para prevenir infeco causada por estreptococos de
grupo B na me e no recm-nascido. Tambm prescrita para terapia tpica de
dermatites fngicas e piodermites em ces e gatos, podendo ser associada ao
miconazol (PEDRINI, MARGATHO, 2003; PERRINS, BOND, 2003).
Seu uso tambm tem sido sugerido em espermicidas, a fim de prevenir a
transmisso do vrus HIV, por possuir atividade in vitro contra o vrus; prevenir a
contracepo por difundir no muco cervical em concentraes em torno de 1 mg/mL,
formando uma barreira e impedindo a entrada do esperma (MARTINDALE, 2007). O
gel de clorexidina associado lidocana pode ser utilizado em cateterizao e
citoscopia; a soluo aquosa de clorexidina tem se mostrado muito eficaz para
controlar sepsis peritoneal na anti-sepsia de pacientes que fazem dilise. O
tratamento local com soluo de clorexidina efetivo para preveno de infeces
nosocomiais do trato respiratrio, reduo de infeco maternal e morbidade neonatal
durante o nascimento e diminuio da mortalidade em sepsi intra-abdominal
experimental (KLJALG et al., 2002; MARTINDALE, 2007).
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

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18

A clorexidina comeou a ser empregada para irrigao de canais radiculares


em 1964, entretanto, seu uso mais sistemtico em endodontia e avaliao de suas
propriedades ocorreu a partir de 1982 (SOUZA et al., 2006). Tem sido muito utilizada
em odontologia veiculada na forma de elixir, chiclete, dentifrcio, enxagatrio, spray
ou gel, sendo muito eficaz como agente antiplaca e antigengivite, devido acentuada
capacidade de adsoro aos dentes, s superfcies mucosas e mucina salivar, com
liberao na cavidade oral em nveis teraputicos, em 24 horas, podendo chegar a 48
horas (LEONARDO et al., 1999).
A faixa de concentrao da soluo de clorexidina empregada em odontologia
bastante ampla, sendo utilizada em concentraes entre 0,12 e 2,0%. De acordo
com a literatura, altas concentraes oferecem efeito bactericida e baixas
concentraes, bacteriosttico na placa bacteriana (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001; BAMBACE et al., 2003; SOUTHERN et al., 2006).
Tambm indicada para tratamento de estomatite, candidase oral,
manuteno da higiene bucal em deficientes fsicos ou mentais, em que o controle da
placa difcil de ser atingido, e em procedimentos pr-cirrgicos (para irrigao de
campos operatrios em cirurgias periodontais e periapicais), para evitar bacteremia,
aplicao ps-cirrgica para auxiliar a cicatrizao, embora alguns autores como
Bonacorsi e colaboradores (2000) e Korolkovas (2001) relatem que a clorexidina
retarda este processo por causar danos ao tecido. A clorexidina indicada em
implantes dentais, higienizao de prteses, pacientes com grande propenso
crie, pacientes com aparelho ortodntico, instrumentao de canal, paciente
imunologicamente comprometido, idoso ou doente terminal (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001).
Ao controlar a formao do biofilme dental atravs da alterao da composio
bacteriana do biolfime supragengival, reduz o risco de crie e doena periodontal,
reduzindo o nmero de Streptococcus mutans por perodos prolongados em
conseqncia de sua liberao lenta na cavidade bucal e ao inibidora sobre
enzimas glicosdicas e proteolticas (BAMBACE et al., 2003; PEREIRA et al., 2006).
O uso de clorexidina para a higienizao das mos seguro e a absoro pela
pele mnima, seno nula. Porm, pode haver irritao na pele, sendo que esta
irritao concentrao-dependente, com probabilidade maior para produtos que
contm 4% de clorexidina e quando utilizados com freqncia (BRASIL, 2008b).

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

19

Efeitos colaterais importantes so: descolorao dos dentes, restauraes e


dorso da lngua, descamao e sensibilidade oral, os quais podem ser diminudos
pela reduo da concentrao da soluo, alm do gosto amargo e interferncia no
paladar por algumas horas aps o bochecho (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001).
Quando associada a um sabonete, pode causar toxicidade local, alterao na
flora normal da pele predispondo-a colonizao por bactrias Gram-negativas
(GONTIJO-FILHO et al., 1984).
Contato de solues com altas concentraes de clorexidina com os olhos e
tecidos sensveis pode causar irritao (TORTORA et al., 2006; MARTINDALE,
2007). H registro na literatura de um recm-nascido que desenvolveu cianose e
bradicardia aps sua me ter administrado spray de clorexidina em seus seios para
prevenir mastite. Aps acidental administrao intravenosa, tm sido relatados casos
de hemlise (MARTINDALE, 2007).
Embora Bonacorsi e colaboradores (2000) apresentem citotoxicidade in vitro
para clorexidina mesmo em baixas concentraes e demonstrem literatura com dados
de toxicidade da clorexidina para vrias clulas humanas, pois seu mecanismo de
ao o memso para clulas procariticas e eucariticas, Kudo e colaboradores
(2002) relatam que a toxicidade da clorexidina baixa para administrao oral (DL50
1800 mg/kg , em rato), mas alta para administrao intravenosa (DL50 22 mg/kg , em
rato). Diversos testes toxicolgicos tm mostrado que a molcula de clorexidina
altamente estvel, e, quando ingerida, quase totalmente eliminada pelas fezes
(SINNES et al., 1997).
De acordo com Martindale (2007), quando ingerida, a clorexidina pode causar
irritaes gastrintestinais, vmito, tontura, enquanto que toxicidade sistmica rara.
Entretanto, Hirata e Kurokawa (2002) relatam que um paciente de 89 anos morreu
aps aspirao e ingesto acidental de soluo de gluconato de clorexidina no Japo,
embora acredita-se que a morte tenha ocorrido devido grave sndrome de angstia
respiratria (causada pela aspirao e conseqente adsoro pelos pulmes) e no
devido aos efeitos gastrintestinais. Kudo e colaboradores (2002) tambm relatam a
morte de uma japonesa aps acidental administrao intravenosa de soluo de
digluconato de clorexidina a 20%.
Hipersensibilidade severa, incluindo choque anafiltico, foi relatada aps
aplicao tpica de clorexidina e de seu uso em lubrificantes para cateterizao
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

20

urinria ou citoscopia e h consenso que reaes similares podem ocorrer quando se


utilizam produtos mdico-cirrgicos como cateteres intravenosos impregnados com
tal produto (MARTINDALE, 2007).
Ainda de acordo com USP DI (2003), a carcinogenicidade no foi observada
em estudo utilizando ratos, que receberam gua com alta dose de clorexidina (38
mg/kg/dia), sendo esta dose, pelo menos, quinhentas vezes a quantidade que pode
ser ingerida pelo homem na dose diria de clorexidina em enxagatrio bucal.
A ao dos anti-spticos sobre os microrganismos e os efeitos txicos que
podem causar ao hospedeiro so dependentes, por exemplo, da concentrao
utilizada. Deste modo, o uso dessas substncias recomendado em concentraes
consideradas seguras para aplicao sobre pele e mucosas (CURY, 1986). Segundo
Imbert e colaboradores (2003), a concentrao de clorexidina utilizada em mucosas
normalmente 500-1000 mg/L e em superfcies plsticas 5000 mg/L.
De acordo com Tambe e colaboradores (2001), o uso de anti-spticos em
produtos mdicos e domsticos aumentou na ltima dcada e o uso indiscriminado
sugere o desenvolvimento de microrganismos resistentes aos anti-spticos.
A resistncia ao germicida, na maioria dos casos, est relacionada com
constituio da parede celular bacteriana, sendo mais freqente em microrganismos
que no so sensveis aos anti-spticos e desinfetantes utilizados normalmente na
prtica clnica (MELO et al., 2000; KLJALG et al., 2002), com o surgimento de
mutao do gene cromossomal ou pela aquisio de material gentico na forma de
plasmdeos (KLJALG et al., 2002; WEBER et al., 2007). Kljalg e colaboradores
(2002) concordam que dados sobre espcies microbianas e susceptibilidade a
antimicrobianos de agentes infecciosos podem sugerir susceptibilidade clorexidina.
Al-Masaudi e colaboradores (1988) descrevem que naquela poca no havia
relatos de resistncia clorexidina em S. aureus antibitico resistente e em
Pseudomonas spp. Entretanto, nos anos de 1990 e 2000, a literatura descreve casos
de resistncia clorexidina (SULLER, RUSSELL, 1999; TAMBE et al., 2001). Thomas
e colaboradores (2005) complementam que a resistncia clorexidina pode ser
adquirida devido ao uso de solues diludas, adaptaes fenotpicas induzidas por
exposio a baixos nveis de biocida ou ainda quando h competio com outro
agente antimicrobiano pelo mesmo alvo de ao.
Algumas precaues devem ser seguidas para o emprego de soluo de
clorexidina, como, por exemplo, no deve ser utilizada em crebro, meninges, ouvido
Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

21

mdio, olhos e outros tecidos sensveis. Alguns cuidados tambm devem ser
seguidos ao preparar a soluo de clorexidina, como utilizar gua esterilizada, utilizar
solues que foram recentemente preparadas, preparar solues em concentraes
corretas e armazen-las adequadamente (MARTINDALE, 2007).
Em 2003, Farias e colaboradores compararam nistatina 100.000 UI e soluo
de digluconato de clorexidina 0,2% sobre o cultivo de C. albicans (ATCC 1031) em
gar BHI. O halo de inibio formado pela clorexidina foi de 27 mm e o formado pela
nistatina foi de 17 mm, demonstrando que a clorexidina pode ser utilizada para auxlio
de preveno e tratamento de candidase oral.
Amorin e colaboradores (2004) determinaram a concentrao inibitria mnima
(CIM), por difuso em gar, de digluconato de clorexidina e p-monoclorofenol, frente
a P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, E. coli, C. albicans, Prevotella intermedia,
Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella denticola e
Prevotella melaninogenica. Os valores de CIMs para clorexidina variaram de 2,67 a
80,0 g/mL, enquanto que para p-monoclorofenol as CIMs foram 46,67 a 213,33
g/mL. Assim, de acordo com os autores, a clorexidina deve ser a primeira escolha
por ser usada em menor concentrao e ser menos txica que o p-monoclorofenol.
Em 2006, Gonalves e colaboradores avaliaram (in vivo) a contaminao
bacteriana gerada pelo aerossol de procedimentos em consultrios odontolgicos e a
eficcia da soluo de digluconato de clorexidina 0,12% para diminuir o nmero de
microrganismos obtidos neste procedimento. O nmero mdio de UFC coletado em
placa com meio de cultura que ficou afixada ao profissional do consultrio
odontolgico, foi de 54,93 na primeira fase (sem profilaxia com bochecho de soluo
de clorexidina) e 18,93 na segunda (com bochecho); em relao s placas coletadas
com a auxiliar e com o paciente, tambm houve reduo significativa do nmero de
UFC na segunda fase, o que corrobora com outros autores que tambm encontraram
reduo no nmero de UFC aps bochechos com clorexidina 0,12%.
Apesar de a clorexidina possuir efeito antimicrobiano, a soluo de clorexidina
pode ser contaminada por bactrias. Gajadhar e colaboradores (2003), em uma
pesquisa realizada em hospitais de Trinidad (Caribe), verificaram que o antisptico/desinfetante mais utilizado em 11 instituies de sade desta ilha foi a
clorexidina. Porm, a qualidade microbiolgica das solues utilizadas em quatro dos
maiores hospitais, demonstrou contaminao por Pseudomonas spp., que prevaleceu

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

22

em 6,1% das amostras analisadas. Portanto, so essenciais as BPF e as BPL


durante seu preparo, uso e conservao.
O mtodo oficial de anlise para sais de clorexidina descritos na literatura
titulao com cido perclrico 0,1 M (BP, 2005; EP, 2005) e cromatografia lquida de
alta eficincia CLAE (USP, 2008). Para soluo de irrigao e enxagatrio bucal de
clorexidina, o mtodo descrito nas farmacopias britnica (2005) e europia (2005)
CLAE. A farmacopia americana (2008) descreve CLAE para anlise de creme oral
com gluconato de clorexidina. Todos estes compndios oficiais descrevem o mtodo
de CLAE para anlise de substncias relatadas. A farmacopia americana (2008),
descreve CLAE para anlise de p-cloroanilina e as farmacopias britnica (2005) e
europia (2005) descrevem mtodo colorimtrico. Para anlise de clorexidina e seus
sais, os mtodos apresentados na literatura so cromatografia gasosa (SIEFERT et
al., 1975) e CLAE (DOUB et al., 1996) e para anlise de impurezas e substncias
relatadas, so oxidao cataltica e CLAE (STEVENS et al., 1986), cromatografia
gasosa (GAVLICK, DAVIS, 1994) e CLAE (REVELLE et al., 1993) . Os parmetros
utilizados nas anlises esto apresentados nas Tabelas 1 e 2.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

23

Tabela 1. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina e seus sais


referncia

mtodo

fase mvel ou

(nm)

solvente

coluna

linearidade

amostra

Soluo A: tampo
fosfato de sdio pH
USP (2008) CLAE

239

3,0 com trietilamina


em

L1

gluconato

gua,

misturando

com

acetonitrila
Soluo

B:

acetonitrila
EP (2005), potenciometria

cido perclrico

sais

BP (2005)
Siefert
al. (1975)

et Cromatografia a

detector Ni

Supelco

gs

50 200 acetato
ppm

Fase A: acetato de Nucleosil


Doub et al. CLAE,
(196)

230

gradiente

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

amnio pH 5,0
Fase B: acetonitrila

C18

10 g/mL a gluconato
10 mg/mL

Reviso da Literatura

24

Tabela 2. Mtodos descritos na literatura para anlise de impurezas e produtos de degradao da clorexidina
referncia

mtodo

(nm)

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

produto encontrado

Soluo A: tampo fosfato


de
USP

CLAE

sdio

pH

trietilamina

239

(2008)

3,0

em

com
gua,

misturando

substncias

L1

relatadas

p-

cloroanilina

com

acetonitrila
Soluo B: acetonitrila
EP (2005),

CG*

reao

BP (2005)

colorimtrica

nitrognio

Octanesulfato
EP (2005),

CLAE

254

cido

BP (2005)

de

actico:

OV 225

4-cloroanilina

Nucleosil C18

substncias relatadas

sdio:
gua:

metanol

Gavlick,
Davis

CG

hlio

(1994)
CLAE

isocrtico

J&W Scientific DB-

0,956 10

ppm

p-cloroanilina

CLAE e CLAE-

Revelle et

com detector diodo

EM**: 230

CLAE e CLAE-EM: tampo

CLAE e CLAE-EM:

11 impurezas, chamadas de: B,

al. (1993)

array,

RMN:

pH 5,0: metanol acetato

Zorbax CN

B1, C, D,D1, D2, E, F, G, G1, H

CLAE-EM*,

RMN***

MHz

CLAE-UV
Stevens et

Oxidao cataltica

al. (1986)

(OC)

220

299,92

RMN: D2O ou CD 3OD


H3PO4: heptanesulfato de

Regis Chemical C6

sdio: CH3CN,

oxignio

pH 2,2

mL/min para OC

300

* cromatografia a gs; ** espectrometria de massas, *** resonncia magntica nuclear


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g/mL

80

p-cloroanilina,

p-clorofenil

biguanida e fenil biguanida

Reviso da Literatura

25

Em fluidos biolgicos, a clorexidina determinada por espectrometria de


cintilao

(BOSNEVOLL

et

al.,

1974),

por

espectrofotometria

(JENSEN,

CHRISTENSEN, 1971; VRIES et al., 1991), CLAE (LAM et al., 1993; MEDLICOTT et
al., 1994; PESONEM et al., 1995) e micro-extrao em fase slida (MUSTEATA,
PAWLISZYN, 2005) em saliva; por CLAE em urina, (GAFFNEY, COOKE, 1984;
WAINWRIGHT, COOKE, 1986), em urina e soro (HUSTON, et al., 1982; BROUGHAM
et al., 1986; BELOW et al., 2004), em soro (KUDO et al., 2002), LC-ESI-MS para
sangue hemolizado (USUI et al., 2006) e CLAE para a determinao de resduos de
clorexidina em leite de vaca (HEBERT et al., 2003). Os parmetros adotados para
estas anlises esto descritos na Tabela 3.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Reviso da Literatura

26

Tabela 3. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em fluidos biolgicos


Referncia

mtodo

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

amostra

(nm)
Bosnevoll et al.
(1974).
Jensen

Espectrometria de

saliva

5-25 g/mL e 25-200

saliva

cintilao lquida
et

al.

UV

250

Clorofrmio

(1971)
Vries

6,9 1,4 mg

g/mL
et.

al.

fluorescncia

541

Tintura eosin-Y

6,7-20 g/mL

saliva

0,05 - 20 g/mL

saliva

2 - 30 g/mL

saliva

(1991)

Lam

et

al.

CLAE - UV

260

(1993)
Medlicott et al.
(1994).

Acetonitrila: tampo acetato

Bekman

de

Ultrasphere

sdio

cido

heptanesulfnico pH 5,0
CLAE com duplo
detector

Acetronitrila:
254

cido

ODS

C18

actico

glacial: laurilsulfato de sdio

Exsil ODS-B C18

Acetonitrila: tampo fosfato


Pesonem et al.
(1995)

CLAE com
detector varivel

260

hidrognio dissdico, cido

LiChrospher

heptanesulfnico

RP-18

0,5 - 100 g/mL

saliva

Zorbax Eclipse C18

0,05 - 40 g/mL

saliva

Bondapak C18

1 - 10 g/mL

urina

100

trietileneamine pH 2,5
Musteata et al.
(2005)

gua acidificada com cido


CLAE-ESI-MS

frmico (pH 3,2): acetonitrila

Gaffney, Cooke
(1984)

metanol: tampo acetato de


CLAE -UV

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

260

sdio pH 5,0

Reviso da Literatura

27

Tabela 3. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em fluidos biolgicos
Referncia

mtodo

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

amostra

(nm)
Wainwright,

metanol:

Cooke (1986)
Huston

et

CLAE -UV

260

al.

(1982)

238

Brougham et al.

CLAE-UV,
Below

et

al.

(2004)

260

gradiente,

combinado com extrao

250

em fase slida

amnia:

sulfnico

gua

Partisil slica

50 - 200 g/mL

urina

ODS Waters

1 - 20 g/mL

urina e sangue

em

metanol: gua
metanol:

CLAE -UV

de

nitrato de amnia
yolueno-4-cido

CLAE -UV

(1986)

soluo

com

20,2

808

heptanosulfato de sdio

Bondapak C18

ng/mL

soro e urina

A: acetonitrila: tampo de soluo

Coluna

de amnia e cido actico pH 8,7

separao

2,5 mg/L e 25

soro e urina

B: acetonitrila: cido actico

C18

mg/L

Capcell Pak C18

0,05 - 50 g/mL

soro

sangue

de
Luna

acetonitrila: gua com 0,05% de


Kudo

et

al.

CLAE -UV

260

(2002)

cido trifluoroactico, 0,05% de


cido heptafluorobutirico e 0,1%
de trietilamina

Usui et al. (2006)


Hebert

et

al.

LC-ESI-MS*

LC-MS: acetonitrila: gua: cido

LC-MS: TSK gel

0,10

LC-MS: HPLC isocrtico

trifluoro actico

ODS 100 V

g/mL

hemolizado

Supelco Discovery

1 - 100 g/mL

saliva

CLAE -PDA

(2003)

258

tampo

acetato

acetonitrila

*cromatografia lquida ionizao elestrospray e espectrotometria de massas

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

(pH

3,6):

RP-Amide C16

11,0

Reviso da Literatura

28

Em preparaes farmacuticas, a clorexidina tem sido determinada pelo


mtodo de CLAE (BAILEY et al., 1975; BAUER et al., 1983; BAUER et al., 1984;
RICHARD et al., 1984; GAGLIARD et al., 1985; HU et al., 1990; GAVLICK, 1992; H,
CHEUNG, 1996; HAVLIKOV et al., 2007), extrao em fase slida combinada com
anlise espectrofotomtrica (BONAZZI et al., 1995), cromatografia gs-lquida,
espectrometria de massas e ressonncia magntica nuclear (MIRIBEL et al., 1983) e
eletroforese capilar (ABAD-VILLAR et al., 2006). Os parmetros utilizados nestas
anlises esto apresentados na Tabela 4.

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29

Reviso da Literatura

Tabela 4. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes farmacuticas


referncia

mtodo

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

amostra

(nm)
Bailey

et

al.

(1975)
Bauer

soluo degermante, loo, talco e


CLAE -UV

et

al.

(1984)

CLAE

254

com

detector

et

al.

(1983)

CLAE

294

com
262

sdio e sulfato hidrognio tetrabutil

Bondapck C18

0,64

pastilha

2,56

g/mL

Bondapack CN 10

0,6 1,4 g/mL

pastilhas

sdio

Erbasil C18

0,02 6 g/mL

creme

tampo fosfato de dihidrognio pH

Nucleosil C18

2,72

soluo anti-sptica para lentes de

acetonitrila

com

laurilsulfato

de

sdio

Gagliard et al.

acetonitrila: gua com perclorato de


CLAE -UV

et

creme obsttrico, gel dental

tampo acetato de sdio pH 3,5:

varivel

Hu

0 - 600 g/mL

amonio pH 5,9

detector

(1985)

Partisil

acetonitrila: tampo com cloreto de

varivel
Bauer

acetonitrila: cido sulfrico 0,02 N

264

al.

(1991)

CLAE -UV

Gavlick (1992)

CLAE

254
-

PDA

3,5

436

g/mL

contato

Suples pkb- 100

9,1 146 ppm

produto de limpeza das mos

Hamilton PRP-1

30 ppm

solues oftlmicas

Fase A: acetonitrila
239

Fase B: tampo TFA pH 2,0

CLAE
H,
(1996)

Cheung

gradiente,
com UV-VIS

Fase A: acetonitrila: tampo acetato


235

e PDA

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de amnio pH 5,0
Fase B: tampo fosfato: acetonitrila

Reviso da Literatura

30

Tabela 4. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes farmacuticas
referncia

mtodo

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

amostra

(nm)
Fase A: tampo acetato de sdio pH 4,0: cido
actico: metanol: soluo de heptanesulfonato
Richard et al.

CLAE

(1984)

gradiente,

UV

254

colrio e solues

de sdio (92,1 0,2: 4,8: 2,9)

Bondapck

0,312

Fase B: tampo acetato de sdio pH 4,0: cido

C18

mg/100mL

10

anti-spticas

para

lente de contato

actico: metanol: soluo de heptanesulfonato


de sdio (4,8: 0,4: 91,9: 2,9)
Zorbax
Havlkov et al.

CLAE - UV-VIS

(2007)

239

SB

Acetonitrila: tampo fosfato de sdio em

Phenyl

51,2-

trietilamina pH 3,0

column

g/mL

178,5

pomada veterinria

Extrao em fase
slida

(EFS)

Bonazzi et al.

combinada

com

(1995)

espectrofotometria

SPE

C18

7,3 36,5 g/mL

cremes

(para EFS)

derivada
Abad-Villar
al. (2006)

et

Eletroforese

capilares de

10 g/mL 20

capilar

slica fundida

mg/mL

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colrio

Reviso da Literatura

31

Tabela 4. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes farmacuticas
referncia

mtodo

fase mvel ou solvente

coluna

linearidade

amostra

(nm)
Cromatografia
3%

gs-lquida,
Miribel

et

al.

(1983)

espectrofotometria
de

massas

Nitrognio (para cromatografia gasosa)

OV-101

on

0,2 2 mg/mL

creme e pomada

Chromosorb

ressonncia

W HP (gs)

magntica nuclear
soluo
BP (2005), EP

CLAE

254

(2005)

Octanesulfato de sdio: cido actico: gua:

Nucleosil C18

metanol

irrigao,
enxagatrio bucal

Soluo A: tampo fosfato de sdio pH 3,0


com trietilamina em gua, misturando com
USP (2008)

CLAE

239

acetonitrila
Soluo B: acetonitrila

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de

L1

creme oral

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32

Na literatura no foi encontrado mtodo de ensaio microbiolgico pela tcnica


de difuso em gar para anlise quantitativa de soluo de digluconato de clorexidina
e tambm no foi encontrado mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta
para anlise quantitativa de sabonete lquido contendo digluconato de clorexidina. Por
estes motivos, este trabalho se props a desenvolver e validar tais metodologias
analticas.

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Reviso da literatura

33

Publicao

FIORENTINO, F.A.M.; CORREA, M.A.; SALGADO, H.R.N.

Clorexidina, uma reviso.

Revista Bio Farma, (So Paulo), v. 3, n. 6, p. 62-72, 2008.

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4. CONTROLE DE QUALIDADE DA SOLUO DE


DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA

Controle de qualidade

35

4.1. Descrio
4.1.1. Descrio geral
Nome genrico: digluconato de clorexidina, registro nmero 02437 na DCB,
(Brasil, 2006).
Descrio: soluo aquosa amarelo-plido, lmpida e quase inodora com sabor
amargo (BRITISH, 2005; USP, 2007).
Nome qumico: 1,1(hexane-1,6-diyl)bis[5-(4-p-chlorophenyl)biguanide] di-Dgluconate (BRITISH, 2005).
Nomes: Chlorhexidine digluconate; Chlorheksidino digliukonato tirpalas;
Chlorhexidin-diglukont; Chlorhexidine, Gluconate de; Chlorhexidini Digluconatis
Solutio; Chlorhexidini Gluconas; Gluconato de clorhexidina (MARTINDALE, 2007).
Nome comercial: soluo aquosa de digluconato de clorexidina, Peridex,
PerioGard (USA); Oro-Clense, Peridex (Canad); Corsody, Chlorohex (Reino
Unido); Chlorhexamed (Alemanha); Savacol (Austrlia); PerioGard, Cariax,
Megatrat, Clorexidina (Brasil).
CAS: 18472-51-0
DCI: 0500
Categoria: Anti-sptico bis-biguanida.
Frmula qumica: C22H30Cl2N10.2C6H12O7
Massa molecular: 898
Faixa de fuso: Os cristais obtidos com a soluo de digluconato de clorexidina
fundem entre 132 C a 136 C (BRITISH, 2005; USP, 2007).
4.1.2. Substncia qumica de referncia
Foi utilizada soluo aquosa de digluconato de clorexidina padro secundrio,
gentilmente doada pela indstria Rioqumica Ltda, na pessoa da Dra. Greici Cristiani
Gomes Tozo, com teor rotulado de 20,98% e identificada pelo lote de nmero
07/1306, validade 13/06/2009.
4.1.3. Forma farmacutica
Foi utilizada soluo aquosa de digluconato de clorexidina, gentilmente doada
pelo Laboratrio de Cosmetologia da Universidade Estadual Paulista Jlio de
Mesquita Filho, na pessoa do Prof. Dr. Marcos Antonio Corra, sob nome comercial

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36

de Soluo de Digluconato de Clorexidina (Henrifarma) e identificada pelo lote CS


0120705.
4.2. Anlise qualitativa da soluo de digluconato de clorexidina
4.2.1. Caracteres fsicos
A soluo de digluconato de clorexidina utilizada na preparao dos sabonetes
foi avaliada em relao ao aspecto, cor e odor.
De acordo com os resultados, a soluo de digluconato de clorexidina
apresentou-se amarelo-plida, lmpida e quase inodora, demonstrando estar de
acordo com o especificado na literatura consultada (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
4.2.2. Cromatografia em camada delgada
O objetivo desta anlise foi verificar se a soluo de digluconato de clorexidina
a ser incorporada aos sabonetes lquidos apresenta impurezas.
4.2.2.1. Material
Foram utilizadas soluo de digluconato de clorexidina padro secundrio,
soluo de digluconato de clorexidina amostra e gluconato de clcio (Henrifarma, So
Paulo).
Os solventes utilizados foram de grau analtico e esto relacionados na lista de
materiais (p. xxv, item 1): acetato de etila, amnia concentrada, gua destilada e
etanol, dicromato de potssio, cido sulfrico, cromatoplaca de gel de slica 60 F254.
4.2.2.2. Mtodo
A placa utilizada (p. xxv, item 1) para identificao foi ativada a 105 C por 1
hora em estufa. Foi diludo 1,0 mL da soluo padro secundrio de digluconato de
clorexidina em 5,0 mL de gua deionizada. O mesmo procedimento foi realizado para
o preparo da soluo amostra de digluconato de clorexidina. A soluo referncia de
gluconato de clcio foi preparada dissolvendo 25,0 mg de gluconato de clcio em 1
mL de gua deionizada (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2007).
A cuba foi saturada com o sistema de fase mvel. Aps migrao de 10 cm da
fase mvel, a placa foi seca a 100 C por 20 minutos, e em seguida, borrifada com
soluo de dicromato de potssio em soluo de cido sulfrico para comparao

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37

dos cromatogramas (EP, 2005; USP, 2007). Foram determinados os valores de Rf de


cada soluo.
4.2.2.3. Resultados
Finalizado o processo cromatogrfico, as manchas detectadas com as
solues de digluconato de clorexidina padro secundrio e amostra e soluo de
referncia foram compatveis, entre si, quanto ao tamanho, local e cor, estando em
concordncia com o especificado nas monografias e entre si, como pode ser visto na
Figura 2.

Figura 2. Cromatograma em camada delgada de soluo de digluconato de clorexidina. (1)


soluo de referncia, (2), soluo teste, (3), soluo padro secundrio, no sistema
solvente: acetato de etila: amnia concentrada: gua: etanol (1:1:3:5, V:V:V:V). Valor de Rf da
soluo referncia 0,56, Rf da soluo padro 0,60 e Rf da soluo teste 0,60.

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes


de uma mistura, realizada atravs de sua distribuio entre duas fases (mvel e
estacionria). Durante a passagem da fase mvel sobre a estacionria, os
componentes da mistura se distribuem entre as fases, de forma que cada um dos
componentes seletivamente retido pela fase estacionria, resultando em migraes
diferenciais destes compostos. um mtodo de fcil execuo til na separao,
identificao, anlise semi-quantitativa das espcies qumicas e requer o uso
modesto de equipamentos sendo um procedimento importante para locais com pouca
infra-estrutura e com treinamento limitado dos operadores, alm de ser um mtodo
rpido, preciso e com baixo custo (F. Bras., 1988; GIL, 2007).

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38

4.2.3. pH
4.2.3.1. Material
Foi utilizada soluo de digluconato de clorexidina padro secundrio e
soluo de digluconato de clorexidina amostra, descritas no item 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente. A anlise foi realizada em peagmetro especificado na lista de
equipamentos (p.xxv, item 2).
4.2.3.2. Resultados
O pH obtido com a soluo amostra foi 5,94 e com a soluo padro
secundrio foi 5,75, estando ambas as solues de acordo com a literatura
consultada, que especifica pH entre 5,5 e 7,0 (BP, 2005; USP, 2008) e tambm esto
de acordo entre si.
4.2.4. Determinao da faixa de fuso
O objetivo foi verificar se a soluo de digluconato de clorexidina a ser
incorporada nos sabonetes apresenta impurezas e se o material cumpre com o
requisito farmacopico.
4.2.4.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina,
soluo amostra de digluconato de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3
respectivamente, soluo de hidrxido de sdio 10 N, lcool 70%, papel de filtro,
soluo de amarelo titnio, conforme descritos em lista de materiais (p. xxv, item 3).
4.2.4.2. Mtodo
A 1,0 mL da soluo padro secundrio, foram adicionados 40 mL de gua
deionizada e isenta de gs carbnico. Foi adicionada soluo de hidrxido de sdio
10 N, at que produzisse cor vermelha em papel amarelo titnio, e 1,0 mL da soluo
de hidrxido de sdio foi adicionado em excesso. O precipitado foi filtrado e lavado
com gua at que as lavagens estivessem livres de lcalis. O resduo foi
recristalizado com lcool (70% v/v). Os cristais foram secos a 100 C - 105 C em
estufa por 1 hora, colocados em tubos capilares e introduzidos no equipamento para
verificao da faixa de fuso (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).

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39

A soluo amostra de digluconato de clorexidina foi preparada da mesma


maneira que a soluo padro. Foram realizadas trs determinaes para os cristais
obtidos com a soluo teste e trs determinaes para a soluo padro secundrio.
4.2.4.3. Resultados
O faixa de fuso dos cristais obtidos da soluo teste foi 134,03 C e o PF dos
cristais obtidos da soluo padro foi 133,97 C, estando estes valores de acordo
com a literatura consultada que especifica faixa de fuso para cristais de soluo de
digluconato de clorexidina entre 132 C - 136 C (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
Alm disso, estes valores indicam conformidade entre ambas as solues.
A faixa de fuso importante tanto para a caracterizao de compostos quanto
para indicar pureza quando se compara com padres de referncia, pois a presena
de impurezas, mesmo que em pequenas quantidades, pode alterar a faixa de fuso
de um composto ou diminuir o seu ponto de fuso (GIL, 2007).
Os resultados obtidos sugerem que a soluo amostra pode ser identificada
como digluconato de clorexidina, e no apresenta impurezas precipitveis por NaOH
10 N.
4.2.5. Densidade relativa
4.2.5.1. Material
Foi utilizada soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina e
soluo amostra de digluconato de clorexidina descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente.
4.2.5.2. Mtodo
Foi realizado conforme o mtodo do picnmetro (F. Bras., 1988). Foram
realizadas trs determinaes para cada soluo.
4.2.5.3. Resultados
A densidade relativa da soluo-teste foi 1,066 e da soluo padro secundrio
foi 1,065, estando estes valores de acordo com o especificado pela literatura, que
de 1,06 a 1,07 (BP, 2005; USP, 2008) e em conformidade entre si.

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40

4.2.6. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho


O objetivo deste estudo foi verificar se a soluo de digluconato de clorexidina
a ser incorporada aos sabonetes apresenta impurezas.
4.2.6.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina e
soluo amostra de digluconato de clorexidina descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente, espectrofotmetro de infravermelho (p. xxv, item 5) e brometo de
potssio.
4.2.6.2. Mtodo
Os cristais foram obtidos da mesma maneira como descrito em determinao
do ponto de fuso, item 4.2.4.3 e analisados em espectrofotmetro de infravermelho
(BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008), utilizando KBr como diluente. Foram pesados
100,0 mg de KBr e 1,0 mg de cristal obtido da soluo teste do digluconato de
clorexidina. O mesmo procedimento foi realizado para soluo padro secundrio.
4.2.6.3. Resultados
Os espectros obtidos esto apresentados nas Figuras 3 e 4. A Figura 5
apresenta a sobreposio de ambos os espectros.

Figura 3. Espectro na regio de infravermelho obtido com cristais da soluo amostra de


digluconato de clorexidina, em pastilhas de KBr.
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41

Figura 4. Espectro na regio de infravermelho obtido com cristais da soluo padro


secundrio de digluconato de clorexidina, em pastilhas de KBr.

Figura 5. Sobreposio dos espectros obtidos com cristais da soluo amostra (azul) e
soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina (vermelho), em pastilhas de KBr.

A substncia em anlise refere-se clorexidina, pois os picos obtidos no


espectro do infravermelho so caractersticos dos grupamentos qumicos presentes

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42

na molcula da clorexidina, como apresentado na Tabela 5, e no demonstra a


presena de impurezas precipitveis por NaOH 10 N.
Tabela 5. Absoro de digluconato de clorexidina substncia-teste e substncia
padro secundrio em espectro de infravermelho em pastilhas de KBr
cm-1

grupamento responsvel

3470- 3380

Deformao axial dos grupamentos N-H

2930-2800

Deformao axial do grupamento sp3CH

1600-1540-1480 Deformao axial do anel benznico


1240

Deformao axial do grupamento C-O

Os espectros de absoro na regio infravermelho em pastilhas de KBr


apresentam picos de absoro caractersticos como: absoro em 3470 3380 cm-1
caractersticas de presena de N-H; absoro em 1600 1540 1480 cm-1
caracterstica de anel benznico; absoro em

1240 cm-1 caracterstica de C-O,

sendo todos condizentes com a estrutura do digluconato de clorexidina como


mostrado na Figura 1.
A espectrofotometria no infravermelho situa-se entre as regies do visvel e
das microondas. Neste espectro, a correlao pico a pico uma tima evidncia para
a identidade da amostra. O espectro de infravermelho caracterstico da molcula
como um todo, mas certos grupos de tomos originam picos de absoro que
ocorrem

em

freqncia

prxima

independente

da

estrutura

da

molcula

(SILVERSTEIN et al., 1994). Este mtodo tem fundamental importncia para ensaios
de identificao e de fins qualitativos, porm, para ensaios de doseamento sua
aplicao bem limitada (GIL, 2007).
4.2.7. Espectrofotometria na regio ultravioleta
4.2.7.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio e soluo amostra de digluconato
de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente. Os solventes
utilizados foram de grau analtico.
Os espectros na regio de ultravioleta foram obtidos utilizando-se equipamento
descrito no item 6, p.xxv, e cubetas de quartzo com 1 cm de caminho ptico.

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43

4.2.7.2. Mtodo
A partir da soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina 20% (p/v),
foi preparada soluo a 0,1%. Uma alquota de 500,0 L da soluo padro foi
transferida para balo volumtrico de 100 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda
utilizando-se gua deionizada para obteno de soluo a 0,1% (soluo A).
4.2.7.2.1. Em gua deionizada
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi tranferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se gua
deionizada para obteno de soluo a 0,002% (QUITETE et al., 2007).
4.2.7.2.2. Em etanol
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se etanol
para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.2.3. Em cido clordrico 0,1 M
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se cido
clordrico 0,1 M para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.2.4. Em hidrxido de sdio 0,1 M
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se hidrxido
de sdio 0,1 M para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.3. Resultados
Os espectros de absoro da soluo de digluconato de clorexidina na regio
de ultravioleta esto representados nas Figuras 6 a 9.

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44

Figura 6. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo de


digluconato de clorexidina padro secundrio a 0,002% em gua deionizada.

Figura 7. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo de


digluconato de clorexidina padro secundrio a 0,002%, em etanol.

Figura 8. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo de


digluconato de clorexidina padro secundrio a 0,002%, em cido clordrico 0,1 M.

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45

Figura 9. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo de


digluconato de clorexidina padro secundrio a 0,002% em hidrxido de sdio 0,1 M.

Para o preparo da soluo amostra de digluconato de clorexidina a 0,1%, uma


alquota de 500,0 L da soluo amostra foi transferida para balo volumtrico de 100
mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se gua deionizada como
solvente (soluo A). A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida
para balo volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizandose etanol para obteno de soluo a 0,002%.
O espectro de absoro de digluconato de clorexidina soluo amostra obtido
em etanol, em concentrao de 0,002% na regio UV est apresentado na Figura 10.
As leituras foram realizadas entre 200 e 400 nm em espectrofotmetro de ultravioleta,
utilizando-se cubeta com 1 cm de caminho ptico.

Figura 10. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo
amostra de digluconato de clorexidina a 0,002% em etanol.

4.2.7.4. Discusso
Diante dos espectros obtidos com os diferentes solventes, optou-se por fazer a
identificao da soluo amostra de digluconato de clorexidina utilizando etanol como
solvente, pois alm de apresentar picos bem definidos, possui facilidade de aquisio,
baixo custo e poucos resduos. O ensaio de quantificao do digluconato de

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46

clorexidina no sabonete lquido, utilizou etanol uma vez que o ativo apresentou maior
absoro.
Os espectros obtidos com cido clordrico 0,1 M e hidrxido de sdio 0,1 M no
foram adequados para identificao da clorexidina, pois para estes solventes no
ocorreram sinais que permitissem caracterizar a substncia.
De acordo com os resultados obtidos nas anlises qualitativas das solues
padro secundrio e amostra de digluconato de clorexidina, concluiu-se que o
produto em estudo realmente a clorexidina pois no houve presena de
interferentes precipitveis por NaOH 10 N detectados nos testes de faixa de fuso e
espectroscopia no infravermelho e as anlises realizadas com a soluo tambm
cumpriram com os requisitos farmacopicos. Portanto, esta soluo apresentou-se
adequada para ser incorporada s formulaes desenvolvidas.
4.3. Anlise quantitativa da soluo de digluconato de clorexidina
4.3.1. Ensaio microbiolgico
O objetivo deste estudo foi realizar o desenvolvimento e a validao de ensaio
de quantificao de soluo de digluconato de clorexidina, utilizando o ensaio
microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar.
4.3.1.1. Material e mtodo
A partir de parmetros especificados em ensaios com agentes antimicrobianos
como esparfloxacino (MARONA e SCHAPOVAL, 1998), gatifloxacino (SALGADO et
al., 2006), lomefloxacino (GOMES e SALGADO 2006), foram realizados testes
preliminares para padronizar as condies a serem empregadas. Os parmetros
estudados encontram-se na Tabela 6.

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Tabela 6. Parmetros testados para avaliao de soluo de digluconato de


clorexidina no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar
Parmetros
Microrganismo

Descrio
Bacillus subtilis ATCC 9372
Staphylococcus aureus ATCC 25923

Meios de cultura

gar Mueller Hinton


gar Brain Heart Infusion (BHI)
soluo tampo fosfato pH 6,8

Diluente

gua deionizada
Concentrao da soluo padro 1,0; 2,0 e 4,0%
1,5; 3,0 e 6,0%
0,25; 1,0 e 4,0%
0,5; 1,5 e 4,5%
0,33; 1,0 e 2,0%
Concentrao do inculo

0,5% e 1,0%

4.3.1.2. Execuo do ensaio


De acordo com os resultados obtidos com os diferentes microrganismos e
meios de cultura foi possvel estabelecer parmetros para realizao do doseamento
microbiolgico, que esto apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Parmetros definidos para o ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso
em gar, a serem utilizados para anlise quantitativa de soluo de digluconato de
clorexidina
Parmetros

Descrio

Microrganismo

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Meio de cultura

gar Brain Heart Infusion (BHI)

Diluente

gua deionizada

Concentrao da soluo padro 0,5; 1,5 e 4,5%


Concentrao do inculo

1,0%

Temperatura de incubao

35 1 C

Tempo de incubao

20 horas

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4.3.1.3. Preparo das solues-padro da soluo de digluconato de clorexidina


Foram transferidos 250,0 L, 750,0 L e 2250,0 L de soluo de digluconato
de clorexidina padro secundrio a 20% para bales volumtricos de 10,0 mL e
completou-se o volume com gua deionizada estril, obtendo-se concentraes finais
de 0,5; 1,5 e 4,5%.
4.3.1.4. Preparo das solues de digluconato de clorexidina substncia amostra
As solues amostras foram preparadas como no item 4.3.1.3, porm,
utilizando soluo amostra de digluconato de clorexidina a 20%.
4.3.1.5. Material
Para o doseamento microbiolgico, foi utilizado o meio de cultura gar Casoy
para manuteno da cepa do microrganismo em tubos com meio inclinado, meio de
cultura gar BHI como camada base e camada de superfcie contendo o inculo e
caldo BHI para preparo e padronizao do inculo. Os meios de cultura, gua
deionizada e ponteiras foram esterilizados em autoclave por 15 minutos a 121 C.
Foram empregadas placas de Petri com 20,0 mm de altura x 100,0 mm de
dimetro, sendo que nas tampas foi colocado papel de filtro para impedir que
gotculas de condensao invalidassem ou dificultassem a leitura dos halos de
inibio. Estes materiais e vidraria no volumtrica foram esterilizados em estufa a
180 C por 1 hora.
4.3.1.6. Preparo do inculo
O microrganismo-teste Staphylococcus aureus ATCC 25923, mantido em gar
Casoy inclinado em tubo de ensaio, foi repicado para caldo BHI e incubado por 24
horas a 35 C 1 C para padronizao do inculo realizada em espectrofotmetro a
580 nm com transmitncia de 25% 2% (F. Bras., 1988). Aps a padronizao, o
inculo foi utilizado a 1% em gar BHI, mantido em banho a 46 C 1 C. Os meios
de cultura foram preparados como indicado no rtulo do fabricante.
4.3.1.7. Ensaio
A camada base de 20,0 mL de gar BHI foi adicionada s placas de Petri.
Aps sua solidificao, foram adicionados 5,0 mL de gar BHI com inculo a 1% (v/v),
com auxlio de pipetador automtico. Aps a solidificao desta camada, foi colocado

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49

o template em cada placa, cujos orifcios foram preenchidos com 200,0 L das
solues descritas nos itens 4.3.1.3 e 4.3.1.4, como apresentado na Figura 11. As
placas foram incubadas a 35 1 C e aps 20 horas foram realizadas as medidas dos
dimetros dos halos de inibio do crescimento bacteriano, com auxlio de
paqumetro digital. Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar.
Foram preparadas 12 placas.

P1
A1

A3

P3

P2
A2

Figura 11. Esquema do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar, delineamento
3 x 3, demonstrando a disposio das solues-padro (P) e amostra (A) na placa de Petri,
donde P1 (0,5%); P2 (1,5%); P3 (4,5%) e A1 (0,5%); A2 (1,5%) e A3 (4,5%).

4.3.1.8. Resultados
Os resultados dos valores dos dimetros dos halos de inibio do crescimento
bacteriano, obtidos para as solues de diferentes concentraes de soluo padro
secundrio e soluo amostra de digluconato de clorexidina esto na Tabela 8.

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50

Tabela 8. Valores dos dimetros dos halos de inibio de crescimento obtidos com a
soluo de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiolgico pelo mtodo de
difuso em gar
concentrao

dimetro dos halos de

dimetro mdio

(%)

inibio (mm)*

e.p.m. **

DPR%***

19,32 19,31
P1

0,5

19,28 19,27

19,30 0,0079

0,09

20,81 0,0084

0,09

22,37 0,0087

0,09

19,24 0,0070

0,08

20,78 0,0088

0,09

22,30 0,0048

0,05

19,30 19,31
20,81 20,79
P2

1,5

20,79 20,83
20,84 20,82
22,33 22,37

P3

4,5

22,39 22,38
22,36 22,38
19,24 19,27

A1

0,5

19,23 19,23
19,22 19,24
20,78 20,79

A2

1,5

20,80 20,81
20,75 20,77
22,30 22,29

A3

4,5

22,32 22,31
22,30 22,29

(*) cada valor do halo de inibio corresponde mdia de 6 determinaes; (**) e.p.m. - erro
padro da mdia e (***) DPR% - desvio padro relativo percentual

4.3.1.9. Clculos
4.3.1.9.1. Curva analtica
A reta foi construda em grfico logaritmo da concentrao versus dimetro dos
halos de inibio, com as mdias dos dimetros de cada uma das concentraes da

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substncia padro secundrio. A curva analtica foi construda com os valores da


mdia do dimetro das concentraes 0,5; 1,5 e 4,5% (Figura 12).

y = 1,3972Ln(x) + 20,26
R2 = 0,9999

halo de inibio (mm)

23,0
22,5

y = 1,3942Ln(x) + 20,209
R2 = 1

22,0
21,5

p
a

21,0

Log. (a)

20,5

Log. (p)

20,0
19,5
19,0
0,1

10

log da concentrao

Figura 12. Representao grfica da curva analtica de soluo de digluconato de clorexidina


padro e amostra, no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar.

Para a construo da curva analtica foram utilizados 3 pontos como


preconizado pela Farmacopia (1988) com delineamento 3 x 3. A disposio das
solues-padro secundrio (P) e solues amostras na placa de Petri aps o ensaio
est demonstrada na Figura 13.

Figura 13. Resultado do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar, da soluo
de digluconato de clorexidina em concentraes de 0,5; 1,5 e 4,5% utilizando S. aureus.

4.3.1.9.2. Clculo da potncia do anti-sptico


A potncia do anti-sptico foi calculada atravs da equao de HEWITT (1977)
apresentada na equao 1. Os ensaios foram realizados em dias diferentes, durante
3 dias consecutivos sendo cada ensaio a mdia de seis determinaes, e em cada
dia o teste foi realizado em duplicata, denominando-se ensaios I, II, III, IV, V e VI.

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52

Equao de HEWITT
T/R (%) = Antilog M x 100
M = F/b

Em que:

Equao 1

b = E/I

F = 1/3{(A1+A2+A3) (P1+P2+P3)}
I = logaritmo da razo das doses
E = {A3+P3) (A1+P1)}

Os resultados obtidos na determinao de digluconato de clorexidina em


soluo no ensaio microbiolgico, calculados pela frmula de HEWITT (1977) esto
apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Valores experimentais obtidos para o doseamento de soluo de
digluconato de clorexidina, no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar
dias

teor de digluconato de

teor mdio e.p.m.**

clorexidina (%)
1

92,54

92,59

92,61

DPR
(%)***

92,57 0,03

0,05

(*) cada valor encontrado a mdia de duas leituras, (**) e.p.m., erro padro da
mdia, (***) DPR%, desvio padro relativo percentual.

4.3.1.10. Anlise estatstica


A equao da reta para representao grfica da curva analtica foi
determinada atravs de regresso linear, pelo mtodo dos mnimos quadrados. Para
a construo da curva analtica foram utilizados trs pontos, cada um representando
a mdia de trs determinaes.
A validao da metodologia foi realizada pela anlise da varincia (ANOVA),
segundo tratamento estatstico preconizado pela Farmacopia (1988) para ensaio
3 x 3 (Tabela 10).

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Tabela 10. Anlise da varincia dos dados obtidos no ensaio microbiolgico com a
soluo de digluconato de clorexidina, pelo mtodo de difuso em gar
Fontes de variao

GL

SG

QM

F calc

F tab

Preparao

0,025

0,025

67,1*

4,24

Regresso

56,427

56,427

Desvio de paralelismo

0,00007 0,00007

0,182

4,24

Quadrtico

0,00009 0,00009

0,243

4,24

Diferena de quadrtico

0,00222 0,00222

6,075*

4,24

Desvio de linearidade

0,002

0,001

3,159

3,38

Entre doses

56,454

11,291

30867,7*

2,6

Entre placas

0,00166 0,00033

0,905

2,6

Dentro (erro)

25

0,00914 0,00037

........

.....

Total

35

.........

.....

56,46

.......

154264,9* 4,24

significativo para p < 0,5%.

4.3.1.11. Teste de Recuperao


O teste de recuperao foi realizado com o objetivo de determinar a exatido
do mtodo proposto (AOAC, 1990; BRASIL, 2003).
4.3.1.11.1. Preparo das solues
O teste de recuperao do mtodo microbiolgico foi realizado como no item
4.3.1.7.
No desenvolvimento do teste de recuperao do doseamento microbiolgico
foram padronizados valores de 5, 10 e 15% de substncia padro secundrio
adicionado na amostra. A soluo de substncia padro secundrio est com
concentrao de 20%.

As solues amostras foram preparadas transferindo-se

250,0; 750,0 e 2250,0 L de soluo de digluconato de clorexidina amostra a 20%


para bales volumtricos de 10,0 mL e o volume foi completado com gua deionizada
estril, obtendo-se concentraes finais de 0,5; 1,5 e 4,5%, respectivamente.
Para a recuperao 1, foram transferidos analiticamente 500,0 L de soluo
padro secundrio para bales volumtricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e
2250,0 L de soluo amostra e os volumes foram completados com gua
deionizada. Para a recuperao 2, foram transferidos 1000,0 L de soluo padro
secundrio para cada bales volumtricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e

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54

2250,0 L de soluo amostra e os volumes foram completado com gua deionizada.


Para a recuperao 3, foram transferidos 1500,0 L de soluo padro secundrio
para cada bales volumtricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e 2250,0 L de
soluo amostra e os volumes foram completados com gua deionizada.
Desta maneira, foram obtidas concentraes tericas de (amostra + padro):

Para o teste de recuperao 1: concentraes de 1,5; 2,5 e 5,5%,


representando os 5% adicionados de padro secundrio.

Para o teste de recuperao 2: concentraes de 2,5; 3,5 e 6,5%,


representando os 10% adicionados de padro secundrio.

Para o teste de recuperao 3: concentraes de 3,5; 4,5 e 7,5%,


representando os 15% adicionados de padro secundrio.

Solues padro secundrio e amostra: 0,5; 1,5 e 4,5%.


As solues foram preparadas conforme Tabela 11.

Tabela 11. Preparao das amostras de soluo de digluconato de clorexidina no


teste de recuperao no ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar
volume de

volume de soluo

concentrao

soluo amostra

padro secundrio

terica de

adicionada (L)

adicionada (L)

amostra + padro

(20%)

(20%)

( %)

Recuperao 1
Amostra a 0,5%

250

500

1,5

Amostra a 1,5%

750

500

2,5

Amostra a 4,5%

2250

500

5,5

Recuperao 2
Amostra a 0,5%

250

1000

2,5

Amostra a 1,5%

750

1000

3,5

Amostra a 4,5%

2250

1000

6,5

Recuperao 3
Amostra a 0,5%

250

1500

3,5

Amostra a 1,5%

750

1500

4,5

Amostra a 4,5%

2250

1500

7,5

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55

Aps a execuo do ensaio, as placas foram incubadas em estufa a 35 C


1 C por 20 horas. Em seguida, os halos de inibio de crescimento foram medidos
com auxlio de paqumetro. A potncia do anti-sptico foi calculada pela equao de
HEWITT (1977), e a partir do valor encontrado foi calculado o teor de recuperao.
4.3.1.11.2. Clculo do teste de recuperao
A porcentagem de recuperao (R%) foi calculada de acordo com a expresso
descrita em AOAC (1990) e BRASIL (2003).
R% = [(PF - PA)/PP] x 100

Em que:

Equao 2

PF = potncia da substncia padro secundrio + amostra


PA = potncia da amostra
PP = potncia da substncia padro secundrio adicionada

Os resultados do mtodo microbiolgico para determinao de digluconato de


clorexidina esto apresentados na Tabela 12.
Tabela 12. Teste de recuperao de amostras de digluconato de clorexidina, no
ensaio microbiolgico pelo mtodo difuso em gar
atividade percentual

recuperao (%)

recuperao
mdia (%)

de padro adicionada
Recuperao 1

5,00

98,6

Recuperao 2

10,00

98,0

Recuperao 3

15,00

100,5

99,03

4.3.1.12. Discusso
O ensaio microbiolgico um mtodo fsico em que um microrganismo
utilizado como revelador. Emprega-se meio de cultura slido inoculado, distribudo em
placas, em sistema de bicamada, onde a substncia teste se difunde (PINTO et al.,
2003).
A fim de assegurar a validade do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso
em gar na determinao da potncia de soluo de digluconato de clorexidina,
foram utilizadas trs concentraes diferentes para a amostra, idnticas s da

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56

soluo padro secundrio, em delineamento 3 x 3. Estas doses esto em


progresso geomtrica (razo 3), j que o sistema utilizado possui relao linear
entre o logaritmo da concentrao da substncia testada e o dimetro dos halos de
inibio.
As diluies foram estipuladas de acordo com o tamanho do halo produzido,
sem que houvesse sobreposio dos halos e que fosse mantida a distncia entre
eles. O diluente utilizado para preparar as solues foi gua, pois em soluo
tampo fosfato pH 6,8, houve precipitao da soluo de clorexidina, devido
incompatibilidade de cargas catinicas da clorexidina com o fosfato presente na
soluo tampo. O B. subtilis mostrou-se menos sensvel clorexidina com formao
de halos menores e no reprodutveis, por isso deu-se preferncia ao S. aureus. A
concentrao do inculo utilizada, previamente padronizado em espectrofotmetro
em 580 nm com 25% 2% de transmitncia, foi 1%, porque quando se utilizou 0,5%
o crescimento de microrganismos no foi homogneo. Desta forma, padronizou-se o
ensaio com S. aureus a 1% utilizando-se gua como diluente das solues testadas.
Com os resultados obtidos foi construda a curva analtica das solues de
clorexidina com concentraes de 0,5%; 1,5% e 4,5%, apresentando coeficiente de
correlao para o padro igual a 0,9999, sendo que a equao da reta foi y =
1,3972Ln(x) + 20,26. A amostra apresentou coeficiente de correlao igual a 1,
sendo que a equao da reta foi y = 1,3942Ln(x) + 20,209. O valor obtido com os
coeficientes de correlao demonstra que o mtodo linear.
A preciso do mtodo foi obtida empregando-se 6 determinaes de
digluconato de clorexidina em soluo aquosa. O desvio padro relativo foi 2,94% e o
teor de digluconato de clorexidina determinado nas solues foi calculado pela
equao de HEWITT obtendo teor mdio de 92,58% (BRASIL, 2003). Para a soluo
de digluconato de clorexidina foi aceito como limite de variao 10%, baseado na
USP (2008), que adota como limite de variao 10% de digluconato de clorexidina em
creme oral. Por se tratar tambm de um produto no estril e de uso externo, este
valor foi utilizado como limite.
A exatido do mtodo foi comprovada pelo teste de recuperao pelo mtodo
de adio, no qual quantidades conhecidas da substncia padro secundrio foram
adicionadas s solues amostras de digluconato de clorexidina para sua
quantificao. A mdia obtida de 99,03%, demonstrou a exatido do mtodo
proposto, que outro requisito obrigatrio dos mtodos analticos (BRASIL, 2003).

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57

4.3.1.13. Concluso
Diante dos resultados encontrados, o mtodo proposto consiste de uma
tcnica simples, sem exigir grande infra-estrutura e que permite indicar a potncia do
produto uma vez que apresenta sensibilidade, linearidade, preciso e exatido
adequadas, de acordo com a F. Bras. (1998) e BRASIL (2003).

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5. DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAES DOS


SABONETES LQUIDOS CONTENDO DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA

Desenvolvimento das formulaes

59

5.1. Desenvolvimento das diferentes formulaes de sabonete lquido com


diferentes concentraes de digluconato de clorexidina
Foram desenvolvidas 4 formulaes contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de
clorexidina, totalizando 16 preparaes. Houve variao nos tensoativos utilizados
nas formulaes, a fim de verificar a atividade anti-sptica da clorexidina associada a
compostos aninicos e anfteros.
5.1.2. Material
Os materiais utilizados para preparao das diferentes formulaes de
sabonete lquido, bem como seu nome INCI, esto apresentados na Tabela 13.
Tabela 13. Materiais utilizados para as diferentes formulaes de sabonete lquido e
seus nomes na INCI
Componentes

Nome INCI

Laurilter sulfato de sdio

Sodium laureth sulfate

Cocoamidopropilbetana

Cocamidopropyl betaine

Dietanolamida de cido graxo de coco Cocamide dea


Lauroilsarcosinato de sdio

Sodium lauroyl sarcosinate

Digluconato de clorexidina

Digluconate chlorhexidine

As formulaes foram preparadas conforme apresentado nas Tabelas 14 a 17.


Tabela 14. Preparo da formulao codificada como Formulao 1
Laurilter sulfato de sdio (L.E.S.S.)

25%

Dietanolamida de cido graxo de coco (amida 90)

3%

Digluconato de clorexidina

1%, 2%, 3%, 4%

Soluo de cido ctrico a 10%


gua (q.s.p.)

qsp pH 6,0 6,5


100%

____________________________________________________________________________
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Desenvolvimento das formulaes

60

Tabela 15. Preparo da formulao codificada como Formulao 2


Laurilter sulfato de sdio (L.E.S.S.)

25%

Cocoamidopropilbetana

5%

Dietanolamida de cido graxo de coco (amida 90)

3%

Digluconato de clorexidina

1%, 2%, 3%, 4%

Soluo de cido ctrico a 10%

qsp pH 6,0 6,5

gua (q.s.p.)

100%

Tabela 16. Preparo da formulao codificada como Formulao 3


Lauroilmiristilsarcosinato de sdio (L.M.S.S.)

25%

Dietanolamida de cido graxo de coco (amida 90)

3%

Digluconato de clorexidina

1%, 2%, 3%, 4%

Soluo de cido ctrico a 10%

qsp pH 6,0 6,5

gua (q.s.p.)

100%

Tabela 17. Preparo da formulao codificada como Formulao 4


Lauroilmiristilsarcosinato de sdio (L.M.S.S.)

25%

Cocoamidopropilbetana

5%

Dietanolamida de cido graxo de coco (amida 90)

3%

Digluconato de clorexidina

1%, 2%, 3%, 4%

Soluo de cido ctrico a 10%

qsp pH 6,0 6,5

gua (q.s.p.)

100%

5.1.3. Mtodos
Foram preparados 50 g de cada formulao.
Formulao 1. L.E.S.S., amida 90, gua e soluo de digluconato de clorexidina
foram adicionados em bquer de vidro, com agitao manual com auxlio de basto
de vidro.
Como o digluconato de clorexidina est em soluo a 20%, foi necessrio
correo da concentrao, ou seja, 1% de digluconato de clorexidina corresponde a
2,5 g de soluo de digluconato de clorexidina a 20%; 2% de digluconato de
clorexidina correspondem a 5,0 g de soluo de digluconato de clorexidina a 20%; 3%
de digluconato de clorexidina correspondem a 7,5 g de soluo de digluconato de
____________________________________________________________________________
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Desenvolvimento das formulaes

61

clorexidina a 20% e 4% de digluconato de clorexidina correspondem a 10,0 g de


soluo de digluconato de clorexidina a 20%.
Formulao 2. L.E.S.S., amida 90 e gua foram adicionados em bquer de vidro,
fase (A). Em outro bquer de vidro, foram colocados cocoamidopropilbetana e a
soluo de digluconato de clorexidina (B). A fase A foi vertida sobre a fase B com
agitao manual com ajuda de basto de vidro.
Foi feita a correo da concentrao como descrito na formulao 1.
Formulao 3. L.M.S.S., amida 90, gua e a soluo de digluconato de clorexidina
foram adicionados em bquer de vidro, com agitao manual, com ajuda de basto
de vidro.
Foi realizada a correo da concentrao como descrito na formulao 1.
Formulao 4. L.M.S.S., amida 90 e gua foram adicionados em um bquer de vidro,
(A). Em outro bquer de vidro, foram colocados cocoamidopropilbetana e a soluo
de digluconato de clorexidina (B). A fase A foi vertida sobre a fase B com agitao
com auxlio de basto de vidro.
Foi realizada a correo da concentrao como descrito na formulao 1.
5.2. Anlise qualitativa das formulaes desenvolvidas
5.2.1. Aspectos fsicos
Na formulao 1, as preparaes com 1 e 2% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes, enquanto que as formulaes com 3 e 4% de
digluconato de clorexidina apresentaram-se turvas.
Na formulao 2, as preparaes com 1 e 2% de digluconato de clorexidina,
apresentaram-se transparentes, enquanto que as formulaes com 3 e 4% de
digluconato de clorexidina apresentaram-se turvas.
Na formulao 3, os sabonetes com 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes, com ausncia de turvao.
Na formulao 4, os sabonetes com 1, 2 ,3 e 4% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes com ausncia de turvao.

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Desenvolvimento das formulaes

62

5.2.1.1. Discusso
5.2.1.1.1. Formulaes
Apesar de a clorexidina ser considerada um excelente agente anti-sptico, seu
carter catinico traz ressalvas sua associao a sistemas com carter aninico
como os sabes e os detergentes sintticos. A manifestao deste tipo de interao
pode ser normalmente visualizada por uma simples turvao do sistema, at
situaes em que o sistema perde a homogeneidade e pode-se detectar visualmente
ntida precipitao. Em tais situaes, o principal questionamento diz respeito ao
poder anti-sptico. Como os sabonetes lquidos atuais so baseados em
concentraes significativas de detergentes aninicos, e considerando-se a possvel
interao do detergente com a clorexidina, a possibilidade de interao com
manifestada turvao e ou precipitao constitui-se em uma realidade que somente
pode ser contornada pelos ajustes de concentrao da clorexidina e ou pela incluso
de matrias-primas capazes de sustentarem homogeneidade do sistema e
manuteno da possvel transparncia. Os ajustes quantitativos da clorexidina
podem, do ponto de vista tcnico, ser realizados com bastante facilidade. Porm, isto
no garante a manuteno da atividade antibacteriana e antifngica.
A adio de tensoativo anftero pode contribuir para manuteno da atividade
da substncia ativa, uma vez que contribui para minimizar a interao do complexo
aninico-catinico formado entre a substncia ativa e o tensoativo utilizado, mas esta
atividade ser averiguada posteriormente no ensaio de determinao da atividade
antimicrobiana dos sabonetes lquidos preparados.
Os tensoativos sarcosinatos so agentes de limpeza com boa substantividade
para pele e cabelo, sendo usados em xampus e vrios tipos de produtos para limpeza
das mos (RIEGER, 1993).
A associao da clorexidina com o tensoativo sarcosinato pode resultar em um
complexo inativo, mas solvel no excesso de tensoativo aninico ou ento a
clorexidina permanece ativa em combinao com o sarcosinato (HART, LEVY, 1977).
5.2.1.1.2. Formulao 1
O LESS tensoativo aninico e por isso incompatvel com a clorexidina
causando a turvao no sabonete; j a dietanolamida do cido graxo de coco (amida
90) um tensoativo no inico, importante para manuteno de viscosidade,
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63

sobreengorduramento e qualidade de espuma da preparao, melhorando a


formulao. Possivelmente, o excesso de tensoativo aninico, frente baixa
concentrao de clorexidina (1% e 2%), consiga solubilizar o complexo aninicocatinico formado, fato que j no mais verificado a partir de concentraes mais
elevadas de clorexidina, como no caso de 3% e 4%, resultando em turvao (HART,
LEVY, 1977).
5.2.1.1.3. Formulao 2
Ocorrem as mesmas interaes observadas na formulao 1, entretanto a
presena de cocoamidopropilbetana, que um tensoativo anftero, permite uma
melhor compatibilidade entre a clorexidina e o LESS, o que possivelmente contribua
para manuteno de sua atividade. A turvao verificada quando se aumenta a
concentrao de clorexidina, porque o tensoativo j no mais consegue solubilizar o
complexo aninico-catinico formado (HART, LEVY, 1977).
Os detergentes anfteros so mais caros, com baixo poder de espuma e pouca
viscosidade. Portanto, se fosse preparado o sabonete lquido apenas com esta
substncia, seria obtido um produto com menos interao com a substncia ativa. No
entanto, este produto tem elevado custo, dificultando a sua projeo comercial. Desta
forma necessria, a sua associao aos detergentes aninicos que so
economicamente mais acessveis, com alta qualidade de espuma e alta reserva de
viscosidade.
5.2.1.1.4. Formulao 3
O LMSS um tensoativo aninico, que, teoricamente, tambm possibilita a
formao de complexo aninico-catinico, permitindo, porm que o sistema receba
maiores concentraes de clorexidina sem manifestao de turbidez e ou
precipitao para as concentraes propostas (HART, LEVY, 1977). Possivelmente
sua estrutura qumica consegue solubilizar tal complexo produzido, at mesmo
quando se tm concentraes mais elevadas de clorexidina e por isso no se
visualiza a turvao nesta formulao.
5.2.1.1.5. Formulao 4
As interaes so as mesmas observadas na formulao 3, mas com a adio
de cocoamidopropilbetana pode haver uma melhora ainda maior na manuteno do
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sistema, manifestado visualmente pela ausncia de turvao e, sugerindo que a


atividade anti-sptica da clorexidina seja menos prejudicada. Entretanto, se fosse
preparado o sabonete lquido apenas com esta substncia, as mesmas condies em
relao aos detergentes anfteros apresentadas na formulao 2 seriam verificadas.
5.2.2. Determinao de pH
5.2.2.1. Material e mtodo
O pH dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina foi medido
em peagmetro especificado na lista de equipamentos (p. xxvi, item 8), e para tal os
sabonetes foram diludos 1:10 em gua, por serem viscosos e no permitir a leitura
pelo eletrodo.
5.2.2.2. Resultados
O pH dos sabonetes lquidos estava entre 8,0 e 9,0. Como este valor de pH
no o ideal para clorexidina (o ideal entre 5,5 e 7,0 como foi visto no item 2.1), e
para a pele, ento foi realizada a correo do pH com soluo de cido ctrico a 10%
at que atingisse valor entre 6,0 e 6,5, que condizente com o ativo e com a pele.
5.2.3. Determinao da viscosidade
Foi verificada em viscosmetro de Brookfield, utilizando-se haste L1 para os
sabonetes das formulaes 1, 3 e 4 e haste L2 para a formulao 2, que por ser mais
viscosa e no permitiu leitura com haste L1.
5.2.3.1. Resultados
Os resultados da viscosidade obtida com os sabonetes lquidos contendo
digluconato de clorexidina esto apresentados na Tabela 18.

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Tabela 18. Valores de viscosidade obtidos com os sabonetes lquidos contendo


digluconato de clorexidina em viscosmetro de Brookfield
Amostra *

Valor de viscosidade em mili Pascal

1a

20

1b

547

1c

590

1d

499

2a

9859

2b

220

2c

219

2d

109

3a

3b

3c

38

3d

1231

4a

4b

10

4c

159

4d

1080

* Os nmeros indicam a formulao e as letras indicam a concentrao da soluo de


digluconato de clorexidina presente em cada sabonete lquido, assim, 1 formulao 1; 2
formulao 2; 3 formulao 3 e 4 formulao 4; a, b, c, d indicam a concentrao de 1, 2,
3 e 4% de digluconato de clorexidina respectivamente.

5.2.3.2. Discusso
A diferena entre as viscosidades deve-se presena da clorexidina nas
diferentes formulaes, em diferentes concentraes.
Na formulao 1, o aumento de viscosidade nas preparaes com 1% e 2% de
digluconato de clorexidina devido ao sistema micelar do tensoativo que intumesce
suas micelas, e ao adicionar maior quantidade de clorexidina, o sistema permanece
estvel porque as micelas no incham mais por j terem atingido sua estabilidade
(WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
Na formulao 2 ocorrem as mesmas interaes observadas na formulao 1,
entretanto a presena de cocoamidopropilbetana aumenta o tamanho das micelas,
favorecendo a organizao do sistema e, consequentemente, o aumento de
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Desenvolvimento das formulaes

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viscosidade (com 1% de clorexidina). A partir de concentraes mais elevadas de


substncia ativa, as micelas do componente anftero no suportam o excesso de
clorexidina e o sistema perde viscosidade (WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
Nas formulaes 3 e 4 com 1% e 2% de dilguconato de clorexidina no h
aumento considervel da viscosidade, pois as micelas ainda no incharam
suficientemente, entretanto, ao elevar a concentrao de clorexidina para 3% e 4% h
aumento da viscosidade devido ao sistema micelar do tensoativo que intumesce suas
micelas.
A viscosidade se mantm mais estvel nas formulaes 3 e 4, provavelmente
devido melhor manuteno do sistema com uso de tensoativo aninico sarcosinato,
que possibilita a formao de complexo aninico-catinico estruturalmente mais
compatvel com a clorexidina (WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
5.3. Controle microbiolgico das formulaes desenvolvidas
O objetivo deste ensaio foi avaliar a qualidade microbiolgica dos sabonetes
lquidos, bem como verificar a sua concordncia com a legislao vigente.
5.3.1. Material e mtodo
5.3.1.1. Contagem do nmero total de microrganismos viveis
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulao para 90,0 mL
de soluo tampo fosfato pH 7,2, para a contagem dos microrganismos totais. As
amostras 1:10 foram agitadas em vortex por 10 min. Aps, em placas de Petri
previamente esterilizadas, foi pipetado 1,0 mL de cada amostra 1:10 e adicionado
20,0 mL gar tioglicolato para bactrias e gar Sabouraud para leveduras,
previamente esterilizados e mantidos a 46 oC 1 C. Aps solidificao dos meios, as
placas foram colocadas em estufa a 35 C 1 oC por 48 h para a pesquisa de
bactrias e 25 C 1 oC por 7 dias para fungos. Este ensaio foi realizado em triplicata
e as placas foram incubadas em posio invertida (PINTO et al., 2003). Os meios de
cultura foram preparados como indicado no rtulo pelo fabricante.
5.3.1.2. Pesquisa de Salmonella ssp e Escherichia coli
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulao para 90,0 mL de
caldo lactosado, para pesquisa de Salmonella spp e Escherichia coli, incubados a
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35 C 1 oC durante 24 h. Aps, 1 mL do caldo lactosado foi transferido para 1 tubo


contendo caldo tetrationato e 1 tubo contendo caldo selenito cistina, e incubados a
35 C 1 oC por 24 h. Aps, a amostra foi semeada do caldo tetrationato para 1 tubo
contendo gar verde brilhante (VB) e duas placas de Petri contendo gar xilose-lisinadesoxicolato (XLD) e duas placas de Petri com gar bismuto sulfito (BS). Foi
realizado da mesma forma com a amostra inoculada no caldo selenito cistina,
transferindo para os trs meios, os quais foram incubados a 35 C 1 oC por 24 h,
sendo que as placas foram incubadas em posio invertida. As colnias suspeitas
foram semeadas com ala reta em tubo contendo gar trplice acar-ferro (TSI) e
incubado a 35 C 1 oC por 24 h. A confirmao da Salmonella spp, quando
presente, feita pela tcnica de Gram.
Na pesquisa de E. coli, 1,0 mL do caldo lactosado foi transferido para placa
contendo gar Mac Conkey e incubado a 35 C 1 oC por 24 h. As colnias suspeitas
foram semeadas em gar eosina-azul de metileno (EMB) e incubadas a 35 C 1 oC
por 24 h. A confirmao de E. coli, quando presente, feita pelo mtodo de Gram. As
placas foram incubadas em posio invertida (PINTO et al., 2003). Os meios de
cultura foram preparados como indicado no rtulo pelo fabricante.
5.3.1.3. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulao para 90 mL de
caldo soja-casena, para a pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa e incubados a 35 C 1 oC por 24 h. Aps, 1,0 mL foi semeado em placa
de Petri contendo gar Vogel Johnson (VJ), para a pesquisa de S. aureus e em placa
de Petri com gar cetrimida, para a pesquisa de P. aeruginosa a 35 C 1 oC por
24 h, sendo que as placas foram incubadas em posio invertida (PINTO et al.,
2003). Os meios de cultura foram preparados como indicado no rtulo pelo fabricante.
A confirmao das bactrias foi feita pelo mtodo de Gram.
5.3.2. Resultados
Os

resultados

obtidos

na

anlise

microbiolgicao

das

formulaes

desenvolvidas permitiram observar que no houve crescimento de microrganismos na


contagem do nmero total de bactrias e fungos e tambm no houve presena das
bactrias pesquisadas.

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68

5.3.3. Discusso
Em produtos no estreis aceitvel a presena de carga microbiana dentro
dos limites recomendados pela RDC 481 de 23 de setembro de 1999, da ANVISA,
mas com ausncia de determinadas cepas patognicas. O controle de qualidade
microbiolgico destes produtos assegura que a carga microbiana presente no
comprometa sua qualidade final, e nem coloque em risco a sade do consumidor.
Para produtos farmacuticos, o nmero total de microrganismos presentes
deve ser inferior a 102 a 103 UFC/g (mL) ou, no mximo, 5 x 102 a 5 x 103 UFC/g (mL)
de amostra e no apresentar S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli. Para
produtos cosmticos, h uma classificao, na qual produtos cosmticos tipo I (para
rea dos olhos, para bebs e para peles com acnes), o limite 102 ou, no mximo,
5 x 102 UFC/g (mL) de microrganismos totais aerbicos e no caso de talcos, ausncia
de clostrdios sulfito-redutores; e para produtos do tipo II (produtos para demais reas
do corpo), 103 ou, no mximo, 5 x 103 UFC/g (mL) de amostra. Para os dois tipos
exigida a ausncia de S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli (F. Bras.,
1988; BRASIL, 1999; PINTO et al., 2003; ANDRADE et al., 2005).
A contagem do nmero total de microrganismos foi realizada pela tcnica de
pour plate por proporcionar crescimento de microrganismos aerbios e anaerbios.

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6. ENSAIOS DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS


SABONETES LQUIDOS DESENVOLVIDOS CONTENDO
DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA

Ensaios de atividade antimicrobiana

70

O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a atividade antimicrobiana in


vitro das formulaes desenvolvidas de sabonetes lquidos contendo digluconato de
clorexidina em diferentes concentraes sobre bactrias patognicas e fungos de
importncia em sade pblica tais como Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas

aeruginosa,

Salmonella

spp,

Staphylococcus

epidermidis,

Enterococcus faecalis e Candida albicans, pois, embora a clorexidina tenha eficcia


antimicrobiana comprovada, necessrio demonstrar se tal eficcia se mantm no
produto desenvolvido, tendo em vista a possibilidade de inativao da clorexidina por
componentes da formulao.
6.1. Mtodos
6.1.1. Tcnica de difuso em gar
tambm chamada de mtodo indireto para determinao da atividade
antimicrobiana ou mtodo de Kirby e Bauer, que a desenvolveu nos anos de 1960
(TRABULSI, 1991). O potencial antimicrobiano se mostra nas reas de inibio de
crescimento, em que uma placa com gar nutriente inoculada com o
microrganismo-teste e o antimicrobiano disposto em pontos equidistantes na placa
com auxlio de discos de papel ou cilindros de ao inoxidvel ou de vidro. Aps
incubao por 24 a 48 h, se observa a formao de halo de inibio de crescimento
ao redor da substncia testada (ALCAMO, 2001; TORTORA et al., 2005).
6.1.2. Tcnica de microdiluio
Este mtodo foi validado em 1992 e constitui uma tcnica que emprega placas
de 96 poos com a transferncia seriada de 100 L entre produto a ser analisado e
caldo, totalizando 200 L de volume em cada poo entre o microrganismo a ser
testado e a concentrao do produto a ser analisado. A microplaca incubada a
36 C 1 C durante 24-48 h. Depois deste perodo, analisada visualmente e/ou
espectrofotometricamente quanto ao crescimento microbiano, atravs da turvao do
meio de cultura (KOLODZIEJ et al., 1999). Tambm pode ser realizada leitura atravs
do uso de corante. A diluio que no apresentar turvao indica a concentrao
capaz de inibir o crescimento do microrganismo teste (PELCZAR et al., 1997).

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Ensaios de atividade antimicrobiana

71

6.1.3. Microrganismos utilizados


Foram utilizados isolados de bactrias e leveduras de colees padres da
American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Instituto Adolfo Lutz (IAL) (IAL 1606), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228 IAL
2150), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 IAL 1028), Enterococcus faecalis
(ATCC 10541), Escherichia coli (ATCC 25922 IAL 2393), Salmonella spp (ATCC 19196)
e Candida albicans (ATCC 64548).
6.2. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar
6.2.1. Material e mtodo
6.2.1.1. Preparo do inculo
6.2.1.1.1. Padronizao da suspenso bacteriana
O inculo de cada bactria utilizada neste ensaio foi adaptado e padronizado de
acordo com os trabalhos realizados por Melo e colaboradores (2006), Souza e
colaboradores (2007), Alvarenga e colaboradores (2007) e segundo o documento do
NCCLS (2003). Cultura de colnias isoladas de cada bactria foi obtida em caldo BHI
por 24 horas a 35 C 1 C. Em seguida, foi transferida uma alquota deste inculo
para soluo salina estril e ento foi ajustada a turvao at o tubo 0,5 da escala
McFarland (1,5 x 108 UFC/mL).
6.2.1.1.2. Padronizao da suspenso fngica
O inculo da levedura utilizada neste ensaio foi adaptado dos trabalhos
realizados por Lima e colaboradores (2006) e por Antunes e colaboradores (2006).
Cultura de colnias isoladas de C. albicans foi obtida em caldo Sabouraud por 24 horas
a 35 C 1 C. Em seguida, foi transferida uma alquota deste inculo para soluo
salina estril e ento foi ajustada a turvao at o tubo 0,5 da escala McFarland (1,5 x
108 UFC/mL).

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Ensaios de atividade antimicrobiana

72

6.2.1.1.3. Padronizao e adaptao dos ensaios de atividade antimicrobiana dos


diferentes sabonetes lquidos contendo 1, 2, 3, e 4% de digluconato de
clorexidina, pelo mtodo de difuso em gar
Os ensaios de atividade antimicrobiana dos diferentes sabonetes lquidos
contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, pelo mtodo de difuso em gar,
foram realizados de acordo com mtodo de Kirby-Bauer, porm modificado, no qual
foram utilizados gar BHI e gar Sabouraud para bactrias e fungos, respectivamente.
Foram utilizados templates de ao inoxidvel, em que 200 L de cada sabonete foram
adicionados em cada orifcio. Foi realizado um controle adicionando 200 L de soluo
de digluconato de clorexidina a 1%, a fim de verificar se tais microrganismos so
sensveis a este anti-sptico e tambm foram adicionados 200 L de cada preparao
de sabonete lquido sem o anti-sptico, a fim de verificar se apenas o sabonete possui
alguma atividade antimicrobiana sobre os microrganismos testados.
Foram preparados, para cada placa, 20 mL de gar como camada base e 5,0 mL
de gar para camada de superfcie. Ao gar superfcie esterilizado e mantido lquido a
46 C 1 C, foram adicionados 10% do inculo previamente padronizado. Aps
solidificao, foi colocado em cada placa o template sobre o gar. Em cada orifcio foi
transferida uma alquota de cada amostra como descrito anteriormente. As placas
foram deixadas em geladeira a 8 C 1 C por 2 horas para que ocorresse difuso dos
sabonetes no gar, e impedisse o desenvolvimento microbiano. A seguir, as placas
foram incubadas por 24 horas a 35 C 1 C. Foram feitas trs placas para cada
formulao com 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, soluo de clorexidina a 1%
e sabonete sem o anti-sptico para cada microrganismo testado, totalizando 72 placas
para bactrias e 12 placas para fungo. Os resultados dos halos de inibio de
crescimento foram medidos com auxlio de paqumetro digital.
O esquema da distribuio das amostras est apresentado na Figura 14.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

73

1%

4%

2%

CHX
1%

Sab
base
3%

Figura 14. Esquema da disposio dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina,
sabonete lquido base (sem o ativo) e a soluo de digluconato de clorexidina a 1%, na placa
de Petri para o ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.

6.2.2. Resultados
A Tabela 19 apresenta os resultados obtidos no ensaio de atividade
antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

74

Tabela 19. Valores em mm dos halos de inibio de crescimento obtidos no ensaio de


atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar
dimetro dos halos de inibio (mm)
S. aureus

P. aeruginosa

E. coli

Salmonella

S. epidermidis

E. faecalis

C. albicans

spp
Sab. 1

1a

1b

1c

1d

CHX 1%

18,57 0,03

14,20 0,01

12,72 0,03

14,90 0,02

20,09 0,02

29,15 0,01

8,30 0,03

Sab. 2

2a

2b

2c

2d

CHX 1%

18,53 0,04

14,18 0,03

12,80 0,04

14,92 0,03

20,12 0,02

29,26 0,03

8,14 0,02

Sab. 3

21,32 0,03

20,24 0,03

29,24 0,03

3a

17,35 0,02

22,57 0,04

23,91 0,03

3b

15,60 0,02

16,49 0,03

18,04 0,04

3c

3d

CHX 1%

18,55 0,02

14,15 0,02

12,88 0,01

14,80 0,02

20,14 0,04

29,27 0,02

8,36 0,03

Sab. 4

21,90 0,02

16,30 0,02

19,80 0,02

28,32 0,04

4a

17,80 0,02

15,90 0,03

18,16 0,04

22,74 0,03

4b

13,60 0,03

12,60 0,02

10,65 0,03

17,10 0,04

4c

4d

CHX 1%

18,48 0,03

14,11 0,03

12,50 0,03

14,96 0,02

20,20 0,03

29,20 0,05

8,28 0,02

(Sab. 1), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina; (Sab. 2), Sabonete base, sem adio
de digluconato de clorexidina; (Sab. 3), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina, (Sab.
4), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina; (-), indica ausncia de halo de inibio;
(CHX 1%), soluo de digluconato de clorexidina a 1%; os nmeros indicam a formulao; as letras
indicam a concentrao de clorexidina, ou seja, a, 1%; b, 2%; c, 3% e d, 4% de clorexidina presente em
cada formulao. Os valores so mdias de trs determinaes.

Os resultados podem ser visualizados nas Figuras 15 a 18.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

75

1
2

Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. aureus (a) e E.
faecalis (b), em que: 1, sabonetes base e formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
2, sabonetes base e formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e
formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulao 4
contendo %1, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de digluconato de clorexidina a
1% conforme esquema apresentado na Figura 14.

Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a E. coli (c) e C. albicans (d), em
que: 1, sabonetes base e formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2, sabonetes base e e e
formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e formulao 3 contendo %,
1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de de
clorexidina e em todos h soluo de digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na
Figura 14.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

76

2
1

Figura 17. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a Salmonella spp (e)
e P. aeruginosa (f), em que: 1, sabonetes base e da formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4%
de clorexidina; 2, sabonetes base e da formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
3, sabonetes base e da formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes
base e da formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de
digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.

Figura 18. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. epidermidis (g),
em que: 1, sabonetes base e da formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2,
sabonetes base e da formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes
base e da formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e da
formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de digluconato
de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

77

6.2.3. Discusso
A escolha do produto ideal com a finalidade de impedir ou inibir o crescimento
microbiano tem sido motivo de grande preocupao entre os profissionais da sade,
especialmente, considerando a diversidade de produtos, grande oferta de mercado e
variaes de orientaes quanto s indicaes e ao uso (ANDRADE et al., 2007). Os
produtos com este objetivo devem apresentar amplo espectro de ao, menor
toxicidade, menor custo e menor indcio de resistncia bacteriana (ALVARENGA et
al., 2007). Alguns so ativos contra um grande nmero de microrganismos, enquanto
outros podem ser ativos contra poucas espcies. Entretanto, no h um
antimicrobiano ideal para todas as finalidades, por isso se faz necessrio o estudo de
vantagens e desvantagens de certo antimicrobiano em cada situao em que seu uso
se faz til (PELCZAR et al., 1997).
A clorexidina um anti-sptico com largo espectro de ao como j foi dito na
introduo deste trabalho e diversos estudos tm sido realizados a fim de verificar sua
atividade antimicrobiana (GOMES et al., 2001; SASSONE et al., 2003; ESTRELA et al.,
2004; SEABRA et al., 2005; MOREIRA, WANDERLEY-CRUZ, 2005; TANOMARU et al.,
2005; BUXBAUM et al., 2006; TANOMARU et al., 2007).
Os sabonetes foram preparados sem adio de conservantes para que no
houvesse interferncia nos resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana.
No ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar, as
formulaes 1 e 2, que contm laurilter sulfato de sdio, no apresentaram halo de
inibio de crescimento frente aos microrganismos testados, provavelmente por no
conseguirem se difundir no gar devido viscosidade destas formulaes com maiores
concentraes de clorexidina, pode ter havido interferncia entre a carga do tensoativo
e o pH do meio de cultura slido, entre a concentrao de clorexidina e o pH do meio
de cultura slido e entre o tensoativo e a clorexidina, formando um complexo aninicocatinico que impediu a difuso da clorexidina no gar.
A soluo aquosa de digluconato de clorexidina a 1% formou halo de inibio de
crescimento

demostrando

que

tal

substncia

possui

atividade

sobre

estes

microrganismos, como citado na literatura (GOMES et al., 2001; ESTRELA et al.,


2003 b; ESTRELA et al., 2004; RADEVA et al., 2005; TANOMARU et al., 2005;
BUXBAUM et al., 2006), e que em baixa concentrao neste veculo no h
interferncia com o meio de cultura slido.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

78

Para os microrganismos S. aureus, S. epidermidis e E. faecalis, as formulaes 3


e 4, que contm lauroilmiristilsarcosinato de sdio, apresentaram halos de inibio de
crescimento microbiano para o sabonete sem adio do anti-sptico, com 1 e 2% de
clorexidina, em tamanho decrescente respectivamente. Esta diminuio da atividade
inclusive em relao ao sabonete base pode ser devido ao aumento da viscosidade ao
elevar a concentrao de clorexidina e isso dificultou a difuso, ao aumento das
interaes das maiores concentraes da clorexidina com o pH do meio de cultura
slido e devido s interaes da clorexidina com o tensoativo, pois apesar de o
lauroilmiristil ser estruturalmente mais compatvel com a clorexidina, pode ser que com
as concentraes mais elevadas do ativo houve formao de complexo aninicocatinico que impediu a difuso da clorexidina no gar. Estas dificuldades podem ser a
causa de tambm no ter havido formao de halo de inibio de crescimento para os
sabonetes lquidos com 3 e 4% de clorexidina.
Frente P. aeruginosa (Figura 17 f), apenas a formulao 4 mostrou halo de
inibio de crescimento no ensaio por difuso em gar para os sabonetes base,
sabonetes com 1 e 2% de clorexidina, entretanto para o sabonete lquido contendo 2%
de ativo, o halo de inibio de crescimento foi menor, provavelmente pelo motivo do
aumento da viscosidade e das interaes destas formulaes com aumento de princpio
ativo.
Em nenhuma formulao houve formao de halo de inibio de crescimento
frente aos microrganismos E. coli, Salmonella spp e C. albicans, mas houve formao
de halo de inibio de crescimento para a soluo de digluconato de clorexidina a 1%,
evidenciando que estes microrganismos so sensveis ao anti-sptico em estudo.
Entretanto, a C. albicans mostrou halo de inibio de crescimento menor, mas de
acordo com a literatura, este microrganismo tambm sensvel clorexidina (KABARA,
1984; CANDIDO et al., 1996; FARIA et al., 2003; ESTRELA et al., 2003b; IMBERT et
al., 2003; ESTRELA et al., 2004).
O fato de ter havido formao de halo de inibio de crescimento para os
sabonetes das formulaes 3 e 4 (que contm lauroilmiristilsarcosinato de sdio) e no
ter havido halo de inibio de crescimento microbiano para os sabonetes das
formulaes 1 e 2 (que contm laurilter sulfato de sdio), pode ser porque o tensoativo
sarcosinato apresentou menor interao com o meio de cultura slido e melhor
atividade antimicrobiana em relao ao laurilter, uma vez que Balsam e colaboradores
(1972), relatam a reduo de 20 a 30% na incidncia de cries quando os indivduos
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

79

utilizaram dentifrcios contendo 2% de lauroilmiristilsarcosinato de sdio em relao ao


grupo controle com outros dentifrcios.
O excesso de clorexidina eleva o custo do produto, eleva o risco de toxicidade ao
paciente e eleva o risco de desenvolvimento de resistncia bacteriana. Thomas e
colaboradores (2000) mencionam que uma maneira de haver resistncia clorexidina
o modo como usada, por exemplo, clorexidina a 4% geralmente especificado, mas
aps o uso, uma concentrao residual pode permanecer abaixo da concentrao
inibitria mnima para algumas bactrias, que podem desenvolver resistncia.
Os microrganismos mais sensveis aos sabonetes foram S. aureus, S.
epidermidis e E. faecalis, enquanto que os mais resistentes foram Salmonella spp, E.
coli e P. aeruginosa, dados que corroboram com a literatura, que diz que a clorexidina
mais ativa frente a microrganismos Gram-positivos e menos ativa frente a
microrganismos Gram-negativos (HENESSEY, 1973; SILVA et al., 2000; SILVA,
JORGE, 2002; ESTRELA et al., 2003a).
Com a finalidade de facilitar a difuso dos sabonetes no gar, foi adicionado 1%
e 2% de dimetilsulfxido (DMSO) aos sabonetes, entretanto os resultados obtidos no
demonstraram alterao nos valores dos halos de inibio microbiana encontrados.
6.2.4. Concluso
Diante dos resultados, a tcnica de difuso em gar foi ineficaz para analisar as
formulaes pelo fato de a difuso no gar ter sido prejudicada pela viscosidade, pelas
possveis interaes entre o tensoativo e o meio de cultura, entre o excesso de
clorexidina e o pH do meio de cultura e entre a clorexidina e o tensoativo. O resultado
apresentado pode ser falso negativo, sendo que a ausncia de formao de halo de
inibio de crescimento pode ser devido dificuldade de difuso dos produtos no gar
e no devido realmente falta de atividade dos produtos em anlise.
Os halos de inibio de crescimento microbiano apresentados pelas formulaes
3 e 4 so devido ao tensoativo sarcosinato que interagiu menos com o meio de cultura
slido e possui atividade antimicrobiana superior do tensoativo laurilter, pois ao
adicionar maior quantidade de clorexidina, houve diminuio do tamanho dos halos de
inibio de crescimento por causa da interao da clorexidina com o meio de cultura
slido e com o tensoativo sarcosinato.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

80

6.3. Determinao da atividade antimicrobiana dos sabonetes lquidos


desenvolvidos contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, pelo mtodo
da microdiluio em caldo
Este ensaio foi realizado no laboratrio de Fisiologia de microrganismos da
Universidade Estadual Paulista (UNESP) com a colaborao da Prof. Dra. Tas
Maria Bauab.
6.3.1. Preparo do inculo
6.3.1.1. Padronizao da suspenso bacteriana
Foi realizada de acordo com o documento do NCCLS (2003) em que cultura de
colnias isoladas de cada bactria foi obtida em caldo BHI por 24 horas a 35 C 1 C.
Em seguida, foi transferida uma alquota deste inculo para soluo salina estril e a
turvao foi ajustada at 0,5 da escala McFarland (1,5 x 108 UFC/mL).
6.3.1.2. Padronizao da suspenso fngica
Foi realizada segundo o documento do NCCLS (2002), em que uma subcultura
de Candida albicans em tubo de ensaio contendo gar Sabouraud dextrose foi
incubada a 35 C 1 C durante 24 horas. Em seguida, foram transferidas 5 colnias
com dimetro de aproximadamente 1 mm para 5 mL de soluo salina estril. Os
tubos foram agitados em vrtex e a densidade foi ajustada em espectrofotmetro em
530 nm, at que se obtivesse transmitncia equivalente a 0,5 da escala McFarland
(1,5 x 108 clulas/mL). Logo aps, foi feita diluio 1:100 em caldo Sabouraud. Foi
feita uma segunda diluio, sendo 1:20, tambm em caldo Sabouraud, resultando em
concentrao de 5 x 102 a 25 x 102 clulas/mL.
6.3.1.3. Padronizao e adaptao dos testes de verificao da atividade
antimicrobiana dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina,
atravs do mtodo da microdiluio
Em placa de 96 poos com fundos chatos, foram pipetados 150 L de
sabonete puro (sem adio de clorexidina) em dois poos (A1, A2); 150 L de
sabonete com 1% de clorexidina em dois poos (B1, B2); 150 L de sabonete com
2% de clorexidina em dois poos (C1, C2); 150 L de sabonete com 3% de
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Ensaios de atividade antimicrobiana

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clorexidina em dois poos (D1, D2); 150 L de sabonete com 4% de clorexidina em


dois poos (E1, E2); 150 L de meio de cultura caldo BHI em dois poos (F1, F2); 100
L de meio de cultura caldo BHI e 50 L de suspenso bacteriana em soluo salina
em dois poos (G1, G2); 100 L de soluo de digluconato de clorexidina a 1% e 50
L de suspenso bacteriana em soluo salina em dois poos (H1, H2); 100 L de
meio de cultura caldo BHI e 50 L de sabonete sem clorexidina em dois poos (A3,
B3); 100 L de meio de cultura caldo BHI e 50 L de sabonete com 1% de clorexidina
em dois poos (C3, D3); 100 L de meio de cultura caldo BHI e 50 L de sabonete
com 2% de clorexidina em dois poos (E3, F3); 100 L de meio de cultura caldo BHI e
50 L de sabonete com 3% de clorexidina no poo G3; 100 L de meio de cultura
caldo BHI e 50 L de sabonete com 4% de clorexidina no poo H3. Foram pipetados
90 L de meio de cultura e 10 L de sabonete com 1% de clorexidina em dois poos
(A4 e B4) e a partir desses poos foi realizada diluio seriada 1:10 at os poos
(A12 e B12), colocando em seguida 50 L de suspenso bacteriana em soluo
salina. Foram pipetados 90 L de meio de cultura e 10 L de sabonete com 2% de
clorexidina em dois poos (C4 e D4) e a partir disso foi realizada diluio seriada 1:10
at os poos C12 e D12, colocando em seguida 50 L de suspenso bacteriana em
soluo salina. Nos poos E4 e F4, foram pipetados 90 L de meio de cultura e 10 L
de sabonete com 3% de clorexidina e a partir disso foi realizada diluio seriada 1:10
at os poos E12 e F12, colocando em seguida 50 L de suspenso bacteriana em
soluo salina. Foram pipetados 90 L de meio de cultura e 10 L de sabonete com
4% de clorexidina em dois poos (G4 e H4) e a partir disso foi realizada diluio
seriada 1:10 at os poos G12 e H12, colocando em seguida 50 L de suspenso
bacteriana em soluo salina. Foi procedida a incubao a 35 C 1 C por 24 horas.
A esquematizao do procedimento para a distribuio das amostras encontra-se
apresentada na Figura 19.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

82

10

11

12

A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 19. Esquema da realizao do ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de microdiluio
150 L de sabonete lquido sem clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 1% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 2% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 3% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 4% de clorexidina (controle negativo)
150 L de caldo BHI (controle negativo)
100 L de caldo BHI e 50 L de microrganismo (controle positivo)
100 L de soluo de clorexidina a 1% e 50 L de microrganismo
100 L de sabonete lquido sem clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 1% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 2% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 3% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 4% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 1% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 2% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 3% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 4% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo

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Ensaios de atividade antimicrobiana

83

Para a levedura C. albicans, foi realizado o mesmo procedimento, no entanto,


o meio de cultura empregado foi caldo Sabouraud.
A Tabela 20 apresenta a diluio feita para os sabonetes lquidos no ensaio de
atividade antimicrobiana em meio lquido microdiluio.
Tabela 20. Diluies utilizadas para os sabonetes lquidos no ensaio de atividade
antimicrobiana em meio lquido pelo mtodo da microdiluio
AMOSTRAS

DILUIES DECRESCENTE DAS FORMULAES


1

Sab. 1 *

1 1 x10-1 1 x10-2 1 x10-3 1 x10-4 1 x10-5 1 x10-5 1 x10-7 1 x10-8

Sab. 2 **

2 2 x10-1 2 x10-2 2 x10-3 2 x10-4 2 x10-5 2 x10-6 2 x10-7 2 x10-8

Sab. 3 ***

3 3 x10-1 3 x10-2 3 x10-3 3 x10-4 3 x10-5 3 x10-6 3 x10-7 3 x10-8

Sab. 4 ****

4 10-1

4 x10-2 4 x10-3 4 x10-4 4 x10-5 4 x10-6 4 x10-7 4 x10-8

(*) Sabonete com 1% de digluconato de clorexidina; (**) sabonete com 2% de digluconato de


clorexidina; (***) sabonete com 3% de digluconato de clorexidina; (****) sabonete com 4% de
digluconato de clorexidina

6.3.1.4. Leituras
Depois de 24 horas de incubao, foram realizadas leituras visuais, antes e
aps a adio de corante resazurina.
Aps a leitura visual, foi realizada subcultura de cada poo da microplaca em
placas de Petri contendo gar BHI, por meio de hastes estreis. As placas foram
incubadas por 24 horas a 35 C 1 C, a fim de determinar se a concentrao
inibitria mnima (CIM) apresentou efeito bactericida ou bacteriosttico.
A resazurina, um corante (fenoxazin-3-ona) indicador de xido-reduo, tem
sido empregada para avaliar a viabilidade bacteriana, (PALOMINO et al., 2002;
MONTEJANO et al., 2005).
A soluo de resazurina foi preparada na concentrao de 0,1 g/mL de gua
destilada estril. Em todos os orifcios da microplaca, foram adicionados 30 L de
corante. Aps leitura visual, a microplaca foi reincubada a 35 C 1 C por 2 horas,
mantendo-as at 24 h para confirmao dos resultados. Em seguida, foi realizada
leitura visual final.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

84

A manuteno de cor azul nos orifcios foi interpretada como ausncia do


crescimento microbiano e o desenvolvimento de cor rosa, como presena de clulas
viveis em crescimento. A CIM foi definida como a menor concentrao do sabonete
lquido capaz de inibir o crescimento de 90% das cepas, ou seja, a menor
concentrao do sabonete capaz de impedir a mudana de cor azul para rosa
(ALVES et al., 2008)
6.3.2. Resultados
Os resultados encontrados para o ensaio de atividade antimicrobiana em meio
lquido pela tcnica de microdiluio em caldo, aps a realizao de subcultura em
placas de Petri contendo gar BHI podem ser vistos nas Tabelas 21 a 36.
Tabela 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da
formulao 1 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

++

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

85

Tabela 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Microrganismos

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 3 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

++

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

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Tabela 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 4 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

++

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

++

++

++

++

++

++

++

Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 1 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos

-1

-2

2x10-3 2x10-4 2x10-5 2x10-6 2x10-7 2x10-8

2x10

2x10

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

++

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

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Tabela 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 2 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
2

Microrganismos

2x10-1 2x10-2 2x10-3 2x10-4 2x10-5 2x10-6 2x10-7 2x10-8

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

++

++

++

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 3 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
2x10-1 2x10-2 2x10-3 2x10-4 2x10-5 2x10-6 2x10-7 2x10-8

Microrganismos

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

E. coli

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

88

Tabela 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 4 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
2x10-1 2x10-2 2x10-3 2x10-4 2x10-5 2x10-6 2x10-7 2x10-8

Microrganismos

P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

++

++

++

++

++

C. albicans

++

++

++

++

++

++

++

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 1 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos

3x10-1 3x10-2 3x10-3 3x10-4 3x10-5 3x10-6 3x10-7 3x10-8

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

E. coli

E. faecalis

C. albicans

P. aeruginosa

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

89

Tabela 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 2 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos

3x10-1 3x10-2 3x10-3 3x10-4 3x10-5 3x10-6 3x10-7 3x10-8

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

++

++

C. albicans

P. aeruginosa
S. aureus

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
3x10-1 3x10-2 3x10-3 3x10-4 3x10-5 3x10-6 3x10-7 3x10-8

Microrganismos

P. aeruginosa

S. aureus

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

E. faecalis

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

90

Tabela 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 4 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
3x10-1 3x10-2 3x10-3 3x10-4 3x10-5 3x10-6 3x10-7 3x10-8

Microrganismos

P. aeruginosa

S. aureus

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

E. faecalis

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 1 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos 4 4x10-1 4x10-2 4x10-3 4x10-4 4x10-5 4x10-6 4x10-7 4x10-8
P. aeruginosa

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

E. coli

E. faecalis

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

91

Tabela 34. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 2 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos

4x10-1 4x10-2 4x10-3 4x10-4 4x10-5 4x10-6 4x10-7 4x10-8

++

++

++

++

++

++

++

++

++

S. aureus

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

++

++

++

S. epidermidis

++

++

++

E. coli

++

++

++

++

++

E. faecalis

++

++

C. albicans

P. aeruginosa

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

Tabela 35. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 3 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos 4 4x10-1 4x10-2 4x10-3 4x10-4 4x10-5 4x10-6 4x10-7 4x10-8
P. aeruginosa

++

++

++

++

S. aureus

++

++

++

Salmonella spp

++

++

++

++

++

S. epidermidis

E. coli

E. faecalis

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

92

Tabela 36. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido do sabonete lquido da


formulao 4 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAES (%)
Microrganismos 4 4x10-1 4x10-2 4x10-3 4x10-4 4x10-5 4x10-6 4x10-7 4x10-8
P. aeruginosa

S. aureus

Salmonella spp

S. epidermidis

E. coli

E. faecalis

C. albicans

(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.

As Figuras 20 a 33 ilustram os resultados do ensaio de atividade


antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio, para os sabonetes lquidos
contendo digluconato de clorexidina. A permanncia de cor azul nos orifcios indica
ausncia de crescimento microbiano e o desenvolvimento de cor rosa, presena de
crescimento.

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93

Figura 20. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando P. aeruginosa. A1, A2, contm
sabonete sem clorexidina; B1, B2, sabonete com 1% de clorexidina; C1, C2, sabonete com 2% de
clorexidina; D1, D2, sabonete com 3% de clorexidina; E1, E2, sabonete com 4% de clorexidina; F1, F2,
meio de cultura; G1, G2, controle positivo; H1 e H2, soluo de clorexidina a 1% e microrganismo; A3,
B3, sabonete sem clorexidina e meio de cultura; C3, D3, sabonete com 1% de clorexidina e meio de
cultura; E3, F3, sabonete com 2% de clorexidina; G3, sabonete com 3% de clorexidina e meio de
cultura; H3, sabonete com 4% de clorexidina e meio de cultura. A4, B4, sabonete com 1% de
clorexidina, meio de cultura e microrganismo e nos demais poos destas fileiras, as diluies seriadas
1:10 do sabonete, meio de cultura e microrganismo; C4, D4, sabonete com 2% de clorexidina, meio de
cultura e microrganismo e nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete,
meio de cultura e microrganismo; E4, F4, sabonete com 3% de clorexidina, meio de cultura e
microrganismo e nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete, meio de
cultura e microrganismo; G4, H4, sabonete com 4% de clorexidina, meio de cultura e microrganismo e
nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete, meio de cultura e
microrganismo.

Figura 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando P. aeruginosa. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

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Figura 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. aureus. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.

Figura 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. aureus. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.

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Figura 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando Salmonella spp. A
distribuio dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 19, entretanto,
houve uma modificao em G1 e G2, que contm soluo de clorexidina a 1%, meio de
cultura e microrganismo e em H1 e H2, que contm meio de cultura e microrganismo.

Figura 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando Salmonella spp. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

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Figura 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. epidermidis. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

Figura 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. epidermidis. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

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97

Figura 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. faecalis. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

Figura 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. faecalis. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

98

Figura 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. coli. A distribuio dos
sabonetes e das diluies dos sabonetes igual apresentada na Figura 24.

Figura 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. coli. A distribuio dos
sabonetes e das diluies dos sabonetes igual apresentada na Figura 24.

Para o ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido frente a C. albicans,


a colorao amarela indica crescimento microbiano, enquanto que colorao marrom,
indica ausncia de crescimento microbiano.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

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Figura 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando C. albicans. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

Figura 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando C. albicans. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.

6.3.3. Discusso
A determinao da CIM um mtodo quantitativo que analisa a menor
concentrao do composto testado capaz de inibir o crescimento visvel do
microrganismo em estudo. A concentrao bactericida mnima (CBM) e concentrao
fungicida mnima (CFM), tambm so mtodos quantitativos em que se analisa a
menor concentrao do composto testado capaz de matar 99,9% da populao
bacteriana e fngica, respectivamente (COLLINS, LYNE, 2004).

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Ensaios de atividade antimicrobiana

100

Os valores de CIM para os sabonetes lquidos esto apresentados na Tabela


37.
Tabela 37. Valores de CIM encontrados para os sabonetes lquidos desenvolvidos
com as diferentes concentraes de digluconato de clorexidina

Formulaes*
1a

Microrganismo / concentrao da formulao (%)


S.
Salmonella
S.
E. coli
E.

P.
aeruginosa
-

aureus
1

spp

epidermidis
-3

10

-8

2x10

-8

3x10

-4

-6

3x10

-6

2x10

1c

3x10

1d

4x10

4x10

4x10

2a

10

-8

-8

2x10

-5

3x10

2b

2x10

2c

3x10

-7

-8
-5
-5

2d

4x10

4x10

3a

10

-3

10

3b

2x10

-4

2x10

3c

3x10

-8

3x10

3d

-8

3x10

4x10

-4

4x10

4a

10

4b

2x10

4c

3x10

4d

4x10

-4

-3

-3

2x10

-8

3x10

-4

3x10

-8

4x10

-8

-3

-4

4x10

3x10

-8

3x10

4x10

-8

4x10

-8

4x10

2x10

-4

3x10

-3

-8
-8

-8

-4

3x10

-6

-8

4x10

4x10

10

-8

-5

-8

2x10

-8

3x10

4x10

-8

-8

2x10

-8

3x10

-4

4x10

4x10

-8

4x10

-8

-6

2x10

-8

2x10

3x10

10

-2

2x10

-8

10

albicans

-2

2x10

4x10

-1

-2

-6

4x10

-3

10

2x10

-1

faecalis
-1

-3

1b

C.

-6

-8

3x10

-8

4x10

-8

4x10

10

2x10

-8

-1
-1

-8

3x10

-8

3x10

-4

4x10

-8

-4

4x10

-4

* Os nmeros indicam a formulao e as letras indicam a concentrao da soluo de


digluconato de clorexidina presente em cada sabonete lquido, assim, 1 formulao 1; 2
formulao 2; 3 formulao 3 e 4 formulao 4; a indica 1% de digluconato de clorexidina;
b, 2% de digluconato de clorexidina; c, 3% de digluconato de clorexidina e d, 4% de
digluconato de clorexidina; (-) ausncia de atividade antimicrobiana

A CIM, com efeito bactericida da formulao 1 com 1% de clorexidina para S.


aureus foi 1%; para S. epidermidis a CIM da formulao 1 com 1% de clorexidina foi
1 x 10-3%, com efeito bacteriosttico; contra E. faecalis, a CIM foi 1 x 10-1% com efeito
bacteriosttico; contra E. coli, a CIM foi 1 x 10-1% com ao bacteriosttica; diante da
Salmonella spp, P. aeruginosa e C. albicans, esta formulao no apresentou
nenhuma atividade.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

101

Para o sabonete 1 com 2% de clorexidina, diante de S. aureus, a CIM com


efeito bacteriosttico, foi 2 x 10-8%; contra S. epidermidis a CIM foi 2 x 10-3% com
efeito bactericida; contra E. faecalis a CIM foi 2 x 10-1 com ao bacteriosttica e
contra E. coli, a CIM foi 2 x 10-2%, com ao bactericida; diante da C. albicans, a CIM
foi 2 x 10-8%, com efeito bacteriosttico; frente Salmonella spp e P. aeruginosa, no
houve atividade alguma.
Quando o sabonete lquido continha 3% de clorexidina, a CIM com ao
bactericida foi 3 x 10-8% contra S. aureus, E. coli e C. albicans; contra S. epidermidis,
a CIM com efeito bactericida foi 3 x 10-6%; contra E. faecalis, a CIM foi 3 x 10-8%, com
efeito bacteriosttico; contra Salmonella spp, a CIM foi 3% com efeito bactericida e
para P. aeruginosa, no houve atividade.
Para o sabonete desta formulao com 4% de ativo, a CIM com efeito
bactericida, foi 4 x 10-3% contra S. aureus; contra S. epidermidis foi 4 x 10-6%, com
efeito bactericida, contra P. aeruginosa a CIM foi 4 x 10-1%, ao bactericida; contra
E. faecalis, E. coli e C. albicans a CIM foi 4 x 10-8%, com efeito bactericida, contra
Salmonella spp, a CIM foi 4%, com ao bactericida.
Em relao formulao 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina a CIM
para S. epidermidis foi 1 x 10-8%, com efeito bacteriosttico, entretanto, para os
demais microrganismos no apresentou nenhuma atividade antimicrobiana.
O sabonete desta formulao contendo 2% de clorexidina mostrou-se
novamente bacteriosttico para S. aureus, S. epidermidis e C. albicans com CIM de
2 x 10-8%; contra E. faecalis e E. coli, a CIM foi 2%, com ao bactericida; para os
demais microrganismos no apresentou atividade.
Com 3% de ativo, a CIM contra S. aureus e S. epidermidis foi 3 x 10-5%, com
ao bactericida; contra E. faecalis, a CIM foi 3 x 10-4% com ao bacteriosttica;
contra E. coli, a CIM foi 3 x 10-3%, com ao bacteriosttica; diante dos demais
microrganismos no houve atividade.
Com 4% de digluconato de clorexidina, a CIM contra S. aureus foi 4 x 10-7%,
com ao bactericida; contra S. epidermidis a CIM foi 4 x 10-5%, com ao
bacteriosttica; contra Salmonella spp, a CIM foi 4%, com ao bactericida; contra E.
faecalis, a CIM foi 4 x 10-6%, com efeito bacteriosttico; contra E. coli, a CIM com
ao bactericida, foi 4 x 10-3%; contra C. albicans, a CIM foi 4 x 10-8%, com ao
bacteriosttica e para P. aeruginosa no houve atividade.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

102

Esses dados ressaltam que no ensaio de atividade antimicrobiana por difuso


em gar no houve formao de halo de inibio de crescimento para as formulaes
1 e 2 contra nenhum microrganismo analisado devido viscosidade dos sabonetes
destas formulaes, s possveis interaes ocorridas entre o tensoativo laurilter e o
meio de cultura slido, entre o excesso de clorexidina e o pH do meio de cultura
slido e entre o tensoativo laurilter e a clorexidina com a formao do complexo
aninico-catinico que dificultou a difuso da clorexidina no gar. Entretanto, este
complexo no impediu que a clorexidina apresentasse ao antimicrobiana frente aos
microrganismos testados pela tcnica da microdiluio em caldo.
A presena do tensoativo anftero cocoamidopropil betana na formulao 2
no contribuiu para diminuio das interaes entre a clorexidina e o tensoativo
laurilter, fato observado por no haver melhora significativa da atividade
antimicrobiana desta formulao em relao formulao 1, quando comparadas na
mesma concentrao pelo mtodo da microdiluio em caldo e tambm no houve
mudana dos aspectos fsicos destas formulaes.
Foi observado tambm que, ao elevar a concentrao da clorexidina nestas
formulaes houve melhora da atividade antimicrobiana pelo mtodo da microdiluio
em caldo, ao contrrio do que aconteceu no teste de atividade antimicrobiana pelo
mtodo da difuso em gar.
Para a formulao 3 com 1% de digluconato de clorexidina a CIM para S.
aureus foi 1 x 10-3%, com ao bactericida; para S. epidermidis, a CIM foi 1 x 10-3%
com efeito bacteriosttico; contra P. aeruginosa, a CIM foi 1%, com ao
bacteriosttica; contra C. albicans, a CIM foi 1 x 10-8% com ao bacteriosttica e
para os demais microrganismos no foi observada nenhuma atividade.
Com 2% de ativo, o sabonete lquido teve CIM de 2% com ao bactericida
contra P. aeruginosa; contra S. aureus, a CIM foi 2 x 10-4% com ao bactericida;
contra S. epidermidis, a CIM foi 2 x 10-6%, com ao bactericida; contra E. coli a CIM
foi 2 x 10-5%, com ao bacteriosttica, contra C. albicans a CIM foi 2 x 10-8% com
ao bactericida e para os demais microrganismos testados no houve atividade.
Com 3% de clorexidina, o sabonete lquido desta formulao apresentou CIM
de 3 x 10-8% com ao bactericida contra S. aureus, E. coli, S. epidermidis, C.
albicans e E. faecalis; contra P. aeruginosa, a CIM foi 3 x 10-8%, com ao
bacteriosttica e para Salmonella spp no houve atividade.

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Ensaios de atividade antimicrobiana

103

O sabonete lquido com 4% de clorexidina mostrou CIM de 4 x 10-4% com ao


bacteriosttica contra P. aeruginosa; CIM de 4 x 10-4%, com ao bactericida contra
S. aureus; contra Salmonella, a CIM foi 4 x 10-3% com ao bactericida; contra S.
epidermidis, E. faecalis, E. coli e C. albicans, a CIM foi 4 x 10-8%, com ao
bactericida.
Em relao formulao 4, o sabonete lquido com 1% de clorexidina contra S.
aureus mostrou CIM de 1 x 10-3%, com ao bactericida; contra S. epidermidis a CIM
foi 1 x 10-3%, com ao bacteriosttica; contra C. albicans, a CIM foi 1 x 10-2%, com
ao bacteriosttica e para os demais microrganismos, no houve ao. O sabonete
lquido com 2% de digluconato de clorexidina, apresentou CIM de 2 x 10-1% com ao
bacteriosttica contra P. aeruginosa; CIM de 2 x 10-6% com ao bactericida contra S.
aureus; contra S. epidermidis, a CIM foi 2 x 10-8% com ao bactericida; contra E.
coli, a CIM foi 2 x 10-6% com efeito bacteriosttico, contra C. albicans, a CIM com
ao bacteriosttica, foi 2 x 10-1% e para os demais microrganismos testados no
houve atividade.
Com 3% de ativo, o sabonete lquido apresentou CIM de 3 x 10-4% com ao
bacteriosttica contra P. aeruginosa; contra E. faecalis, S. aureus, S. epidermidis, E.
coli e C. albicans, a CIM com ao bactericida, foi 3 x 10-8% e diante da Salmonella
spp, no houve atividade.
Com 4% de clorexidina, o sabonete desta formulao mostrou CIM com ao
bacteriosttica de 4 x 10-8% contra P. aeruginosa; contra S. aureus, Salmonella spp,
S. epidermidis, E. faecalis, E. coli e C. albicans, a CIM foi 4 x 10-8% com ao
bactericida.
Diante dos resultados obtidos nos ensaios de atividade antimicrobiana em
meio lquido e por difuso em gar, as formulaes 3 e 4 apresentaram melhores
resultados.
Foi possvel notar pelo ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido, que
com aumento da concentrao da clorexidina, obtm-se melhores resultados de
atividade antimicrobiana, diferentemente do ensaio de difuso em gar, que, com
aumento da concentrao da clorexidina no sabonete, houve diminuio do tamanho
do halo de inibio de crescimento. Portanto, ao elevar a concentrao de clorexidina,
no h aumento de interao com o meio de cultura lquido, ao contrrio do que
ocorreu com o meio de cultura slido e que os resultdos encontrados podem ser
realmente falso-negativos. Alm disso, o tensoativo sarcosinato pode ter interagido
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

104

menos com o meio de cultura lquido, resultando em melhora de atividade


antimicrobiana.
A presena do tensoativo anftero cocoamidopropil betana na formulao 4
no contribuiu para diminuio das interaes entre a clorexidina e o tensoativo
sarcosinato, fato observado por no haver melhora significativa da atividade
antimicrobiana desta formulao em relao formulao 3, quando comparadas na
mesma concentrao pelo mtodo da microdiluio em caldo e tambm no houve
mudana dos aspectos fsicos destas formulaes.
Confirmando os resultados encontrados no ensaio de atividade antimicrobiana
por difuso em gar, os microrganismos Gram-positivos foram mais sensveis
clorexidina, enquanto que os Gram-negativos foram mais resistentes. Neste ensaio, a
C. albicans tambm se mostrou sensvel. Entretanto, em trabalho realizado por
Bambace e colaboradores (2003), utilizando soluo aquosa de clorexidina a 0,5%;
1%; 2%; 3% e 4% comparando sua eficcia com a do lcool 70% gel e lquido para
limpeza de superfcies em consultrio odontolgico, constatou que P. aeruginosa foi
sensvel soluo de clorexidina em todas as concentraes testadas.
O mtodo de microdiluio apresentou vantagem em relao ao mtodo de
difuso em gar, uma vez que empregou menor quantidade de meio de cultura,
houve facilidade de manuseio, permitiu anlise qualitativa e quantitativa e tambm
permitiu avaliar melhor as formulaes em estudo, pois a viscosidade das amostras e
as interaes com o meio de cultura lquido no interferiram nos resultados de
atividade antimicrobiana. Entretanto, apresentou-se inconveniente para leitura visual,
pois em algumas vezes a turvao encontrada era causada pela prpria formulao
em contato com o meio de cultura e, no pela presena de crescimento microbiano,
no entanto, esta dificuldade foi sanada ao realizar a subcultura em placas de Petri
contendo meio de cultura gar BHI e gar Sabouraud e com a adio do corante
resazurina.
6.3.4. Concluso
Diante dos resultados obtidos, necessrio o emprego de mais de uma tcnica
para avaliar o potencial antimicrobiano de determinado produto ou formulao. Para
os produtos viscosos e que podem interagir com o meio de cultura slido, deve-se dar
preferncia ao mtodo de diluio em caldo.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

105

Em relao s formulaes, os resultados do ensaio de atividade


antimicrobiana pelo mtodo de diluio em caldo, demostraram que as formulaes 1
e 2 (com laurilter sulfato de sdio) possuem atividade antimicrobiana frente aos
microrganismos

Gram-positivos

testados

houve

melhora

da

atividade

antimicrobiana com o aumento da concentrao de clorexidina nas formulaes,


demonstrando que a incompatibilidade entre o tensoativo aninico e a clorexidina
apenas do ponto de vista tcnico, uma vez que h turvao e precipitao destas
formulaes.
Foi realizado o mesmo ensaio com o sabonete sem adio de clorexidina, que
demonstrou atividade antimicrobiana apenas quando no foi diludo, portanto, a
atividade apresentada pelos sabonetes contendo o ativo, refere-se mesmo
clorexidina.
Diante dos microrganismos Gram-negativos, estas formulaes apresentaram
melhores resultados frente E. coli. Esta atividade deveu-se presena de
clorexidina, pois o sabonete sem o ativo apresentou atividade apenas quando no
estava diludo. Em relao aos outros microrganismos Gram-negativos, no houve
atividade antimicrobiana.
Quanto s formulaes 3 e 4 (com lauroilmiristilsarcosinato de sdio), os
microrganismos Gram-positivos novamente demonstraram maior susceptibilidade. A
atividade devido presena de clorexidina, comprovada uma vez que no teste
realizado apenas com os sabonetes, houve atividade na amostra no diluda e na
primeira diluio. Quando obteve-se a diluio 10-3,

o efeito foi bacteriosttico,

entretanto estes resultados corroboram com a literatura, que diz que o


lauroilmiristilsarcosinato de sdio possui atividade antimicrobiana superior ao
laurilter sulfato de sdio. Diante dos microrganismos Gram-negativos, apenas a E.
coli apresentou atividade satisfatria.
Assim como nas formulaes 1 e 2, o aumento da concentrao da clorexidina
nas formulaes 3 e 4 melhorou a atividade antimicrobiana pelo mtodo de diluio
em caldo.
Foi observado que houve maior interao das quatro formulaes com o meio
de cultura slido e quando utilizou maior concentrao de clorexidina nas
formulaes. A presena do tensoativo anftero cocoamidopropil betana nas
formulaes 2 e 4 no melhorou a atividade antimicrobiana e os aspetos fsicos em
relao s formulaes 1 e 2 respectivamente.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Ensaios de atividade antimicrobiana

106

Foi observado que a formulao 3 com 3% de clorexidina apresentou resultado


semelhante em relao mesma formulao com 4% de ativo, diferindo apenas
quanto Salmonella spp que apresentou efeito bactericida na diluio de 4 x 10-3%,
enquanto que com o sabonete com 3% no houve atividade; quanto P. aeruginosa,
que, com 3% de clorexidina houve efeito bacteriosttico em todas as diluies e com
4% de clorexidina houve efeito bacteriosttico at a diluio de 4 x 10-3% e ao S.
aureus que com 3% de clorexidina houve ao bactericida em todas as diuies e
com 4%, foi bactericida at a diluio de 4 x 10-4%.
Quanto formulao 4, com 4% de clorexidina, o sabonete mostrou melhor
atividade em relao P. aeruginosa, pois foi bacteriosttico em todas as
concentraes analisadas e com 3% de clorexidina foi bacteriosttico at a diluio
3 x 10-4%. Quanto Salmonella spp, a formulao 4, com 4% de ativo, foi bactericida
em todas as diluies analisadas e com 3% de ativo, no mostrou atividade
antimicrobiana.
A formulao 3 com 3% de clorexidina foi considerada, do ponto de vista
microbiolgico, mais ativa, uma vez que contm menor quantidade de anti-sptico em
relao s formulaes 3 e 4 com 4% de clorexidina e foi observado resultado
semelhante a estas preparaes, porm, com atividade superior quela apresentada
pelas formulaes 1, 2, 3 e 4 com 1% e 2% de clorexidina. Ao levar em conta os
fatores econmicos, ambientais e risco de efeitos indesejveis pelo consumidor como
irritao, alergia e desenvolvimento de resistncia, esta formulao foi escolhida para
dar continuidade s anlises realizadas neste trabalho.

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Flvia Anglica Msquio Fiorentino

7.TESTE DE EFICCIA DE ATIVIDADE


ANTIMICROBIANA

108

Teste de eficcia

O objetivo deste estudo foi realizar o teste desafio do sabonete lquido


contendo

3%

de

digluconato

de

clorexidina,

frente

culturas

puras

de

microrganismos, a fim de verificar com que velocidade o sabonete capaz de matar


os microrganismos empregados e se esta velocidade suficiente para que o produto
seja aceito pelos critrios farmacopicos do teste.
7.1. Microrganismos utilizados
Foram utilizados isolados de bactrias, fungo e levedura de colees padres
da American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus (ATCC 25923
IAL 1606), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 IAL 1028), Escherichia coli
(ATCC 25922 IAL 2393), Candida albicans (ATCC 64548) e Aspergillus niger (ATCC
16404).
7.2. Conservao dos microrganismos-teste
Cada uma das bactrias foi repicada por semeadura em estrias, em 12 tubos
de ensaio contendo meio gar tripticasena-soja esterilizado e inclinado. A levedura
foi repicada em meio gar Sabouraud dextrose, seguindo a mesma tcnica. Em
seguida,

os

microrganismos

foram

levados

estufa,

onde

as

bactrias

permaneceram por 24 horas temperatura de 35 C 1 C, e a levedura por 48-72


horas a 25 oC 1 C. Aps o crescimento, em cada tubo, foi vertida uma quantidade
suficiente de leo mineral esterilizado para conservao em congelador
temperatura de -10 oC 1 C. Desta maneira, para cada ms, foi preparado 1 tubo de
cada microrganismo.
O fungo A. niger, inoculado em meio gar Sabouraud dextrose inclinado, foi
repicado com auxlio de ala de platina a outros 6 tubos, contendo o mesmo meio.
Aps, os tubos foram incubados por 5 dias 25 C 1 C. Aps o desenvolvimento
das culturas, os tubos foram mantidos em temperatura de 4 C, obtendo-se assim, o
estoque semestral.
7.3. Reativao dos microrganismos
Ao incio de cada ms, um tubo de cada microrganismo (bactrias e levedura)
foi retirado do congelador e submetido ao descongelamento temperatura ambiente.
Em seguida, um tubo de cada bactria foi transferido para Erlenmeyer contendo 50
mL de caldo tripticasena-soja e no caso da levedura em caldo Sabouraud-dextrose e

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

109

incubados em estufa temperatura de 35 oC 1 C por um perodo de 48 horas para


as bactrias e 72 horas para a levedura. Aps este perodo, cada microrganismo foi
repicado, em meio adequado, por semeadura em estrias em 6 tubos e novamente
incubados nas mesmas condies.
O fungo foi repicado em 2 tubos com gar Sabouraud a 25 C 1 C por 7 dias
para obteno do estoque mensal, a partir do tubo do estoque semestral.
7.4. Repiques dos microrganismos para utilizao nos testes
Um tubo de cada microrganismo foi retirado do estoque mensal e repicado por
semeadura em estrias, em meio gar inclinado adequado e incubado temperatura
de 35 oC 1 C por 24 horas para bactrias, para a levedura a temperatura de
incubao foi 25 oC 1 C, por 3 dias e para o fungo foi 25 C, por 7 dias.
7.5. Obteno de suspenses-me de microrganismos testes e contagem do
nmero de microrganismos viveis
s culturas de microrganismos-teste, adicionaram-se 9 mL de soluo salina
esterilizada para a obteno da suspenso de cada microrganismo (S. aureus, E. coli,
P. aeruginosa, C. albicans). A suspenso-me foi ento ajustada quanto escala
0,5 McFarland e submetida diluio decimal seriada em soluo salina estril, at
obter a diluio 101.
Alquotas de 1,0 mL das diluies seriadas foram semeadas superfcie do
meio com auxlio de ala de Drigalsky esterilizada. As placas foram incubadas em
estufa a 35 C 1 C por 24 horas em meio tripticasena-soja, enquanto que a
levedura foi incubada a 25 C 1 C por 72 horas em meio Sabouraud-dextrose.
Aps este perodo, as placas que apresentavam um nmero de colnias entre 30 a
300, foram selecionadas para contagem do nmero de microrganismos viveis.
Para o fungo, a um tubo com gar Sabouraud dextrose inclinado, contendo A.
niger, foram adicionados 9,0 mL de soluo salina estril e, por agitao, os esporos
foram suspensos. Desta suspenso, 1,0 mL foi transferido para outro tubo de soluo
salina estril e diluda 8 vezes, tambm em soluo salina estril. Destas diluies
foram retirados pequenos volumes para contagem de nmero de esporos/mL em
cmara de Neubauer, sob microscpio ptico. A diluio que apresentou 108 UFC de
esporos foi selecionada para contagem do nmero de microrganismos viveis.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

110

Alquotas de 1,0 mL da diluio que apresentou nmero de 108 esporos foram


diludas em 9,0 mL soluo salina estril at obter a diluio 101. Alquotas de 1,0 mL
das diluies seriadas foram semeadas superfcie do meio de cultura gar
Sabouraud-dextrose com auxlio de ala de Drigalsky esterilizada. As placas foram
incubadas a 25 C 1 C por 7 dias. Aps este perodo, as placas que apresentavam
um nmero de colnias entre 30 a 300, foram selecionadas para contagem do
nmero de microrganismos viveis. (BP, 2003; USP, 2006).
7.6. Avaliao da neutralizao na inibio da atividade antimicrobiana do
sistema
O estudo de neutralizao foi feito verificando-se a inibio do crescimento dos
microrganismos S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, A. niger e C. albicans em
concentraes diferentes da formulao, obtidas a partir de diluies seriadas.
Primeiramente, a 1,0 g da formulao foram adicionados 9 mL de soluo
salina estril, obtendo-se, ento, a primeira diluio (10-1), a partir desta foram feitas
diluies decimais at 10-9 para as bactrias Gram-negativas, A. niger e para C.
albicans e at 10-12 para as Gram-positivas. A cada uma das diluies, foi adicionado
1 mL da suspenso de microrganismos contendo aproximadamente 104 bactrias, 105
clulas de bolores para a C. albicans ou 105 esporos para A. niger. A seguir, os tubos
foram agitados mecanicamente e alquotas de 1 mL foram semeadas, em duplicatas,
nas placas de Petri contendo meios adequados (BP, 2003; USP, 2006).
O mesmo procedimento foi realizado com o sabonete lquido sem adio de
clorexidina para comparao dos resultados entre as duas formulaes, a fim de
garantir que os resultados encontrados sejam devido ao da clorexidina, evitando
erros na interpretao dos resultados, pois apenas o sabonete tambm possui
atividade antimicrobiana como j foi discutido na reviso de literatura deste trabalho e
nos ensaios de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.
Para comprovao da eficincia da neutralizao dos conservantes, o teste foi
acompanhado por um controle, no qual 1,0 mL da suspenso de microrganismo foi
adicionado em 9,0 mL de soluo salina estril, seguindo o mesmo procedimento da
formulao.
As placas foram incubadas em estufa por 24 horas a 35 C 1 C, para a
contagem de bactrias, enquanto que para a levedura foi 25 C 1 C por 72 horas e

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

111

Teste de eficcia

para o fungo foi 7 dias. Aps o crescimento, o nmero de UFC foi determinado
(Figura 34).

1g/amostra

CONTROLE

-1

Homogeneizao

10

9mL de soluo salina


+
1mL da suspenso de
microrganismos

manual

Suspenso (~1000 g/mL)


9 mL diluente
(soluo salina)

1 mL

1mL

INOCULAO DOS MICRORGANISMOS


Meio: gar tripticasena-soja
Temperatura
e
tempo
de
incubao: 30C/72 horas

Figura 33: Esquema do teste da avaliao da eficcia de neutralizante-12sobre


10

-1

10

-2

10
1mL

-3

Diluio seriada decimal

10

1mL

Semeadura em
superfcie

Figura 34. Esquema da realizao do teste de neutralizante.

7.7. Teste de eficcia do sistema conservante propriamente dito


Em embalagem adequada e esterilizada, foram colocados 20 g de formulao.
Em seguida, foi inoculado um volume de suspenso de microrganismo, para a
obteno final de uma carga terica de microrganismos equivalente a 106 bactrias ou
106 esporos ou clulas de fungo por grama de formulao. Em seguida, 1 g de
formulao foi pesado, em recipiente estril, e adicionados de 9 mL de soluo salina
estril, sob agitao manual constante. Aps a dissoluo de todo contedo, obtevese a diluio 10-1, que foi subsequentemente diluda at 10-5 (BP, 2003; USP, 2006).
Este procedimento foi realizado para todos os microrganismos em anlise.
O mesmo procedimento foi realizado com o sabonete lquido sem adio de
clorexidina, para todos os microrganismos em anlise a fim de comparar os
resultados entre as duas formulaes, para garantir que os resultados encontrados

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

112

sejam devido ao da clorexidina, evitando erros na interpretao dos resultados,


pois apenas o sabonete tambm possui atividade antimicrobiana.
Paralelamente, controles foram realizados, em que, nos tubos de ensaio, com
20 mL de soluo salina estril, inoculou-se a mesma carga microbiana, e foi agitado
para homogeneizao das clulas. Em seguida, 1 mL desta suspenso foi pipetado e
adicionado a 9,0 mL de soluo salina 1 estril, dando seqncia s diluies at
10-5.
Da diluio 10-5, alquotas de 1,0 mL, foram retiradas com auxlio de pipeta
automtica e inoculadas em placas de Petri, em duplicata, contendo os meios de
cultura adequados para bactrias, levedura e fungo. As placas foram incubadas em
estufa por 24 horas temperatura de 35 C 1 C, para contagem de bactrias e a
25 C 1 C por 72 horas para a levedura e 7 dias para o fungo. Aps o crescimento,
o nmero UFC foi determinado (Figura 35).
O perodo do teste ocorreu nos intervalos de tempo de 0, 2, 6, 12, 24 e 48
horas; 7, 14, 21 e 28 dias. A anlise dos microrganismos viveis dos controles foi
executada somente no tempo zero, ou seja, logo aps a inoculao.
Durante a execuo do teste, as formulaes foram mantidas temperatura
ambiente em local livre de umidade e excesso de luz.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

113

Teste de eficcia

A) INOCULAO DOS MICRORGANISMOS NA AMOSTRA


(106 bactrias/g ou 105 esporos/g de
amostra)

Homogeinizao
manual

Estocagem em temperatura
ambiente at o final do teste

B) CONTAGEM DOS MICRORGANISMOS VIVEIS

1mL
1g

Diluio seriada
decimal
-3

10

-5

10

-2

9mL diluente

Amostra

10

0,5 mL
1mL

0,5 mL

0,5mL

Semeadura
em
superfcie

CONDIES DO TESTE DESAFIO


Bactrias: Meio gar tripticasena-soja/35C/24h
Levedura: Meio gar Sabouraud-dextrose/25C/72h
Fungo: Meio gar Sabouraud-dextrose/25C/7 dias
Perodos de anlise: 0, 2, 6, 12, 24 e 48h; 7, 14, 21 e 28 dias

Figura 35: Esquema da execuo das anlises microbiolgicas do sabonete lquido contendo
digluconato de clorexidina durante o teste desafio.

7.8. Resultados
7.8.1. Avaliao da neutralizao na inibio da atividade antimicrobiana
Os resultados da avaliao da neutralizao do sabonete lquido contendo 3%
de digluconato de clorexidina e do sabonete isento do anti-sptico esto
apresentados nas Tabelas 38 a 42, frente aos microrganismos em anlise.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

114

Teste de eficcia

Tabela 38. Contagem do nmero de microrganismos viveis de P. aeruginosa aps


neutralizao do sistema conservante
Amostras

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Controle

SL

56

91

165

203

296

388

502

598

686

142

SL CHX

41

86

101

137

248

302

412

587

625

142

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

A contagem do nmero total de microrganismos viveis para P. aeruginosa


demonstrou que o sabonete lquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
lquido em que o ativo no est presente.
Tabela 39. Contagem do nmero de microrganismos viveis de E. coli aps
neutralizao do sistema conservante
Amostras

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Controle

SL

46

103

185

241

313

388

410

473

566

240

SL CHX

82

164

223

297

362

368

418

528

240

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

Tabela 40. Contagem do nmero de microrganismos viveis de S. aureus aps


neutralizao do sistema conservante
-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

-7

-8

-9

10

10

10

10

-10

10

-11

10

-12

Cont

10

SL

21

54

87

125

169

199

222

269

294

311

323

256

SL

98

127

156

256

256

CHX

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina; cont.,


controle

A contagem do nmero total de microrganismos viveis para S. aureus,


demonstrou que o sabonete lquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
lquido em que o ativo no est presente.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

115

Teste de eficcia

Tabela 41. Contagem do nmero de microrganismos viveis de C. albicans aps


neutralizao do sistema conservante
Amostras

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Controle

SL

218

234

256

283

294

319

349

362

399

272

SL CHX

78

92

128

232

264

301

330

342

365

272

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

A contagem do nmero total de microrganismos viveis para C. albicans


demonstrou que o sabonete lquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
lquido em que o ativo no est presente.
Tabela 42. Contagem do nmero de microrganismos viveis de A. niger aps
neutralizao do sistema conservante
Amostras

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Controle

SL

84

103

164

206

288

359

496

562

603

278

SL CHX

63

96

122

189

247

301

397

476

562

278

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

7.8.2. Teste de eficcia do sistema conservante propriamente dito


As Tabelas 43 a 52 e as Figuras 36 a 45 apresentam os resultados obtidos nos
ensaios de teste desafio realizado tanto pelo mtodo convencional (BP, 2003; USP,
2006) quanto pelo mtodo do valor D (ORTH, 1989).
Tabela 43. Log de UFC/g de P. aeruginosa, nas formulaes de sabonete lquido com
e sem a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante

0h

2h

6h

12h

24h 48h

7d

14d 21d

28d

SL

6,0 5,74 5,32 4,95

SL CHX

6,0 5,32 4,90 4,00

Controle

6,0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

h = horas; d = dias; ND = no determinado; SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete


lquido com digluconato de clorexidina

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

116

Teste de eficcia

O resultado do teste evidenciou que o sabonete lquido de clorexidina


apresenta atividade superior mesma formulao isenta de clorexidina frente P.
aeruginosa.
Os resultados das equaes da reta, coeficiente de correlao (R) e valores
(D) obtidos para as formulaes isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando P.
aeruginosa, esto apresentados nas Figuras 36 e Tabela 44.

Figura 36. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de P. aeruginosa
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina
(cheio).

Tabela 44. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando P. aeruginosa
Sistema

Equao da reta

conservante

Valor D

Coeficiente de correlao

(h)

(R)

SL

y = -0,121x + 6,19

8,1

0,984

SL CHX

y = -0,2411x + 6,166

4,06

0,981

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

O valor D confirma a reduo do microrganismo P. aeruginosa quando


comparado mesma formulao sem a presena da clorexidina.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

117

Teste de eficcia

Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulaes de sabonete lquido com e sem
a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante

0h

2h

6h

SL

6,0

5,5

4,47

12h 24h 48h

7d

14d 21d 28d

4,3

SL CHX

6,0 5,41 4,30

Controle

6,0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

h = horas; d = dias; ND = no determinado; SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete


lquido com digluconato de clorexidina

O resultado do teste evidenciou que o sabonete lquido de clorexidina


apresenta atividade superior mesma formulao isenta de clorexidina frente
bactria E. coli.
Os resultados das equaes da reta, coeficiente de correlao (R) e valores
(D) obtidos para as formulaes isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando E.
coli para o teste desafio, esto apresentados na Figura 37 e Tabela 46.

Figura 37. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de E. coli
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

118

Teste de eficcia

Tabela 46. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando E. coli
Sistema

Equao da reta

Valor D

Coeficiente de correlao

(h)

(R)

conservante
SL

y = -0,2386x + 6,1538

4,06

0,970

SL CHX

y = -0,4992x + 6,4233

1,95

0,974

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

O valor D confirma a reduo do microrganismo E. coli quando comparado


mesma formulao sem a presena da clorexidina.
Tabela 47. Log de UFC/g de S. aureus, nas formulaes de sabonete lquido com e
sem a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante

0h

2h

6h

12h 24h 48h

7d

14d 21d 28d

4,90 4,30

SL CHX

4,47

Controle

6,0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

SL

h = horas; d = dias; ND = no determinado; SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete


lquido com digluconato de clorexidina.

O resultado do teste evidenciou que o sabonete lquido de clorexidina


apresenta atividade superior mesma formulao de sabonete lquido isento de
clorexidina frente bactria S. aureus.
Os resultados das equaes da reta, coeficiente de correlao (R) e valores
(D) obtidos para as formulaes isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando S.
aureus para o teste desafio, esto apresentados na Figura 38 e Tabela 48.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

119

Teste de eficcia

Figura 38. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de S. aureus
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).

Tabela 48. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando S. aureus
Sistema

Equao da reta

Valor D

Coeficiente de correlao

(h)

(R)

conservante
SL

y = - 0,7054x + 4,3943

1,40

0,981

SL CHX

y = - 2,345x + 4,69

0,43

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

O valor D confirma a reduo do microrganismo S. aureus na formulao com


clorexidina quando comparado mesma formulao isenta de clorexidina.
Tabela 49. Log de UFC/g de C. albicans, nas formulaes de sabonete lquido com e
sem a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante

0h

2h

6h

12h 24h 48h

7d

14d 21d 28d

4,90 4,47

SL CHX

4,60

Controle

6,0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

SL

h = horas; d = dias; ND = no determinado; SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete


lquido com digluconato de clorexidina.

O resultado do teste evidenciou que o sabonete lquido de clorexidina


apresenta atividade superior mesma formulao de sabonete lquido isento de
clorexidina frente levedura C. albicans.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

120

Teste de eficcia

Os resultados das equaes da reta, coeficiente de correlao (R) e valores


(D) obtidos para as formulaes isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando C.
albicans para o teste desafio, esto apresentados na Figura 39 e Tabela 50.

Figura 39. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de C. albicans
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e com digluconato de clorexidina (cheio).

Tabela 50. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando C. albicans
Sistema

Equao da reta

Valor D

Coeficiente de correlao

(h)

(R)

conservante
SL

y = - 0,8596x + 5,4157

1,12

0,968

SL CHX

y = - 2,3x + 4,6

0,43

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

O valor D confirma a reduo de C. albicans na formulao com clorexidina


quando comparado mesma formulao isenta do ativo.
Tabela 51. Log de UFC/g de A. niger, nas formulaes de sabonete lquido com e
sem a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante

48h

7d

6,0 5,53 5,25 4,84 4,47

SL CHX

6,0 5,23 5,04 4,47

Controle

6,0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

SL

0h

2h

ND

6h

ND

12h

ND

24h

14d 21d 28d

h = horas; d = dias; ND = no determinado; SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete


lquido com digluconato de clorexidina.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

121

Teste de eficcia

O resultado do teste evidenciou que o sabonete lquido de clorexidina


apresenta atividade superior mesma formulao de sabonete lquido isento de
clorexidina frente ao fungo A. niger.
Os resultados das equaes da reta, coeficiente de correlao (R) e valores
(D) obtidos para as formulaes controle e com digluconato de clorexidina, utilizando
A. niger para o teste desafio, esto apresentados na Figura 40 e Tabela 52.

Figura 40. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de A. niger
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (azul) e contendo digluconato de clorexidina (vermelho).

Tabela 52. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
a formulao sem digluconato de clorexidina e para a formulao com digluconato de
clorexidina, utilizando A. niger
Sistema

Equao da reta

conservante

Valor D

Coeficiente de correlao

(h)

(R)

SL

y = -0,1162x + 6,1302

8,3

0,962

SL CHX

y = -0,2365x + 6,2293

4,1

0,958

SL = sabonete lquido; SL CHX = sabonete lquido com digluconato de clorexidina

O valor D confirma a reduo do microrganismo A. niger quando comparado


mesma formulao sem a presena da clorexidina.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

122

7.9. Discusso
Nos anos de 1980 surgiram os testes de eficcia conservante ou teste desafio
ou ainda challenge test, que possibilitam a anlise da eficcia do sistema conservante
em formulaes especficas (BP, 2003).
Nestes testes, o produto contaminado propositalmente com uma carga
microbiana especfica do microrganismo-teste. O monitoramento realizado quanto
presena de sobreviventes em intervalos de tempo, pela contagem das unidades
formadoras de colnias (UFC) em placas de Petri de acordo com metodologias
internacionalmente recomendadas, para garantir um produto microbiologicamente
seguro e estvel (ORTH, MILSTERIN, 1989; NICOLETTI et al., 1997; BP, 2003).
Os mtodos convencionais baseiam-se na porcentagem de reduo da carga
microbiana analisada em diferentes tempos. A carga microbiana expressa em
logaritmo decimal (log) de UFC, a qual obtida em intervalos de tempos variveis,
dependendo do mtodo oficial aplicado (CRMIEUX et al., 2005).
Os mtodos rpidos se baseiam na inoculao proposital de microrganismos e
avaliao da morte celular em intervalos de tempo subsequentes, diferenciando do
mtodo convencional quanto frequncia da avaliao das cargas microbianas. No
mtodo convencional o perodo de avaliao de 28 dias, enquanto que no mtodo
rpido de 48 horas (CRMIEUX et al., 2005).
Para a realizao deste teste, culturas puras ou misturas de cultura de
microrganismos podem ser empregadas, no entanto, as culturas puras so mais
apropriadas, pois permitem conhecer as taxas de morte de cada microrganismo e
determinar o perfil de resistncia para determinada formulao (ORTH, 1993),
enquanto que a mistura de culturas pode refletir mais corretamente o perfil de
contaminao normal de um produto (BRANNAN, 1997). Ainda de acordo com estes
autores, os microrganismos utilizados para o teste devem representar as espcies de
bactrias Gram-positivas como, por exemplo, S. aureus; Gram-negativas com
diversas capacidades metablicas como P. aeruginosa; bactria do grupo coliforme
como E. coli; C. albicans como levedura e fungos como Aspergillus niger.
Os testes de eficcia de conservante so executados a fim de determinar o tipo
e a concentrao mnima do conservante necessria para que produtos no estreis
acondicionados em recipientes de mltiplo uso e com base aquosa permaneam
conservados e mantenham a estabilidade (ORTH, STEINBERG, 2003), alm de
fazerem parte dos testes de segurana do produto por avaliar a qualidade

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

123

Teste de eficcia

microbiolgica durante sua vida til, inclusive nas condies de uso (RODRIGUES,
SAITO, 1991).
Conservantes antimicrobianos no devem ser empregados para substituir as
boas prticas de fabricao (BP, 2003; USP, 2006), entretanto, no devem permitir a
proliferao microbiana, para que no haja comprometimento do produto, de sua
ao e da segurana do paciente (RODRIGUES, SAITO, 1991). A eficcia do
conservante deve ser demonstrada em produtos tpicos de mltiplas doses, de uso
oral, oftlmico, nasal e fluidos de dilise (USP, 2006). De acordo com Siqueira (2004),
o teste de eficcia de conservante deve tambm ser realizado para a embalagem do
produto, uma vez que o material de acondicionamento pode dificultar ou facilitar a
entrada de microrganismos no produto.
Para que o produto seja aceito pelo mtodo convencional descrito na
farmacopia britnica (2003), necessrio que haja queda de 2 log da carga
bacteriana inicialmente inoculada em 48 horas, reduo de 3 log da carga inicial de
bactria em 7 dias e no deve haver proliferao microbiana at o perodo final de
realizao do teste. Em relao aos fungos, deve haver reduo de 2 log da carga
inicialmente inoculada em 14 dias e no deve haver aumento da populao fngica
at o perodo final do teste. De acordo com a farmacopia americana (2006), deve
haver reduo de pelo menos 2 log em 14 dias da carga bacteriana inicialmente
inoculada e no deve haver aumento de microrganismos at o final do teste. Quanto
aos fungos, no deve haver aumento de microrganismos contatos no incio do teste,
no 14 dia e no perodo final do teste.

O mtodo de regresso linear outra

metodologia descrita para avaliao da eficcia do sistema conservante. Neste


mtodo, a taxa de inativao dos microrganismos obtida atravs da reduo
decimal (valor D), que corresponde ao tempo necessrio para que 90% (1 log) da
populao microbiana do teste morra, quando submetidos ao agente letal (ORTH,
1993; MAZZOLA et al., 2003).
De acordo com Orth e Steinberg (2003), o valor D calculado tomando-se a
recproca negativa da inclinao da curva de sobrevida traada, utilizando o nmero
log de microrganismos sobreviventes em funo do tempo em que as amostras foram
coletadas para cada espcie microbiana teste. Menores valores D indicam uma taxa
de morte rpida, e, valores maiores, indicam que a taxa de morte mais lenta.
As vantagens que podem ser conferidas ao mtodo do valor D so resultados
rpidos, possibilidade de estimar o tempo necessrio para eliminao total de

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

124

qualquer microrganismo em um produto, pode ser utilizado em estudo de efeitos


aditivos e sinrgicos de combinao de conservantes (PINTO et al., 2003).
O teste de neutralizante foi executado para permitir a contagem de
microrganismos viveis presentes no sabonete lquido com 3% de digluconato de
clorexidina. Neste estudo, o mtodo escolhido para neutralizao da formulao foi a
diluio, pois se tivesse sido empregado algum inativante para clorexidina, o
tensoativo permaneceria exercendo sua atividade antimicrobiana, e com a diluio
este produto tambm foi neutralizado.
Neste trabalho foi seguida a metodologia recomendada pelas farmacopias
britnica (2003) e americana (2006), com algumas modificaes, para o mtodo
convencional. De acordo com os compndios, o teste realizado em intervalos de
tempo de 0, 6 e 24 horas, 7, 14 e 28 dias (BP, 2003) e de 0 hora, 7, 14 e 28 dias
(USP, 2006). Os intervalos de tempo analisados neste trabalho foram 0, 2, 6, 12, 24 e
48 horas, 7, 14, 21 e 28 dias, a fim de obter um maior nmero de pontos.
Os resultados obtidos demonstram que foi necessrio uma diluio do
sabonete lquido contendo clorexidina maior do que aquela recomendada pela
literatura para que fosse possvel a contagem do nmero de microrganismos viveis
comparveis ao controle, tendo em vista que nas diluies sugeridas pela
metodologia seguida neste trabalho, no houve crescimento microbiano. Os
resultados obtidos no ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquidofoi verificado
que o sabonete na concentrao de 3 x 10-8% inibiu o crescimento de S. aureus, E.
coli e C. albicans.
Para que o valor D seja critrio de aceitao no teste desafio, este nmero
deve ser menor ou igual a 4 horas para bactrias patognicas e menor ou igual a 28
horas para bactrias no patognicas e bolores (BP, 2003).
De acordo com os requisitos exigidos pelas farmacopias britnica (2003) e
americana (2006), ambos os produtos analisados (sabonete lquido contendo ou no
digluconato de clorexidina) apresentaram eficcia para o S. aureus e foram aceitos
quanto ao teste desafio pela metodologia convencional e pelo mtodo rpido. Houve
reduo de 100% da carga microbiana inoculada antes de 48 horas e durante o
perodo de realizao do teste no houve desenvolvimento de microrganismos e o
valor D foi inferior a 4 horas.
Os resultados encontrados para C. albicans demonstraram que as duas
formulaes analisadas foram eficazes e aceitas no teste desafio pelo mtodo

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

125

convencional e pelo mtodo rpido. Houve morte em 100% da carga microbiana


inicialmente inoculada antes de 48 horas e durante o perodo de realizao do teste
no houve desenvolvimento da levedura e o valor D encontrado foi menor que 28
horas. Portanto, as formulaes estavam de acordo com os requisitos exigidos pelos
compndios oficiais seguidos neste trabalho.
Para E. coli, as formulaes analisadas foram eficazes e aceitas para o teste
desafio quando adotada a metodologia convencional e do teste rpido. Houve
reduo de 100% dos microrganismos inicialmente inoculados em menos de 48 horas
e durante a realizao do teste os mesmos no se desenvolveram. O valor D
encontrado para as formulaes analisadas foi inferior a 4 horas. Portanto, as
formulaes estavam de acordo com os requisitos exigidos pelos compndios oficiais.
Para P. aeruginosa as duas formulaes analisadas atenderam aos requisitos
farmacopicos exigidos para o teste desafio pela metodologia convencional, pois
houve reduo de 100% da carga microbiana inicialmente inoculada antes de 48
horas e durante o perodo de realizao do teste no houve desenvolvimento de
microrganismos, mas apenas a formulao com clorexidina atendeu aos requisitos
farmacopicos exigidos pelo teste rpido, pois o valor D para a formulao isenta de
clorexidina foi superior a 4 horas.
Para o fungo A. niger as duas formulaes analisadas cumpriram com os
requisitos farmacopicos exigidos para o teste desafio pela metodologia convencional
e do teste rpido. Houve reduo de 100% da carga microbiana inicialmente
inoculada em menos de 48 horas e durante o perdo de realizao do teste no houve
proliferao deste microrganismo e ovalor D encontrado foi infeiror a 4 horas.
Diante dos resultados encontrados, foi verificado que as duas formulaes
foram eficazes na eliminao dos microrganismos analisados, confirmando dados da
literatura que o tensoativo lauroilmiristilsarcosinato de sdio possui atividade
antimicrobiana (BALSAM et al., 1972). Esse fato justifica no ter havido grande
diferena nos valores D encontrados para a formulao com e sem a presena de
clorexidina diante dos microrganismos desafiados, e tambm em relao ao tempo
necessrio para que ocorresse morte de 100% da populao microbiana.
Porm, este fato favoreceu a realizao de diluies altas da formulao, e
isso acarretou em diminuio da sensibilidade da tcnica.
Diante dos resultados obtidos no teste desafio, foi possvel concluir que no
houve formao de halo de inibio para as formulaes 1 e 2 analisadas nos

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Teste de eficcia

126

ensaios de atividade antimicrobiana por difuso em gar, devido s interaes


ocorridas entre o tensoativo e o meio de cultura slido, ao excesso de clorexidina e o
meio de cultura, devido viscosidade das formulaes e ao complexo formado entre
a clorexidina e o tansoativo laurilter.
Estes dados tambm confirmam que os resultados obtidos com o teste de
atividade antimicrobiana por difuso em gar para as formulaes 3 e 4 so devido
ao tensoativo sarcosinato.
Tambm confirmam os resultados obtidos nos ensaios de atividade
antimicrobiana por diluio em caldo, em que grandes diluies das formulaes
mostraram-se eficazes para inibir o crescimento microbiano.
7.10. Concluso
Foi possvel concluir que tanto a clorexidina quanto o tensoativo sarcosinato
utilizado nas formulaes possuem atividade conservante, mas esta ao no foi
muito potencializada quando se adicionou clorexidina formulao de sabonete
lquido em estudo, com exceo diante da bactria P. aeruginosa.
A metodologia do valor D estava em concordncia com os resultados
encontrados pela metodologia convencional para S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C.
albicans e A. Nger para a formulao com clorexidina e para a formulao sem
clorexidina houve discordncia apenas em relao P. aeruginosa, com valor D
superior a 4 horas.
Estas informaes confirmam os resultados obtidos com os ensaios de
atividade antimicrobiana, que demonstraram que grandes diluies das formulaes
foram eficazes para impedir o desenvolvimento microbiano e que os resultados
obtidos pelo teste de difuso em gar foram falso-negativos, por no haver formao
de halo de inibio devido viscosidade, s interaes ocorridas entre as
formulaes e o meio de cultura slido e entre a clrexidina e os tensoativos utilizados.
A metodologia do valore D foi importante porque considerou a resistncia do
microrganismo em anlise quando estva em contato direto com agente qumico
possuidor de atividade antimicrobiana.
Finalmente, foi observado que entre os microrganismos testados, a P.
aeruginosa foi o mais resistente clorexidina, conforme observado nos testes de
atividade animicrobiana pelo mtodo de diluio em caldo e corroborando os dados
da literatura.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

8. ANLISE QUANTITATIVA DE SABONETE LQUIDO


DESENVOLVIDO CONTENDO 3% DE DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA

Anlise quantitativa

128

Este estudo teve por objetivo avaliar o teor de digluconato de clorexidina


presente no sabonete lquido contendo 3% de digluconato de clorexidina.
8.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina e
soluo amostra de digluconato de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3
respectivamente.
As determinaes foram realizadas em espectrofotmetro especificado na
Lista de Equipamentos, (p.xxvii, item 13), utilizando etanol como solvente.
8.1.1. Preparo da substncia qumica padro secundrio
A partir da soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina 20,98%
(p/v), foi preparada uma soluo a 0,1%. Uma alquota de 500,0 L da soluo
padro foi diluda em balo volumtrico de 100 mL, utilizando-se gua deionizada
para obteno de soluo a 0,1% (soluo A).
8.1. 2. Mtodo
A partir da soluo A, uma alquota de 200,0 L foi transferida para balo
volumtrico de 10 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se etanol
para obteno de uma soluo a 0,002%.
O espectro de absoro na regio de ultravioleta foi obtido utilizando-se o
equipamento especificado na Lista de Equipamentos (p. xxvii, item 13) e cubeta de
quartzo de 1 cm de caminho ptico. A leitura foi realizada entre 200 e 400 nm. O
espectro de absoro de soluo de digluconato de clorexidina padro secundrio,
em etanol, na regio de ultravioleta pode ser visto na Figura 41.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Anlise quantitativa

129

Figura 41. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina padro


secundrio em etanol, em concentrao de 0,002%, de 200 a 400 nm.

8.1.2.1. Obteno da curva de Ringbom


A curva de Ringbom foi realizada com o objetivo de determinar a faixa de
concentrao na qual o mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta
obedece linearidade.
A partir da soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina 20,98%,
foi preparada uma soluo a 0,1%. Uma alquota de 500,0 L da soluo padro foi
transferida para balo volumtrico de 100 mL, com auxlio de micropipeta, e foi
diluda utilizando-se gua deionizada para obteno de uma soluo a 0,1%
(soluo A). A partir da soluo A, foram preparadas solues de digluconato de
clorexidina em concentraes crescentes, para obteno da curva de Ringbom de
18 pontos. Solues com concentraes de 0,0002 a 0,0036% de digluconato de
clorexidina foram obtidas transferindo-se alquotas da soluo A para balo
volumtrico de 10 mL e completando-se o volume com etanol (Tabela 53). As
leituras foram efetuadas no comprimento de onda de 260,0 nm.
A Figura 42 apresenta as leituras espectrofotomtricas que permitiram a
construo da curva de Ringbom.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

130

Anlise quantitativa

Tabela 53. Preparo da curva de Ringbom de digluconato de clorexidina pelo mtodo


espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm
Pontos

Volume (L) soluo

Concentrao

Absorvncia

estoque de digluconato

final

(ABS)

de clorexidina 0,1%

(%)

20

0,0002

0,082

17,205

40

0,0004

0,173

32,857

60

0,0006

0,261

45,172

80

0,0008

0,347

55,022

100

0,0010

0,428

62,674

120

0,0012

0,501

68,449

140

0,0014

0,588

74,177

160

0,0016

0,662

78,222

180

0,0018

0,762

82,701

10

200

0,0020

0,839

85,512

11

220

0,0022

0,905

87,554

12

240

0,0024

0,985

89,648

13

260

0,0026

1,096

91,983

14

280

0,0028

1,185

93,468

15

300

0,0030

1,279

94,739

16

320

0,0032

1,368

95,714

17

340

0,0034

1,439

96,360

18

360

0,0036

1,526

97,021

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

100-T%

131

Anlise quantitativa

100
90
80
100-T%

70
60
50
40
30
20
10
0
0,0001

0,001

0,01

Concentrao (%)

Figura 42. Curva de Ringbom obtida pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de


ultravioleta para soluo de digluconato de clorexidina padro secundrio, utilizando etanol
como solvente, no comprimento de onda de 260 nm.

8.1.2.2. Obteno da curva analtica


Para obteno da curva analtica de soluo de digluconato de clorexidina
padro secundrio, foram transferidas alquotas de 500,0 L da soluo padro
secundrio de digluconato de clorexidina para balo volumtrico de 100 mL e seu
volume foi completado com gua deionizada (soluo A). A partir da soluo A,
foram preparadas solues de digluconato de clorexidina em concentraes
crescentes, de 0,001% a 0,002% para obteno da curva analtica de 6 pontos. As
solues foram obtidas transferindo-se alquotas da soluo A para balo
volumtrico de 10 mL e completando-se o volume com etanol (Tabela 54). Cada
concentrao foi preparada em triplicata. As leituras das solues foram efetuadas a
260 nm, utilizando etanol como branco.
Tabela 54. Preparo da curva analtica de digluconato de clorexidina pelo mtodo
espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm
Pontos

Volume (L) soluo estoque de

Concentrao final

digluconato de clorexidina 0,1%

(%)

100

0,0010

120

0,0012

140

0,0014

160

0,0016

180

0,0018

200

0,0020

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

132

Anlise quantitativa

Os resultados das leituras de absorvncia obtidos para construo da curva


analtica esto apresentados na Tabela 55.
Tabela 55. Valores de absorvncias determinados para a curva analtica de
digluconato de clorexidina padro secundrio por espectrofotometria na regio de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Concentrao de
Pontos

digluconato de clorexidina
(%)

Absorvncia a 260
nm

Absorvncia
mdia

DPR%**

e.p.m. *

0,427
1

0,0010

0,422

0,425

0,425

0,0015

0,59

0,523
2

0,0012

0,522

0,524

0,527

0,0015

0,50

0,613
3

0,0014

0,617

0,617

0,620

0,0020

0,57

0,714
4

0,0016

0,707

0,708

0,704

0,0030

0,72

0,790
5

0,0018

0,791

0,790

0,789

0,0006

0,13

0,889
6

0,0020

0,884

0,887

0,888

0,0015

0,30

* e.p.m. erro padro da mdia; ** DPR desvio padro relativo

A curva analtica de digluconato de clorexidina (Figura 48) foi construda com


as mdias dos valores de absorvncias de trs curvas analticas obtidas nos ensaios
de linearidade. A equao da reta determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados
y = 457,33 x - 0,0276, com coeficiente de correlao (R) igual a 0,9997.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

133

Anlise quantitativa

A representao grfica da curva analtica e o coeficiente de regresso das


solues de digluconato de clorexidina em concentraes de 0,001 0,002% pelo
mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm esto representados
na Figura 43.

Absorvncia

1,000
0,800
0,600
y = 457,33x - 0,0276
R2 = 0,9993

0,400
0,200
0,000
0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

Concentrao (%)

Figura 43. Representao grfica da curva analtica da soluo de digluconato de


clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando
etanol como solvente.

8.2. Anlise estatstica


A representao grfica da equao da reta foi determinada pela anlise de
regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Os valores de absorvncias
utilizados na determinao da curva analtica foram estatisticamente avaliados pela
anlise da varincia (ANOVA), apresentada na Tabela 56.
Tabela 56. Anlise da varincia das absorvncias determinadas na obteno da
curva analtica de digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na
regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
soma dos

varincia

Fcalc

Ftab

0,43952

0,08790

732,53*

3,11

0,43893

0,43893

3657,73*

4,75

desvio de linearidade

0,00059

0,00015

1,23

3,26

RESDUO

12

0,00012

0,00001

TOTAL

17

0,43964

Fontes de variao

GL

ENTRE doses

regresso linear

*significativo para p< 0,5.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

quadrados

134

Anlise quantitativa

Os parmetros do tratamento estatstico sobre os valores experimentais obtidos


para a curva analtica encontram-se na Tabela 57.
A abortividade molar () foi calculada pela equao:
= A/(c.b)

Equao 3

Em que: A = absorvncia
c = concentrao molar
b = caminho ptico da cubeta (cm)
Tabela 57. Parmetros analticos utilizados na determinao de digluconato de
clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente
Parmetros

Resultados

(nm)

260

(L/M.cm)

276202540783,52

Faixa de concentrao utilizada (%)

0,001 0,002

Equao: y = ax + b
a

457,33

0,0276

r (coeficiente de correlao)

0,9997

8.3. Determinao de digluconato de clorexidina no sabonete lquido


8.3.1. Preparo do padro
A soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina foi preparada
conforme descrita no item 8.1.2.
8.3.2. Preparo da amostra
Foram pesados 400,0 mg de sabonete lquido contendo 3% de digluconato de
clorexidina e transferidos para balo volumtrico de 100 mL e seu volume foi
completado com gua deionizada, obtendo-se soluo com concentrao de
0,012%. Desta soluo, 1,667 mL foram transferidos para balo volumtrico de 10

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

135

Anlise quantitativa

mL, com auxlio de micropipeta, e seu volume foi completado com etanol, obtendose concentrao final de 0,002%. As solues foram preparadas em seis rplicas.
As leituras foram realizadas em espectrofotmetro a 260 nm, utilizando
cubeta de quartzo com 1 cm de caminho ptico e sabonete lquido isento de
clorexidina e etanol como branco.
O clculo do teor de digluconato de clorexidina no sabonete lquido foi feito
uilizando-se a Equao 4.
CA = AA . CSP / ASP

Equao 4

Em que: CA = concentrao da amostra (%)


CSP = concentrao da soluo padro secundrio (%)
AA = absorvncia da amostra
ASP = absorvncia da soluo padro secundrio
O teor percentual de digluconato de clorexidina nas amostras foi calculado
segundo a Equao 5.
CA% = CA . 100 / Ct

Equao 5

Em que: CA = concentrao de digluconato de clorexidina encontrada na


amostra (%)
Ct = concentrao terica de digluconato de clorexidina na amostra
8.3.3. Resultados
Os valores de teor de digluconato de clorexidina no sabonete lquido,
determinados pelo mtodo proposto, encontram-se na Tabela 58.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

136

Anlise quantitativa

Tabela 58. Valores determinados para o doseamento de sabonete lquido com


digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Ensaios

Teor de digluconato de CHX1 sabonete

Teor mdio

lquido* (%)

e.p.m.

2,91

II

2,87

III

2,90

2,89 0,0921

DPR%

0,7877

*cada valor mdia de trs determinaes


1

CHX, digluconato de clorexidina em sabonete lquido

e.p.m. erro padro da mdia; DPR% - desvio padro relativo

8.4. Teste de recuperao


O teste de recuperao realizado com o objetivo de determinar a exatido
do mtodo desenvolvido (AOAC, 1990; USP, 2004). Para a realizao deste teste,
quantidades exatamente definidas de soluo padro secundrio de digluconato de
clorexidina foram adicionadas s solues amostras de sabonete lquido contendo
digluconato de clorexidina para a quantificao da substncia.
8.4.1. Preparo das solues
A partir da soluo padro secundrio com concentrao de 0,1%, foi
preparada soluo de digluconato de clorexidina em concentrao de 0,002%.
As solues amostras foram preparadas com concentrao de 0,012%, a
partir da soluo de sabonete lquido com digluconato de clorexidina.
Para o ensaio de recuperao, foram transferidas alquotas de 1,0 mL da
soluo amostra para bales volumtricos de 10 mL, denominadas A, R1, R2 e R3.
Foram adicionadas quantidades de 20,0; 40,0; 60,0 e 120,0 L de soluo de
digluconato de clorexidina padro secundrio em concentrao de 0,1% nos bales
R1, R2, R3 e P, respectivamente. Os volumes dos bales foram completados com
etanol, obtendo-se concentraes de 0,0012; 0,0014; 0,0016; 0,0018; 0,0012% para
os bales A, R1, R2, R3 e P, respectivamente (Tabela 59). Cada concentrao foi
preparada em triplicata.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

137

Anlise quantitativa

Tabela 59. Preparo das solues para o teste de recuperao de sabonete lquido
de digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Vol. Sol. da amostra Vol. Sol padro sec. CHX Concentrao final
0,012% (L)

0,1%

(%)

1000,0

0,0012

R1

1000,0

20,0

0,0014

R2

1000,0

40,0

0,0016

R3

1000,0

60,0

0,0018

120,0

0,0012

8.4.2. Clculo do teste de recuperao


A percentagem de digluconato de clorexidina recuperada (R%) foi calculada
utilizando-se a Equao 6.
%R = [(Cf-Ca)/Cr] x 100

Equao 6

Em que: Cf = concentrao da soluo amostra adicionada de padro (%)


Ca = concentrao da amostra (%)
Cr = concentrao terica da substncia padro secundrio adicionada (%)
8.4.3. Resultados
Os valores encontrados no teste de recuperao para sabonete lquido com
digluconato de clorexidina esto na Tabela 60.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

138

Anlise quantitativa

Tabela 60. Valores obtidos no teste de recuperao do sabonete lquido contendo


digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio do ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Digluconato
CHX SPS*

Concentrao

adicionado
(%)

final
(%)

Digluconato
CHX

Recuperao Recuperao DPR

encontrado

(%)

mdia (%)

(%)

100,12

1,21

(%)*

R1

0,0002

0,0012

0,00139

101,41

R2

0,0004

0,0014

0,00158

99,01

R3

0,0006

0,0016

0,00178

99,93

DPR, desvio padro relativo, * digluconato de clorexidina soluo padro secundrio

8.5. Validao
A validao do mtodo espectrofotomtrico de ultravioleta para sabonete
lquido contendo digluconato de clorexidina foi realizada de acordo com o guia
publicado pela ANVISA (BRASIL, 2003).
8.5.1. Linearidade
Os resultados obtidos na construo da curva analtica, descrita no item 8.1.2,
foram analisados para obteno da equao da reta pelo mtodo dos mnimos
quadrados e a linearidade foi verificada pela ANOVA.
8.5.2. Preciso
A preciso foi avaliada pelos ensaios para determinao de digluconato de
clorexidina em sabonete lquido, durante trs dias consecutivos e o desvio padro
relativo (DPR%) dos dados foi calculado estatisticamente. Os resultados desta
anlise esto descritos no item 8.3.3, na Tabela 58.
A preciso foi avaliada pelos ensaios de repetibilidade (intradia e interdia) e
reprodutibilidade, realizados em trs dias diferentes, nos quais foram analisadas seis
amostras preparadas em cada dia. O teor de digluconato de clorexidina encontrado
no sabonete lquido foi em mdia 2,89%. O desvio padro relativo das absorvncias
nas leituras foi de 1,07 e 1,05% no ensaio intradia e interdia (intermediria),
respectivamente.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

139

Anlise quantitativa

Ensaios preliminares de reprodutibilidade foram realizados variando o


espectrofotmetro (Tabela 61). Foram utilizados equipamentos de marcas diferentes
em diferentes laboratrios como descrito na Lista de Equipamentos (p. xxviii, item
13).
Tabela 61. Valores obtidos para a reprodutibilidade do mtodo espectrofotomtrico
na regio de ultravioleta a 260 nm do sabonete lquido com digluconato de
clorexidina, utilizando etanol como solvente
Absorvncias Absorvncia mdia e.p.m. DPR (%) DPR (%) total
0,893; 0,877
1

0,879; 0,891

0,886 0,0028

0,76

0,886; 0,890
0,67

0,874; 0,863
2

0,874; 0,869

0,872 0,0021

0,58

0,876; 0,876
DPR, desvio padro relativo; e.p.m., erro padro da mdia

Para o teste de reprodutibilidade, o desvio padro relativo foi de 0,67%.


Assim, os desvios esto dentro do permitido, que de, no mximo, 5% para
produtos farmacuticos, comprovando a preciso do mtodo.
8.5.3. Exatido
A exatido do mtodo foi determinada pelo ensaio de recuperao, conforme
descrito no item 8.4. O mtodo proposto exato, uma vez que a mdia das
recuperaes foi 100,12%, estando de acordo com o especificado na legislao
vigente (BRASIL, 2003), que recomenda recuperao entre 98% e 102%.
8.5.4. Especificidade e Seletividade
A especificidade do mtodo proposto foi comprovada pela comparao da
resposta observada para o digluconato de clorexidina na ausncia dos excipientes
(padro secundrio) e a resposta verificada na presena dos excipientes do
sabonete lquido (Figura 44).

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

140

Anlise quantitativa

Figura 44. Espectro na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina padro


secundrio (em preto), soluo de sabonete com clorexidina (em vermelho) e soluo de
sabonete sem clorexidina (em azul), utilizando etanol como solvente.

8.5.5. Robustez
A robustez do mtodo foi determinada pela comparao dos resultados
obtidos pela variao de parmetros operacionais como a modificao no
comprimento de onda para leitura dos valores de absorvncias. Desse modo,
utilizaram-se comprimentos de 260 nm e 255 nm (Tabela 62).
Tabela 62. Valores obtidos para a robustez do mtodo espectrofotomtrico na regio
de ultravioleta a 260 nm para o sabonete lquido contendo digluconato de
clorexidina, utilizando etanol como solvente
Absorvncia

Absorvncia mdia

DPR

DPR (%)

e.p.m.

(%)

total

0,876 0,0012

0,37

0,875; 0,876
= 260 nm

0,872; 0,881
0,875; 0,880

0,38

0,875; 0,869

nm

255

0,865; 0,872

0,870 0,0014

0,38

0,869; 0,869

, comprimento de onda; e.p.m., erro padro da mdia; DPR, desvio padro relativo
8.6. Discusso
A espectrofotometria uma das tcnicas mais utilizadas em anlise
quantitativa, por ter facilidade de manuseio, custo relativamente baixo, boa
sensibilidade, exatido, robustez, seletividade moderada e ampla aplicabilidade.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

141

Anlise quantitativa

Nesta regio do espectro, ocorre absoro de molculas com capacidade de sofrer


transies eletrnicas nos orbitais de baixa energia (GIL, 2007).
Mtodos

quantitativos

utilizando

espectrofotometria

de

absoro

so

baseados na suposio de que a capacidade de absortividade de um sistema


diretamente proporcional concentrao de soluto (Lei de Lambert-Beer) (ROCHA,
TEIXEIRA, 2004).
O mtodo proposto para a quantificao de digluconato de clorexidina em
sabonete lquido foi desenvolvido utilizando etanol como solvente, uma vez que
apresentou boa intensidade de absoro da substncia ativa neste meio como foi
verificado nos ensaios de identificao de digluconato de clorexidina, bem como sua
facilidade de aquisio. Embora a gua tambm tenha demonstrado ser bom
solvente, houve interferncia dos excipientes da formulao quando a utilizou como
solvente do sabonete lquido para anlise quantitativa.
A linearidade refere-se capacidade de um mtodo analtico em produzir
respostas diretamente proporcional concentrao do analito nas amostras, em
determinada faixa de concentrao (INMETRO, 2007). Desse modo, a linearidade
do mtodo foi obtida na faixa de concentrao de 0,001% a 0,002%, com coeficiente
de correlao de 0,9997, com desvio padro relativo entre as determinaes menor
que 5%, demonstrando a existncia de correlao linear entre os valores analisados.
A preciso intradia (repetitividade) e intermediria tambm foi comprovada
com os dados do item 8.5.2, no qual se observa que os valores experimentais
obtidos esto prximos, com desvio padro relativo inferior a 2%.
Embora a reprodutibilidade no seja necessria para validao de um mtodo
efetuado por um s laboratrio (LEITE, 2002; INMETRO, 2007), foram realizados
testes preliminares de reprodutibilidade em que se variou o equipamento e o
laboratrio, obtendo desvio padro relativo de 0,67%, estando de acordo com a
legislao, que recomenda desvio padro relativo inferior a 5%.
A robustez tem por finalidade avaliar a sensibilidade que o mtodo apresenta
diante de pequenas variaes (INMETRO, 2007); sendo assim, a robustez do
mtodo proposto pode ser comprovada de acordo com o item 8.5.5., no qual se
modificou o comprimento de onda de anlise de absorvncias.
A exatido tambm foi comprovada demonstrando concordncia entre os
valores experimentais e verdadeiros (LEITE, 2002; INMETRO, 2007), como
apresentado no item 8.5.3, com valor de recuperao de 100,12%.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Anlise quantitativa

142

O parmetro especificidade refere-se resposta de apenas um analito,


enquanto que seletividade, refere-se s respostas para vrios analitos, mas
possvel distinguir a resposta de um analito entre os outros (INMETRO, 2007).
A especificidade do mtodo foi comprovada pelo percentual de resposta
observando-se as concentraes obtidas para a soluo padro secundrio e
amostra. A seletividade foi demonstrada pela ausncia de interferncia dos
excipientes da formulao, como apresentado na Figura 49.
Como no h limite de variao de teor especificado na literatura para
sabonete lquido contendo digluconato de clorexidina, adotou-se a faixa de variao
de 10% em relao ao valor inicial de substncia ativa. Neste caso, como a
formulao sabonete lquido com 3% de digluconato de clorexidina, a faixa do teor
adotado varia de 2,7 a 3,3%. Este limite de variao foi adotado baseado na
farmacopia americana (2008), que especifica como limite de variao 10% de
digluconato de clorexidina em creme oral. Como sabonete lquido tambm um
produto no estril e de uso externo, tomou-se este valor como limite.
8.7. Concluso
O mtodo espectrofotomtrico na regio ultravioleta a 260 nm proposto para
anlise de teor de digluconato de clorexidina em sabonete lquido foi adequado, uma
vez que cumpriu com as exigncias da legislao brasileira vigente em relao
validao de mtodos analticos.
Alm disso, uma tcnica de fcil e rpida execuo, com pouco uso de
solvente e de baixo custo.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

9. DISCUSSO GERAL

Discusso geral

144

A clorexidina um importante anti-sptico com usos diversos em diferentes


reas. No entanto, so necessrias as BPF e os devidos cuidados durante sua
manipulao e armazenamento para evitar que a soluo contendo clorexidina seja
contaminada e comprometa sua eficcia.
Para a anlise da clorexidina e seus produtos de degradao bem como suas
impurezas, h diversos mtodos descritos na literatura, porm a CLAE se destaca. O
mtodo proposto pelas farmacopias europia e britnica (reao colorimtrica) para
anlise de cloroanilina nos sais de clorexidina menos sensvel e exato. Os mtodos
propostos por Revelle e colaboradores (1993) e por Doub (1996), apenas separa e
identifica as impurezas da clorexidina, mas no as quantifica.
Entre os mtodos de anlise para clorexidina em fluidos biolgicos
encontrados na literatura, o mtodo espectrofotomtrico apresentado por Jensen e
Christensen (1971) no especfico para clorexidina, pois recupera constituintes da
saliva, embora seja um mtodo de simples e fcil execuo. Entretanto, o mtodo de
fluorescncia descrito por Vries e colaboradores (1991) simples e exato para
determinao de clorexidina em soluo aquosa e em saliva. O mtodo proposto por
Bosnevoll e colaboradores (1974) verifica a quantidade de clorexidina que fica retida
na boca aps 24 horas do enxgue com soluo de digluconato de clorexidina 0,2%.
Os mtodos cromatogrficos de anlise para clorexidina em saliva so mais
trabalhosos exigindo processos de extrao mais demorados e complicados, porm
possuem maior sensibilidade e especificidade; o mtodo de micro-extrao em fase
slida permite avaliar diversos aspectos como ligao e estabilidade da clorexidina
saliva, farmacocintica da clorexidina aps enxgue com a soluo de clorexidina,
porm, exige diversas passagens para a extrao da clorexidina, tornado-se
trabalhoso e necessitando de maior tempo de anlise.
O mtodo de anlise apresentado por Usui e colaboradores (2006), mais
sensvel e seletivo que o mtodo CLAE-UV e tambm fornece mais informaes para
a identificao da clorexidina e suas impurezas.
Para determinao de clorexidina em urina, a CLAE o mtodo de escolha. O
mtodo proposto por Wainwright e Cooke (1986) permite detectar p-cloroanilina na
urina, porm apenas a clorexidina foi quantificada. A tcnica de CLAE associada
extrao em fase slida, apresentada por Below e colaboradores (2004), permite
determinar o limite de quantificao de clorexidina em fluidos biolgicos e em

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Discusso geral

145

preparaes farmacuticas e tambm possibilita observao de p-cloroanilina e 1cloro-4-nitrobenzeno, mas suas quantificaes no so exatas.
Em preparaes farmacuticas, a CLAE o mtodo mais utilizado, porm
necessita de extrao da clorexidina dos produtos que em alguns casos demorada.
O mtodo proposto por Miribel e colaboradores (1983) necessitou de diversos
passos, e, espectrometria de massas e ressonncia magntica foram realizadas para
verificar se a estrutura qumica era realmente da clorexidina. Os mtodos propostos
por Gavlick (1992) e Bauer e colaboradores (1984) permitem quantificao de
clorexidina e cloroanilina.
No foi encontrado na literatura mtodo de anlise para sabonete lquido
contendo digluconato de clorexidina e anlise quantitativa pelo ensaio microbiolgico
por difuso em gar para soluo de digluconato de clorexidina. Em virtude destes
motivos, estes mtodos foram desenvolvidos e validados.
A soluo de digluconato de clorexidina utilizada neste trabalho cumpriu com
os testes de identificao, uma vez que estava de acordo com os parmetros
farmacopicos exigidos e de acordo com a soluo padro secundrio.
O mtodo analtico de doseamento microbiolgico da soluo de digluconato
de clorexidina por difuso em gar mostrou-se uma tcnica eficiente, com pouco
custo e facilidade de execuo. Foi possvel validar este mtodo, utilizando-se
anlises de varincia, no qual a soluo apresentou potncia de 92,58% frente ao
microrganismo S. aureus.
As formulaes de sabonetes lquidos desenvolvidas demonstraram diferentes
caractersticas fsicas, quando observadas visualmente, confirmando o fato de haver
precipitao e turvao das preparaes contendo tensoativo aninico lauril.
Em relao viscosidade, tambm foi observado que, com aumento da
concentrao de clorexidina nos produtos, houve aumento da viscosidade, at o
ponto em que o sistema micelar do tensoativo suportou a quantidade de clorexidina
presente e conseguiu manter o sistema, como observado nas formulaes I e II
contendo 1% e 2% de clorexidina. No entanto, ao adicionar quantidade maior de
clorexidina, o sistema micelar no mais conseguiu estabilizar o sistema, acarretando
perda da viscosidade, como observado nas formulaes I e II contendo 3% e 4% de
clorexidina.
Em relao ao tensoativo aninico sarcosinato, houve uma melhor estabilidade
do sistema sem a presena de turvao e precipitao, demonstrando que este

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Discusso geral

146

detergente embora seja tambm aninico, foi estruturalmente mais compatvel com a
clorexidina.
De acordo com resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana pelo
mtodo de difuso em gar foi verificado que as formulaes 1 e 2 contendo
tensoativo aninico lauril no apresentaram atividade antimicrobiana. Entretanto,
quando analisadas pelo mtodo da microdiluio em caldo, houve atividade para
alguns dos microrganismos analisados, demonstrando que a incompatibilidade deste
produto com a clorexidina tcnica.
O fato de no ter havido resposta antimicrobiana pelo mtodo de difuso em
gar para as formulaes 1 e 2, pode ser devido interao entre o tensoativo
aninico lauril e o meio de cultura slido, entre o excesso de clorexidina e o meio de
cultura slido, dificuldade de difuso por causa do excesso de viscosidade nas
formulaes com maiores quantidades de clorexidina e pela formao do complexo
aninico-catinico formado entre a clorexidina e tensoativo lauril, que pode ter
dificulatado a difuso da clorexidina no gar.
O fato de ter havido halo de inibio de crescimento microbiano menor para as
formulaes 3 e 4 com maiores concentraes de clorexidina, quando analisadas
pelo mtodo de difuso em gar, possivelmente ocorreu porque houve maior
interao do excesso de clorexidina com o meio de cultura slido, devido
viscosidade das formulaes com maiores concentraes de clorexidina e pode ter
havido formao de complexo aninico-catinico entre o tensoativo sarcosinato e o
excesso de clorexidina, que dificultou a difuso no gar.
O tensoativo sarcosinato pode ter interagido menos com o meio de cultura
slido e isto possibilitou a difuso do mesmo no gar e houve formao do halo de
inibio de crescimento, pois como j foi visto anteriormente neste trabalho, este
tensoativo possui atividade antimicrobiana superior a do tensoativo lauril. Entre os
microrganismos testados, os Gram-positivos foram mais sensveis.
Quando as formulaes 3 e 4 foram analisadas pelo mtodo de diluio em
caldo foi verificado que com o aumento da concentrao da clorexidina nas
formulaes houve melhora da resposta antimicrobiana, demonstrando que no
houve interaes entre as formulaes e o meio de cultura lquido.
O mtodo de microdiluio em caldo foi melhor em relao tcnica de difuso
em gar, pois a viscosidade das formulaes, as interaes entre o tensoativo e o
meio de cultura e a maior quantidade de clorexidina nas formulaes no interferiram

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Discusso geral

147

nos resultados como aconteceu para o mtodo de difuso. Confirmando os dados


obtidos com o teste de atividade antimicrobiana por difuso em gar, os
microrganismos mais sensveis clorexidina foram os Gram-positivos.
Houve dificuldade de anlise de atividade antimicrobiana dos sabonetes
lquidos, pois os tensoativos presentes possuem atividade antimicrobiana, e
justamente por isso foram realizados controles apenas com o sabonete lquido isento
de clorexidina e tambm os tensoativos podem ter inferido com o meio de cultura
slido dificultando a difuso do produto e a formao do halo de inibio de
crescimento, podendo mascarar os resultados.
O tensoativo anftero cocoamidopropil betana no modificou as aspectos
fsicos das formulaes 2 e 4 quando comparadas com as formulaes 1 e 3,
respectivamente, pois as formulaes 1 e 2 apresentaram-se turvas e com
precipitao enquanto que as formulaes 3 e 4 apresentaram-se lmpidas.
O tensoativo cocoamidopropil betana tambm no alterou os resultados de
atividade antimicrobiana, pois pelo mtodo de difuso em gar as formulaes 1 e 2
no apresentaram resposta e as formulaes 3 e 4 apresentaram respostas
semelhantes. Quando comparadas pelo mtodo de diluio em caldo, as formulaes
1 e 2 apresentaram respostas antimicrobiana semelhantes, quando comparadas na
mesma concentrao para o mesmo microrganismo, e as formulaes 3 e 4 tambm
apresentaram respostas semelhantes, quando comparadas na mesma concentrao
para o mesmo microrganismo.
No teste desafio foi avaliado o sabonete lquido contendo clorexidina e a
mesma formulao isenta de clorexidina, frente a S. aureus, E. coli, C. albicans, P.
aeruginosa e A. niger. Os resultados demonstraram no haver grande diferena de
atividade antimicrobiana entre as formulaes analisadas, pois no houve grande
diferena de valor D encontrado para ambas as formulaes.
As duas formulaes analisadas cumpriram com o teste desafio diante de
todos os microrganismos analisados pelo mtodo convencional. Quanto
metodologia do teste rpido, apenas a formulao isenta de clorexidina no atendeu
aos requisitos exigidos pelas farmacopias diante de P. aeruginosa, pois o valor D
obtido foi superior a 4 horas.
Como se trata de produto contendo tensoativo com atividade antimicrobiana,
foi necessrio realizar diluies maiores que as diluies apresentadas pela literatura
para o teste de neutralizante, mas este fato acarretou em perda de sensibilidade da

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

Discusso geral

148

tcnica. Portanto, produtos que naturalmente possuem atividade antimicrobiana,


mesmo sem a adio de ativos, dificultam a sua anlise. Talvez seja este o motivo de
no ter sido encontrado na literatura trabalhos de atividade antimicrobiana de
sabonetes lquidos pelo mtodo de difuso em gar, diluio em caldo e teste
desafio.
H neutralizantes para a clorexidina como soluo de azolectina a 0,75% e
tween 80 a 0,5%, mas se estes produtos tivessem sido utilizados no teria sido feito a
neutralizao do tensoativo presente nas formulaes, por isso foi escolhido o
mtodo da diluio para neutralizar os produtos em anlise.
O mtodo analtico na regio de ultravioleta utilizando etanol como solvente
demonstrou-se sensvel, de fcil aplicao, rpida execuo, com baixo custo e sem
gerao de resduos txicos. Foi validado de acordo com anlise de varincia e
cumpriu com os parmetros descritos na legislao vigente para validao de
mtodos analticos.

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10. CONCLUSES

Concluses

150

A soluo de digluconato de clorexidina foi identificada e caracterizada


utilizando-se tcnicas como faixa de fuso, densidade relativa, pH, cromatografia em
camada delgada, espectrofotometria na regio de ultravioleta e infravermelho.
Foi possvel propor ensaio microbiolgico, pela tcnica de difuso em gar,
utilizando S. aureus como microrganismo indicador, para soluo de digluconato de
clorexidina como mtodo de anlise quantitativa.
No estudo de atividade antimicrobiana das formulaes desenvolvidas foi
constatado que a incompatibilidade entre o tensoativo aninico laurilter sulfato de
sdio e a clorexidina tcnica, mas ainda assim possui atividade antimicrobiana.
O estudo de atividade antimicrobiana em meio lquido foi mais favorvel para
verificar a atividade das formulaes sem interferentes, pois no ensaio por difuso em
gar, a viscosidade das formulaes, as interaes entre o tensoativo e meio de
cultura e o excesso de clorexidina e o meio de cultura prejudicaram os resultados.
Diante dos resultados apresentados pelo ensaio de atividade antimicrobiana
por microdiluio em caldo, foi observado que h aumento de atividade
antimicrobiana quando se eleva a concentrao de clorexidina de 1%, 2% e 3% em
todas as formulaes. No entanto, ao elevar para 4%, no h melhora significativa de
atividade, principalmente ao se levar em conta fatores econmicos, de toxicidade e
risco de resistncia bacteriana.
O tensoativo sarcosinato foi estruturalmente mais compatvel com a clorexidina
uma vez que no houve precipitao e turvao das formulaes com este
detergente e tambm interagiu menos com os meios de cultura utilizados nos ensaios
de atividade antimicrobiana.
O tensoativo cocoamidopropil betana no melhorou os aspectos fsicos e a
atividade antimicrobiana das formulaes 2 e 4 em relao s formulaes 1 e 3,
respectivamente.
No estudo do teste desafio, as duas formulaes estudadas (com e sem a
presena de clorexidina), cumpriram com os requisitos farmacopicos para a
metodologia convencional. Para a metodoliga do teste rpido, apenas a formulao
sem a presena de clorexidina no cumpriu com o teste para a P. aerugionosa.
Para E. coli, o valor D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 4,06
horas e para o sabonete com a clorexidina foi, 1,9 horas. Para P. aeruginosa o valor
D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 8,1 horas e para o sabonete com
a clorexidina foi 4,0 horas. Para A. niger, o valor D para o sabonete sem a clorexidina

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

151

Concluses

foi 8,3 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 4,1 horas. Para S. aureus o valor
D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 1,4 horas e para o sabonete com
a clorexidina foi 0,43 horas e para C. albicans, o valor D encontrado para o sabonete
sem a clorexidina foi 1,1 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 0,43 horas.
Foi possvel desenvolver e validar o mtodo de anlise quantitativa de
sabonete

lquido

contendo

digluconato

de

clorexidina,

pela

tcnica

de

espectrofotometria na regio de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente


e faixa de concentrao de 0,001% a 0,002%.
Este trabalho foi satisfatrio, por conseguir desenvolver formulaes distintas
com diferentes concentraes de digluconato de clorexidina e avaliar suas atividades
antimicrobianas, apesar das interferncias ocorridas entre as formulaes e as
tcnicas utilizadas.
Diante dos resultados obtidos com estes ensaios, foi possvel obter uma
formulao satisfatria em relao ativadade antimicrobiana, custo, facilidade de
utilizao e tambm foi possvel o desenvolvimento e validao de metodologia
analtica quantitativa para esta formulao. A formulao que satisfez aos objetivos
deste trabalho foi a formulao 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina.

Flvia Anglica Msquio Fiorentino

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