Tcnicas analticas en toxicologa

Ana Mara Lpez Parra

Departamento de Toxicologa y Legislacin Sanitaria.
Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
(UCM)

Ciencia que estudia las sustancias qumicas y los

fenmenos fsicos en cuanto son capaces de
producir alteraciones patolgicas a los seres
vivos, a la vez que estudia los mecanismos de
produccin de tales alteraciones y los medios
teraputicos para contrarrestarlas, as como los
procedimientos para detectar, identificar y
determinar tales agentes y valorar el riesgo que
representan
(M. Repetto 1981/2009)

REAS
BSICAS

Biologa
Bioqumica
Qumica
Fisiologa

Farmacologa
Patologa
Medicina Legal

TOXICOLOGA
REAS
FUNDAMENTALES Mecanstica

Analtica

Humana
Veterinaria

RAMAS
APLICADAS

Forense

Tox. Reguladora

General
Docencia
Investigacin

Clnica

rgano especfica

Alimentaria

Evaluacin
Toxicol.

Farmacutica

Eval.
Riesgo

Ecotoxicologa

Ambiental

Ocupacional

-Toxicologa Analtica
-Qumica Analtica

Urgencia en el resultado
Anamnesis
Muestras biolgicas
Concentracin del producto
Determinacin del txico
Instalaciones

Diagnstico clnico
Diagnstico biolgico
Diagnstico qumico

 Estudio de las constantes o parmetros biolgicos y

bioqumicos
Biomarcadores de exposicin
Biomarcadores del efecto
Biomarcadores de susceptibilidad

Experimentacin con animales y vegetales

Ensayos inmunolgicos y radioinmunolgicos

El anlisis qumico-toxicolgico
es el conjunto de procesos
analticos que tienen por objeto
el aislamiento, identificacin y
determinacin cuantitativa de
los txicos, tanto en el vivo
como en el cadver, con el fin
de permitir el diagnstico de la
intoxicacin.

Modalidad Judicial
Modalidad Clnica
Modalidad Ambiental

Contenido gstrico
Sangre
Orina
Humor vtreo
Hgado
Cerebro
Rin
Bilis
Pelo
Saliva
Meconio

Contenido gstrico
-Vmito, aspirado gstrico y lavados gstricos.
-En el caso de los lavados gstricos, primer lavado
(500 ml).
-Puede ser necesario procedimientos de
homogenizacin, filtracin y/o centrifugacin.
-No representa grado de intoxicacin (txico no
absorbido).
-Se pueden encontrar tabletas o cpsulas, o txico
sin metabolizar.

Sangre
-Es una de las muestras ms tiles para la identificacin y
especialmente para el anlisis cuantitativo.
-La sangre total y el plasma son las muestras ms
representativas.
-Recoger la muestra en tubos con fluoruro sdico como
anticoagulante.
-Si se sospecha de intoxicacin con plomo, utilizar EDTA.

Orina
-Ensayos preliminares en el screening de txicos.
-Para drogas de abuso.
-La concentracin de un txico puede llegar a ser 100
veces mayor que en la sangre.
-Exenta de protenas.
-Se debe de tomar antes del tratamiento.
-Como mnimo 50 ml.
-No aadir conservantes.
-Desventaja: Txicos que se eliminan en su
totalidad como metabolitos comunes.

Humor vtreo.
-Fcil accesibilidad
-Volumen suficiente
(casi 2 ml por ojo)
-No muchas protenas
-Protegido de circulacin
general
-Pocas enzimas
-Resistente a la contaminacin bacteriana
-Drogas y alcohol

Hgado

-Niveles de txicos superiores

a los de la sangre.
-Especialmente til cuando no
se puede disponer de sangre.
-Evitar contaminacin por bilis.
-Evitar aadir conservantes.

Otros tejidos y fluidos biolgicos

-Cerebro: especialmente casos de inhalacin.

-Rin: especialmente en intoxicaciones por
metales y txicos que se acumulan en riones.
-Bilis: Txicos que se eliminan por va biliar. En
sobredosis por opiceos se acumulan altas
concentraciones de glucurnidos.

Pelo
-Txicos minerales
-Deteccin de drogas de abuso en consumidores
crnicos.
-Exposicin prenatal
-Refleja el estado promedio de los elementos
minerales del organismo durante su crecimiento.

Saliva.
-Correlacin de los anlisis
sricos con drogas de abuso y
psicofrmacos.

Drager DrugCheck
Kit

Drug Testing in Oral FluidEvaluation of Sample Collection Devices

Journal of Analytical Toxicology Vol. 32: 393- 401, (2008)

Meconio.
-Meconio: lquido amnitico,
moco, lanugo, bilis y clulas que
se han desprendido de la piel y
del tracto intestinal.
-Identificacin de drogas durante
la gestacin.

Muestras envenenadas, fortificadas o reforzadas

Muestras certificadas o estndares de referencia

B.O.E. DEL 23 DE DICIEMBRE DE 1.996 28654 ORDEN de 8 de

noviembre de 1.996 por la que se aprueban las normas para la
preparacin y remisin de muestras objeto de anlisis por el
Instituto de Toxicologa.

TOXICOS DESCONOCIDOS
Un recipiente con estmago y su contenido, y adems vmitos y los
lavados gstricos que en el tratamiento de urgencia se hicieran con
agua sola.
Un frasco seco con sangre en cantidad de unos 50 ml.
Un frasco de orina; toda cuanta sea posible extraer.
Un recipiente con aproximadamente 100 g de cerebro.
Un recipiente con hgado (aproximadamente 100 g) y vescula biliar.
Un recipiente con una cua renal de aproximadamente 100 g.
Un recipiente con aproximadamente 100 g de pulmn.
Si se sospecha de intoxicacin por arsnico, plomo, berilio, talio,
estroncio, uranio y fluor, debern remitirse muestras de uas,
cabellos o huesos.

-Desinfeccin del instrumental

-Desinfeccin de la piel
-Cantidad de sangre que se debe extraer
-Frasco para remitir la muestra
-Aditivos conservadores
-Etiquetado
-Documentacin
-Sangre de cadveres

Tapones PTFE
(polytetrafluoroethylene)
Evitar frascos con cmaras
de aire en el caso de txicos
gaseosos o voltiles
Etiquetas
No conservantes excepto
Fluoruro sdico
Formol

Polvos, nieblas, gases y vapores

recogibles sobre filtros de soportes
slidos
Gases y vapores recogibles
mediante frascos lavadores
Vapores orgnicos absorbibles en
tubos de carbn activo.
Muestreo de aguas

Comprimidos
AIRE
Restos vegetales
Residuos
AGUA
en una taza,
vaso , etc
Alimento
Bebida
Envase de una conserva
ALIMENTOS
Aire urbano
SUELO
Recinto
Ecosistema

Factores que intervienen:

Luz

Temperatura

Hidrlisis

Oxidacin

Descomposicin
biolgica

10

Se sospecha de un determinado txico:

1. Separacin del medio.
2. Tcnicas de identificacin directas (sin
separacin).

No se sospecha de ningn txico concreto:

1. Separacin o extraccin del txico de la
muestra problema.
2. Fraccionamiento del extracto.
3. Purificacin de los extractos obtenidos.
4. Deteccin de la sustancia xenobitica.
5. Identificacin del txico.
6. Determinacin o valoracin cuantitativa.

Extraccin: Conceptos
La extraccin es una tcnica de separacin o aislamiento que
se puede aplicar a todo tipo de mezclas, ya sean stas slidas,
lquidas o gaseosas.
La extraccin se basa en la diferencia de solubilidad de los
componentes de una mezcla en un disolvente adecuado.
La forma ms simple de realizar una extraccin consiste en
tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de manera
que uno de los componentes se disuelva y los dems no.

11

Extraccin clsica Lquido-Lquido

Disolvente apolar

Disolvente polar
Partcula apolar
Partcula polar
Los componentes de la mezcla se distribuyan entre los dos
disolventes segn su coeficiente de reparto, que est
directamente relacionado con la solubilidad de cada compuesto.

Criterios para elegir mtodo de

extraccin

Selectividad
Rendimento
Tiempo
Seguridad
Coste
Posibilidad de
automatizacin

Finalidad:
Aislamiento y purificacin del txico
Concentracin del txico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva ntegra

Desde el punto de vista analtico los txicos se

dividen en:
Txicos voltiles
Txicos gaseosos
Txicos orgnicos fijos o extrables
Txicos inorgnicos o minerales

12

 Aquellos que se volatilizan por debajo de los

100C, por lo cual son arrastrados por el
vapor de agua cuando sta destila (alcohol
etlico, alcohol metlico, benceno, fenoles, ...).

Las tcnicas son:

-Destilacin simple.
-Destilacin fraccionada.
-Destilacin directa al vaco.
-Destilacin por arrastre en corriente de vapor.
-Microdifusin.
-Tcnica de espacio en cabeza ("head space" ).

Muestra
problema

Txico
voltil
extrado

13

Separacin segn puntos

de ebullicin

Camara
de
Conway

1. La muestra se deposita
en un vial cerrado con
tapn perforable, en el
que se deja una cmara
de aire.
2. Se calienta a 60C
durante 30 minutos.
3. Se extrae con una
jeringa para gases una
muestra de la parte
superior del frasco para
inyectarla en un
cromatgrafo de gases.

14

 Se denominan txicos gaseosos a todas

aquellas sustancias que a temperatura ambiente
se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:
CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.

Las tcnicas son:

-La extraccin de gases en sangre se basa en leyes
fsicas, segn las cuales su solubilidad disminuye
elevando la temperatura o disminuyendo la presin.
-Mediante las mismas tcnicas que para los txicos
voltiles.
-Cromatografa de gases: tcnica de separacin
tanto para txicos gaseosos como voltiles.

In the animation below the red molecules are

more soluble in the liquid (or less volatile) than
are the green molecules.

15

Cromatografa
de gases (GC)

Tcnica de separacin.
Se basa en la diferente velocidad con que se
mueven los solutos a travs de un medio poroso
arrastrados por un disolvente en movimiento.

Cromatografa de gases
(GC)

16

Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
Tcnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad
de los txicos) y cuantitativas (lmite de
sensibilidad 1-5 g/ml.) .
Posibilidad de derivatizacin (obtener un
compuesto intermedio a partir de una sustancia
no voltil) hace su aplicacin prcticamente
universal.

17

Sustancias orgnicas y no voltiles.

Se incluyen:
*Txicos de origen vegetal (glucsidos,
aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de sntesis (medicamentos).

Sin o con tratamiento previo de la muestra (desproteinizacin y

liberacin de conjugados)
Fase A. Extraccin:
-con disolvente apolar
-con disolvente polar (etanol): tcnica de Stas-Otto.
Fase B. Purificacin del extracto.
Fase C. Fracionamiento del extracto, para grupos:
- cidos
- bsicos
- neutros

Las tcnicas son:

-Mtodo de electrodilisis: se basa en la propiedad que
tiene la corriente elctrica de descomponer las sales de
los txicos orgnicos, yendo la base hacia el polo
negativo y el resto al polo positivo.
-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgnicas
son absorbidas por la resina y luego son eluidos con
solventes apropiados.

18

Extraccin en fase slida

Estos txicos se encuentran en el organismo

firmemente unidos a albmina, lpidos o glcidos,
siendo requisito la destruccin de la materia
orgnica para poder realizar su anlisis.

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1. Mineralizacin: proceso por el cual se produce la destruccin

de la materia orgnica y la consiguiente liberacin del txico.
a) Destruccin oxidativa por va hmeda de la materia orgnica empleando
cido ntrico o mezclas de c. ntrico-agua oxigenada, etc.
b) Destruccin de materia orgnica por va seca (calcinacin).
c) Formacin de complejos y posteriormente se separa con disolventes
orgnicos.

Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos

mtodos, para obtener una muestra ms apropiada.

Existen mtodos que no precisan la destruccin de la

materia orgnica como:
*Dilisis.
*Ultrafiltracin.
*Electrodilisis.
*Desproteinizacin.
2. Marcha posterior de extraccin

Dos etapas:
1. Rastreo o deteccin rpida:
-Tcnicas de inmunoensayo
-Cromatografa en capa fina
2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.

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Fundamento:
Reacciones antgeno-anticuerpo.
Se basan en la competencia por un anticuerpo de txico
marcado frente al txico sin marcar de la muestra problema.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y
psicofrmacos.
Txico libre

+ AC

Txico libre-AC

Txico marcado
Txico marcado

1. Radioinmunoensayo (RIA): istopo radioactivo.

2. Enzimoinmunoensayo: enzima.
-ELISA: ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzimas
-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluorforo.
4. Inmunoanlisis por interaccin cintica de partculas
(KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar
agregados de micropartculas.

21

Reacciones cruzadas

Cromatografa en capa fina (CCF)

Cromatografa en capa fina (CCF)

22

2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.

Fundamento: capacidad que tienen las molculas y los

tomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda
utilizando la energa de dichas radiaciones para producir cambios
energticos en su estructura (en los tomos transiciones
electrnicas y en las molculas movimientos electrnicos)

23

1. Al aplicar energa, el tomo absorbe

2. El electrn exterior es inducido a
moverse a un orbital menos estable,
estado excitado = estado provocado.

Emisin
4

3. Retorno a su estado fundamental.

Absorcin
4. El electrn emitir energa radiante
equivalente a la cantidad de energa
inicialmente absorbida = estado
espontneo
La longitud de onda de la energa
radiante emitida esta directamente
relacionada
a
la
transicin
electrnica
producida
y
es
especfica.

Los procesos de:

1 excitacin = absorcin
4 Decaimiento= emisin
Pueden ser medidos

E*
Luz
incidente

Fluorescencia
emitida

Lmpara de
ctodo hueco

Sistema
atomizador

Sistema
monocromador

Sistema
detector

La emisin de una energa electromagntica de longitud de onda determinada,

se hace incidir sobre un tomo libre en estado fundamental, este tomo
absorbe la energa y con lo que pasa a un estado excitado.

24

Lmpara de ctodo hueco

La lmpara produce lneas especficas del
ctodo con el que se la disea.

El ctodo debe de ser buen conductor de la corriente

Siempre se precisa atomizar la muestra.

Hay dos procedimientos:
Atomizacin con llama
Muestras lquidas y gases
Atomizacin sin llama
Horno con cmara de grafito
Muestras slidas y lquidas

Atomizacin con llama

El atomizador consiste en un
mechero con cabeza larga y
estrecha que sirve de paso
ptico para la muestra (b)
La muestra se aspira
dentro de la llama.

El nebulizador controla el
flujo de muestra y la
nebuliza.

Cmara
de mezclado

La cmara de mezclado, asegura

que la muestra se mezcla con el
fuel y el oxidante, antes de entrar
en el interior de la llama

nebulizador

25

Horno de grafito

Atomizacin sin llama

purga de gas
inyector-muestra

Paso ptico
tubo grafito
agua de refrigeracin
HORNO DE CMARA DE GRAFITO

E*

Luz emitida

26

Volatilizacin
Ionizacin

2.Aceleracin
iones

3. Separacin

4. Deteccin

Tcnica cualitativa y cuantitativa.

Separa partculas moleculares o atmicas segn su masa.

Tcnica cualitativa y cuantitativa.

Anlisis de fragmentos moleculares. Determinacin de la estructura
molecular.
Su principal aplicacin es la identificacin de sustancias desconocidas

Cromatografa de gases: espectrmetro de masas (CG-EM).

27

ICP: Plasma de
acoplamiento inducido

Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases

28

Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

fase mvil v/s fase estacionaria

29

Tiempo de retencin Polaridad

30

Electroforesis capilar
Capilar con
polimero

Laser Argon
50-100 m x 27 cm

Ventana del
capilar

Separacin de molculas
Anodo

Catodo

5-20 kV
Datos pasan al equipo

cIEF Methodology (Sample Loading)

31

cIEF Methodology (Focusing)

1. Momento de la toma de la muestra

2. Estabilidad del compuesto en la muestra
y homogeneidad de sta
3. Amplitud y reproducibilidad del mtodo
analtico
4. Interferencias en el mtodo analtico

No se detecte el txico
Defectos operatorios
Desaparicin del txico del cuerpo del
intoxicado

32

Factores que intervienen:

Soporte
estadstico

Sensibilidad
Exactitud

Confusin
valores

Diferencias
individuales

Metabolitos
activos e
inactivos

http://www.chem.wits.ac.za/chem212-213-280/0%20Introduction%20-%20Lecture.ppt

1.
2.
3.
4.
5.

Capacitacin del personal del laboratorio

Cadena de custodia
Mtodos Normalizados
Sustancias certificadas
Programas de control y de garanta de
calidad internos

33

34