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RESUMEN
En esta prctica se utilizaran tres mtodos para la cuantificacin de protenas:
Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los mtodos se realizaran: una curva
estndar, el clculo del coeficiente de extincin y el rango de sensibilidad. Se
realizar la cuantificacin de dos muestras problemas de baja y alta
concentracin, respectivamente, y se discutir las ventajas e inconvenientes de
cada uno de los mtodos.
Palabras clave: cuantificacin de protenas, Biuret, Bradford, BCA
Abreviaturas: BCA: cido bicinconnico
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
1.1 Mtodos para la cuantificacin de protenas: ventajas e inconvenientes
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica
de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos
propsitos.
A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 - A236
100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45
Coeficiente de extincin o
Clculo de la concentracin
280 = 1 mL/mg cm
205 = 31 mL/mg cm
Protena (mg/mL) = (1.55A280
0.76A260)
Protena (mg/mL) = (A235
A280)/2.51
A215 - A225
1000-10000
Lowry
Bradford
25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
1-15
BCA
0.5- 10
Mtodos Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido
1-5 excitacin a 340 nm
emisin a 475 nm
Tabla II. Principales mtodos
para la cuantificacin de
protenas, principales ventaja
e inconvenientes Mtodo
Mtodos de Absorcin
Ventajas
Bradford
Muy sensible
BCA
Mtodos Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido
Muy sensible
Inconvenientes
1.5. Objetivos
Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes
mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e
inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para
cada uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el
coeficiente de extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la
cuantificacin de dos muestras problemas.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
Tubos de ensayo
Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l
Espectofotmetro
Agua destilada
Soluciones estndar de protena
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford
Reactivo de BCA
3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Mtodo de Biuret
Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla III.
Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.
Resultados
A545 nm
0 l
100 l
1 ml
25 l
75 l
1 ml
50 l
50 l
1 ml
75 l
25 l
1 ml
100 l
0 l
1 ml
M1
100 l
0 l
1 ml
M2
100 l
0 l
1 ml
Muestras
[protena]
Resultados
A595 nm
[protena]
Blanco
0 l
100 l
1 ml
25 l
75 l
1 ml
50 l
50 l
1 ml
75 l
25 l
1 ml
100 l
0 l
1 ml
Muestras
M1
100 l
0 l
1 ml
M2
100 l
0 l
1 ml
Resultados
A562 nm
0 l
100 l
1 ml
25 l
75 l
1 ml
50 l
50 l
1 ml
75 l
25 l
1 ml
100 l
0 l
1 ml
M1
100 l
0 l
1 ml
M2
100 l
0 l
1 ml
Muestras
[protena]
N0
Si
1% Triton X-100
No
Si
40% Sacarosa
No
Si
Si
Si
3% Sulfato amnico
No
Si
ANEXO 1: REACTIVOS
Reactivo de Biuret