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El documento describe varios métodos para medir la capacidad antioxidante total y específica de sistemas antioxidantes, incluyendo ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno como ORAC y TRAP, y ensayos basados en la transferencia de electrones como ABTS, DPPH, FRAP, DMPD y CUPRAC. También describe los principios y procedimientos de algunos métodos individuales como ORAC, TRAP, ABTS, DPPH y FRAP.
El documento describe varios métodos para medir la capacidad antioxidante total y específica de sistemas antioxidantes, incluyendo ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno como ORAC y TRAP, y ensayos basados en la transferencia de electrones como ABTS, DPPH, FRAP, DMPD y CUPRAC. También describe los principios y procedimientos de algunos métodos individuales como ORAC, TRAP, ABTS, DPPH y FRAP.
El documento describe varios métodos para medir la capacidad antioxidante total y específica de sistemas antioxidantes, incluyendo ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno como ORAC y TRAP, y ensayos basados en la transferencia de electrones como ABTS, DPPH, FRAP, DMPD y CUPRAC. También describe los principios y procedimientos de algunos métodos individuales como ORAC, TRAP, ABTS, DPPH y FRAP.
Los sistemas antioxidantes se pueden medir de diferentes formas especficas y el
sistema amortiguador antioxidante global se puede evaluar con las pruebas de capacidad antioxidante total. Dentro de las pruebas para evaluar o determinar la capacidad antioxidante podemos encontrar: ENSAYOS BASADOS EN LA TRANSFERENCIA DE TOMOS DE HIDRGENO (HAT). Monitorean una reaccin cintica competitiva, generalmente estn compuestos de un generador de radical libre sinttico, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Podemos encontrar en estos ensayos los siguientes mtodos:
Capacidad de absorcin del radical oxgeno (ORAC)
Parmetro antioxidante de captura de radicales (TRAP) Inhibicin de la oxidacin del cido linoleico Inhibicin de la oxidacin de los lpidos de baja densidad (LDL) Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno (ORAC). El mtodo ORAC consiste en medir la disminucin en la fluorescencia de una protena como resultado de la prdida de su conformacin cuando sufre dao oxidativo causado por una fuente de radicales perxido (ROO). El mtodo mide la capacidad de los antioxidantes en la muestra para proteger la protena del dao oxidativo. La protena usada es la fluorescena. El mecanismo de la reaccin se basa en la transferencia de un tomo de hidrogeno del antioxidante al radical libre. Por esto, se utiliza el radical iniciador, el AAPH, para generar el radical peroxil ROO. Un mol de AAPH, pierde un mol de nitrgeno, para generar dos moles de radical AAPH a una rata constante. En una solucin saturada de aire, el radical AAPH reacciona rpidamente con el oxgeno para dar un radical peroxil ms estable, ROO. La prdida de fluorescencia de la FL es el indicador de la extensin de la oxidacin con el radical peroxil. En presencia de un antioxidante, RRO capta, preferiblemente, un tomo de
hidrgeno del antioxidante estable. Como consecuencia, la disminucin de la
fluorescencia de la FL por accin del radical peroxil es disminuida o inhibida. El mtodo permite determinar los moles equivalentes de Trolox en un rango de 5 a 200 ug/ml, en donde el analito utilizado como referencia tiene un comportamiento lineal. Si las muestras lo requieren debern ser diluidas para alcanzar una concentracin que se encuentre en el rango establecido. Parmetro antioxidante de captura de radicales (TRAP). Este
ensayo
emplea
radicales
peroxilo
que
se
generan
mediante
descomposicin trmica de un compuesto hidrosoluble: ABAP
la
Una vez
adicionado a la muestra a estudio (plasma originariamente), la oxidacin de las
molculas es monitorizada, mediante la determinacin de oxgeno consumido. El periodo de induccin, en el que la oxidacin se inhibe mediante la accin de los compuestos antioxidantes en la muestra, se compara con el generado por el Trolox en iguales condiciones. ENSAYOS BASADOS EN LA TRANSFERENCIA DE ELECTRONES (ET) Involucran una reaccin redox con el oxidante como un indicador del punto final de reaccin. Dentro de estos ensayos podemos encontrar:
1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH+) Poder de reduccin antioxidante del hierro (FRAP) N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) Capacidad de reduccin antioxidante del cobre (CUPRAC)
Voltametra Cclica Kohen
Este ensayo evala el poder reductor total de molculas de bajo peso molecular. Una vez procesada la muestra se introduce en una celda donde se sitan 3 electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia, y un electrodo auxiliar. Se aplica un potencial constante (100 mV/seg) al electrodo de trabajo, bien hacia el potencial positivo (con lo que evaluaremos agentes reductores) o hacia el
potencial negativo (con lo que evaluaremos agentes oxidantes). Durante este
proceso se monitoriza una curva de corriente (voltamograma cclico). Desventaja: no todos los antioxidantes donan sus electrones a cualquier electrodo de trabajo seleccionado. Se necesitan varios electrodos para determinar antioxidantes concretos: glutatin no se detectara con este electrodo Au/Hg. El compuesto de referencia empleado suele ser el cido ascrbico.
Ensayo del DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo)
Este mtodo fue propuesto por Blois (1958) en el cual se demostr por primera vez la capacidad del radical libre DPPH + para aceptar un tomo de hidrgeno (H +) proveniente de una molcula de cistena. El procedimiento consiste en emplear un tiempo de reaccin de 20-30 min en vez de un tiempo de reaccin total de 120 minutos requerido para alcanzar el estado estacionario y completar la reaccin redox (Ojha et al., 2012). La mayora de los estudios expresan los resultados como el valor de la concentracin mxima de la media inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentracin inicial de DPPH al 50%.
El ensayo original de ABTS++ estaba basado en la activacin de la metilmioglobina
con perxido de hidrgeno en presencia de ABTS para producir un radical catin, en presencia o ausencia de antioxidantes. Un formato ms apropiado para el ensayo consiste en la tcnica de decoloracin, en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reaccin con los antioxidantes (Re et al., 1999). La tcnica mejorada para la generacin del radical catin ABTS ++, implica la produccin directa del cromforo ABTS ++ verde-azul a travs de la reaccin entre ABTS y el persulfato de potasio (K 2S2O8). Este presenta tres mximos de absorcin a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La adicin de los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado de decoloracin como porcentaje de inhibicin del radical catin ABTS ++ est determinado en funcin de la concentracin y el tiempo; as como del valor correspondiente usando el Trolox como estndar, bajo las mismas condiciones. Mtodo teac (trolox equivalent antioxidant capacity) El mtodo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), es un mtodo que sirve para cuantificar la capacidad antirradicalaria de los compuestos antioxidantes, es decir, sirve para cuantificar la captura de los radicales libres. El mtodo TEAC, se genera un radical libre positivo, estable, llamado ABTS (Acido 2,2 -azinobis-(3-etilbenzotioazoln-6- sulfnico) mediante una reaccin entre ste y el persulfato de potasio. A ste, se le aade el antioxidante que queremos estudiar, y comprobamos la disminucin de la absorvencia de la muestra, ya que el ABTS posee un grupo cromforo que observa la luz a 734 nm. Poder de reduccin antioxidante del hierro (FRAP) Determina la capacidad de la muestra para reducir un complejo de frrico con la molcula tripiridil s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (pH bajo). De este modo se genera una coloracin azul, de intensa proporcionalidad a la capacidad reductora
de la muestra (se genera un complejo ferroso-TPTZ) que puede cuantificarse por
colorimetra (593nm) en base a un patrn de sulfato ferroso. El ensayo FRAP es sencillo y fcilmente automatizable. Es rpido, generalmente la reaccin se completa entre 4 y 8 minutos. Sin embargo, en el caso de algunos polifenoles se han descrito reacciones ms lentas, llegando incluso a requerir 30 minutos hasta completar la reduccin del complejo. La reaccin no es especfica, y por tanto, cualquier reaccin con un potencial redox menos positivo originar la reduccin del complejo Fe 3+-TPTZ. N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) Este mtodo se basa en la reduccin del radical catin DMPD por los antioxidantes de la muestra. La generacin de este radical requiere un pH adecuado (5.25) y la adicin de una solucin de cloruro frrico. La absorbancia del radical se determina a 505 nm y los compuestos antioxidantes, una vez adicionados, son capaces de transferir un tomo de H+, provocando su decoloracin (proporcional a su concentracin). Slo puede disolverse en medio acuoso.