Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnologa
Laboratorio de ingeniera de productos
biolgicos
Practica No.1 Pruebas de efectividad de antibiticos
en diferentes organismos
Profesores:
Zamora Contreras Aida Margarita
Integrantes:
Acevedo Alfaro Laura Ivette
Cullar Rodrguez Azareel Jocelyn
Hernndez Rodrguez Claudia Anglica
Machado Archundia Javier Alejandro
Paredes Morales Yoloxochitl
GRUPO:
Equipo 1
2 de octubre de 2015

Tabla de contenido
1. Introduccin........................................................................................... 3
2. Objetivos................................................................................................ 5
3. Metodologa experimental.......................................................................6

Estndar de penicilina..........................................................................................6
Estndar de tetraciclina........................................................................................6
Estndar de estreptomicina..................................................................................6
Preparacin del inoculo:.......................................................................................7
Mtodo del cilindro-placa......................................................................................8
Mtodo turbidimtrico........................................................................................10

4. Resultados............................................................................................ 10
5. Discusin.............................................................................................. 12
6. Conclusiones......................................................................................... 13
7. Recomendaciones.................................................................................13
8. Referencias........................................................................................... 13
9. Anexos................................................................................................. 14

1. Introduccin
El antibiograma es un procedimiento por el cual se determina el grado de sensibilidad o
resistencia de una bacteria a un antibitico y representa un mtodo de diagnstico rpido y
preciso.
Con los resultados del antibiograma se clasifica a las bacterias en: SENSIBLE (ningn crecimiento
en las diluciones), INTERMEDIO (crecimiento a baja concentracin y no en la alta), RESISTENTE
(crecimiento en todas las diluciones). La informacin que proporciona el antibiograma es muy
valiosa, aunque no basta para el establecimiento de una terapia adecuada si se considera
aisladamente y se aplica sin tener en cuenta las peculiaridades del antimicrobiano, las
caractersticas clnicas del proceso infeccioso y las del propio paciente.
Los antibiticos se definen como sustancias producidas por diversas especies de
microorganismos (bacterias, hongos, actinomicetos) capaces de inhibir especficamente el
crecimiento o destruir otras especies microbianas. Sin embargo, el uso comn a menudo ha
ampliado el trmino de antibiticos, de modo que incluya antibacterianos sintticos tambin
llamados quimioterpicos (sulfamidas y quilonas).
Los antibiticos son sustancias que deben presentar:
Una elevada especificidad, es decir, que acten frente a
un grupo limitado de microorganismos.
Un alta potencia biolgica, es decir, que sean activos a
bajas concentraciones. Esta actividad antimicrobiana se
expresa como CMI (concentracin mnima inhibitoria) y
se define como la concentracin mnima del agente
antimicrobiano que es capaz de inhibir el crecimiento del
microorganismo.
Mnima toxicidad sobre las clulas humanas.
Capacidad de destruir las bacterias patgenas del organismo humano.
Tetraciclinas
Se caracterizan por un esqueleto comn de octahidronaftaceno formado por cuatro anillos
condensados y por su amplio espectro de actividad. La tetraciclina se obtiene por
deshalogenacin cataltica de la clortetraciclina y se introdujo en 1953. Para que las tetraciclinas
ejerzan su accin a nivel de ribosoma, se requiere que penetren a la clula del microorganismo
por mecanismos de difusin pasiva a travs de los canales hidrfilos (porinas) y por procesos de
transporte activo dependiente de energa. Una vez dentro, las tetraciclinas se unen de manera
reversible a los receptores en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano y de esta manera
bloquea la fijacin del aminoacil-tRNA al sitio aceptor en el complejo mRNA-ribosoma, esto evita
la incorporacin de nuevos aminocidos a la cadena peptdica en crecimiento, inhibiendo la
sntesis de protenas.

Las bacterias que desarrollan resistencia, habitualmente la presentan cruzada con otras. Los tres
mecanismos que dan lugar a este fenmeno son:
1) Prdida o disminucin de la permeabilidad
bacteriana
para
el
antibitico
o
la
adquisicin de una va de salida dependiente
de energa.
2) Menor acceso de la tetraciclina al ribosoma
bacteriano.
3) Formacin de enzimas bacterianas que
metabolizan al antibitico.

Penicilina
El ncleo activo de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico, constituido por una estructura
-lactmico-tiazolidnica anillada, la cual se una a una cadena
lateral variable.
El hongo utilizado industrialmente para la produccin de
penicilina es Penicillum chrysogenum y es especialmente activo
contra estafilococos, estreptococos, neumococos y la mayora
de las bacterias Gram positivas. A la penicilina producida
comercialmente se la llama penicilina G (bencil-penicilina),
aunque el mismo hongo produce varios tipos ms.
Acta mediante inhibicin de la biosntesis del pptido glicn (murena) de la pared celular que le
confiere la forma, rigidez y estabilidad a la membrana celular, haciendo a la bacteria permeable
e inestable. No es activa contra bacterias productoras de penicilinasa, entre las cuales figuran
muchas cepas de estafilococos.
Estreptomicina
La estreptomicina est incluida dentro de los aminoglucsidos, un tipo de antibitico que acta a
nivel ribosomal inhibiendo la sntesis proteica en la subunidad pequea del ribosoma (subunidad
30S) de forma que impide que se forme el complejo de iniciacin de la sntesis proteica.
Streptomyces griseus es el microorganismo sintetizador de la estreptomicina, Albert Schaltz,
hall dos cepas de esta bacteria las cuales sintetizaban el frmaco. S. griseus forma esporas
grises y pigmentos grises y amarillos cuando crece en colonia, se encuentra en el suelo y es
distinguible por su caracterstico olor a tierra mojada producido por un metabolito secundario, la
geosmina.
Existen diferentes mecanismos de resistencia frente a la estreptomicina: Inactivacin enzimtica
en el cual se sintetizan enzimas que catalizan la inactivacin; alteracin del ingreso, por diversos
mecanismos como las bombas de extrusin o el cambio en la conformacin de la molcula (por
ejemplo, aadir una adenina a la estreptomicina impidiendo as e paso de sta al interior de la
bacteria); alteracin del sitio de unin al ribosoma, se produce la mutacin de la protena S12.
Staphylococcus aureus

El gnero Staphylococcus est formado por cocos Gram positivos, con un dimetro de 0.5 a 1.5
m, agrupados como clulas nicas, en pares, ttradas, cadenas cortas o formando racimos de
uvas. Son bacterias no mviles, no esporuladas, no poseen cpsula, aunque existen algunas
cepas que desarrollan una cpsula de limo, son anaerobias facultativas. La mayora de los
estafilococos producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el perxido de hidrgeno en agua y
oxgeno libre); caracterstica que se utiliza para diferenciar el gnero Staphylococcus de los
gneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa negativos.
Entre las especies que colonizan al humano, las de mayor importancia clnica son: S. aureus y
Staphylococcus lugdunensis; en tanto que en animales se encuentra adems de S. aureus a
Staphylococcus intermedius. S. aureus es uno de los patgenos ms importantes a nivel
mundial, bacteria oportunista que forma parte de la microflora humana: poco despus del
nacimiento, los neonatos son colonizados por S. aureus, los sitios de colonizacin incluyen el
mun del cordn umbilical, el rea perineal, la piel y, a veces, el tracto gastrointestinal.
Tambin puede contaminar la vestimenta y la ropa de cama. La colonizacin ms frecuente por
S. aureus es la mucosa nasal, el principal reservorio lo constituye el hombre enfermo o el
portador. Un aspecto importante en aos recientes en salud p- blica son las infecciones por S.
aureus que han reemergido debido a que la bacteria se ha tornado resistente a diversos
antibiticos con los que normalmente se les trata.

Bacillus subtilis
Debido a sus caractersticas, Bacillus subtilis, microorganismo cuyo hbitat natural es el suelo, se
encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza. Entre sus principales caractersticas se
encuentra su capacidad para formar esporas en diversas condiciones de estrs, crecer en un
intervalo amplio de temperaturas (desde 15 hasta 55 C), presentar motilidad, aerotaxis y
velocidades de crecimiento altas, sobrevivir en concentraciones salinas (hasta el 7% de NaCl),
producir una amplia variedad de antibiticos y enzimas hidrolticas extracelulares (catalasa) y
ser una bacteria gram positiva.

Esta bacteria se encuentra en los suelos y es raramente patognica (las enfermedades que
puede causar incluyen intoxicacin).

2. Objetivos
General:
Determinar la potencia de 3 antibiticos: Tetraciclina, Penicilina y Estreptomicina.
Especficos:
o Conocer los mtodos existentes para determinar la eficacia teraputica de un antibitico.
o Realizar la curva patrn de penicilina, estreptomicina y tetraciclina de acuerdo a la
FARMACOPEA.
o Determinar la CMI de los diferentes antibiticos.

3. Metodologa experimental
Estndar de penicilina

Pesar
Peniclina para una concentracion final de 1000U/mL

Diluir
1000U/mL a 100U/mL, 10U/mL, 1U/mL y 0.1U/mL.
Estndar de tetraciclina

Pesar
Peniclina para una concentracion final de 1mg/mL

Diluir
1mg/mL a 0.75mg/mL, 0.5mg/mL, 0.24mg/mL y 0.16mg/mL
Estndar de estreptomicina

Pesar
Peniclina para una concentracion final de 100mg/mL

Diluir
100mg/mL a 50mg/mL, 25mg/mL, 13mg/mL y 6mg/mL
Preparacin del inoculo:

-Staphylococcus aureus
-Bacillus subtilis

Sembrar
En un tubo de agar nutritivo

Incubar
El microorganismo en el tubo

Solucion salina

Mtodo del cilindro-placa

Durante 24 horas

Aadir
Ajustarla a 25% transmitancia a
580nm.

Incubar
A temperatura ambiente de 4 a 5 dias

Aadir
50 L de tres diluciones previasmente elegidas.

Colocar
2 cilindros sobre las placas gelificadas

10 mL del medio inoculado sobre la placa con medio No.2

Dejar solidificar

Al medio No.1, 0.1mL de Staphylococcus aureus o Bacillus

subtilis de la asuspencion ajustada a 25% transmitancia.

20 mL medio No.2 en cajas petri.

Elegir tres diluciones.
Dejar solidificar.

Aadir

Aadir

Aadir

Mtodo turbidimtrico

Colocar
9mL del medio para
antibioticos liquido
Aadir
0.01mL del
inoculo
Aadir
1 mL de cada
dilucion elegida
anteriormente
Incubar

A
temperatu
ra
ambiente
de 4 a 5
dias
Aadir 0.5mL de formaldehido al 12% y leer
en absorbancia a 530nm

4. Resultados
Tabla 1. Resultados obtenidos por el mtodo de turbidimetra
Microorganismo
Bacillus subtilis

Antibitico
Tetraciclina

Staphylococucs
auerus

Penicilina

Resultados (nm)
Control negativo 0
0.5 mg/mL 0.122
0.24 mg/mL 0.334
0.16 mg/mL 0.378
Control positivo
0.479
Control negativo 0
1.1 U/mL 0.066
2 U/mL 0.070
10 U/mL 0.012
Control positivo
0.187

Tabla 2. Resultados obtenidos por el mtodo de cilindro placa o antibiograma

Microorganismo
Bacillus subtilis

Antibitico
Penicilina

Bacillus subtilis

Tetraciclina

Staphylococucs
auerus

Estreptomicina

Resultados
0.1 U/mL 2.5
1 U/mL 3.5
10 U/mL 4.0
100 U/mL 5.5
1000 U/mL 7.0 cm
0.16 mg/mL 1.5 cm
0.24 mg/mL 1.8 cm
0.5 mg/mL 2.4 cm
0.75 mg/m 3 cm
1 mg/mL 5cm
50 mg/mL 1cm
100 mg/mL 1.5 cm

En la metodologa experimental se utilizaron 3 antibiticos diferentes en conjunto

con dos microorganismos, tetraciclina, penicilina y estreptomicina y Bacillus
subtilis, y Staphylococus aureus respectivamente.
En la Tabla 1 se pueden observar los resultados obtenidos por el mtodo de
turbidimetra, en los cuales a mayor concentracin de antibitico, se tiene menor
crecimiento celular, lo cual es debido a que las cepas utilizadas no contaban con
ningn plsmido (inducido) que les confirieran resistencia a dichos antibiticos.
La tetraciclina tiene un amplio espectro y acta sobre bacilos Gram + y Gram y
funciona al acceder al interior celular por un doble mecanismo de difusin pasiva y
transporte activo, unindose a subunidad 30S del ribosoma bacteriano bloqueando
la fijacin del aminoacil-tRNA al sitio aceptor del complejo formado por el mRNA y
la subunidad 50S del ribosoma. Acta como bacteriostticos al impedir la adicin
de nuevos aminocidos a la cadena peptdica en crecimiento. La resistencia a
tetraciclinas se establece lentamente y son inducibles.
Mientras que la penicilina impide el crecimiento microbiano al afecta a la pared de
peptidoglucano, lo cual afecta la rigidez de la bacteria, debilitndola y haciendo
que el paquete celular se disperse, inhabilitando a la bacteria.
Se tiene el mtodo de antibiograma el cual es muy utilizado en las industrias
lecheras para determinar la cantidad y tipo de microorganismos en la leche y as
poder eliminarlos (Gatica et al., 2007; Reyes et al., 2001). Los resultados obtenidos
por este mtodo se muestran en la Tabla 2, donde el halo de inhibicin es ms
grande a mayor concentracin de antibitico, lo cual indica que la metodologa
experimental fue realizada correctamente y las bacterias contenidas en las cajas
Petri no cuentan hasta el momento con resistencia a esos antibiticos en particular.

5. Discusin
o

De acuerdo a los resultados obtenidos en la tabla 1, se observa un comportamiento no

lineal entre la concentracin de antibitico utilizado y la inhibicin observada por medio
del anlisis de la turbidez, esto podra significar, en el caso de la tetraciclina; que a partir
de una concentracin menor a 0.24mg/ml el efecto de esta no tiene un efecto inhibitorio
significativo ya que los valores de esta concentracin y la mitad de esta son muy
cercanos al valor en el control positivo.

De lo anterior tambin se puede mencionar que una dosis de 0.5mg/ml muestra un efecto
inhibitorio considerable al reducir la carga microbiana en trminos de turbidez en una
lectura casi 4 veces menor que la del control positivo.

Con respecto a los resultados mostrados en la tabla 2 se puede considerar que 1mg de
tetraciclina se aproxima a 1000 Unidades de Potencia (Arias Thomas D 1999) ; en cuyo
caso basta con multiplicar por mil los resultados de dicha seccin en la tabla:

p ej. 1 mg/ml 1000U / ml

o

Tomando esta consideracin se puede hacer el anlisis cuantitativo entre penicilina y

tetraciclina administrados a Bacillus subtilis; observando que la penicilina tuvo un mayor
efecto inhibitorio en todas las concentraciones probadas; esto demuestra la
susceptibilidad de este microorganismo por antibiticos inhibidores de la replicacin de
ADN como lo son los -lctamicos.

En cuanto al anlisis de la accin de la estreptomicina frente al Staphylococucs auerus

Es difcil calcular una concentracin mnima inhibitoria basndonos en nuestros resultados

ya que en todos los experimentos se tuvo cierta inhibicin significativa ya sea en menor o
mayor medida; para poder calcular este parmetro ser necesario realizar de nuevo los
experimentos a una menor dosis de antibitico para poder as alcanzar una ausencia clara
de halo en el antibiograma y as establecer que concentracin de antibitico es la mnima
necesaria para producir inhibicin.

El nico dato fuera de lo esperado es el del anlisis turbidimtrico Con respecto a la

concentracin de 0.1 y 1 U ya que el de menor concentracin tuvo un mayor error;
atribuimos este error a la preparacin de los estndares de antibiticos a utilizar ya sea
por un pesado deficiente o un error al hacer las diluciones.

Medio para antibiticos No1-Medio estndar utilizado para preparar capa los ensayos de
la potencia antibitica de preparaciones de bacitracina y penicilina. Este medio tiene la
misma frmula estndar con la diferencia de que el pH del medio se ajust a 6,6 0,1.

Medio para antibiticos No2Es el medio estndar utilizado para preparar la base de la
capa en el ensayo microbiolgico de antibiticos. Se utiliza en ensayos microbiolgicos de
antibiticos tales como bacitracina, cloranfenicol y penicilina.

Medio para antibiticos No3-- En el mtodo de discos en placas, este medio se utiliza para
resuspender el inculo en el ensayo de la potencia para la penicilina, eritromicina,
neomicina, clortetraciclina y cloranfenicol. El mtodo de dilucin en serie se utiliza para el
ensayo de la penicilina. Por ltimo, este medio tambin puede ser utilizado en la

se pude decir que este es susceptible de manera considerable a altas dosis de

este antibitico ya que la concentracin utilizada de este fue mucho mayor con
respecto a la de los anteriores.

determinacin turbidimtrica de la potencia de la bacitracina, estreptomicina y

terramicina.

6. Conclusiones
o
o
o
o
o

Se trabaj en condiciones de asepsia y esterilidad ya que los controles negativos en

ambos experimentos tuvieron un resultado de cero esto da confiabilidad a los resultados
anteriormente mostrados.
Se determin la potencia de antibiticos mediante dos mtodos encontrando valores
semejantes entre ambos mtodos.
Se determin la susceptibilidad de 3 bacterias diferentes con3 diferentes antibiticos.
Se hizo un estudio del efecto concentracin vs potencia mediante la utilizacin de la
tcnica de antibiograma por halos de inhibicin.
Los antibiticos utilizados para las diferentes bacterias muestra buenos resultados de
inhibicin.
EL mtodo turbidimetrico en este caso no es confiable ya que se muestran ciertas
inconsistencias en los resultados.

7. Recomendaciones
o
o

Para disminuir las variaciones en los experimentos y que los alumnos puedan visualizar
una continuidad del mismo, es recomendable que cada equipo prepare su propia curva de
antibitico.
Con el objetivo de tener ms bases para comparar, se recomienda que todos los equipos
realicen un ensayo de cada mtodo.

8. Referencias
Gatica Cristina y Geshe Ericka (2007), Mtodo de las 5 Placa Para la Deteccin de
Residuo de Antibacterianos en Leche. Revista cientfica FCV-LUZ, Volumen XVII, No
3, 231-237.
Reyes Faras, Allara Cagnasso, Izquierdo Crser, DPool, Garca Urdaneta y Valero-Leal
(2001), Resistencia a los antimicrobianos de especies de Bacillus aislados de leche
cruda, Revista cientfica FCV-LUZ, Volumen XI, No 6, 479-484.
Garca Ma. Jos, Silva Ma. Del Carmen (2004). Manual del Tcnico Superior de
Laboratorio de Anlisis Clnicos. Editorial Mad, Primera Edicin. Espaa
ngel G. & ngel M. (2006) Interpretacin Clnica del Laboratorio. Editorial Mdica
Internacional. Sptima Edicin. Bogot
Actualidades Farmacolgicas: Tetraciclinas consultado el 28 de septiembre de 2015 en:
http://www.ejournal.unam.mx/rfm/no51-1/RFM051000106.pdf
Penicilinas: Compendio General consultado el 28 de septiembre de 2015 en:
http://www.terapeuticaveterinaria.com/antibioticos/betalactamicos/penicilinas
Penicilinas
consultado
el
28
de
septiembre
de
2015
en:
http://bvs.sld.cu/revistas/act/vol8_1_98/act04198.pdf
Estreptomicina
consultado
el
28
de
septiembre
de
2015
en:
http://microbiologiaumh.blogspot.mx/2011/05/estreptomicina.html
Caractersticas generales de Staphylococcus aureus consultado el 28 de septiembre de
2015 en: http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2014/pt141e.pdf

9. Anexos
Imgenes de antibiogramas de tetraciclina-bacillus subtillis

Figura 1 imagen
representativa de
antibiograma co
concentracin de
0.16mg/ml
(tetraciclina)

Figura 2 imagen
representativa de
antibiograma con
concentraciones de
0.24mg/ml
0.5mg/ml de

Figura 4 Imagen ilustrativa de tubos analizados por

turbidimetra
De izquierda a derecha
(Control (+), 0.16mg/ml, 0.24mg/ml, 0.5mg/ml,
Control(-) )

Figura 3 imagen
representativa de
antibiograma con
concentraciones de
0.75mg/ml y 1mg/ml
de tetracicliana