Bruna Amorim Pires

Bruna Amorim Pires
OTIMIZAO DE UM MTODO ANALTICO

PARA A DETERMINAO DE
HIDROCARBONETOS POLICCLICOS
AROMTICOS (HPAs) EM SEDIMENTOS
ESTUARINOS
Departamento de Qumica e Bioqumica

Faculdade de Cincias da Universidade do Porto
2012
Bruna Amorim Pires
OTIMIZAO DE UM MTODO ANALTICO PARA A

DETERMINAO DE HIDROCARBONETOS
POLICCLICOS AROMTICOS (HPAs) EM
SEDIMENTOS ESTUARINOS
Tese submetida Faculdade de Cincias da Universidade do Porto para a obteno do grau

de Mestre em Qumica
Jri:
Prof. Doutora Maria das Dores Ribeiro da Silva, Professora Associada do Departamento de Qumica e
Bioqumica da Faculdade de Cincias da Universidade do Porto (Diretora do 2 Ciclo de Estudos em
Qumica) Presidente
Prof. Doutor Baltazar Manuel Romo de Castro, Catedrtico do Departamento de Qumica e
Bioqumica da Faculdade de Cincias da Universidade do Porto;
Prof. Doutora Maria Clara Ramalho Monteiro Pires Basto, Professora Auxiliar do Departamento de
Qumica e Bioqumica da Faculdade de Cincias da Universidade do Porto (Orientadora)
Prof. Doutor Paulo Joaquim Ferreira de Almeida, Professor Auxiliar do Departamento de Qumica e
Bioqumica da Faculdade de Cincias da Universidade do Porto.
Departamento de Qumica e Bioqumica

Faculdade de Cincias da Universidade do Porto
2012
Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos
Agradecimentos
Em primeiro lugar quero agradecer Dra. Cristina Marisa Almeida minha coorientadora e ao
Dr. Pedro Carvalho pela incansvel ajuda e troca de ideias nos diversos problemas surgidos ao
longo do trabalho e orientao dada, sem os quais seria impossvel realizar este trabalho.
Queria tambm agradecer Dra. Maria Clara Basto, minha orientadora, pela fantstica
disponibilidade demonstrada e pelo inexcedvel apoio dado durante todo o trabalho sem o
qual seria impossvel realizar este projeto.
Ao resto do grupo de trabalho, Marta, Joana, Paulo, Teodor, Cristina e Mafalda pelo
companheirismo e amizade.
Ao meu namorado, Rui Silva, pela amizade e apoio emocional dado nesta fase muito
importante da minha vida.
Aos meus melhores amigos, Catarina Trancoso, Cristina Pina, Rita Afonso, Daniela Correia,
Maria Joo Furtado; Sofia Suarez, Edgar Oliveira, Ricardo Castro, Tiago Ventura, Ludovic,
Lus Barata, Ablia Moreno, Brbara Oliveira e Carlos Gensio obrigada por existirem na
minha vida.
Aos meus amigos da faculdade, Margarida Carvalho, Christiane Santos, Lia Lima, Eliana
Malheiro, Ins Camoiana, Gonalo Ribeiro, ngelo Oliveira e Teresa Alves, sem vocs estes
anos no teriam sido iguais!
Por ltimo, um profundo e sincero agradecimento, ao que a base de tudo na minha vida, os
meus pais e irmos, pelo carinho, compreenso e apoio sem os quais nada teria sido possvel.
A todos, um muito obrigado!
ii
Resumo
Os hidrocarbonetos aromticos policclicos (HPAs) so compostos altamente lipoflicos.
Dezasseis HPAs tm efeitos txicos nos organismos e so classificados como poluentes
prioritrios pela EPA, a Agncia Norte Americana para o Ambiente.
Os esturios so recursos valiosos por variadas razes. No entanto, as reas estuarinas esto
expostas a uma vasta gama de poluentes, nomeadamente hidrocarbonetos de petrleo como os
HPAs, poluentes que podem afetar negativamente este habitats incluindo os mltiplos sapais
caractersticos destas zonas. As plantas, nomeadamente as plantas de sapal, tm capacidade
para alterar as condies fsicas e qumicas do solo, aumentar a biomassa microbiana,
fornecer exsudatos e biomassa que formam a matria orgnica do solo e libertar enzimas
oxidativas na zona envolvente das suas razes, numa rea comummente designada por
rizosfera. Esta influncia das plantas pode inclusivamente afetar a distribuio de diversos
poluentes, contribuindo em alguns casos para a sua remoo/eliminao (a chamada
fitorremediao) diminuindo assim a carga poluente nos ambientes estuarinos.
Assim, o objetivo deste trabalho foi a otimizao de mtodos de determinao de HPAs em
sedimentos para estudar o potencial efeito da rizosfera de plantas de sapal na distribuio de
HPAs em ambientes estuarinos. A deteo e quantificao de HPAs foram realizadas usando
microextrao em fase slida (SPME) acoplada a cromatografia em fase gasosa com deteo
por espetrometria de massa (GC-MS), aps extrao dos hidrocarbonetos do sedimento.
Numa etapa inicial, foi adaptado da literatura um mtodo cromatogrfico de determinao de
HPAs tendo, posteriormente, sido otimizadas as condies de SPME. As condies de SPME,
quer por headspace quer por fibra imersa, foram testadas a diferentes temperaturas de
extrao tendo os resultados indicado que a extrao a uma temperatura de 80 C em
headspace corresponde que permite a deteo simultnea dos HPAs mais leves e mais
pesados. Os tempos de reteno dos HPAs e as curvas de calibrao de cada composto foram
obtidos usando solues padro contendo os 16 HPAs. No entanto, apenas 10 HPAs foram
detetados. Foi observada linearidade no intervalo de concentraes 10-1500 ng L-1. O limite
de deteo variou entre os 2 e 14 ng L-1 e o limite de quantificao entre 8 e 45 ng L-1. A
extrao dos HPAs da matriz dos sedimentos foi realizada utilizando duas tcnicas, ultrassons
e extrao assistida por micro-ondas. Para tal, um sedimento de referncia foi submetido a
extrao, utilizando diferentes solventes: metanol, diclorometano, etanol e uma mistura de
hexano / acetona (1:1). Os resultados indicaram que a tcnica de extraco por ultrassons,
usando metanol como solvente extrator, a mais adequada. Aps validao, a metodologia
iii
global foi aplicada a amostras de sedimento estuarino para a determinao da respetiva

contaminao por HPAs e para a realizao do estudo da influncia de plantas de sapal na sua
distribuio nos sedimentos. A metodologia global demonstrou poder ser aplicada para a
quantificao dos compostos em concentraes na faixa dos nanogramas por litro ou ng por g
de sedimento. A aplicao da metodologia determinao das concentraes de HPAs em
sedimentos estuarinos vegetados e no vegetados permitiu concluir que a presena das plantas
estudadas no teve influncia significativa na distribuio dos HPAs nos referidos
sedimentos.
iv
Abstract
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are highly lipophilic compounds. Sixteen PAHs
have toxic effects on organisms and are classified as priority pollutants by the EPA, U.S.
Agency for Environment. Estuaries are valuable resources for various reasons. However,
estuarine areas are exposed to a wide range of pollutants, especially petroleum hydrocarbons
such as PAHs, pollutants that can negatively affect these habitats including salt marshes
characteristic of these zones. Plants, including the salt marsh plants, have the capacity to
change the physical and chemical conditions of the soil, increasing microbial biomass,
supplying exudates, increasing the soil organic matter and releasing oxidative enzymes in the
surrounding area of its roots, an area commonly called the rhizosphere. This influence of
plants can even affect the distribution of various pollutants, contributing in some cases for
their removal / disposal (called phytoremediation) thus reducing the pollutant load in
estuarine environments. The objective of this work was the optimization of an analytical
method for PAHs determination in sediments to study the potential effect of the rhizosphere
of salt marsh plants in the PAHs distribution in estuarine environments. Detection and
quantification of PAHs was performed using solid phase microextraction (SPME) coupled
with gas chromatography with detection by mass spectrometry (GC-MS) after extraction of
the hydrocarbons from the sediment. In an initial step, a chromatographic method for the
determination of PAHs was adapted from the literature, being subsequently optimized the
conditions for SPME. SPME conditions, either by headspace or by immersed fiber, were
tested at different temperatures. Results indicated that extraction at a temperature of 80 C in
headspace enables the simultaneous detection of lighter and heavier PAHs, being the one
chosen. The retention times of PAHs and calibration curves for each compound were obtained
using standard solutions containing the 16 PAHs. However, only 10 HPAs were detected.
Linearity was observed over the concentration range 10-1500 ng L-1. The limit of detection
ranged between 2 and 14 ng L-1 and the limit of quantitation between 8 and 45 ng L-1. The
extraction of PAHs from the sediment matrix was performed using two techniques, ultrasound
and microwave assisted extraction. Reference sediment was subjected to extraction using
different solvents: methanol, dichloromethane, ethanol and a mixture of hexane / acetone
(1:1). The results indicate that the best extraction was achieved using methanol as solvent and
ultrasound extraction. After proper validation, the overall methodology was applied to
samples of estuarine sediments for determining the respective PAHs contamination and for
the study of the influence of salt marsh plants in their distribution in sediments. The
v
methodology can be applied to the quantification of the compounds in concentrations in the

range of ng L-1 or ng g-1 of sediment. The methodology for determining the concentrations of
PAHs in estuarine sediments vegetated and non-vegetated concluded that the presence of the
plants studied had no significant influence on the distribution of PAHs in these sediments.
vi
NDICE GERAL
AGRADECIMENTOS .................................................................................................................... i
RESUMO ................................................................................................................................. iii
ABSTRACT .............................................................................................................................. v
NDICE GERAL ........................................................................................................................ vii
NDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. xi
NDICE DE TABELAS .............................................................................................................. xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ..................................................................................... xv
CAPTULO I - INTRODUO....................................................1
1. INTRODUO ...................................................................................................................3
1.1. HIDROCARBONETOS AROMTICOS POLICCLICOS (HPAS) ....................................3
1.2. SEDIMENTOS.................................................................................................................5
1.3. SISTEMAS ESTUARINOS..............................................................................................6
1.4. REMEDIAO DE SOLOS E SEDIMENTOS .................................................................8
1.5. MTODOS ANALTICOS APLICADOS NA DETERMINAO DE HPAS ......................9
1.5.1. MTODOS DE EXTRAO .......................................................................................10
1.5.1.1. EXTRAO POR BANHO de ULTRASSONS.....................................................................10
1.5.1.2 EXTRAO ASSISTIDA POR MICRO-ONDAS ....................................................................11
1.5.2. MICROEXTRAO EM FASE SLIDA SPME...................................................................12
1.5.2.1. Extrao por fibra imersa.........................................................................................13
1.5.2.2. Extrao em headspace ..........................................................................................14
1.5.2.3. Aspetos prticos para a otimizao da SPME .........................................................14
1.5.3.CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA ...............................................................................15
1.5.4. DETEO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA .................................................................16
1.5.5. AQUISIO DE DADOS ...................................................................................................17
1.6. VALIDAO DO MTODO ANALTICO ......................................................................18
1.6.1. PARMETROS ANALTICOS ............................................................................................. 18
1.6.1.1. Seletividade.............................................................................................................18
vii
1.6.1.2. Linearidade e curva analtica ...................................................................................19

1.6.1.3. Preciso ..................................................................................................................19
1.6.1.3.1. Repetibilidade.......................................................................................................20
1.6.1.3.2. Preciso intermdia .............................................................................................. 20
1.6.1.3.3. Reprodutibilidade..................................................................................................20
1.6.1.4. Exatido ..................................................................................................................21
1.6.1.5. Ensaios de recuperao ..........................................................................................21
1.6.1.6. Limite de deteo (LD) ............................................................................................ 21
1.6.1.7. Limite de Quantificao (LQ) ...................................................................................22
1.7. OBJETIVOS DO TRABALHO.......................................................................................23
1.8. ESTRUTURA DA DISSERTAO ...............................................................................23
CAPTULO II MATERIAL E MTODOS ...............................25

2. MATERIAL E MTODOS.................................................................................................27
2.1. REAGENTES, SOLUES E MATERIAL UTILIZADO ................................................27
2.2. SEDIMENTOS...............................................................................................................27
2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ..........................................................................28
2.3.1. EXTRAO POR ULTRASSONS .......................................................................................28
2.3.2. EXTRAO ASSISTIDA POR MICRO-ONDAS......................................................................28
2.3.3. EXTRAO POR SPME .................................................................................................29
2.3.4.ANLISE POR GC-MS....................................................................................................30
2.3.4.1.Aquisio de dados por GC-MS ...............................................................................30
CAPTULO III OTIMIZAO DO MTODO ANALTICO ....33

3. OTIMIZAO DO MTODO ANALTICO........................................................................35
3.1. OTIMIZAO DOS PARMETROS DE SPME ............................................................ 35
3.2. OTIMIZAO DOS PARMETROS DE EXTRAO DOS ANALITOS POR
ULTRASSONS E MICRO-ONDAS.......................................................................................39
viii
3.3. CARACTERISTISCAS DO MTODO ANALTICO .......................................................45

3.3.1. SELETIVIDADE ..............................................................................................................45
3.3.2. LINEARIDADE................................................................................................................46
3.3.3. LIMITES DE DETEO (LD) E QUANTIFICAO (LQ) ........................................................47
3.3.4. PRECISO ....................................................................................................................48
3.3.4.1. Repetibilidade e Reprodutibilidade ..........................................................................48
3.3.5. RECUPERAO ............................................................................................................49
CAPTULO IV HPAS EM SEDIMENTOS DO SAPAL DO

ESTURIO DO RIO LIMA .......................................................51
4. HPAS EM SEDIMENTOS DO SAPAL DO ESTURIO DO RIO LIMA............................. 53
4.1. GRAU DE CONTAMINAO DOS SEDIMENTOS COM HPAS ..................................55
4.2. DISTRIBUIO DOS HPAS EM SEDIMENTOS ESTUARINOS ..................................59
CAPTULO V CONSIDERAES FINAIS ...........................61

5. CONSIDERAES FINAIS ............................................................................................. 63
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................65
ANEXOS ..................................................................................73
ix
NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Estrutura dos dezasseis HPAs considerados prioritrios pela EPA ......................4
Figura 2.1 Local de amostragem dos diversos sedimentos estuarinos, vegetados e no
vegetados. Figura adaptada de Almeida et al, 2011. Local L1 e L2 colonizado por Juncus
maritimus, local L3 colonizado por Juncus maritimus, Phragmites australis, Triglochin striata
e local L4 colonizado por Juncus maritimus e Spartina patens.............................................28
Figura 2.2. Frascos e suporte para micro-ondas..................................................................29
Figura 3.1. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs de concentrao 200 ng L-1
analisada por SPME headspace a diferentes temperaturas (C). .........................................36
analisada por SPME headspace a diferentes temperaturas (C). .........................................36
analisada por SPME com fibra imersa a diferentes temperaturas (C). ................................ 37
analisada por SPME com fibra imersa a diferentes temperaturas (C). ................................ 37
Figura 3.5. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs com concentrao de 100 ng
L-1 analisada por SPME quer em headspace quer com fibra imersa.....................................38
Figura 3.6. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs com concentrao de 1000 ng
L-1 analisada por SPME quer em headspace quer com fibra imersa.....................................39
Figura 3.7a. Valores mdios dos sinais (e respetivos desvios padro) de HPAs com menor
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons)
usando diferentes solventes extratores.. ..............................................................................40
Figura 3.7b. Valores mdios dos sinais (e respetivos desvios padro) de HPAs com maior
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons)
usando diferentes solventes extratores. ...............................................................................40
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons com
metanol) com diferentes tempos de extrao dos HPAs.. ....................................................41
xi
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons com
metanol) com diferentes tempos de extrao dos HPAs. .....................................................42
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao assistida por
micro-ondas) com dois solventes. ........................................................................................43
massa molar obtidos na anlise de extratos de sedimento (aps extrao assistida por
micro-ondas) com dois solventes. ........................................................................................44
Figura 3.10. Cromatograma de uma soluo padro de HPAs com concentrao 1500 ng L1
. Naftaleno (1), acenaftileno (2), acenafteno (3), fluoreno (4), fenantreno (5), antraceno (6),
fluoranteno (7), pireno (8), benzo(a)antraceno (9), criseno (10). ..........................................45
xii
NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Programa (tempo (T), potncia (E), temperatura (T1) e presso (P)) do cook
book utilizado na extrao assistida por micro-ondas...........................................................29
Tabela 2.2 Tempos de reteno dos HPAs analisados e dos padres internos ...................31
Tabela 2.3. Ies de quantificao e de diagnstico usados na anlise de GS-MS. ..............32
Tabela 3.1. Valores dos coeficientes de correlao das retas de calibrao para os HPAs
estudados............................................................................................................................. 46
Tabela 3.2. Limites de deteo (LD) e de quantificao (LQ) para cada HPA estudado. .....47
Tabela 3.3. Valores da repetibilidade (%), reprodutibilidade (%) e RSD (%) para cada HPA.48
Tabela 3.4. Valores de concentrao em ng g-1 no sedimento de referncia (NIST 1941b) e
valores experimentalmente obtidos (mdia e respetivo desvio padro, n=3), valores de
coeficientes de variao (CV) e fatores de recuperao em percentagem. ..........................49
Tabela 4.1. Contedo em matria orgnica (MO desvio padro relativo, n=3) e
granulometria dos sedimentos vegetados (rizosedimentos) e no vegetados do esturio do
Rio Lima. Adaptado de Almeida et al, 2011..........................................................................54
Tabela 4.2. Concentraes de HPAs (ng g-1) (mdia e respetivo desvio padro, n=3) nas
amostras de sedimento no vegetado nos quatro locais do esturio do Rio Lima. Os limites
de deteo (LD) e quantificao (LQ) so tambm apresentados. .......................................55
amostras de rizosedimento do esturio do Rio Lima nos locais L1 e L2............................... 56
amostras de rizosedimento do local L3 do esturio do Rio Lima.. ........................................57
amostras de rizosedimento do local L4 do esturio do Rio Lima. .........................................58
xiii
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS

AcP-d10 Acenafteno deuterado
CG/MS Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
Ch-d12 Criseno deuterado
CRM Materiais de referncia certificados
CV Coeficiente de variao
Cwx- Carbowax
EPA Environmental Protection Agency
FullScan Varrimento total
HPAs Hidrocarbonetos Policclicos Aromticos
ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human use
Kfh Coeficiente de distribuio (fibra/headspace)
Khm Coeficiente de distribuio (headspace/matriz)
LD Limite de Deteo
LQ Limite de Quantificao
MAE Extrao assistida por micro-ondas
MM Massa molar
N-d8 Naftaleno deuterado
NIST National Institute of Standards and Technology
PA- Poliacrilato
PCBs Bifenilos policlorados
P-d10 Fenantreno deuterado
PDMS - Polidimetilsiloxano
PFA Perfluoroalkoxy polymer resin
xv
POPs Poluentes Orgnicos Persistentes

R Coeficiente de correlao
Rpm Rotaes por minuto
RSD Desvio padro relativo
SIS- Monitorizao de ies selecionados
SPME Microextrao em Fase Slida
s Desvio padro
S - Declive
xvi
CAPTULO I
INTRODUO
1. Introduo
1.1. Hidrocarbonetos Aromticos Policclicos (HPAs)
Os hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs) so poluentes orgnicos persistentes
(POPs), os quais tm um elevado impacto no meio ambiente e, por isso, so motivo de
numerosos estudos (Macdonald et al, 2005). So compostos orgnicos potencialmente txicos
que tm como principais caractersticas a alta hidrofobicidade, baixa reatividade no meio
ambiente e grande tendncia para se acumular nos tecidos dos organismos vivos
(Schwarzenbach et al, 1991). Os HPAs so caracterizados como ambientalmente estveis,
resistentes degradao, bioacumulveis, hidroflicos e txicos (Kennish, 1997; Sundt et al,
1998; Baumard et al,1998). Os HPAs constituem uma numerosa e diversificada famlia de
contaminantes orgnicos lipoflicos amplamente distribudos nos ecossistemas, sendo
identificados em reas remotas distantes de fontes antropognicas (Macdonald et al, 2005).
Os HPAs podem estar presentes nas formas gasosas, particulada e/ou dissolvida, podendo ser
detetados na gua, solo, sedimento, material particulado atmosfrico, organismos aquticos e
alimentos (Kennish, 1997). Muitos dos HPAs so produzidos durante a combusto
incompleta, a altas temperaturas, de carvo, petrleo, gs, madeira e outras substncias
orgnicas e, deste modo, emitidos para o meio ambiente (Lopes et al, 1996). Somente alguns
HPAs so utilizados comercialmente, entre os quais, o naftaleno (inseticida e repelente) e o
fenantreno (intermedirio nas snteses de inseticidas e resinas) (International Programme on
Chemical Safety, 1998).
Os HPAs fazem parte de uma famlia de compostos que se caracterizam por possurem dois
ou mais anis aromticos condensados e que pode ser dividida em duas classes: compostos
com baixa massa molecular, com massa molar menor que 202 (naftaleno ao fenantreno) e
compostos com alta massa molecular, massa molar igual ou superior a 202 (do fluoranteno ao
indeno(1,2,3-cd)pireno) (Silva, 2002). At data, mais de 100 HPAs foram caracterizados na
natureza, 16 dos quais foram classificados pela Environmental Protection Agency, EPA,
como poluentes prioritrios. A Figura 1.1 (Yan et al, 2004) mostra as estruturas de alguns
HPAs importantes, incluindo os dezasseis HPAs considerados prioritrios pela EPA:
Figura 1.1 Estrutura dos dezasseis HPAs considerados prioritrios pela EPA (Yan et al, 2004)
A contaminao da atmosfera, meio aqutico e solo pode alterar de forma irreparvel o

equilbrio dos ecossistemas, colocando em risco a sade humana. A ao adversa dos HPAs
sobre os organismos vivos pode ser exercida diretamente ou atravs dos seus derivados,
muitos deles ainda desconhecidos. Muitos destes compostos aromticos possuem
caractersticas mutagnicas e/ou txicas confirmadas (Chen et al, 2004). Em geral, a
solubilidade em gua diminui com o aumento do nmero de anis aromticos. Os HPAs
apresentam tambm grande afinidade lipoflica, que aumenta com o nmero de anis
aromticos na molcula (Lopes et al, 1996; Schwarzenbach et al, 1991). Por outro lado, a
volatilidade destes compostos diminui com o aumento da massa molar e, consequentemente,
os HPAs de massas molares menores so mais volteis e apresentam maior presso de vapor
que os mais pesados. Como consequncia destas propriedades, estas substncias podem ser
encontradas na atmosfera tanto em fase gasosa como adsorvidas no material particulado em
suspenso. No solo, os HPAs encontram-se geralmente adsorvidos no material constituinte e
ficam retidos nas camadas superiores (Pereira Netto et al, 2000). Nos corpos de gua
4
superficiais, estes compostos so geralmente adsorvidos pelas partculas em suspenso e

rapidamente conduzidos para os sedimentos (Manahan, 1994).
1.2. Sedimentos
O ambiente aqutico bastante complexo e diverso e apresenta caractersticas nicas, onde
cada ecossistema aqutico um produto dinmico das interaes complexas dos seus
componentes biticos e abiticos (Rand, 1995). Os sedimentos representam uma parte
integrante e importante dos ecossistemas aquticos e so derivados do intemperismo e da
eroso das rochas, sendo susceptveis de transporte pelas guas superficiais, no ficando
restritos a uma rea particular de uma bacia hidrogrfica (Filipkowska, 2005). So
considerados o resultado da interao de todos os processos que ocorrem num ecossistema
aqutico (Esteves, 1988), e possuem valor ecolgico, social e econmico. O sedimento uma
entidade complexa formada por gua, minerais, matria orgnica, partculas de origem
geolgica e organismos vivos. Enquanto compartimento dos ecossistemas aquticos
desempenha mltiplas funes essenciais, tais como armazenamento e transformao de
compostos naturais e contaminantes, regenerao de nutrientes, habitat para fauna e flora, etc.
As partculas que compem os sedimentos contm uma mistura complexa de materiais
orgnicos e inorgnicos, sendo os seus principais constituintes: argilas, quartzo, feldspatos,
carbonatos de origem biognica e geognica e xidos e hidrxidos de ferro e mangans
(Caetano, 1998; Lavrado, 2003). No sedimento ocorre uma grande diversidade de processos
qumicos, fsicos e biolgicos que provocam alteraes fsicas e/ou qumicas que so
designadas por processos diagenticos ou diagnese. Os sedimentos tm uma grande
importncia no estudo da contaminao ambiental por serem reconhecidos como
reservatrios, transportadores e fontes de contaminantes e nutrientes. O desenvolvimento sem
planeamento da sociedade industrial e urbana atual leva entrada no meio ambiente de
grandes quantidades de diversos compostos qumicos provenientes de vrias atividades
antrpicas (Almeida, 2003). Estes compostos, inadvertidamente ou propositadamente, so
libertados na biosfera causando inmeros impactos negativos, tais como a alterao do
equilbrio dinmico do ecossistema bem como a extino da biodiversidade em algumas
situaes. Alguns desses contaminantes, como os hidrocarbonetos aromticos policclicos
(HPAs), podem associar-se s partculas dos sedimentos, causando uma deteriorao gradual
ou imediata da qualidade dos ambientes aquticos. A estabilidade qumica dos HPAs est
diretamente relacionada com a baixa velocidade de degradao, alta persistncia e baixa
5
mobilidade, pelo que os HPAs so conduzidos com facilidade para os corpos de gua
(Harrison, 1996; VanLoon et al, 2005). Ao alcanarem os corpos de gua, por exemplo, por
processos de lixiviao dos solos, lavagem de vegetao e escoamento superficial de guas de
chuva, ocorre a adsoro dos hidrocarbonetos matria orgnica suspensa e dissolvida na
coluna de gua, e aps precipitao, acumulam-se nos sedimentos (Zagatto et al, 2006;
Froehner et al, 2008).
1.3. Sistemas Estuarinos

Um esturio pode ser definido como uma zona em que a gua salgada do mar diluda com
gua doce de origem fluvial, originando diferentes tipos de gradientes (longitudinais,
transversais e temporais nos mais variados parmetros fsico-qumicos pH, potencial redox,
matria orgnica, metais, etc.). Esta mistura de guas promove a circulao da gua
controlando a distribuio e reatividade dos vrios constituintes qumicos (Forster, 1981). Os
esturios so, assim, considerados sistemas de grande importncia ecolgica, por serem
bitopos essenciais aos processos ecolgicos que suportam a vida e so, consequentemente,
vitais para a manuteno do equilbrio ecolgico da biosfera. Estes sistemas caracterizam-se,
essencialmente, pela existncia de baixas profundidades, pela receo de nutrientes e de
matria orgnica transportados pelos rios ao longo das bacias hidrogrficas, criando condies
favorveis ao desenvolvimento dos produtores primrios e, consequentemente, ao suporte de
cadeias trficas. Os esturios so fontes de alimentao e habitat para uma alargada gama de
organismos bnticos, epi-bnticos e pelgicos que tm um papel determinante nas cadeias
trficas marinhas (Bettencourt, 2003). Nas zonas temperadas, as margens lodosas a montante
nos esturios, so ocupadas por habitats particularmente relevantes do ponto de vista
ecolgico: os sapais. Os sapais podem ser definidos como sendo reas entre-mars
constitudas por solos provenientes de sedimentos aluviais e estuarinos que so transportados
pelas mars. Estes ecossistemas localizam-se em zonas temperadas colonizados por vegetao
halfita (plantas vasculares, herbceas ou arbustivas) (Dijkema, 1998) e, em Portugal, so
regularmente inundados por guas estuarinas de salinidade varivel (Caador, 2001; Arajo,
1987). Do ponto de vista geolgico, os sapais podem ser caracterizados como sendo sistemas
abertos que recebem, transformam e exportam sedimentos, matria orgnica, nutrientes e
metais (Caador, 1994). As caractersticas que melhor classificam o sapal so a sua elevada
dinmica, sendo dos ecossistemas que apresentam um maior grau de fertilidade da biosfera
(Richardson, 1999) uma vez que constituem a interface entre o meio terrestre e o meio
6
marinho (Packamm, 1997). Os sapais so ecossistemas particularmente inconstantes em

relao a parmetros como a temperatura, a salinidade, o oxignio dissolvido, nutrientes e a
turvao (Reboredo, 1988). Consequentemente, so ecossistemas onde ocorre um elevado
nmero de reaes fsico-qumicas e biogeoqumicas (Chenhall, 1992). O desenvolvimento de
sapais depende da interao de diversos fatores, como a fisiografia da costa, a amplitude e a
energia das mars, o tipo de sedimentos presentes e a tolerncia das plantas em relao
salinidade e imerso. (Cepeda, 2011; Ribeiro, 1996; Prista, 2003; Valiela, 2000). Os sapais
so locais de extrema produtividade biolgica, atuando ainda como barreira natural, quer
funcionando como filtro para a poluio proveniente das margens dos esturios, quer
atenuando o impacto das cheias e a eroso costeira (Turner, 1992; Mackenzie, 2001;
Morgado, 2003; Wenner, 2003). A gesto dos esturios reveste-se, assim, de grande
importncia tendo, como objetivo principal, a preservao e proteo do ambiente estuarino e
de todos os seres vivos inseridos nestes sistemas, incluindo o Homem. A contaminao
proveniente da atividade industrial pode ser caracterizada por elevada carga orgnica,
metlica e de nutrientes. Esta contaminao emitida para os rios ou diretamente para os
esturios, o que constitu uma ameaa para as comunidades que residem associadas ao
sedimento, j que a maioria dos contaminantes emitidos por atividades antropognicas tende a
ser adsorvido pela matria particulada e a concentrar-se no ambiente sedimentar. A presena
de contaminantes no ambiente sedimentar afeta a qualidade de vida das espcies residentes
nestes sistemas, aumentado potencialmente ocorrncia de efeitos adversos nos organismos
devido aos processos de bioacumulao de contaminantes (Lee, 2000). A poluio qumica
associada aos sedimentos de sapal est dependente do tamanho das partculas dos sedimentos
e da quantidade de matria orgnica a eles associada. A presena de plantas nos sapais tem
um papel muito importante, visto poderem absorver toxinas e poluentes ou favorecer a
remoo de poluentes na zona da rizosfera.
Em Portugal a maioria dos sapais est sujeita a ao regular das mars que os inundam
periodicamente, o que promove a criao de ambientes instveis, com elevadas variaes de
salinidade e temperatura (Caador, 2000). As condies fsico-qumicas dos sapais so
adversas relativamente nutrio, crescimento e reproduo da maioria das plantas
vasculares, limitando assim o nmero das espcies capazes de suportar estas condies
ambientais. Com efeito, os sapais so colonizados por um reduzido nmero de espcies, com
caractersticas fisiolgicas, morfolgicas e ecolgicas bem adaptadas ao habitat em que se
desenvolvem (Adam, 1990). Nos sapais distinguem-se trs zonas distintas que so
colonizadas por plantas vasculares: 1) baixo sapal onde se encontram espcies como
7
Spartina maritima e Salicornia nitens. 2) Sapal intermdio - esta zona normalmente

colonizada por Halimione portulacoides, Arthrocnemum fruticosum, Arthrocnemumperenne,
Aster tripolium, Puccinella maritima e Triglochin maritima e 3) zona alta do sapal - onde se
encontram habitualmente Atriplex halimus, Arthrocnemum glaucum, Inulachritmoides,
Suaeda vera, Juncus spp. e Festuca rubra (Adam, 1990; Cooper, 1982).
Os sapais funcionam, como anteriormente referido, como recetores diretos dos desperdcios
industriais e municipais e tambm de compostos agrcolas, que originam um aumento das
concentraes de metais e de poluentes orgnicos nos sedimentos. Deste modo, os seus
sedimentos so considerados um reservatrio de poluentes orgnicos tais como HPAs
(Martins et al, 2004). Ao atuar como um reservatrio de poluentes, estes sistemas reduzem a
contaminao de ecossistemas circundantes (Jacob, 2003). No entanto, o aumento dos nveis
de poluentes, alm de poder alterar a sua capacidade de incorporar desperdcios, transforma
estes ambientes numa fonte de toxicidade sendo necessrio, portanto, alvo de processos de
remediao que podem incluir a ao de plantas.
1.4. Remediao de Solos e Sedimentos

A remediao de solos/sedimentos pode ser realizada atravs da remoo de grandes
quantidades de solo/sedimento e tratamentos mais ou menos complexos e custosos. No
entanto, verificou-se que o processo de devolver as caractersticas naturais a um local afetado,
denominada remediao, pode ocorrer de forma natural, atravs da ao de seres vivos, tanto
bactrias, como pequenas plantas (Chen, 2000). O processo de tratamento resultante da ao
de seres vivos denomina-se bioremediao e frequentemente muito lento. Assim, nos
ltimos anos, vrias formas de bioremediao tm vindo a ser estudadas, com o objetivo de
tentar acelerar o processo de remediao utilizando diversas formas de vida (Schnoor, 1995).
A fitorremediao utiliza plantas e os organismos da rizosfera que lhes esto associados, para
remover, transformar ou conter produtos qumicos txicos que podem estar localizados no
solo, sedimentos, gua (superficial como em lenis freticos) ou at mesmo na atmosfera.
Atualmente, a fitorremediao utilizada para remover diferentes contaminantes como, por
exemplo, os HPAs, solventes clorados, pesticidas ou at metais pesados (Susarla, 2002). Esta
promove diversos processos de remediao dos solos e guas contaminadas, entre eles a
modificao das propriedades qumicas e fsicas dos solos contaminados; libertao de
exsudados das razes, aumentando assim a quantidade de carbono orgnico disponvel;
8
aumento do arejamento do solo, atravs da libertao de oxignio na regio das razes e,

tambm, aumentando a porosidade das regies mais superiores do solo.
A fitorremediao est limitada a guas superficiais, ou que estejam perto da superfcie, solos
e sedimentos. Por ser um processo natural promove o tratamento adequado ao meio, a esta
vantagem acresce ainda um baixo custo, quando comparado a outras alternativas
convencionais de tratamento. Devido longa durao da fitorremediao, esta tida como o
ltimo passo do processo de remediao de um caso de contaminao elevada. No entanto,
mais rpida que os processos de diminuio naturais, apesar de ser eficiente apenas em meios
moderadamente hidrofbicos (Lytle, 2001). Para se obter um rendimento elevado no
processo, necessrios que se verifiquem determinadas condies que favoream a atividade
microbiana, tais como: meio anxico, elevado tempo de reteno, atividade enzimtica,
temperatura e pH adequados. Existem vrios estudos sobre o uso de plantas para remoo de
compostos txicos em ecossistemas estuarinos (Carvalho et al, 2008; Carvalho et al, 2010).
Relativamente remediao de HPAs existem poucos estudos sobre o uso de plantas para a
remoo destes compostos em solos/sedimentos contaminados (Gan et al, 2009; Bamforth et
al, 2005)
1.5. Mtodos Analticos Aplicados na Determinao de

HPAs
Diversos mtodos tm sido desenvolvidos para a determinao de HPAs em matrizes slidas,
nomeadamente em sedimentos (e.g. Pino et al, 2000; Rocha et al, 2011). O primeiro passo na
determinao destes compostos passa pela sua extrao da matriz slida, que pode ser
conseguida por uma extrao ultra snica ou por uma extrao assistida por micro-ondas (e.g.
Pastor et al, 1997; Pino et al, 2000; Rocha et al, 2011). Aps este procedimento uma segunda
extrao continua a ser necessria antes da anlise do composto de interesse j que o extrato
obtido apresenta normalmente uma matriz demasiado complexa para a sua anlise direta.
Neste sentido a SPME tem vindo a demonstrar ser uma boa opo (Rocha et al, 2011). A
anlise de HPAs tem sido normalmente efetuada por cromatografia apresentando a anlise por
GC-MS diversas vantagens como sendo a elevada sensibilidade e a possibilidade de
identificao seletiva de cada composto de interesse. Adicionalmente esta tcnica permite
facilmente o acoplar da SPME.
9
1.5.1.
Mtodos de Extrao
A extrao de poluentes orgnicos de diferentes polaridades de uma matriz slida que contm
material orgnico, exige o uso de solventes orgnicos e misturas de solventes com polaridade
adequada. Mtodos de extrao por banho de ultrassons e por micro-ondas so
frequentemente utilizados. O banho de ultrassons rpido e pode ter uma boa eficincia de
recuperao (Luque-Garca and Luque de Castro, 2003). A tcnica de extrao assistida por
micro-ondas tem sido usada como uma alternativa na preparao de amostras para a
determinao de poluentes orgnicos de diferentes polaridades em solos, com uma reduo do
tempo de anlise, baixo consumo de solventes e a possibilidade de extrair vrias amostras
simultaneamente com alta eficincia de extrao (Pino et al, 2000; Sun et al, 2002). Porm, as
grandes vantagens da extrao por micro-ondas so os efeitos de pr-concentrao, segurana
e simplicidade durante a extrao (Sun et al, 2002).
1.5.1.1. Extrao por Banho de Ultrassons

A extrao por ultrassons um mtodo efetivo de extrao de um grande nmero de analitos
de diferentes tipos de amostras (Babic et al, 1998). O uso do ultra-som vem progredindo e
ganhando confiana no s nas etapas de limpeza, como tambm no pr-tratamento de
amostras. A menor frequncia dos ultrassons , normalmente, de 20 kHz. A frequncia na
faixa dos gigahertzs tem sido usada em algumas aplicaes (Luque-Garca et al, 2003);
(Priego-Capote et al, 2004). As transformaes observadas num meio sob sonicao no so
provenientes de interaes diretas entre o campo ultrassnico e as molculas, ies ou tomos
do meio, mas sim, a consequncia da grande quantidade de energia gerada pelo fenmeno de
cavitao (Suslick et al, 1999) que definido como o fenmeno de formao e subsequente
colapso de microbolhas no centro de um lquido. A importncia da cavitao no est em
como so formadas as bolhas mas sim no que acontece quando elas colapsam. Em certo
momento, as bolhas no absorvem mais energia do ultra-som e implodem. A rpida
compresso adiabtica de gases e vapores dentro das bolhas ou cavidades produz altas
temperaturas e presses. Suslick et al (1999) estimaram a temperatura destes pontos
quentes (hotspots) em torno de 5000K e presses da ordem de 1000 atm. O tamanho das
bolhas pequeno em relao ao volume total do lquido e o aquecimento que produzem
dissipado rapidamente sem nenhuma mudana nas condies ambientais. Quando a cavitao
ocorre num lquido prximo de uma superfcie slida, o colapso da cavidade assimtrico e
10
produz microjatos de lquido de alta velocidade (v>100m/s) responsveis pela limpeza da

superfcie slida, assim como tambm pela extrao de elementos da matriz slida (LuqueGarca et al, 2003). As temperaturas elevadas no sistema sob sonicao provocam o aumento
da solubilidade o que, aliado s presses geradas, favorece a penetrao e transporte na
interface entre uma mistura de solventes e a matriz slida e que, combinadas com a energia
oxidativa dos radicais (por exemplo, hidroxilo) gerados durante a sonlise, resultam no poder
extrator (Luque-Garca et al, 2003). Dependendo da natureza do sistema de deteo, a
amostra pode ser diretamente analisada ou o extrato sujeito remoo de interferentes,
concentrao e/ou separao cromatogrfica antes da deteo. Apesar do banho de ultrassons
ser comummente utilizado, este apresenta algumas desvantagens que podem diminuir a
repetibilidade e a reprodutibilidade experimental: falta de uniformidade na distribuio da
energia do ultrassom (apenas uma pequena parcela do volume total de lquido na vizinhana
imediata da fonte do ultra-som experimenta cavitao) e declnio da potncia com o tempo.
Esta tcnica, no entanto, apresenta vantagens como: a possibilidade de utilizao para uma
ampla faixa de tamanho da amostra, a rapidez no processamento da amostra e o baixo custo
(Luque-Garca et al, 2003).
1.5.1.2. Extrao Assistida por Micro-ondas

A radiao de micro-ondas uma radiao no ionizante que causa aquecimento por migrao
dos ies e rotao das molculas polares, no causando mudanas na estrutura molecular
(Sanseverino, 2002). Na extrao assistida por micro-ondas utilizada a radiao
eletromagntica para a dessoro dos poluentes das suas matrizes. A regio de micro-ondas
compreende frequncias de 300 MHz a 300 GHz, operando-se comummente na frequncia de
2,45 GHz (Dean et al, 2000). A capacidade do material de converter a energia de micro-ondas
em energia trmica dependente das suas caractersticas de polaridade e absoro.
Diferentemente dos mtodos convencionais de extrao que esto sujeitos temperatura de
ebulio dos solventes de extrao presso atmosfrica, a energia de micro-ondas aquece
misturas de amostra solvente em vasos de extrao fechados e pressurizados. Sob estas
condies, a temperatura pode ser rapidamente aumentada acima do ponto de ebulio do
solvente, aumentando a taxa de dessoro dos analitos da amostra (CEM Corporation, 2000).
Alguns modelos de sistemas de extrao com sonda de temperatura e um sensor de presso,
permitem monitorar as condies de extrao. Os vasos utilizados geralmente, so de Teflon
PFA e desenvolvidos para permanecerem completamente selados durante a operao,
11
prevenindo a perda de analito e solvente (Lopez-Avila, 1998). O controlo da temperatura

necessrio para otimizar a eficincia da extrao, prevenir degradao trmica e fornecer
condies operacionais reprodutveis (CEM Corporation, 2000). Solventes polares com
elevados momentos dipolares e constantes dieltricas aquecem rapidamente sob a ao de
micro-ondas, enquanto os solventes no polares so transparentes e no aquecem.
A solubilidade de um analito pode ser afetada pelas suas caractersticas de solvatao e
temperatura de extrao (Pastor et al, 1997). Altas temperaturas do solvente aumentam a
eficincia e reduzem o tempo de extrao. A escolha de um solvente ou mistura de solventes
apropriada fundamental para a migrao dos analitos da amostra para o solvente. A
solubilidade do analito pode ser maximizada ajustando a mistura de solventes e controlando a
temperatura (Dean et al, 2000).
A extrao auxiliada por micro-ondas (MAE) tem sido aplicada para a extrao simultnea de
contaminantes orgnicos txicos, tais como HPAs, bifenilos policlorados (PCBs), fenis e
pesticidas organoclorados de solos, sedimentos e outras matrizes slidas (Sun et al, 2002).
Comparando com os mtodos tradicionais de extrao, o tempo de preparao de amostra e a
quantidade de solvente utilizado so drasticamente reduzidos, sem decrscimo da eficincia
de extrao dos analitos (Xiong et al, 1999). A temperatura, o contedo de gua e o solvente
de extrao so considerados os parmetros mais crticos que necessitam controlo durante a
MAE. Alm destes, outros parmetros so fundamentais para a utilizao deste tipo de
extrao: o tempo de aquecimento e a potncia. Todos os parmetros devem ser tidos em
ateno para a obteno da melhor eficincia de extrao. Embora a radiao de micro-ondas
no modifique a estrutura molecular dos compostos, as temperaturas que podem ser
alcanadas durante a extrao podem causar a sua degradao, devido aos efeitos de
aquecimento localizados (Molins et al, 2000).
1.5.2.
Microextrao em Fase Slida SPME
comum no se analisar quimicamente matrizes na sua forma bruta, pois costumam gerar
interferncias e incompatibilidades com equipamentos analticos. Para contornar este tipo de
problemas so utilizados procedimentos de preparao de amostras, com os quais se
procura isolar e concentrar os analitos a nveis ajustados e obter um nvel de limpeza da
amostra que no comprometa a sua anlise qumica. Esta fase permite, a compatibilizao
com a tcnica analtica que vai possibilitar a deteo e quantificao dos analitos. A SPME
12
tem sido empregada para este fim e cria a ligao entre a matriz qumica e a tcnica analtica,
sendo particularmente utilizada para Cromatografia Gasosa (Boyd-Boland, 1996). SPME
uma microtcnica em que os processos de extrao e pr-concentrao dos analitos ocorrem
numa s fase. O sistema de SPME mais comum utiliza uma pequena fibra de slica revestida
por uma fase polimrica (polidimetilsiloxano (PDMS), poliacrilato (PA), Carbowax (Cwx))
ou de um slido adsorvente (carvo ativado microparticulado (Carboxen)). A fibra colocada,
para sua proteo, num instrumento com a forma de uma seringa. Para utilizao em
cromatografia, a fibra montada num suporte prprio, denominado holder, que equipado
com um sistema de profundidade de fibra ajustvel, o que permite o controlo da profundidade
a que a fibra se encontra no frasco da amostra e no injetor de um sistema cromatogrfico.
No caso de ser usado um sistema de cromatografia gasosa para separao e quantificao dos
analitos, a fibra inserida num injetor a uma temperatura elevada, onde ocorre dessoro
trmica dos analitos aps estes terem sido adsorvidos/absorvidos na fase polimrica da fibra.
A quantidade de analito extrada depende da grandeza do coeficiente de partio do analito
entre a matriz da amostra e o material polimrico, entre outros parmetros.
Em SPME, os analitos, normalmente, no so extrados de forma quantitativa da matriz, no
entanto, os mtodos de equilbrio so mais seletivos porque aproveitam as vantagens das
diferenas nas constantes de distribuio entre a fase extratora/matriz para separar os analitos
das interferncias. Uma das principais vantagens da tcnica que, em princpio, muitas das
espcies sem interesse no so transferidas para a fase extratora.
A introduo dos analitos no sistema analtico, por introduo da fibra no sistema de
dessoro facilita a rpida separao entre espcies e o aparecimento de picos com boa
resoluo num sistema cromatogrfico. Desta forma, a SPME reverte numa integrao dos
primeiros passos num procedimento analtico: extrao, concentrao da amostra e introduo
da mistura extrada num instrumento analtico.
Amostragem por SPME pode ser realizada de vrias formas, extrao por fibra imersa,
extrao em headspace e extrao por membrana protetora; neste trabalho foram usadas
extrao por fibra imersa e em headspace (Pawliszyn, 1997).
1.5.2.1. Extrao por Fibra Imersa

Na extrao por fibra imersa, a fibra inserida na amostra e os analitos passam da matriz para
a fase extratora. De forma a facilitar a velocidade da extrao, necessria agitao forte e
regular. Para amostras gasosas, a conveco natural , normalmente, suficiente para facilitar o
estabelecimento rpido do equilbrio, no entanto, para matrizes aquosas, tcnicas de agitao
13
mais eficiente (movimento rpido da fibra, do frasco ou agitao ultra snica, por exemplo)
so necessrias para reduzir o efeito da "zona de deplexo" produzida nas proximidades da
fibra como resultado do transporte difusional lento do analito atravs da fase estacionria da
matriz lquida que rodeia a fibra (Pawliszyn, 1997).
1.5.2.2. Extrao em Headspace

No caso da extrao em headspace, os analitos so extrados da fase gasosa em equilbrio
com a amostra. A principal razo desta alterao de processo proteger a fibra de efeitos
causados por substncias no volteis presentes na matriz da amostra. A extrao no
headspace permite modificaes da matriz, sem afetar a fibra. Num sistema constitudo por
uma amostra lquida e o seu headspace, a quantidade de analito extrado pela fibra no
depende da localizao da fibra, logo a sensibilidade da amostragem em headspace a mesma
da sensibilidade verificada com a fibra imersa, desde que o volume das duas fases seja igual
nos dois modos de amostragem. A temperatura tem um importante efeito na cintica do
processo, uma vez que determina a presso de vapor dos analitos. Geralmente, o tempo de
equilbrio para compostos volteis menor em extrao por headspace do que em extrao
com fibra imersa, devido a que uma frao substancial do analito est presente no headspace
antes do incio do processo de extrao, existe uma interface grande entre a matriz da amostra
e o headspace, e o coeficiente de difuso na fase gasosa normalmente muito superior ao da
fase lquida.
Como a concentrao dos compostos semi-volteis na fase lquida temperatura ambiente
baixa, a extrao no headspace desses mesmos compostos pode ser melhorada usando uma
agitao mais eficiente ou aumentando a temperatura do sistema. A extrao no headspace
muito usada neste tipo de estudos porque permite uma maior seletividade das espcies
extradas, consequente minimizao do efeito de matriz e um aumento de vida da fibra de
SPME (Pawliszyn, 1997).
1.5.2.3. Aspetos Prticos para a Otimizao da SPME

Vrios aspetos importantes devem ser considerados durante o desenvolvimento de um
processo de SPME. Alm da escolha da fibra, parmetros operacionais bsicos tais como a
seleo do modo de microextrao e a escolha da temperatura de extrao so fundamentais
em SPME.
14
Seleo do Modo de Microextrao

O modo de microextrao a usar depende da composio da matriz da amostra, da
volatilidade do analito e da sua compatibilidade para a matriz. A extrao no headspace
adequada no caso de matrizes complexas com analitos de mdia ou alta volatilidade, uma vez
que os tempos de equilbrio so menores quando comparados com a extrao com a fibra
imersa, alm de que permite fazer uma seleo dos analitos alvo pelo controlo da temperatura
de extrao. No caso de matrizes complexas, a no exposio direta permite evitar a adsoro
de espcies presentes no em estudo que, assim, competiriam para a adsoro na fibra e se
poderiam comportar como interferentes.
Otimizao da Temperatura de Extrao

A temperatura tem um efeito significativo na cintica do processo de extrao. Temperaturas
altas aumentam a velocidade de difuso atravs das fases, diminuindo o tempo para se atingir
o equilbrio, mas provocando uma descida dos valores das constantes de distribuio. Quando
a extrao feita em headspace, a temperatura determina a presso de vapor das substncias;
desta forma, o aumento da temperatura de extrao favorece a passagem dos analitos para a
fase de vapor, o que favorece o processo de extrao. No entanto, se a temperatura for
demasiado elevada, pode alterar as propriedades da amostra ou do analito ou at mesmo,
favorecer o processo de dessoro dos analitos (o que seria contrrio ao propsito da
extrao).
De uma forma geral, se a percentagem extrada a preocupao principal devem ser usadas
temperaturas mais elevadas, desde que precavidos os fatores paralelos.
1.5.3.
Cromatografia em Fase Gasosa
A cromatografia gasosa uma tcnica que permite a separao de substncias volteis

arrastadas por um gs atravs de uma fase estacionria. Os componentes da mistura gasosa
distribuem-se entre as duas fases atravs de processos fsicos e qumicos, tais como a
adsoro, diferenas de solubilidades, volatilidades ou partilha. O componente da amostra
cuja afinidade pela fase estacionria for maior, ficar mais tempo retido do que aquele cuja
interao com a fase estacionria menor. Ligando-se um detetor sada da coluna, a ordem
de eluio e a eficincia da separao so constatadas atravs do cromatograma registado.
15
Atualmente, a cromatografia gasosa uma tcnica instrumental cuja popularidade pode ser
atribuda a tempos rpidos de anlise, alta seletividade e resoluo, exatido e preciso e alta
sensibilidade (Santos et al, 2002). As caractersticas fundamentais de um sistema de
cromatografia gasosa so: reteno e seletividade, eficincia e resoluo. A resoluo dos
picos cromatogrficos depende de dois parmetros: a seletividade e a eficincia da coluna. O
valor da resoluo reflete o grau com que dois picos so separados, tendo em conta a
contribuio da eficincia e da seletividade. Uma resoluo superior a 1,5 permite a chamada
resoluo de linha de base, ou seja, a separao completa de dois picos de igual tamanho
(Skoog, 1996). Os estudos com recurso a cromatografia gasosa para amostras de solos e
sedimentos so numerosos (Rocha et al, 2011). Esta tcnica tem sido muito usada para a
separao de contaminantes e pode ser aplicada em estudos envolvendo HPAs.
1.5.4.
Deteo por Espectrometria de Massa
Quando substncias puras so introduzidas num sistema de alto vcuo, onde as molculas
podem ser excitadas pelo fornecimento de energia, algumas das suas ligaes quebram-se.
Geram-se, deste modo, fragmentos inicos que podem ser separados de acordo com a relao
massa/carga (m/z) dando origem a um padro bem definido de ies presentes por cada valor
daquela relao. Este padro de distribuio de ies (abundncia relativa) designado por
espectro de massa contm informao exclusiva e caracterstica da substncia. A quantidade
de dados obtida por um espectrmetro de massa exige o uso de software adequado para
possibilitar o tratamento e anlise dos mesmos. Quando uma substncia orgnica
bombardeada por um feixe de eletres algumas molculas excitadas procuram estabilidade
atravs do rompimento de ligaes, formando ies mais pequenos como fragmentos da
molcula original. Algumas molculas que no absorvem energia suficiente para fragmentar,
perdem apenas um eletro, formando ies radicais positivos com a mesma massa nominal da
+
molcula neutra. Estes ies so chamados ies moleculares [M] e contm informao sobre o
peso molecular. O padro de fragmentao obtido num espectro de massa pode ser
interpretado de acordo com um conjunto de regras de modo a permitir a reconstruo da
molcula com base na sua estrutura. Os espectros produzidos atravs do impacto eletrnico
so reprodutveis e nicos para a maioria dos compostos orgnicos. Este facto permite o
estabelecimento de uma base de dados para comparao espectral e identificao
computorizada de compostos (Skoog, 1996).
16
1.5.5.
Aquisio de Dados
Existem vrias formas de aquisio de dados sendo das mais importantes a obteno do
espetro completo em varrimento total (FullScan) e a monitorizao de ies selecionados
(SIS).
O controlo da funo de aquisio de dados extremamente importante, pois dela resultam os
dados necessrios obteno dos resultados analticos. Os espectros de massa dos analitos
resultam da contabilizao de um conjunto de fragmentos identificados pelas razes m/z.
Como cada composto tem o seu espectro de massa caracterstico, importante determinar
qual a parte do espectro de massa que se pretende utilizar para a obteno de resultados.
Convm salientar que, se se optar por utilizar todo o espectro de massa correspondente a
determinado pico, pode-se estar a incluir alguns interferentes que tenham o mesmo tempo de
reteno que a espcie em questo. Normalmente utilizam-se apenas alguns fragmentos m/z
de forma a minimizar a probabilidade de interferncias (Harris, 2000).
Deteo por Varrimento Total (FullScan)

A aquisio contnua do espectro total de massa e determinao do tempo de reteno de uma
espcie permite a identificao de analitos por comparao com a biblioteca de espectros de
massa. Obtm-se um registo completo da anlise da amostra e, como resultado, um elevado
nmero de espectros gerado. Este tipo de mtodo , principalmente, indicado para uma rpida
anlise de misturas complexas a fim de determinar a presena e tempos de reteno de compostos
cujo espectro de massa conhecido (Harris, 2000).
Monitorizao por Io Selecionado (SIS)
O espectrmetro adaptado para medir a corrente inica correspondente a apenas um nico

ou vrios ies predeterminados. Operando em modo SIS o GC/MS apresenta algumas
vantagens, como o aumento da sensibilidade, uma vez que h reduo do nmero de ies por
varrimento na anlise, pouco rudo e o aumento da faixa linear do instrumento para baixas
concentraes de analito. A sensibilidade obtida por SIS de 100 a 1000 vezes superior
alcanada com o mtodo de varrimento total, com limites de deteo da ordem dos
subpicogramas. Este limite depende da eficincia de ionizao do composto, da intensidade
do rudo, da resoluo do espectrmetro de massa e da sensibilidade do detetor.
17
A maior vantagem prtica deste tipo de mtodo a eliminao de compostos interferentes e

consequente inferior limite de deteo (Harris, 2000).
1.6. Validao do Mtodo Analtico

Para garantir que um mtodo analtico gera informaes confiveis e interpretveis sobre a
amostra a ser analisada, este deve ser submetido a uma avaliao denominada validao. Os
parmetros analticos normalmente encontrados para validao de mtodos de separao so
conhecidos como parmetros de desempenho analtico. A validao de um mtodo analtico
definida como um processo contnuo de avaliao, desde a etapa de planeamento, passando
pelo desenvolvimento e recolha de dados, at monitorizao da aplicao (Ribani et al,
2004). O objetivo garantir que os dados gerados possuam a qualidade necessria, em termos
de confiabilidade. Assim, deve-se selecionar, estudar e monitorar constantemente os
parmetros mnimos necessrios para garantir a interpretao inequvoca dos resultados
(Gonalves, 1996) (Miller,1984).
1.6.1.
Parmetros Analticos
Os parmetros analticos normalmente encontrados para validao de mtodos de separao

so: seletividade; linearidade e intervalo de trabalho; preciso; exatido; limite de deteo e
limite de quantificao. Estes termos so conhecidos como parmetros de desempenho
analtico e, algumas vezes, como figuras analticas de mrito (Harris, 2000).
1.6.1.1. Seletividade
Uma amostra, de maneira geral, constituda pelos analitos a serem medidos, a matriz e por
outros componentes que podem ter algum efeito na medio, mas que no se querem
quantificar. Um mtodo que produz a resposta para vrios analitos, mas que pode distinguir a
resposta de um analito da de outros, chamado seletivo. Assim, se a seletividade no for
assegurada, a linearidade, a exatido e a preciso estaro seriamente comprometidas. Por isso,
a seletividade o primeiro passo no desenvolvimento e validao de um mtodo instrumental
de separao (Ribani et al, 2004). A seletividade de um mtodo instrumental de separao a
capacidade de avaliar, de forma clara, as substncias em exame na presena de componentes
que podem interferir com a sua determinao numa amostra complexa. A seletividade estima,
assim, o grau de interferncia de espcies como impurezas e produtos de degradao, bem
18
como outros compostos que possam estar presentes. A seletividade garante que o pico de
resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Uma forma de se avaliar a
seletividade consiste na comparao do espetro do pico obtido na separao com o do padro
(Ribani et al, 2004).
1.6.1.2. Linearidade e Curva analtica

A linearidade refere-se capacidade do mtodo de gerar resultados linearmente proporcionais
concentrao do analito, enquadrados no intervalo analtico especificado (Brito et al, 2003).
A correlao entre o sinal medido (rea ou altura do pico) e a massa ou concentrao da
espcie a ser quantificada muito raramente conhecida. Na maior parte dos casos, a relao
matemtica entre o sinal e a concentrao ou massa da espcie de interesse deve ser
determinada a partir dos sinais medidos para massas ou concentraes conhecidas dessa
espcie. A curva analtica (resposta do equipamento em funo das diferentes concentraes
do analito) permite determinar a linearidade (Lanas, 2004). A correlao , normalmente,
calculada por intermdio do coeficiente de correlao R que indica o grau de ajuste do modelo
de regresso. Este parmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, quanto
mais prximo de um, menor a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a
incerteza dos coeficientes de regresso estimados. Normalmente um coeficiente de correlao
maior que 0,999 considerado como evidncia de um bom ajuste dos dados para a linha de
regresso (Ribani et al, 2004).
1.6.1.3. Preciso
A preciso de um mtodo analtico a medida da concordncia entre os valores experimentais
de ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra sob condies definidas. Pode ser
expressa atravs do desvio padro (s) e da estimativa do desvio padro relativo (RSD) (Ribani
et al, 2004; Leite, 2002). Representa, assim, a disperso de resultados entre ensaios
independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres sob
condies definidas. A preciso tambm pode ser expressa atravs do intervalo de confiana
mdia, que uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade de se
encontrar um certo valor de uma varivel. Uma forma de determinar a preciso atravs da
estimativa do desvio padro relativo, tambm conhecido como coeficiente de variao (CV).
Uma maneira simples de melhorar a preciso aumentar o nmero de rplicas.
19
A preciso em validao de mtodos considerada em trs nveis diferentes: repetividade;

preciso intermdia; reprodutibilidade.
1.6.1.3.1.
Repetibilidade
Representa a concordncia entre os resultados de medies sucessivas por um mesmo

mtodo, efetuadas sob as mesmas condies de medio, mesmo procedimento, mesmo
analista, mesmo instrumento usado sob as mesmas condies, mesmo local, repeties num
curto espao de tempo. O termo repetibilidade envolve vrias medies da mesma amostra,
denominada tambm de preciso intraensaio e pode ser expressa atravs da estimativa do
desvio padro relativo (RSD). Para a repetibilidade, sete ou mais repeties so recomendadas
para o clculo da estimativa do desvio padro. A International Conference on Harmonization
of Technical Requirements (ICH) sugere que a repetibilidade seja verificada a partir de um
mnimo de seis determinaes a uma concentrao similar ao valor esperado (Ribani et al,
2004).
1.6.1.3.2.
Preciso Intermdia
Indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a eventos como diferentes dias,
diferentes analistas, diferentes equipamentos ou uma combinao destes fatores.
reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados num nico
laboratrio. O objetivo desta determinar se no mesmo laboratrio o mtodo fornecer os
mesmos resultados. O nmero de ensaios necessrios para se avaliar a preciso intermediria
segue a mesma recomendao da ICH para o clculo da repetibilidade acima descrita. Esta
pode ser expressa atravs da estimativa do desvio padro relativo (Ribani et al, 2004).
1.6.1.3.3.
Reprodutibilidade
A reprodutibilidade dada pelo grau de concordncia entre os resultados das medies de

uma mesma amostra, efetuadas sob condies variadas (mudana de operador, local,
equipamentos, etc.). A reprodutibilidade refere-se aos resultados dos estudos de colaborao
entre laboratrios e deve ser considerada em situaes como a padronizao de procedimentos
analticos a serem excludos. muito comum encontrar desacordo entre mtodos analticos,
quando vrios laboratrios analisam uma amostra em comum, em estudos colaborativos
(Ribani et al, 2004).
20
1.6.1.4. Exatido
A exatido de um mtodo analtico o grau de concordncia entre o valor mdio obtido de
uma srie de anlises e o valor de referncia aceite, e pode ser expressa como a percentagem
da resposta obtida atravs do ensaio de uma quantidade conhecida da substncia de interesse
incorporada num meio de composio conhecida, geralmente materiais certificados.
Os materiais de referncia certificados (CRM) so acompanhados de um certificado que
possui o valor de concentrao ou outra grandeza de uma dada substncia, com uma incerteza
associada. Os valores obtidos pelo laboratrio (a mdia e a estimativa do desvio padro de
uma srie de rplicas) da mesma amostra padro devem ser comparados com os valores
certificados do material de referncia, para avaliar a exatido do mtodo (Ribani et al, 2004).
1.6.1.5. Ensaios de Recuperao

A recuperao (ou fator de recuperao), definida como a proporo da quantidade de
substncia de interesse, presente ou adicionada na poro analtica do material teste, que
extrada e suscetvel de ser quantificada. A informao de recuperao pode ser estimada a
partir de um material de referncia certificado (CRM) (em que a quantidade de substncia
conhecida), quando disponveis, ou de um padro da substncia adicionado matriz isenta da
substncia ou amostra (fortificao, dopagem), ou at mesmo atravs de um composto
quimicamente diferente da substncia de interesse, mas que seja representativo do seu
comportamento.
importante salientar que a eficincia do mtodo varia em funo da concentrao da
substncia. Na maioria dos casos, a disperso dos resultados aumenta com a diminuio da
concentrao e a recuperao pode diferir substancialmente a altas e a baixas concentraes.
Por esse motivo, a recuperao deve ser avaliada na faixa de concentrao esperada para o
composto de interesse. (Ribani et al, 2004; Leite, 2002).
1.6.1.6. Limite de Deteo (LD)

O limite de deteo (LD) definido como a menor concentrao de um analito que pode ser
detetada, mas no necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento
analtico. Este pode ser calculado por trs processos diferentes: mtodo visual, mtodo relao
sinal-rudo, mtodo baseado em parmetros da curva analtica.
21
Mtodo Visual
Para determinar o limite de deteo por este processo pode utilizar-se a matriz com adio de
concentraes decrescentes conhecidas da substncia de interesse, at que se possa ainda
distinguir entre rudo e sinal analtico pela visualizao do sinal da menor concentrao
(detetvel).
Mtodo da Relao Sinal-Rudo
Este processo pode ser aplicado somente em procedimentos analticos que mostram rudo da
linha de base. Para determinar a relao sinal-rudo, feita a comparao entre a medio dos
sinais de amostras em baixas concentraes conhecidas do composto de interesse na matriz e
num branco (matriz isenta do composto de interesse. Assim, estabelecida uma concentrao
mnima na qual a substncia pode ser facilmente detetada. A relao sinal-rudo pode ser 3:1
ou 2:1, propores geralmente aceites como estimativas do limite de deteo.
O limite de deteo (LD) pode ser expresso como:

LD= 3
Onde s a estimativa do desvio padro da resposta, que pode ser a estimativa do desvio
padro do branco, da equao da linha de regresso ou do coeficiente linear da equao e S
o declive ou coeficiente angular da curva analtica (Ribani et al, 2004; Leite, 2002).
1.6.1.7. Limite de Quantificao (LQ)

O limite de quantificao (LQ) o menor valor quantificvel, para uma determinada condio
analtica. Critrios semelhantes aos usados para determinao do LD podem ser adotados para
determinar o LQ, ou seja, o LQ tal como o LD, pode ser calculado utilizando o mtodo visual,
a relao sinal-rudo (10 vezes a razo sinal-rudo) ou a relao entre a estimativa do desvio
padro da resposta (s) e o declive da curva analtica (S), em nveis prximos ao LQ, a partir
da equao:
LQ= 10
O mtodo mais utilizado o da relao sinal-rudo.
22
1.7. Objetivos do Trabalho

Os HPAs so um grupo de compostos altamente lipoflicos que esto omnipresentes no
ambiente como poluentes. As reas estuarinas esto expostas a uma ampla gama de poluentes,
particularmente hidrocarbonetos de petrleo, tais como HPAs, poluentes que podem afetar
negativamente estes habitats, incluindo sapais caractersticos dessas reas.
Devido respetiva hidrofobicidade ligam-se a partculas inorgnicas e orgnicas que se
encontram suspensas e, subsequentemente, so depositadas sobre os sedimentos aquticos.
Assim, o principal objetivo do trabalho o estudo do potencial efeito da rizosfera de plantas
de sapal na distribuio de hidrocarbonetos em sedimentos estuarinos para futura utilizao na
remediao dos mesmos. Para alcanar os objetivos do trabalho foi feita a otimizao e
validao das condies para a extrao e anlise de HPAs em sedimentos, para posterior
aplicao da metodologia ao referido estudo. Assim, foram realizadas as seguintes etapas:
determinao das condies cromatogrficas para a separao dos HPAs e validao do
mtodo de anlise; otimizao e utilizao da microextrao em fase slida (SPME) para
posterior determinao de HPAs em matrizes ambientais; comparao da eficincia das
tcnicas de extrao (ultrassons e micro-ondas) de HPAs em sedimentos e determinao
cromatogrfica dos nveis de HPAs em rizosedimentos e sedimentos estuarinos.
1.8. Estrutura da Dissertao

A dissertao encontra-se dividida em cinco captulos: introduo terica, material e mtodos,
otimizao do mtodo analtico, aplicao do mtodo analtico, consideraes finais e
referncias bibliogrficas. No primeiro captulo abordam-se assuntos relacionados com os
HPAs tal como as suas propriedades, os respetivos impactos no meio ambiente,
nomeadamente, o seu impacto a nvel dos ambientes estuarinos e as razes pelas quais so
motivo de vrios estudos. So ainda abordados a remediao de solos/contaminantes bem
como os mtodos analticos para a determinao de HPAs. No segundo captulo refere-se a
metodologia experimental utilizada. No captulo trs esto descritos os procedimentos
adotados para o desenvolvimento e otimizao do mtodo analtico. A determinao da
contaminao por HPAs de alguns sedimentos estuarinos e a distribuio de HPAs nesses
sedimentos (sedimentos vegetados vr sedimentos no vegetados) esto descritas no captulo
23
quatro. Por ltimo, no captulo cinco, incluem-se as consideraes finais, concluses e

possveis desenvolvimentos deste estudo.
24
CAPTULO II
MATERIAL E MTODOS
2. Material e Mtodos
2.1. Reagentes, Solues e Material Utilizado
Na preparao das amostras foram utilizados os seguintes solventes sem qualquer purificao
adicional: diclorometano (Sigma-Aldrich 99,9 %), metanol (Sigma-Aldrich 99,9 %), hexano
(Sigma-Aldrich), acetona (Sigma-Aldrich 99,8 %) e etanol (Panreac 99,9 %).
A partir de uma soluo padro comercial de uma mistura de 16 HPAs (os 16 HPAs
considerados prioritrios pela EPA) em acetonitrilo (EPA-method 610) da Sigma-Aldrich
(USA), preparam-se duas solues stock padro em metanol, de concentraes 10 g L-1 e
100 g L-1. Estas solues foram utilizadas para preparar os diferentes padres de
concentraes compreendidas entre 25 ng L-1 e 2000 ng L-1. As solues stock padro foram
mantidas a 4 C. Foi ainda usada uma soluo stock de 100 g L-1 HPAs deuterados (usados
como padres internos), preparada em metanol a partir de uma soluo comercial da Supelco
(Semivolatile Internal Standard mix 2000 g L-1, em diclorometano) contendo naphthalened8 (N-d8), acenaphthene-d10 (Ace-d10), phenanthrene-d10 (P-d10), chrysene-d12 (Ch-d12) e
Perylene-d12 (Per-d12).
Todos os restantes reagentes utilizados foram de pureza analtica ou equivalente.
Todo o material de vidro utilizado foi lavado com gua desionizada e deixado imerso numa
soluo de cido ntrico a 20 % durante 24 h. Aps ter sido lavado abundantemente com gua
desionizada foi guardado numa estufa, a uma temperatura de cerca de 40 C, at nova
utilizao.
2.2. Sedimentos
O material certificado utilizado na otimizao do mtodo analtico foi NIST (1941b).
Para o estudo do efeito da rizosfera de plantas de sapal na distribuio de HPAs em ambientes
estuarinos determinaram-se HPAs em amostras de sedimento recolhidas no Esturio do Rio
Lima em Junho de 2009. Sedimento e rizosedimento de quatro plantas distintas, Juncos
maritimus (P1), Phragmites australis (P2), Triglochin striata (P3) e Spartina patens (P4)
foram recolhidos em quatro locais diferentes (L1, L2, L3, L4) do referido esturio (Figura
2.1). As amostras depois de secas foram mantidas temperatura ambiente ao abrigo da luz,
envoltas em folha de alumnio dentro de sacos plsticos fechados.
27
Figura 2.1 Local de amostragem dos diversos sedimentos estuarinos, vegetados e no vegetados. Figura adaptada de
Almeida et al, 2011. Local L1 e L2 colonizado por Juncus maritimus, local L3 colonizado por Juncus maritimus, Phragmites
australis, Triglochin striata e local L4 colonizado por Juncus maritimus e Spartina patens.
2.3. Procedimentos Experimentais

2.3.1.
Extrao por Ultrassons
O procedimento final para a extrao de HPAs de sedimentos consistiu na pesagem de uma

massa definida de sedimento (entre 0,25 e 4 g, dependendo dos nveis de HPAs da amostra)
para frascos de vidro (Supelco SPME 20 ml). Seguidamente foram adicionados 10 ml de
metanol, sendo os frascos fechados com tampas metlicas descartveis (tampas metlicas com
septos para amostrador automtico, Supelco) Os tubos foram agitados manualmente e as
amostras foram submetidas ao banho de ultrassons (Transsonic 460/H Elma) durante 30 min.
Aps a extrao, as amostras foram centrifugadas (P Selecta Mixtasel) durante 5 min (2500
rpm) e o sobrenadante foi decantado. Um volume de 150 L de extrato foi retirado para novo
frasco de vidro perfazendo-se o volume final a 10 ml com gua desionizada, para posterior
anlise. Para a escolha do solvente extrator mais adequado foram efetuadas extraes com
28
quatro tipos de solventes (metanol, diclorometano, etanol e uma mistura de hexano:acetona

1:1). O procedimento acima descrito foi repetido para cada solvente. Foram tambm testados
diferentes tempos de extrao com o solvente selecionado: 30 min, 1 h e extrao sequencial
de 30 min mais 30 min. Na extrao sequencial foi usado duas tomas independentes do
solvente, cada com 10 ml.
2.3.2.
Extrao Assistida por Micro-ondas
Para a escolha do solvente extrator foram usadas amostras de sedimento (massa entre 0,25 e 4
g, dependendo dos nveis de HPAs da amostra) e 10 ml dos j anteriormente referidos
solventes (Metanol, diclorometano, etanol e uma mistura de hexano:acetona 1:1. As amostras
foram colocadas em tubos de Teflon (Figura 2.2) e levadas ao Micro-ondas (Milestone ETHOS 1) num suporte apropriado (Figura 2.2) e submetidas a um programa prprio do
cook-book, especifico para a anlise de HPAs (Tabela 2.1). Aps a extrao, as amostras
foram centrifugadas durante 5 min (2500 rpm) e o sobrenadante foi recolhido para um novo
frasco de vidro. O procedimento de extrao foi repetido para cada solvente e para cada
rplica. Um volume de 150 L de extrato foi retirado para novo frasco de vidro perfazendo-se
o volume final a 10 ml com gua desionizada. Este procedimento foi realizado para os quatro
solventes testados.
Figura 2.2. Frascos e suporte para micro-ondas.
Tabela 2.1. Programa (tempo (T), potncia (E), temperatura (T1) e presso (P)) do cook book utilizado na extrao assistida
por micro-ondas.
T (min)
E [w]
T 1 (C)
P (bar)
10
500
120
30
20
500
120
30
29
2.3.3.
Extrao por SPME
A fibra de SPME (Supelco, 100 m PDMS, para amostrador automtico) foi condicionada
segundo as instrues do fabricante, tendo sido colocada no injetor do cromatgrafo a uma
temperatura de 250 C durante 30 minutos. Este procedimento serve para limpar a fibra de
espcies contaminantes.
No incio de cada dia de trabalho condicionou-se a fibra durante no injetor do cromatgrafo e
procedeu-se ao traado de um cromatograma de forma a verificar o seu estado de limpeza.
Para seleo das condies de SPME foram testadas vrias temperaturas de extrao (60, 70,
80 e 90 C) bem como a extrao por headspace e extrao por imerso da fibra. No
procedimento final foi selecionado a temperatura de 80 C em headspace.
2.3.4.
Anlise por GC-MS
No incio de cada utilizao, a coluna (CP-SIL8CB LowBleed/MS 60 m0,250 mm, (0,25 m

film thickness) Varian) do cromatgrafo foi deixada a 250 C durante 30 minutos, com o
injetor com a vlvula de repartio aberta.
Aps a exposio da fibra limpa e a seleo do programa a usar, era traado um
cromatograma, de forma a verificar-se a boa operacionalidade do sistema.
2.3.4.1.
Aquisio de Dados por GC-MS
Para a implementao do processo de anlise cromatogrfica comeou-se por determinar os

tempos de reteno das espcies em estudo.
Usou-se, para tal, uma soluo padro com uma mistura dos 16 HPAs.
Condies Cromatogrficas
Utilizou-se um Cromatgrafo VARIAN 3900 Gas Chromatograph, com um injetor
programvel
com
repartio/sem
repartio
(split/splitless),
liner
especfico
para
microextrao em fase slida (SPME) e um sistema de septo Merlin Microseal, detetor por
espectrometria de massa Varian Saturn GC-MS 2000 e amostrador automtico CTC
Analytics, modelo Combipal. As condies cromatogrficas utilizadas foram: temperatura do
injetor 270 C e interface 300 C. O gs de arrasto foi hlio com elevado grau de pureza e
fluxo de 1.0 mL min-1. O injetor split/splitless foi utilizado no modo sem diviso de fluxo
30
(splitless) durante 7 min. O programa do forno do GC foi o seguinte: temperatura inicial de 40

C permanecendo por 1 min, aumentando gradualmente para 150 C com velocidade de
aquecimento de 40 C min-1, seguidamente aumento da temperatura para 280 C a uma
velocidade de 3,4 C min-1, e finalmente aumento de temperatura para 300 C com uma
velocidade de 4 C min-1, permanecendo, nessa temperatura, durante 14 min. O tempo total de
anlise cromatogrfica foi de 61,99 min. O programa de forno inicialmente utilizado foi
adaptado a partir de Rocha et al, (2011) e alterado com a progresso do trabalho experimental.
Aquisio de Dados em Fullscan

O programa foi utilizado inicialmente em varrimento total (FullScan), tendo como principal
objetivo a determinao dos tempos de reteno das espcies a analisar e a posterior
separao em segmentos para otimizao pelo mtodo de monitorizao dos ies selecionados
(SIS) com ionizao por impacto de eletres. Na Tabela 2.2 encontram-se os tempos de
reteno de cada HPA obtidos em fullscan:
Tabela 2.2 Tempos de reteno dos HPAs analisados e dos padres internos.
HPAs
Tempo de reteno / min
Naftaleno (N-d8) *
9,370
Naftaleno (N)
9,418
Acenaftileno (Ace)
14,297
Acenaftileno (Ace-d10) *
14,887
Acenafteno (AcP)
15,020
Fluoreno (F)
17,520
Fenantreno (P-d10) *
22,884
Fenantreno (P)
23,030
Antraceno (A)
23,343
Fluoranteno (Fluo)
30,858
Pireno (Py)
32,346
Benzo(a)antraceno (BaA)
40,722
Criseno (Ch-d12) *
40,796
Criseno (Ch)
40,978
*Padres Internos (HPAs Deuterados)
31
Programa Cromatogrfico Final

Posteriormente, a identificao dos HPAs nas amostras de sedimento foi determinada pelo
tempo de reteno, e a sua identificao foi confirmada pelos espectros de massas obtidos no
espectrmetro por meio de um io de quantificao e um io de diagnstico. Operando em
modo SIS o GC/MS apresenta algumas vantagens como o aumento da sensibilidade, uma vez
que h reduo do nmero de ies por varrimento na anlise, menor rudo de fundo e o
aumento da faixa linear do instrumento para baixas concentraes de analito. Antes de
qualquer injeo no sistema cromatogrfico, foi realizada uma anlise do branco nas mesmas
condies cromatogrficas de anlise, para avaliar a presena de interferentes nos tempos de
reteno dos HPAs.
Os ies caractersticos escolhidos para cada HPAs esto descritos na Tabela 2.3.
Tabela 2.3. Ies de quantificao e de diagnstico usados na anlise de GS-MS.
HPAs
Io de Quantificao (m/z)
Io Diagnstico (m/z)
Naftaleno (N-d8)*
136
Naftaleno (N)
128
127
Acenaftileno (Ace)
152
151
Acenaftileno (Ace-d10)*
164
Acenafteno (AcP)
153
154
Fluoreno (F)
165
166
Fenantreno (P-d10)*
188
Fenantreno (P)
178
176
Antraceno (A)
178
176
Fluoranteno (Fluo)
202
101
Pireno (Py)
202
101
Benzo(a,h)antraceno (BaA)
228
226
Criseno (Ch-d12)*
240
Criseno (Ch)
228
226
*Padres Internos (HPAs Deuterados)
32
CAPTULO III
OTIMIZAO DO MTODO
ANALTICO
3. Otimizao do Mtodo Analtico

Neste captulo so descritos procedimentos adotados para o desenvolvimento e otimizao do
mtodo analtico. Foi feito um estudo de parmetros de uma forma individual, devido
complexidade e variabilidade da matriz. Apesar de ser usada uma soluo padro com 16
HPAs para otimizao das condies de anlises apenas foram detetados 10 HPAs.
3.1. Otimizao dos Parmetros de SPME

Temperatura de Microextrao
Em Headspace-SPME, os coeficientes de distribuio Khm (headspace/matriz) e Kfh
(fibra/headspace) aumentam os seus valores medida que aumenta a temperatura, sendo a
velocidade no processo de extrao facilitada, em particular para analitos de volatilidade
baixa a moderada, considerando-se o processo de absoro como exotrmico e que este seja o
mecanismo predominante na interao analito/fibra (Ulrich, 2000). Assim, foram testadas
quatro temperaturas diferentes (90, 80, 70 e 60 C) para a extrao por SPME (Figuras 3.1 a
3.4). A temperatura 60 C demonstrou ser insuficiente para a volatilizao dos analitos com
massa molar mais elevada quer em headspace SPME quer em SPME com imerso de fibra.
Para a temperatura de 90 C observou-se uma diminuio do sinal registado para quase todos
os HPAs analisados. Quer a temperatura de 70 C quer a temperatura de 80 C permitiram a
extrao simultnea de todos os analitos. No entanto, a temperatura de 80 C para SPME
headspace foi aquela que garantiu um melhor compromisso, em termos do sinal medido, para
todos os HPAs analisados.
35
Figura 3.1. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs de concentrao 200 ng L-1 analisada por SPME headspace a
diferentes temperaturas (C).
Figura 3.2. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs de concentrao 2000 ng L-1 analisada por SPME headspace a
diferentes temperaturas (C).
36
Figura 3.3. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs de concentrao 200 ng L-1 analisada por SPME com fibra
imersa a diferentes temperaturas (C).
Figura 3.4. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs de concentrao 2000 ng L-1 analisada por SPME com fibra
imersa a diferentes temperaturas (C).
37
Tipo de Microextrao (Headspace ou Fibra imersa)

De maneira a aferir qual dos dois tipos de SPME (headspace ou fibra imersa) seria o mais
aconselhvel para a anlise dos compostos em estudo, foram realizados vrios testes de
comparao usando solues padro de HPAs, com duas concentraes, 100 ng L-1 e 1000 ng
L-1. Atravs da anlise das Figuras 3.5 e 3.6 pode verificar-se que para os HPAs com maior
massa molar, que so os mais difceis de volatilizar e, consequentemente, aqueles que mais
dificilmente so extrados, se obtiveram melhores resultados em headspace do que com a
fibra imersa, ao contrrio do que poderia ser esperado. Assim, SPME em headspace foi
selecionada. Este tipo de SPME apresenta tambm mais vantagens j que se encontra menos
sujeito a interferncias da matriz da amostra.
Figura 3.5. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs com concentrao de 100 ng L-1 analisada por SPME quer em
headspace quer com fibra imersa.
38
Figura 3.6. Sinais obtidos para uma soluo padro de HPAs com concentrao de 1000 ng L-1 analisada por SPME quer em
headspace quer com fibra imersa.
3.2. Otimizao dos Parmetros de Extrao dos Analitos

por Ultrassons e Micro-ondas
Aps a seleo da temperatura e do tipo de SPME (headspace a 80 C), foram efetuados

estudos para a otimizao de parmetros relativos extrao dos analitos de uma matriz
slida, por ultrassons e micro-ondas.
Extrao por Ultrassons

Foi estudada a eficincia de extrao usando diferentes solventes e diferentes tempos de
extrao
Tipo de Solvente
Foram utilizados quatro solventes, metanol, etanol, diclorometano e uma mistura de
hexano:acetona 1:1, na extrao dos HPAs de sedimento de referncia. Nas Figuras 3.7a e
3.7b apresentam-se os valores mdios dos sinais (e respetivos desvios padro) obtidos na
anlise de extratos de sedimento (valores corrigidos para as massas usadas nos diferentes
ensaios). Pode concluir-se que, no geral, o metanol se revelou o melhor solvente extrator,
39
tanto para os HPAs com menor massa molar como para aqueles que tm massa molar maior,
sendo este o solvente selecionado.
Figura 3.7a. Valores mdios dos sinais (e respetivos desvios padro) de HPAs com menor massa molar obtidos na anlise de
extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons) usando diferentes solventes extratores.
Figura 3.7b. Valores mdios dos sinais (e respetivos desvios padro) de HPAs com maior massa molar obtidos na anlise de
extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons) usando diferentes solventes extratores.
40
Tempo de Extrao
Foram estudados dois tempos de extrao: 30 minutos e 1 hora de extrao e uma extrao
sequencial do sedimento com duas tomas independentes de solvente, sendo cada extrao de
30 min. O solvente utilizado foi o metanol. Nas Figuras 3.8a e 3.8b esto representados os
resultados obtidos (corrigidos para as massas usadas nos diferentes ensaios) para os diferentes
tempos de extrao, sendo que para a extrao sequencial se apresentam separadamente os
sinais obtidos em cada toma de solvente.
extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons com metanol) com diferentes tempos de extrao dos HPAs.
41
extratos de sedimento (aps extrao por ultrassons com metanol) com diferentes tempos de extrao dos HPAs.
Comparando os tempos de extrao de 30 minutos e de 1 hora, pode concluir-se que o

aumento do tempo de extrao no provoca aumento significativo da quantidade de analitos
extrados. Pode observar-se, tambm, que na extrao sequencial (30 min + 30min) a
quantidade dos analitos extrados na 2 toma de solvente no significativa, o que leva a
concluir que uma nica extrao com um tempo de 30 minutos suficiente para a extrao
dos HPAs em estudo da matriz slida.
42
Extrao Assistida por Micro-ondas

Tipo de Solvente
Numa primeira fase do trabalho, tal como no caso da extrao por ultrassons, foram utilizados
quatro tipos de solventes: metanol, diclorometano, etanol e mistura hexano:acetona 1:1. O
programa usado nesta fase do trabalho foi um programa do cook-book do instrumento
utilizado, tendo apenas sido, na prtica, possvel usar o programa na sua totalidade para dois
dos solventes (metanol e diclorometano). Assim, posteriormente, foram realizadas extraes
de HPAs apenas com estes dois solventes Nas Figuras 3.9a e 3.9b apresentam-se os valores
mdios das reas dos sinais obtidos nos cromatogramas para os diversos HPAs, corrigidas
para as massas usadas nos diferentes ensaios, e os respetivos desvios padro.
extratos de sedimento (aps extrao assistida por micro-ondas) com dois solventes.
43
extratos de sedimento (aps extrao assistida por micro-ondas) com dois solventes.
Tanto o diclorometano como o metanol podem ser utilizados na extrao de HPAs por microondas, nas condies j descritas. Nota-se que, de um modo geral, a extratibilidade foi muito
semelhante para ambos os solventes, o que sugere que o metanol pode ser usado como
solvente extrator em ambas as tcnicas de extrao.
Por comparao dos sinais obtidos para os HPAs, na anlise de extratos de sedimento, aps
extrao por ultrassons (Figuras 3.8a e 3.8b) e aps extrao assistida por micro-ondas
(Figuras 3.9a e 3.9b), ambas com metanol, pode concluir-se que a extrao por ultrassons
dever ser a preferida. Este processo de extrao apresenta ainda a vantagem de ser uma
tcnica simples, rpida e de baixo custo para utilizao em anlises de rotina.
44
3.3. Caractersticas do Mtodo Analtico

Para validao do mtodo, foram avaliados os seguintes parmetros: seletividade, linearidade,
preciso, exatido, limites de deteo e quantificao e, posteriormente realizaram-se ensaios
de recuperao.
3.3.1.
Seletividade
A seletividade foi avaliada por meio da observao de cromatogramas de solues aquosas

padro contendo os HPAs em estudo. Foram identificados cada um dos HPAs, determinados
os respetivos tempos de reteno e observada a separao dos picos. Na Figura 3.10
apresenta-se um cromatograma exemplificativo de uma soluo padro de HPAs com
concentrao 1500 ng L-1 onde pode ser observada a boa separao dos picos relativos aos
HPAs em estudo.
Figura 3.10. Cromatograma de uma soluo padro de HPAs com concentrao 1500 ng L-1. Naftaleno (1), acenaftileno (2),
acenafteno (3), fluoreno (4), fenantreno (5), antraceno (6), fluoranteno (7), pireno (8), benzo(a)antraceno (9), criseno (10).
Nas condies descritas para a anlise de HPAs por CG-MS, foi obtida uma boa resoluo
para 10 HPAs (Figura 3.10), com tempos de reteno variando de 9,370 a 40,978 minutos. Os
HPAs com menores tempos de reteno so os de menor massa molecular, caraterizados
tambm por serem os mais volteis.
45
3.3.2.
Linearidade
Como referido na seco 1.6.1.2, a linearidade determinada por intermdio de uma curva de
calibrao obtida custa de pelo menos 5 a 6 pontos. Neste trabalho, a curva de calibrao foi
construda usando solues padro de HPAs com concentrao 10, 25, 50, 100, 250, 500,
1000 e 1500 ng L-1 (Anexo1). O mtodo apresentou resposta linear em todo o intervalo de
trabalho (10-1500 ng L-1). Os valores dos coeficientes de correlao (R) so apresentados na
Tabela 3.1
Tabela 3.1. Valores dos coeficientes de correlao das retas de calibrao para os HPAs estudados.
46
HPA
HPA
Naftaleno (N)
0,995
Antraceno (A)
0,995
Acenaftileno (Ace)
1,000
Fluoranteno (Fluo)
0,993
Acenafteno (AcP)
1,000
Pireno (Py)
0,994
Fluoreno (F)
0,994
Fenantreno (P)
0,994
Benzo(a)antraceno
(BaA)
Criseno (Ch)
0,998
0,992
3.3.3.
Limites de Deteo (LD) e Quantificao (LQ)
Como referido anteriormente nas seces 1.6.1.6 e 1.6.1.7, o limite de deteo corresponde
menor quantidade de um analito que pode ser detetada e, na prtica, pode ser determinado
como a menor concentrao do analito que pode ser diferenciada com segurana do rudo do
sistema. O limite de quantificao (LQ) corresponde menor quantidade de um analito que
pode ser quantificada com uma fidelidade determinada aceitvel. Desta forma, o LD e o LQ
foram estimados atravs da razo sinal/rudo para a soluo padro de HPAs de menor
concentrao. Na Tabela 3.2 esto os valores de LD e LQ obtidos para os HPAs em estudo.
Os LDs variaram entre os 2 e 14 ng L-1 e os LQs entre 8 e 45 ng L-1.
Tabela 3.2. Limites de deteo (LD) e de quantificao (LQ) para cada HPA estudado.
HPA
LD (ng L-1)
LQ (ng L-1)
HPAs
LD (ng L-1)
LQ (ng L-1)
Naftaleno (N)
14
45
Antraceno (A)
14
Acenaftileno (Ace)
29
Fluoranteno (Fluo)
Acenafteno (AcP)
24
Pireno (Py)
10
Fluoreno (F)
16
18
Fenantreno (P)
12
14
Benzo(a)antraceno
(BaA)
Criseno (Ch)
47
3.3.4.
Preciso
3.3.4.1.
Repetibilidade e Reprodutibilidade
A preciso do mtodo foi determinada atravs da avaliao da repetibilidade e

reprodutibilidade. Os resultados do estudo da reprodutibilidade e da repetibilidade foram
expressos pelo RSD (relative standard deviation) que representa a preciso total em
percentagem ou seja, a preciso total sobre o valor mdio. Normalmente, o RSD deve ser
inferior a 20 %. Na Tabela 3.3 encontram-se os valores de repetibilidade (%),
reprodutibilidade (%) e RSD (%) para cada HPA, verificando-se que os valores de RSD para
a repetibilidade esto compreendidos entre 2 e 25 % e entre 6 e 19 % para a reprodutibilidade.
A repetibilidade e a reprodutibilidade foram determinadas atravs da anlise de uma soluo
padro de HPAs com concentrao de 500 ng L-1.
Tabela 3.3. Valores da repetibilidade (%), reprodutibilidade (%) e RSD (%) para cada HPA.
HPAs
Repetibilidadea
RSD
Reprodutibilidadeb
RSD
Naftaleno (N)
Acenaftileno (Ace)
Acenafteno (AcP)
19
19
Fluoreno (F)
Fenantreno (P)
11
13
16
17
Antraceno (A)
13
15
14
16
Fluoranteno (Fluo)
25
25
17
Pireno (Py)
18
20
11
10
12
Criseno (Ch)
14
17
12
Repetibilidade foi calculada com base em seis rplicas de 500 ng L-1 durante um dia.
Reprodutibilidade foi avaliada atravs da anlise de uma soluo de 500 ng L-1 em 6 dias diferentes.
48
3.3.5.
Recuperao
Para o estudo do fator de recuperao foram realizadas anlises em triplicado do material

certificado NIST (1941b). Para que se possa considerar aceitvel a recuperao de todos os
HPAs em estudo, o fator de recuperao dever estar dentro do intervalo 80-120 %. Porm,
para os HPAs mais volteis, tais como o naftaleno, antraceno e o fenantreno, obtiveram-se
recuperaes mais baixas (Tabela 3.4). Diferentes razes podem contribuir para estes valores,
a degradao do HPA em questo ou a perda destes hidrocarbonetos podem ser as razes.
Tabela 3.4. Valores de concentrao em ng g-1 no sedimento de referncia (NIST 1941b) e valores experimentalmente
obtidos (mdia e respetivo desvio padro, n=3), valores de coeficientes de variao (CV) e fatores de recuperao em
percentagem.
HPAs
Valor certificado
Valor obtido
CV
Fator de
Recuperao
Naftaleno (N)
84895
43647
10
51
Acenaftileno (Ace)
53,36,4
589
109
Acenafteno (AcP)
38,45,2
364
26
94
Fluoreno (F)
8515
n.d
Fenantreno (P)
40644
27124
10
67
Antraceno (A)
18418
1375
75
Fluoranteno (Fluo)
65150
72294
17
111
Pireno (Py)
58139
55879
14
96
33525
28168
18
84
Criseno (Ch)
29131
33531
115
n.d. no detetado
49
50
CAPTULO IV
HPAS EM SEDIMENTOS DO
SAPAL DO ESTURIO DO RIO
LIMA
4.
HPAs em Sedimentos do Sapal do Esturio do Rio Lima
As plantas de sapal podem ter influncia na distribuio de contaminantes nos sedimentos

estuarinos. Para estudar o potencial efeito da rizosfera das plantas Juncus maritimus (P1),
Phragmites australis (P2), Triglochin striata (P3) e Spartina patens (P4), que colonizam o
esturio do Rio Lima (Figura 2.1), na distribuio de HPAs, foram analisados sedimentos
recolhidos em quatro locais (L1, L2, L3, L4), entre as razes das plantas e nas imediaes das
mesmas, sedimento no vegetado utilizando a metodologia desenvolvida. Os locais L1 e L2
so colonizados por J. maritimus, o local L3 colonizado por J. maritimus, P. australis e T.
striata e o local L4 colonizado por J. maritimus e S. patens.
Em geral, os sedimentos do local L3 (quer vegetados quer no vegetados) apresentam o valor
mais elevado de contedo em matria orgnica e de frao de finos (areia fina e silt e argilas)
(Tabela 4.1). Em cada local o rizosedimento apresenta um tamanho de gro menor,
apresentando uma maior percentagem quer de matria orgnica quer da frao constituda por
silt e argila (Almeida et al, 2011)
53
Tabela 4.1. Contedo em matria orgnica (MO desvio padro relativo, n=3) e granulometria dos sedimentos vegetados
(rizosedimentos) e no vegetados do esturio do Rio Lima. Adaptado de Almeida et al, 2011
Locais
Amostras
% MO
%
Gravilha
% Areia
grossa
% Areia
fina
% Silt e
Argila
L1
Sedimento
2.38 0.05
0.22
4.2
95
0.62
Rizosedimento J.
maritimus
3.4 0.3
11
40
40
9.7
Sedimento
4.3 0.8
6.8
22
49
22
Rizosedimento J.
maritimus
4.65 0.02
5.3
16
49
29
Sedimento
5.3 0.5
n.d.
4.5
45
51
Rizosedimento J.
maritimus
5.53 0.09
n.d.
3.6
36
60
Rizosedimento T.
striata
6.30 0.02
n.d
0.25
29
70
Rizosedimento P.
australis
5.7 0.1
n.d
0.70
39
60
Sedimento
0.60 0.01
12
36
46
6.7
Rizosedimento J.
maritimus
5.85 0.01
1.8
16
30
52
Rizosedimento S.
patens
3.41 0.01
n.d
4.4
74
21
L2
L3
L4
n.d. - no detetado.
54
4.1. Grau de Contaminao dos Sedimentos por HPAs

As diferentes amostras de rizosedimento e sedimento no vegetado nas imediaes de cada
planta foram extradas em triplicado. A quantificao dos HPAs nas amostras foi realizada,
utilizando o mtodo de padronizao interna, com base em curvas analticas, tendo sido
obtidos coeficientes de correlao aceitveis (acima de 0,99) para todos os compostos. Nas
Tabelas 4.2, 4.3, 4.4 e 4.5 resumem-se os valores dos teores de HPAs encontrados nos quatro
locais do esturio do rio Lima em sedimentos e rizosedimentos.
Tabela 4.2. Concentraes de HPAs (ng g-1) (mdia e respetivo desvio padro, n=3) nas amostras de sedimento no vegetado
nos quatro locais do esturio do Rio Lima. Os limites de deteo (LD) e quantificao (LQ) so tambm apresentados.
HPAs
LQ
LD
L1
L2
L3
L4
Naftaleno (N)
2,3
93
<LQ
135
<LD
Acenaftileno (Ace)
1,5
<LQ
<LD
<LD
<LD
Acenafteno (AcP)
1,2
<LD
<LD
<LD
<LD
Fluoreno (F)
0,8
<LQ
<LD
<LD
159
Fenantreno (P)
0,7
2610
14,70,7
425
121
Antraceno (A)
0,7
132
151
312
131
Fluoranteno (Fluo)
0,3
2414
142
6410
111
Pireno (PY)
0,5
2711
171
704
<LD
0,8
3015
202
486
<LD
0,7
254
297
577
<LD
154
110
325
51
Criseno (Ch)
HPAs*
*Soma das concentraes dos HPAs quantificados
Os nveis de concentrao total dos HPAs variaram entre 51 e 325 ng g-1. O valor mais
elevado foi observado no sedimento do local 3 cujo contedo em matria orgnica o mais
elevado dos quatro locais estudados (Tabela 4.1). No sedimento do local L4, foi apenas
possvel quantificar quatro dos dez HPAs analisados; este local caracterizado pelo menor
contedo em matria orgnica. Com exceo deste local, em todos os outros se observou a
presena de fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo(a)antraceno e criseno.
55
Na Tabela 4.3 encontram-se os valores do teor de HPAs nos rizosedimentos de dois dos
quatro locais estudados (L1 e L2) do esturio do Rio Lima, colonizados por J. maritimus.
Tabela 4.3. Concentraes de HPAs (ng g-1) (mdia e respetivo desvio padro, n=3) nas amostras de rizosedimento do
esturio do Rio Lima nos locais L1 e L2.
HPAs
L1
L2
Naftaleno (N)
183
204
Acenaftileno (Ace)
<LD
<LD
Acenafteno (AcP)
51
<LD
Fluoreno (F)
<LD
<LD
Fenantreno (P)
201
14,10,9
Antraceno (A)
171
132
Fluoranteno (Fluo)
2310
11,80,7
Pireno (Py)
197
132
233
<LD
Criseno (Ch)
2711
<LD
HPAs*
152
72
Verifica-se, que apenas dois dos 10 HPAs no foram detetados no rizosedimento do local L1.
Todos os outros se encontram em quantidades quantificveis. Relativamente ao local L2,
foram quantificados cinco dos HPAs, tambm quantificados no rizosedimento do local L1.
Na Tabela 4.4 apresentam-se os valores do teor de HPAs nos rizosedimentos das diferentes
plantas que colonizam o local L3 (J. maritimus, P. australis, T. Striata).
56
Tabela 4.4. Concentraes de HPAs (ng g-1) (mdia e respetivo desvio padro, n=3) nas amostras de rizosedimento do local
L3 do esturio do Rio Lima.
HPAs
L3 P1a
L3 P2b
L3 P3c
Naftaleno (N)
86
1110
123
Acenaftileno (Ace)
<LD
<LD
<LD
Acenafteno (AcP)
<LD
<LD
<LD
Fluoreno (F)
<LD
<LD
18041
Fenantreno (P)
6110
442
4510
Antraceno (A)
323
314
346
Fluoranteno (Fluo)
7619
7411
5615
Pireno (Py)
7313
7910
5221
461
465
5111
Criseno (Ch)
474
515
644
HPAs*
343
336
494
P1 J. maritimus
P2 P. australis
P3 T. Striata
Os valores de concentrao total dos HPAs variaram entre 343 e 494 ng g-1 nos trs tipos de
rizosedimento do local L3. O valor mais elevado foi observado no rizosedimento da planta T.
Striata; tal facto pode estar relacionado com o maior contedo de matria orgnica presente
neste rizosedimento (Tabela 4.1). Com exceo do fluoreno, foram quantificados os mesmos
HPAs em todos os rizosedimentos deste local, como seria de esperar se todas as plantas
tivessem a mesma influncia na acumulao/degradao dos contaminantes.
Na Tabela 4.5 coligiram-se os valores das concentraes de HPAs nos rizosedimentos das
plantas que colonizam o local L4 (J. maritimus e S. patens).
57
Tabela 4.5. Concentraes de HPAs (ng g-1) (mdia e respetivo desvio padro, n=3) nas amostras de rizosedimento do local
L4 do esturio do Rio Lima.
HPAs
L4 P1a
L4 P4b
Naftaleno (N)
235
<LD
Acenaftileno (Ace)
404
<LD
Acenafteno (AcP)
143
<LD
Fluoreno (F)
<LD
<LD
Fenantreno (P)
564
151
Antraceno (A)
282
12,50,1
Fluoranteno (Fluo)
8047
101
Pireno (Py)
7337
111
5830
<LD
Criseno (Ch)
495
<LD
10 HPAs
421
48,5
P1 J. maritimus
P4 S. patens
A concentrao total de HPAs quantificados no rizosedimento de J. maritimus superior

observada no rizosedimento de S. patens, de acordo com os respetivos contedos de matria
orgnica. Todos os HPAs foram quantificados, exceto o fluoreno, no rizosedimento de J.
maritimus. Por outro lado, no rizosedimento de S. patens, observou-se apenas a presena de
quatro dos HPAs.
Assim, em qualquer um dos locais, quer nos sedimentos quer nos rizosedimentos das
diferentes plantas, foi observada a presena deste tipo de contaminantes na gama das dezenas
de ng g-1.
58
4.2. Distribuio dos HPAs nos Sedimentos Estuarinos

No sentido de tentar estudar o efeito da rizosfera das plantas que colonizam o esturio do Rio
Lima, na distribuio dos HPAs pelos sedimentos, compararam-se as concentraes e tipo de
hidrocarbonetos encontrados nos sedimentos vegetados e no vegetados dos diferentes locais.
No local L1 colonizado por J. maritimus s se observa uma aparente acumulao de naftaleno
e acenafteno no rizosedimento. No local L2 colonizado pela mesma planta observou-se o
aumento da concentrao de naftaleno no rizosedimento, enquanto que a concentrao de
benzo(a)antraceno e criseno diminuram relativamente observado no sedimento no
vegetado.
No local L3, no observada a influncia da planta na distribuio dos
hidrocarbonetos. Por outro lado, no local L4 observada uma acumulao de hidrocarbonetos

no rizosedimento. Assim, no pode inferir-se que a rizosfera desta planta tenha influncia na
distribuio dos hidrocarbonetos nos diferentes sedimentos. Poder eventualmente ocorrer em
alguns casos acumulao devida a um maior contedo de matria orgnica do rizosedimento.
Relativamente s plantas T. Striata, P. australis e S. patens no se observam diferenas
significativas entre as concentraes dos diferentes HPAs encontrados no sedimento vegetado
e no vegetado.
Globalmente os resultados obtidos levam a concluir que a presena das plantas em estudo no
exerceu influncia na acumulao/degradao de HPAs nos sedimentos estuarinos.
59
60
CAPTULO V
CONSIDERAES FINAIS
5.
Consideraes Finais
A metodologia desenvolvida para determinao de HPAs numa matriz slida de sedimento

permitiu a deteo e quantificao de 10 dos HPAs considerados prioritrios. A tcnica de
headspace-SPME-GC-MS precedida de extrao dos contaminantes em sedimentos
estuarinos por ultrassons, usando metanol como solvente, revelou-se mais eficiente do que
quando precedida de extraco por micro-ondas usando o mesmo solvente. O processo de
extraco por ultrassons demonstrou ser uma tcnica simples e precisa para a extrao de
HPAs de sedimento, obtendo-se uma recuperao mdia para o sedimento referncia no
intervalo 51 a 115 % e um coeficiente de varincia entre 8 a 26%.
A SPME em headspace, temperatura de 80 C, permitiu obter uma soluo de compromisso
para a melhor deteo simultnea dos HPAs, tanto de menor como de maior massa molar. A
tcnica apresentou tambm seletividade para possibilitar a determinaes de concentraes
vestigiais de HPAs em amostras de sedimento sem interferncias significativas.
A metodologia global demonstrou poder ser aplicada para a quantificao dos compostos em
concentraes na faixa dos nanogramas por litro ou ng por g de sedimento. Deve, no entanto
salientar-se que a metodologia desenvolvida necessita de refinao, em particular do processo
de aquisio de dados cromatogrficos, para que possam ser quantificados mais do que 6 dos
HPAs considerados prioritrios.
A aplicao da metodologia determinao das concentraes de HPAs em sedimentos
estuarinos vegetados e no vegetados permitiu concluir que a presena das plantas estudadas
no teve influncia significativa na distribuio dos HPAs nos referidos sedimentos. Para um
estudo futuro da capacidade de plantas de sapal remediarem sedimentos contaminados com
HPAs, para alm de determinaes e comparao das concentraes dos contaminantes em
sedimentos vegetados e no vegetados, devero ser realizadas experiencias planeadas
adequadamente, incluindo a simulao da ao das mars em esturios.
63
64
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72
ANEXOS
ANEXO 1. EXEMPLOS DE RETAS DE CALIBRAO

1. NAFTALENO (N)
Naftaleno
9000
8000
rea (counts)
7000
6000
5000
4000
3000
y = 5,4523x + 304,76
R = 0,9928
2000
1000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
2. ACENAFTILENO (Ace)
Acenaftileno (Ace)
16000
14000
rea (counts)
12000
10000
8000
6000
y = 8,8842x + 257,73
R = 0,9963
4000
2000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
75
3. ACENAFTENO (AcP)
Acenafteno (AcP)
7000
6000
rea (counts)
5000
4000
3000
y = 3,8552x + 314,08
R = 0,9975
2000
1000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
4. FLUORENO (F)
Fluoreno (F)
25000
rea (counts)
20000
15000
10000
y = 12,821x + 732,17
R = 0,9969
5000
0
0
200
400
600
800
C
76
(ngL-1)
1000
1200
1400
1600
5. FENANTRENO (P)
Fenantreno (P)
50000
45000
rea (counts)
40000
35000
30000
25000
20000
y = 30,322x + 826,08
R = 0,9968
15000
10000
5000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
6. ANTRACENO (A)
Antraceno (A)
80000
70000
rea (counts)
60000
50000
40000
30000
y = 45,22x - 814,46
R = 0,9943
20000
10000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
75
7. FLUORANTENO (Fluo)
Fluoranteno (Fluo)
90000
80000
rea (counts)
70000
60000
50000
40000
30000
y = 49,497x + 1674,5
R = 0,9907
20000
10000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
8. PIRENO (Py)
Pireno (Py)
80000
70000
rea (counts)
60000
50000
40000
30000
y = 46,758x + 1814
R = 0,9938
20000
10000
0
0
200
400
600
800
C
76
(ngL-1)
1000
1200
1400
1600
9. BENZO(a)ANTRACENO (BaA)
35000
30000
rea (counts)
25000
20000
15000
10000
y = 18,744x + 667,39
R = 0,9962
5000
0
0
200
400
600
800
C
1000
1200
1400
1600
(ngL-1)
10. CRISENO (Ch)
Criseno (Ch)
30000
rea (counts)
25000
20000
15000
10000
y = 17,79x + 1039,2
R = 0,9979
5000
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
C (ngL-1)
75

Bruna Amorim Pires

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OTIMIZAO DE UM MTODO ANALTICO

Departamento de Qumica e Bioqumica

Bruna Amorim Pires

OTIMIZAO DE UM MTODO ANALTICO PARA A

Tese submetida Faculdade de Cincias da Universidade do Porto para a obteno do grau

Departamento de Qumica e Bioqumica

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

global foi aplicada a amostras de sedimento estuarino para a determinao da respetiva

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

methodology can be applied to the quantification of the compounds in concentrations in the

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

1.6.1.2. Linearidade e curva analtica ...................................................................................19

CAPTULO II MATERIAL E MTODOS ...............................25

CAPTULO III OTIMIZAO DO MTODO ANALTICO ....33

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

3.3. CARACTERISTISCAS DO MTODO ANALTICO .......................................................45

CAPTULO IV HPAS EM SEDIMENTOS DO SAPAL DO

CAPTULO V CONSIDERAES FINAIS ...........................61

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

fluoranteno (7), pireno (8), benzo(a)antraceno (9), criseno (10). ..........................................45

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

POPs Poluentes Orgnicos Persistentes

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

A contaminao da atmosfera, meio aqutico e solo pode alterar de forma irreparvel o

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

superficiais, estes compostos so geralmente adsorvidos pelas partculas em suspenso e

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

1.3. Sistemas Estuarinos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

marinho (Packamm, 1997). Os sapais so ecossistemas particularmente inconstantes em

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Spartina maritima e Salicornia nitens. 2) Sapal intermdio - esta zona normalmente

1.4. Remediao de Solos e Sedimentos

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

aumento do arejamento do solo, atravs da libertao de oxignio na regio das razes e,

1.5. Mtodos Analticos Aplicados na Determinao de

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

1.5.1.1. Extrao por Banho de Ultrassons

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

produz microjatos de lquido de alta velocidade (v>100m/s) responsveis pela limpeza da

1.5.1.2. Extrao Assistida por Micro-ondas

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

prevenindo a perda de analito e solvente (Lopez-Avila, 1998). O controlo da temperatura

Microextrao em Fase Slida SPME

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

1.5.2.1. Extrao por Fibra Imersa

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

1.5.2.2. Extrao em Headspace

1.5.2.3. Aspetos Prticos para a Otimizao da SPME

Otimizao de um mtodo analtico para a determinao de HPAs em sedimentos estuarinos

Seleo do Modo de Microextrao