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Un enfoque evolutivo
de la clula
Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich
Fig. I-0. Imaginando una protoclula. Estructura vesicular con contenido orgnico,
rodeada por una membrana visible con microscopia de fluorescencia (vase fig. I-1).
Todas la formas de vida estn compuestas por molculas que no estn vivas por s
mismas. Pero, de qu manera difiere la materia viva de la no viva? Cmo podra
surgir una primitiva forma de vida de un conjunto de molculas no vivas? La transicin de la materia no viva a la materia viva usualmente emerge en el contexto del
origen de la vida. (Del prrafo inicial de Rasmussen et al., 2004).
PARTE I
Captulo 1
Mtodos generales para el estudio de las clulas
y los tejidos 10
Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard
y Mirta A.Valentich
Captulo 2
El ncleo como centro interactivo de control
celular 33
Mirta A. Valentich, Guillermina A. Bongiovanni
y Roberto A. Rovasio
Captulo 3
Lneas de montaje, trnsito y destino de
macromolculas y membranas para exportacin
y para uso interno 72
Mirta A. Valentich y R. Olga Caldern
Captulo 4
Evolucin de las fuentes de energa y su
transformacin 90
Mirta A. Valentich y R. Olga Caldern
Captulo 5
Relaciones de la clula hacia su interior y con
su medio exterior 103
Roberto A. Rovasio, Mirta A.Valentich
y Aldo R. Eynard
EL CAMINO HACIA
LA PROTOCLULA
Como se mencion en el prrafo introductorio
avalado por abundante evidencia, podemos imaginar el inicio del largo camino que dar origen a la
clula(*), como un enorme caldero que contiene miradas de las primeras molculas orgnicas simples
(fig. I-1 A). Molculas que, por afinidades fisicoqumicas que no seran necesariamente diferentes de las
del tiempo actual, determinaron uniones entre ellas.
Estos enlaces permitiran el surgimiento de conjuntos moleculares que denominamos los polmeros
primigenios (fig. I-1 B). Considerando el comportamiento fisicoqumico de las molculas modernas,
tampoco es difcil imaginar que en aquella poca los
constituyentes de los primitivos polmeros tuviesen
sus propias preferencias de unin, cuya resultante
sera otro polmero, complementario del primero
(fig. I-1 C). A la luz de nuestros actuales conocimientos, los cambios que acabamos de describir no slo
fueron posibles, sino muy probables. Lo difcil para
nuestra dimensin humana es, precisamente, imaginar que para llegar a esos cambios, hicieron falta muchos millones de aos de evolucin molecular, y
muchos trillones de interacciones moleculares fallidas, hasta que algunas de ellas comenzaron a ser estables. Es difcil de imaginar pero no imposible de
conceptuar que muchos de los cambios que ocurren
en nuestras modernas clulas (o en un tubo de ensayo) en segundos o minutos, demoraron millones de
aos en ensayos hasta llegar a un estado fisicoqumico estable y reproducible.
Cmo contina esta historia prebitica? Ya tenemos molculas orgnicas simples formando polmeros. No hay razn para pensar que las molculas
integrantes de esos polmeros no hayan tenido afinidad para unirse con otras molculas simples y
que stas, a su vez, puedan haberse unido entre s
para formar un nuevo polmero (fig. I-1 D). Podemos agregar a este razonamiento los millones de
aos que hagan falta, que nunca sern pocos Pero, he aqu un nuevo cambio que ser esencial para
la vida tal como hoy la conocemos, cual es la adquisicin de la capacidad de auto-duplicacin de un
polmero (fig. I-1 B-D).
En sntesis, en el viejo y largo camino hacia la protoclula ya tenemos los elementos que sern la base de muchos procesos importantes para la clula
moderna y el ncleo fundamental de todos los sistemas biolgicos. La formacin de polmeros y la
capacidad de autoduplicacin de los mismos forman la base de los procesos de sntesis biolgica y
de la transferencia de informacin (fig. I-1 A-D).
Sin embargo, a pesar de la importancia de esos
millones de aos de evolucin molecular, an esta* Las palabras en negrita se definen en el Glosario.
Fig. I-1. Etapas en la evolucin hacia la protoclula. A. Molculas orgnicas simples. B. Polmero primigenio. C. Polmero complementario. D. Nuevo polmero. (+) y (-) Efecto favorable o desfavorable sobre el polmero primigenio.
Formacin del primer compartimiento = protoclula.
Procariontes
Eucariontes
Organismos
Bacterias y cianobacterias
Tamao
Pequeo (1-10 m)
Grande (10-100 m)
Sistema gentico
DNA repetitivo
Sistema sexual
Transferencia unidireccional de
genes de donador a receptor
RNA y protenas
Sintetizados en el mismo
compartimiento
Membranas internas
Slo transitorias
Metabolismo
Anaerbico o aerbico
Aerbico
Nutricin
Difusin. Algunos
fotosintetizadores
Organizacin celular
Ausente, principalmente
unicelulares
Motilidad citoplasmtica
No posee citoesqueleto
Transporte vesicular
Divisin celular
Protenas en citoplasma
Endocitosis y exocitosis
Motilidad global
por qu, como veremos las membranas interna y externa de la envoltura nuclear se continan con la
membrana del RE. Tambin existen slidos criterios
moleculares que apoyan la propuesta de que la mitocondria se origin de una bacteria aerobia ancestral,
al ser internalizada por un eucarionte primitivo, seguido por la adaptacin simbitica que les permiti
a ambos tipos celulares obtener ventajas funcionales
y evolutivas (fig. I-2 B). El origen del cloroplasto de
las clulas vegetales sera similar, pero por simbiosis
con una bacteria fotosinttica (fig. I-2 C). En ambos
casos, se sabe que muchas caractersticas moleculares de estos organoides (DNA, RNA, enzimas, etc.)
son de tipo bacteriano, ambos estn envueltos por
una doble membrana (la externa derivada de la
membrana plasmtica) y ambos estn fuera del circuito topolgico de endomembranas (fig. I-2 D).
COMPARTIMIENTOS Y FUNCIONES:
LA MEMBRANA CELULAR
El concepto de compartimentacin bsico y fundamental para el conocimiento de la biologa celular visualiza el citoplasma como un conjunto de espacios con diferente contenido, limitados por distintos tipos
de membranas (fig. I-2 D). As, todos los organoides
estn rodeados por una membrana (o dos, con menos frecuencia) que delimitan espacios con una organizacin ultraestructural, composicin qumica,
propiedades fsicas y funciones caractersticas. Muchas de las enzimas que catalizan las funciones celulares se encuentran distribuidas en forma selectiva en los diferentes compartimientos, ya sea en sus
componentes membranosos o en los espacios que
delimitan. Las membranas, a la vez que separan
Fig. I-2. Posible evolucin de los compartimientos celulares. A. Adquisicin de envoltura nuclear y retculo endoplasmtico. B. Mitocondrias. C. Cloroplastos. D. Endomembranas de un eucarionte actual. REL: retculo endoplasmtico
liso. RER: retculo endoplasmstico rugoso.
Clula de mamfero
% del peso celular
70
70
Iones inorgnicos
Metabolitos pequeos
15
18
Protenas
RNA
1,1
DNA
0,25
Fosfolpidos
Otros lpidos
Polisacridos
Volumen total
Volumen relativo
2 10
12
2
cm
4 19
cm3
2000
Fig. I-3. La membrana celular segn el modelo de GorterGrendel, con su doble capa de fosfolpidos orientados
con sus cabezas polares (P) hacia el exterior y las cadenas
hidrfobas (CH) hacia el interior de la bicapa. (Gorter y
Grendel, 1925).
Fig. I-4. La membrana celular segn el modelo de Danielli-Davson, con su doble capa de fosfolpidos y las protenas globulares adsorbidas a sus superficies externa e interna. (Danielli y Davson, 1935).
croscopio utilizado durante muchos aos para describir en detalle muchos tipos celulares no permiti
visualizarla, por lo que durante largo tiempo el
concepto de membrana celular permaneci en el mbito de las intuiciones o las especulaciones. Cuando
las herramientas tecnolgicas lo permitieron, se
avanz sobre la idea de la composicin lipdica de
la membrana propuesta por Overton en 1902. Para
ello, dos cientficos seleccionaron un modelo experimental simple, el eritrocito de mamfero formado
esencialmente por una envoltura membranosa y un
contenido homogneo, sin ncleo ni organoides.
Luego de eliminar el contenido, analizaron la envoltura del eritrocito, describieron su composicin
en lpidos y, calculando el espacio que ocupaban,
concluyeron que la membrana plasmtica estara
formada por una doble capa de lpidos, lo que estableci las bases estructurales de lo que se conoce como el modelo de Gorter-Grendel (fig. I-3). Este modelo terico, basado sobre datos biofsicos y qumicos, explicaba parcialmente la permeabilidad de la
membrana a las sustancias lipoflicas y la fusin espontnea entre membranas (vase cap. 5, cuadro 51), pero no poda explicar muchas otras funciones
celulares, para lo cual el modelo resultaba insuficiente.
Durante 25 aos, el concepto de membrana no se
modific, a pesar de que slo explicaba parcialmente el mecanismo de permeabilidad de molculas liposolubles o hidrfobas, y no poda explicar
muchas otras funciones de la membrana celular.
Por esta necesidad funcional, el modelo debi
evolucionar y se propuso el agregado de capas externa e interna de protenas globulares adheridas
(adsorbidas) a la bicapa de fosfolpidos, que conform el modelo de Danielli-Davson (fig. I-4). Esta participacin proteica en la membrana, aunque
tampoco explicaba el mecanismo, ayudaba a visualizar mejor el transporte de molculas hidrfilas y la antigenicidad de la clula (vase cap. 5,
cuadro 5-1).
Sin embargo, el concepto de membrana an no
contena los elementos que permitieran comprender otras funciones y tampoco haba acuerdo en la
estructura molecular y forma de integracin de las
capas proteicas con los lpidos de la membrana. En
la dcada de 1950, la estructura de la membrana se
visualiz con los primeros microscopios electrnicos como una doble capa osmifila y, sobre una base cuantitativa proporcionada por los datos ultraestructurales, Robertson postul en 1962 que las protenas superficiales deban disponerse en forma extendida sobre la superficie lipdica. Esta estructura
y la visualizacin de la bicapa lipdica contribuyeron a consolidar el concepto universal an vigente
de unidad de membrana, apoyado en particular
por la semejanza estructural entre las membranas
artificiales y diferentes tipos de membranas naturales (fig. I-5).
Pasaron casi cuarenta aos para que el modelo de
la membrana celular ganara nuevos componentes,
nueva estructura y mayor dinamismo. Durante esa
tercera etapa se hicieron contribuciones trascendentes a la estructura de la membrana que, con ligeras
variantes, permanecen hasta la actualidad. Sobre la
base de los modelos anteriores se propuso la incorporacin de glucolpidos y glucoprotenas como
parte integral de la membrana y no adsorbidos como
en el modelo anterior. Estas molculas estaran interaccionando con la regin hidrfoba de la bicapa lipdica, exhibiendo su porcin glucdica hacia la superficie externa de la clula. Esta ltima caracterstica permiti tambin que se reconociera la existencia real del glucocliz como un componente intrn-
C
B
Fig. I-5. A. Micrografa electrnica de membrana artificial formada por el ensamble espontneo de lpido-protenaagua. (W. Stoeckenius, tomada de De Robertis et al., fig. 7.7, 1968.) B. Membrana de dos clulas intestinales contiguas.
(Tomada de De Robertis et al., fig. 8.3, 1968.) C. Membrana plasmtica del cuerpo (flecha) y corte transversal de flagelo (f) de Trypanosoma cruzi. (Rovasio, 1976.)
los cambios de forma celular, la interaccin y el reclutamiento de ligandos (capping), muchos fenmenos inmunes y de histocompatibilidad (vase
cap. 5, cuadro 5-1). Paralelamente, permiti determinar la heterogeneidad fisicoqumica entre membranas de diferentes clulas y entre diferentes
dominios de una misma membrana, as como la
asimetra entre los componentes superficiales y citoslicos de una membrana.
NIVELES DE ORGANIZACIN
CELULAR
Llegar al concepto de que la clula actual es el resultado de un prolongado y complejo mecanismo
evolutivo nos permitir introducirnos en los cinco
captulos de la Parte I del libro, en los que trataremos inicialmente algunos mtodos e instrumentos
para estudiar la clula, para detallar a continuacin
sus principales estructuras, funciones y productos.
Esos conocimientos darn las condiciones adecuadas para entender que los organismos de muchos
metazoarios, como el ser humano, estn formados
por un elevado nmero de clulas (cerebro = 1012
clulas!!!) y que stas no se disponen al azar, sino
que se encuentran distribuidas con distintos grados de complejidad en los diferentes niveles de organizacin.
En la Parte II (captulos 6 a 10) veremos cmo las
clulas se agrupan en diversas poblaciones celula-
EL ESTUDIO DE CLULAS
Y TEJIDOS, SU RELACIN CON
OTRAS REAS BIOMDICAS
La biologa celular, la histologa y la embriologa
son reas interdisciplinarias que convergen para el
estudio de diversos aspectos de la estructura, la
funcin y la regulacin de conjuntos celulares integrados y organizados a lo largo del desarrollo de un
organismo desde su etapa unicelular hasta su
muerte. A su vez, esas disciplinas fundamentan y se
involucran en mltiples reas del conocimiento de
las ciencias biomdicas.
La biologa celular proporciona las bases estructurales de los cambios qumicos y metablicos estudiados en qumica biolgica, as como de las
caractersticas funcionales correspondientes a la fisiologa; son numerosos los mecanismos celulares
y moleculares as como las herramientas utilizadas para su estudio que requieren los fundamentos de la biofsica. La histologa se relaciona con la
anatoma, ya que sta no se integra desde lo fun-
Fig. I-6. La membrana celular segn el modelo de Singer-Nicolson, con la doble capa de lpidos y las protenas
integrales que atraviesan total (P1) o parcialmente (P2) la
membrana. Una de las protenas integrales forma un canal o tnel (t) que comunica ambas superficies de la
membrana. Se indican tambin los glucolpidos (Gl) y las
glucoprotenas (Gp) con sus residuos azcares hacia el
lado externo de la membrana formando el glucocliz.
(Singer y Nicolson, 1972)
Lente montada
en un soporte
metlico
Soporte
para
sostener el
espcimen
Sistema de
enfoque y
movimiento
del espcimen
Fig. 1-0. A. Microscopio simple inventado por Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), vista posterior (derecha) y lateral (izquierda), y manera de utilizarlo por el autor (recuadro). B. Microscopio compuesto inventado por Robert Hooke (1635-1703).
Resumen conceptual
l conocimiento de la clula y de los tejidos se inicia en el siglo XVI con la invencin de los primeros microscopios, que permitieron cruzar el lmite impuesto por la resolucin del ojo humano.
Durante los primeros aos, la observacin de pequeos organismos o de partes diminutas de estructuras biolgicas mayores estuvo restringida a los objetos tal como podan obtenerse en su estado natural. Posteriormente se desarrollaron mtodos para la preservacin de los especmenes,
para lograr mayores contrastes que permitieran evaluar mejor su estructura y para analizar sus
componentes. Ese largo camino, iniciado hace mucho tiempo, se mantiene en la actualidad y traza un paralelismo permanente entre el avance tecnolgico y los progresivos descubrimientos cientficos.
Aunque los sistemas aplicados para el estudio de clulas y tejidos son numerosos, los requerimientos bsicos que veremos a continuacin son: 1) material de estudio preparado en forma adecuada (tcnicas citohistolgicas) y 2) instrumental para su visualizacin y estudio (microscopios).
En este captulo se pasar revista a algunos mtodos bsicos que permiten estudiar la clula y los
tejidos animales en su estructura y en diversos aspectos de su composicin qumica y funcin.
TCNICA CITOHISTOLGICA
Y MICROSCOPIAS
Tcnica citohistolgica
Observaciones importantes
Toma de la muestra: manipulacin delicada para
evitar su deformacin. La muestra puede obtenerse
11
Fundamento / Precauciones
Producto / Instrumento
Toma de la muestra
Fijacin
Deshidratacin
Aclaracin
Xilol, benzol
Inclusin en parafina
Corte
Micrtomo
Portaobjetos
Desparafinacin
Xilol, benzol
Hidratacin
Coloracin
Hematoxilina-eosina
Deshidratacin
Aclaracin
Xilol, benzol
Montaje de cubreobjetos
Cubreobjetos + resinas
* La descripcin en el cuadro y en el texto se refiere al procesamiento de tejidos slidos. Para procesar clulas aisladas, obtenidas in vivo o in vitro, se modifican algunos procedimientos, mantenindose los lineamientos generales.
12
Fig. 1-1. Tcnica histolgica. Desde la toma de la muestra hasta el montaje del corte.
13
Fig. 1-2. Tcnica histolgica. Desde la desparafinacin hasta la preparacin microscpica permanente.
aninicos) por la presencia del grupo carboxilo (COOH), por ejemplo, eosina.
El mtodo de coloracin convencional ms utilizado en histologa e histopatologa se conoce como hematoxilina-eosina (fig. 1-3). La hematoxilina es un
colorante nuclear que se comporta como un colorante bsico al teir los componentes cidos de los tejidos; por ejemplo, los ncleos celulares, por su contenido en DNA, se observan de color azul-violceo. La
eosina es un colorante citoplasmtico, cido, que tie los componentes bsicos de los tejidos; por ejem-
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Aplicaciones
Hematoxilina de Mayer
Ncleos celulares
Eosina
Citoplasma
Hematoxilina frrica
Fibras elsticas
Hematoxilina fosfotngstica
Impregnacin argntica
May Grnwald-Giemsa
Clulas sanguneas
Artefactos de la tcnica
Los artefactos de la tcnica son alteraciones que
se producen por fallas en alguna etapa de la tcnica
citohistolgica y que se reflejan en la preparacin
microscpica. Defectos en la fijacin, la deshidratacin y la inclusin pueden ser causas de desgarros
y retracciones en los tejidos, que llevan a la aparicin de espacios que no tienen existencia real. Asimismo, si la acidez del formol no se neutraliza, pueden aparecer grnulos coloreados por interaccin
del cido frmico con la hemoglobina (pigmento de
formalina). Durante la seccin con el micrtomo
pueden aparecer rayas producidas por melladuras
de la cuchilla. Si el corte no se extiende perfectamente sobre el portaobjetos, puede haber pliegues y
arrugas. Los defectos en la coloracin tambin pueden ser provocados por la calidad y la preparacin
de las mezclas colorantes o por una fijacin insuficiente. Es importante saber discriminar los artefactos de la tcnica de las estructuras normales en una
preparacin microscpica, ya que de lo contrario se
puede cometer un error en el diagnstico o en la
conclusin del estudio.
Tcnicas citoqumicas
Las tcnicas citoqumicas proporcionan informacin qumica localizada sobre la clula o tejido en estudio. Algunas son muy especficas y proporcionan
datos cuantitativos, por lo cual permiten obtener resultados analticos y funcionales ms completos que
las tcnicas empricas. No son coloraciones, sino
reacciones fisicoqumicas cuyo producto final es coloreado, con lo cual se identifica y localiza una mo-
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Fig. 1-4. Reaccin de Feulgen. A. Fundamento, sitios de ataque de la hidrlisis cida (flecha). B. Hgado (mediano aumento). Ntese el DNA de la cromatina nuclear (flecha) y el pequeo puntillado del DNA mitocondrial (cabeza de flecha).
Reaccin de Feulgen
La reaccin de Feulgen demuestra selectivamente el DNA. Para ello, en un primer paso, la
preparacin se somete a una hidrlisis con cido
clorhdrico (ClH), la cual produce: 1) separacin
de las bases pricas del DNA y 2) apertura del
anillo desoxirribosa (fig. 1-4), que pasa a una forma molecular abierta y deja grupos aldehdos al
descubierto. En el siguiente paso, los aldehdos
reaccionan con el reactivo de Schiff, que produce
un color rojo magenta en las zonas donde se encuentra el DNA. La unin entre aldehdos y reactivo de Schiff es estequiomtrica; es decir, el nmero de molculas del reactivo unido mantiene
una relacin constante con la cantidad de DNA.
Esto permite realizar la cuantificacin del contenido de DNA por medicin de la coloracin obtenida en preparaciones microscpicas mediante un
microespectrofotmetro.
El control negativo se obtiene al someter preparaciones microscpicas del mismo material en estudio
a digestiones previas con desoxirribonucleasa
(DNAasa), enzima que degrada selectivamente el
DNA y, por lo tanto, la reaccin debida al DNA ser negativa. El control positivo consiste en un corte
histolgico de cualquier tejido conocido que contenga ncleos celulares (DNA).
Reaccin de PAS
(periodic acid-Schiff)
Se inicia con una oxidacin con cido perydico
(HlO4), que reacciona con grupos hidroxilos libres de
una hexosa o con grupos adyacentes hidroxilo y
amino de una hexosamina, convirtindolos en grupos aldehdos con rotura de la unin carbono-carbono (fig. 1-5 A). En un segundo paso, los aldehdos
reaccionan con el reactivo de Schiff y producen un
complejo estable de color rojo magenta en los sitios
donde se encuentran los azcares mencionados (fig.
1-5 B, vase tambin fig. 1-20B). En las estructuras
celulares o extracelulares, la mayor parte de esta
reaccin corresponde a glucgeno y glucoprotenas.
Como control negativo de la presencia de glucgeno se realiza una preincubacin de la preparacin con
la enzima amilasa, que digiere especficamente el
glucgeno (vase fig. 1-5 C). Para ello, puede usarse
una preparacin pura de amilasa, o simplemente saliva cuyo contenido en esta enzima es abundante. En
este caso, la reaccin de PAS ser negativa en los sitios ocupados por el glucgeno, mientras que seguir
siendo positiva en los lugares que contiene glucoprotenas. Como control negativo de la presencia de glucoprotenas se realiza una preincubacin de la preparacin con glucosidasas especficas con el fin de hidrolizar estos carbohidratos complejos. En este caso,
los sitios negativos corresponden a los sitios de las
glucoprotenas hidrolizadas y los sitios PAS positivos
correspondern a otras clases de glucoprotenas o a
glucgeno. Como control positivo se utilizan preparaciones microscpicas conocidas por poseer glucgeno (hgado, msculo) o glucoprotenas (membranas basales, glucocliz, glndulas mucosas).
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Colorantes metacromticos
Se denomina metacromasia a la tincin de algunos componentes de los tejidos de un color distinto
que el del colorante utilizado, en tanto que cuando
se tien del mismo color recibe el nombre de ortocromasia. Ciertos colorantes bsicos (catinicos)
tienen propiedades metacromticas; al colorante
metacromtico se unen los grupos sulfatos, carboxilos y fosfatos, que estn presentes en muchos proteoglucanos, cidos nucleicos y algunos lpidos.
vidad de la fosfatasa cida (fig. 1-6). En una primera etapa, la preparacin microscpica se incuba en
un medio que contiene el sustrato de la enzima cuya actividad queremos demostrar (vase fig. 1-6,
glicerofosfato). En este caso, si la enzima fosfatasa
cida est contenida en las estructuras celulares en
estudio (lisosomas), acta sobre el sustrato presente en el medio de incubacin y lo hidroliza liberando las molculas de glicerol y de fosfato. Estos ltimos quedan localizados en el sitio de la enzima
donde se combina con iones plomo o calcio para
formar un producto insoluble (fosfato de plomo o
de calcio). ste es incoloro pero puede visualizarse
con el microscopio electrnico porque es denso a
los electrones. Para poder visualizar el producto de
la reaccin con el microscopio ptico es necesario
continuar la tcnica agregando sulfuro de amonio
al medio de incubacin, lo que produce un precipitado de color pardo (sulfuro de plomo) en el sitio
donde est localizada la enzima (vase fig. 1-6).
Se realiza un control negativo omitiendo el sustrato en el medio de incubacin o introduciendo un
inhibidor de la actividad enzimtica. El control positivo consiste en utilizar preparaciones que son conocidas por poseer actividad de fosfatasa cida. Por
ejemplo, lisosomas de macrfagos, de hgado, etc.
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Tcnicas inmunocitoqumicas
Los mtodos inmunocitoqumicos consisten en la
visualizacin de un componente celular (organoide,
macromolcula, etc.) mediante una reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). En este caso, el elemento en
estudio funciona como antgeno (Ag), mientras que
el anticuerpo (Ac) especfico se agrega a la preparacin donde se une con aqul. A su vez, el anticuerpo
debe estar unido a un marcador que permita su visualizacin mediante algn sistema ptico (fig. 1-7).
Sobre clulas y tejidos, los marcadores ms comunes
son colorantes fluorescentes, enzimas o partculas
electrondensas y su eleccin depende del tipo y procesamiento del material, de la finalidad del estudio y
de su observacin con microscopio ptico o con microscopio electrnico (vase fig. 1-7).
La unin entre antgeno y anticuerpo (unin eptope-paratope) se realiza mediante enlaces no covalentes relativamente dbiles. Esta caracterstica y la
gran especificidad del anticuerpo por su antgeno
hacen de este mecanismo una herramienta muy poderosa en biologa celular, ya que permite identificar y localizar molculas presentes en las clulas y
los tejidos usando los anticuerpos correspondientes
marcados adecuadamente. [Se recomienda estudiar
los conceptos inmunolgicos bsicos (vase cap. 8)
a fin de comprender mejor los fundamentos metodolgicos de estas tcnicas.]
pueden visualizar con microscopia ptica o electrnica (fig. 1-7 A). No es una tcnica muy utilizada, ya
que requiere que cada tipo de anticuerpo est unido
a un marcador en forma directa y permanente. Esta
tcnica fue reemplazada por las tcnicas indirectas,
que permiten utilizar el mismo anticuerpo secundario (marcado) para visualizar muchas clases de anticuerpos primarios, lo que tambin facilita el incremento de la marcacin (vase el siguiente apartado).
Tcnicas inmunocitoqumicas
indirectas
En este tipo de reaccin, el anticuerpo primario
no est marcado. En consecuencia, para poder
visualizar la reaccin, se utiliza un anticuerpo secundario, que es un anticuerpo antianticuerpo (antiinmunoglobulina), que est marcado y permite
visualizar el complejo Ag-Ac-Ac (vase fig. 1-7 B).
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Fig. 1-7. Esquema de los mtodos inmunocitoqumicos directos (A) e indirectos (B y C).
19
Fig. 1-8. Esquema de un mtodo inmunocitoqumico indirecto y marcacin con el complejo peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
tado del marcador localizado fuera del sitio normal del antgeno que debemos visualizar. Este tipo de problema dificulta la interpretacin de la
inmunomarcacin y puede estar provocado por
la falta de especificidad del Ac primario o secundario, o por la movilizacin del Ag por fijacin
deficiente, o por solubilizacin del Ag, o por
reaccin cruzada con otras molculas antignicas que comparten eptopes similares.
2) La submarcacin, que es la marcacin escasa o ausente del Ag en tejidos en los cuales se conoce su
presencia. La causa, en general, es la destruccin
del Ag por un tratamiento indebido, o por fijacin
inadecuada, o utilizacin de concentraciones bajas del Ac, o tiempos de incubacin o temperatura inadecuados. Para reconocer y solucionar estos
inconvenientes deben realizarse controles adecuados y variaciones de las tcnicas, que son particulares para cada caso en estudio y cuyo detalle
excede los alcances de este libro.
La eleccin entre diferentes mtodos inmunocitoqumicos depende de muchos factores, como el ti-
po de Ag en estudio (mayor o menor labilidad frente a fijadores histolgicos, ubicacin dentro de la estructura en estudio, etc.), del equipamiento que se
ha de utilizar (microscopia ptica, de fluorescencia,
electrnica, etc.), de la disponibilidad de reactivos,
etc. Asimismo, el mtodo seleccionado ser directamente dependiente del trabajo o investigacin que
se desea realizar, por ejemplo, la determinacin de
la proliferacin celular (fig. 1-9). En el cuadro 1-3 se
sealan las ventajas y los inconvenientes de algunos mtodos de inmunomarcacin.
Por otra parte, existen mtodos de fluorescencia
que no utilizan anticuerpos marcados con fluorocromos, sino molculas que adquieren fluorescencia bajo alguna condicin biolgica, qumica o fsica. Por
ejemplo, un mtodo para evaluar la viabilidad celular se basa en la determinacin simultnea de clulas
vivas y muertas mediante marcadores que reconocen
dos parmetros de viabilidad celular: 1) la actividad
de esterasa intracelular con el reactivo calcena AM y
2) la integridad de la membrana celular con el reactivo etidio H-1. La calcena AM, que no es fluorescen-
20
Fig. 1-9. Cultivo celular con un mtodo inmunocitoqumico para evaluar la proliferacin celular. Se incuba el
cultivo con bromodesoxiuridina (BrdU), un anlogo de la
uridina que se incorpora al DNA durante la divisin celular y luego se demuestra su incorporacin mediante un
anticuerpo primario anti-BrdU y un anticuerpo secundario marcado con un fluorocromo (fluorescena = verde).
Se determina la proporcin de clulas en proliferacin
mediante la expresin clulas marcadas/total de clulas. Se observan figuras de mitosis (flechas).
te, penetra en clulas vivas y es convertida, por la actividad de la esterasa mitocondrial, en el colorante
polianinico calcena, que es retenido por las clulas
vivas y fluoresce intensamente en color verde (vase
fig. 1-10). Por su parte, el etidio H-1 no penetra la
membrana plasmtica de clulas vivas, pero penetra
la membrana daada de las clulas muertas y aumenta 40 veces su fluorescencia al unirse con los cidos nucleicos, con una seal fluorescente de color rojo (fig. 1-10).
Microscopias
Microscopio ptico
El microscopio ptico (MO) (microscopio de luz
visible, microscopio fotnico o microscopio de
campo claro) est compuesto por un estativo o par-
Inmunoperoxidasa
Inmunorradiografa
Sensibilidad buena
Sensibilidad buena
Excelente conservacin de la
morfologa
Excelente conservacin de la
morfologa
Conservacin indefinida de la
marcacin
Conservacin indefinida de la
marcacin
21
te mecnica (fig. 1-11, lado izquierdo) y por un sistema ptico (fig. 1-11, lado derecho).
A travs del sistema ptico se refractan los rayos
luminosos provenientes del objeto en estudio para
proporcionar una imagen final de mayor tamao, invertida y virtual (fig. 1-12). Para lograr este resultado, el objeto en estudio debe ser transparente y poseer contraste para poder discriminar sus distintos
componentes. Como mencionamos en el apartado
Tcnica citohistolgica, la transparencia se logra en
parte con cortes muy delgados del material en estudio (figs. 1-3 a 1-5) o mediante el estudio de extendidos celulares o bien con cultivos de clulas aisladas (figs. 1-9, 1-10 y 1-15). El contraste adecuado se
alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o mediante sistemas pticos particulares (fig. 115) (p. ej., microscopio de contraste de fase o microscopio de interferencia).
Los siguientes conceptos referidos a un sistema
ptico son muy importantes para conocer el funcionamiento y el uso correcto del microscopio.
Poder de resolucin
El poder de resolucin (PR) es la capacidad pa-
ra distinguir los ms finos detalles de las estructuras en estudio; o sea, dar imgenes distintas (separadas) de dos puntos situados muy cerca entre s
en el objeto de estudio. Esta caracterstica depende de la longitud de onda de la radiacin utilizada () y de la abertura numrica (AN) de la lente.
Esta ltima depende a su vez del ndice de refraccin del medio que atraviesa la radiacin () y del
seno del semingulo de abertura de la lente ()
(cuadro 1-4).
AN = sen
Se denomina ngulo de abertura al limitado por
los rayos ms perifricos del cono de luz que penetra en una lente.
El PR es directamente proporcional a la AN. As,
un objetivo con mayor AN tendr mayor PR que un
objetivo con menor AN.
El PR es inversamente proporcional a la longitud de onda (). Si utilizamos una fuente de
radiacin con una longitud corta (p. ej., luz ultravioleta o electrones), el PR ser mayor (vase fundamentos del microscopio electrnico, ms adelante).
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Lmite de resolucin
Esta propiedad deriva del concepto anterior. El lmite de resolucin (LR) es la distancia mnima que
separa dos puntos para poder ser discriminados como tales (o el objeto ms pequeo que puede ser visualizado). Es la inversa del poder de resolucin y
depende principalmente de la longitud de onda ()
utilizada.
LR =
0,61
AN
El LR para:
el ojo humano = 0,1 mm
el microscopio ptico = 0,2 m
el microscopio electrnico = 2 a 10 .
En general, un tipo de luz no puede emplearse
para resolver estructuras ms pequeas que su
propia longitud de onda. As, el LR del MO est
dado por la longitud de onda de la luz visible, que
va desde 400 nm (violeta) hasta 700 nm (rojo). En
trminos prcticos, una bacteria y una mitocondria son los objetos ms pequeos que pueden ser
visualizados claramente en este tipo de microscopio (fig. 1-13).
Poder de penetracin
Es el que permite observar diferentes planos de la
preparacin en una misma posicin del enfoque. Es
inversamente proporcional a la AN y a la magnificacin de la lente.
Poder de definicin
Es la capacidad de dar imgenes claras de contornos ntidos.
Distancia focal
Es la distancia entre el centro ptico de una lente
y el foco donde se renen todos los rayos luminosos
que la atraviesan.
Distancia frontal
Es la distancia entre la preparacin microscpica y
la lente inferior del objetivo. Nota: Debe recordarse
que en los objetivos de inmersin, esta distancia es
de apenas 0,1 mm. precaucin, al hacer en enfoque
a mayor aumento! (vase fig. 1-12).
Objetivos secos
Son objetivos que se utilizan con interposicin de
aire entre la preparacin y el objetivo (3, 10, 20,
40). Precaucin! No usar aceite de inmersin!
Objetivos de inmersin
Son objetivos que se utilizan interponiendo una
delgada capa de aceite entre la preparacin y el objetivo (40, 60, 100). Tienen el propsito de lograr
un mayor aprovechamiento de los rayos luminosos
perifricos. Nota: Debe recordarse que en los objetivos de inmersin, esta distancia es de apenas 0,1
mm. Precaucin al hacer en enfoque a mayor aumento! (vase fig. 1-12).
Magnificacin o aumentos
Se calcula multiplicando los aumentos correspondientes a los sistemas pticos empleados (ocular
objetivo). Es directamente proporcional a la AN,
aunque no es necesariamente proporcional al PR
(cuadro 1-5).
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= 0,1
= 1,6
700 nm
= 700 nm
= 610 nm
= 565 nm
= 550 nm
= 515 nm
= 463 nm
= 428 nm
= 400 nm
400 nm
= 1 nm
= 0,005 nm
celulares que, aun siendo transparentes a la luz, poseen distintas densidades relativas; es decir, diferente concentracin de materia por unidad de volumen. As, los materiales que tienen distintos ndices
de refraccin permiten diferentes velocidades de las
ondas de luz que los atraviesan (vase fig. 1-14 A, B,
D-G). Cuanto mayor es la densidad de una estructura, mayor es su ndice de refraccin y menor la
velocidad de la luz que la atraviesa; es decir, las ondas de luz se retardan y cambian de fase. Con el
MO comn no es posible discriminar pequeas diferencias en los ndices de refraccin o absorcin en
las estructuras celulares no coloreadas. En cambio,
los MO de contraste de fase y de interferencia estn
diseados para utilizar las caractersticas pticas
mencionadas y traducirlas en imgenes con grados
visibles y diferenciales de contraste y brillo (fig. 115).
Fig. 1-13. Escala y tamao de objetos que pueden visualizarse con diferentes pticas.
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El microscopio de contraste por interferencia diferencial (DIC) posee un polarizador que filtra la luz
que vibra en un solo plano y un juego de prismas especiales. Uno de ellos, ubicado cerca del condensador
o sobre l, desdobla el rayo incidente en dos componentes (dos ondas) que atraviesan la muestra. Los dos
rayos luego son combinados nuevamente por un segundo prisma que los hace interferir para formar una
imagen de aspecto tridimensional. Este microscopio
fue diseado para observar relieves en superficie de
especmenes voluminosos, o difciles de manejar o
muy gruesos como para ser observados con el microscopio de contraste de fase. Con el microscopio de
interferencia tambin se pueden cuantificar los cambios de ndices de refraccin. Como la densidad ptica y el retardo de fase del haz luminoso son proporcionales a la masa de la muestra, es posible obtener
datos cuantitativos de componentes celulares mediante la comparacin de un haz luminoso de referencia con las ondas de fase retardadas. Adems, es
posible traducir los cambios de fase como cambios de
color y as se obtienen imgenes de clulas vivas y
coloreadas por medios pticos.
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Micrmetro (m)
Valor de la unidad
10-3 m
10-6 m
Mtodo de estudio
Estructura visualizada
Ojo
rganos. Tejidos
Lupa
Clulas grandes
Microscopias pticas
Tejidos. Clulas
Organoides grandes
Nanmetro (nm)
10-9 m
Microscopia electrnica
Componentes subcelulares
Microscopia de polarizacin
Virus
Macromolculas
Angstrm ()
10-10 m
Microscopia electrnica
Estructura molecular
Difraccin de rayos X
Estructura atmica
Microscopio de polarizacin
Tambin es un microscopio ptico de luz visible,
pero se basa en el uso de luz polarizada y permite
obtener informacin acerca del ordenamiento de las
molculas del objeto estudiado. Los materiales que
poseen el mismo ndice de refraccin en todas las
direcciones se denominan isotrpicos porque no
poseen una disposicin regular u ordenada de sus
constituyentes y la luz polarizada los atraviesa a la
misma velocidad cualquiera que sea la direccin
del plano de incidencia. Por el contrario, un mate-
Fig. 1-15. Cultivo primario de clulas neurales con microscopia de contraste de fase. Se observan clulas de diferentes
formas y tamaos que reflejan la distinta adhesividad al sustrato; algunas presentan filopodios o proyecciones perifricas que indican motilidad celular (flechas) y otras estn en proceso de divisin (cabezas de flecha).
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lo esqueltico, el huso mittico, las estructuras cristalinas, etc.) se observan ms brillantes o ms oscuras
(birrefringencia) que aquellas cuyos componentes se
disponen al azar y ms desordenados.
Microscopio de fluorescencia
condensador que se encarga de uniformar en un solo plano del espacio las vibraciones de la onda de luz
que luego atraviesa la preparacin en estudio. Tambin tiene un cristal analizador, montado sobre el
objetivo, que al ser rotado alrededor del eje ptico
permite estudiar la orientacin de los rayos luminosos provenientes de la fuente y la muestra. En una
muestra observada con este microscopio, las zonas
cuya disposicin macromolecular es regular y muy
ordenada (p. ej., las bandas transversales del mscu-
27
28
Fig. 1-19. Esquemas comparativos de microscopios ptico (A), electrnico de transmisin (B) y electrnico de barrido (C).
Microscopio electrnico
de transmisin
El microscopio electrnico de transmisin (MET)
posee los componentes bsicos equivalentes al microscopio ptico (fig. 1-19 A, B), pero en lugar de una
fuente de luz utiliza un tubo de radiacin de electrones y en vez de lentes de cristal posee lentes o bobinas electromagnticas. Los electrones, que en el vaco se desplazan en lnea recta, son desviados por las
bobinas de una manera similar a la refraccin que
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Fig. 1-20 A. Clulas epiteliales de rin (dominio basolateral) y fibroblasto de la estroma con microscopia electrnica
de transmisin. Ntense los ncleos con cromatina laxa (CL), cromatina condensada (CC) y la membrana basal (flecha). B. Membrana basal de tubos colectores, asas de Henle y capilares (flechas) se marcan con la tcnica de PAS por
su contenido en glucoprotenas.
producen las lentes pticas sobre los rayos luminosos. Luego de emitirse desde un tubo de rayos catdicos a un voltaje de 50.000 a 100.000 voltios, los electrones se concentran por accin de una bobina condensadora sobre la muestra en estudio (vase fig. 119 B), donde chocan y cambian de direccin segn la
electrodensidad de las partculas que componen la
muestra. Cuanto mayor es el nmero atmico de los
componentes de la muestra, mayor ser la dispersin de los electrones. Como la mayor parte de los
tomos que forman las estructuras biolgicas poseen
un nmero atmico bajo, se deben utilizar tomos
pesados (Os, Pb, Au, U, etc.), como colorantes electrondensos que desvan mucho los electrones y proporcionan densidad a las diferentes estructuras celulares. Luego de atravesar la muestra, los electrones
son concentrados por una bobina colectora y proyectados sobre una pantalla fluorescente o pelcula
fotogrfica, donde se forma la imagen y se efecta el
estudio (vase fig. 1-19 B). Las zonas o estructuras
que por su densidad dispersan ms a los electrones
se observan como reas oscuras en la pantalla o pelcula fotogrfica (fig. 1-20 A). Al contrario de lo que
ocurre en la microscopia ptica, los haces de electrones no son visibles directamente por el ojo, por lo
que se debe efectuar el estudio directamente sobre la
pantalla fluorescente, sobre la fotografa o sobre un
monitor.
En un trabajo de rutina de MET en biologa celular, como ejemplo indicativo, se trabaja normalmente hasta unos 30.000 a 50.000 aumentos directos sobre la pantalla. En trabajos a alta resolucin (estudio de las partculas que componen organoides, estructura de membrana, etc,) se suele trabajar con
hasta 100.000 a 200.000 aumentos directos y se puede llegar al milln de aumentos. Adems, por ampliacin fotogrfica la imagen se puede incrementar
5 veces o ms y llegar a aumentos reales del orden
de los 10 millones o ms. En este orden de aumentos se debe trabajar con una tcnica muy depurada
en la preparacin del material y contar con suficiente experiencia en la interpretacin de los datos estructurales, ya que en muchos casos resulta difcil
discriminar entre estructuras reales o artefactos de
la tcnica.
Es importante considerar que la posibilidad de lograr aumentos importantes en MET depende de la
corta longitud de onda de los electrones (vanse los
apartados Poder de resolucin y Lmite de resolucin). Como ya mencionamos, dos objetos se ven
separados cuando la distancia entre ellos es mayor
que la mitad de la longitud de onda empleada para
su estudio. Por ejemplo, la longitud de onda de la
luz blanca (de unos 550 nm), establece un lmite de
resolucin para el MO de unos 0,2 m. Como la longitud de onda de los electrones es muy pequea
(0,005 nm), el lmite de resolucin del MET se sita
entre los 2 y los 10 , lo cual es tericamente suficiente para visualizar la mayor parte de las macromolculas biolgicas cuyas dimensiones estn en el
orden de los 10 a los 100 .
Microscopio electrnico
de transmisin de alto voltaje
Es un MET que utiliza emisiones de electrones
acelerados a varios millones de voltios, lo que permi-
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BIBLIOGRAFA
Fig. 1-21. Cultivo primario de clulas neurales con microscopia electrnica de barrido. Comprese con la preparacin equivalente de la figura 1-15; se observan clulas de diferentes formas y tamaos; algunas con proyecciones perifricas que indican motilidad celular (flechas)
y otras en proceso de divisin (A, B, C).
te penetrar cortes muy gruesos y estudiar la estructura tridimensional de los componentes subcelulares dado que posee un enorme poder de resolucin
y penetracin. Con este instrumento se pueden hacer estudios sobre clulas enteras cultivadas, lo que
permite discriminar mejor las relaciones e interacciones entre los diferentes organoides que en materiales seccionados.
Microscopio electrnico
de barrido
El microscopio electrnico de barrido (MEB) permite observar la superficie de especmenes gruesos y de
organismos enteros que no se podran estudiar con el
MET. Para ello, el haz electrnico no atraviesa la
muestra, sino que realiza un barrido por toda la superficie del material en estudio (vase fig. 1-19 C). Este impacto de los electrones primarios sobre el espcimen produce la emisin de electrones secundarios
y, con dependencia de la geometra de la superficie
del espcimen, son captados por un detector, integrados y proyectados en la pantalla de un monitor (vase fig. 1-19 C). Es decir, construye una imagen basada sobre el grado y la direccin de la dispersin de
electrones secundarios, que vara de acuerdo con las
diferentes caractersticas geomtricas y la opacidad
electrnica de la muestra. El resultado final es una
imagen tridimensional con elevado poder de resolucin (fig. 1-21). Adems, con adaptaciones del mismo
equipo denominados detectores de sondas electrnicas es posible realizar el anlisis de la emisin se-
LECTURAS
ADICIONALES
PGINAS WEB
PGINAS WEB
http://www.protocol-online.org/
http://www.monografias.com/trabajos11/intecnic/intecnic.shtml
http://www.vet.unicen.edu.ar/catedras/cHistologia/Tecnicashistologicas.PDF
http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modtecni
http://es.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_histol%C3%B3gica
http://es.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_histol%C3%B3gica
31
http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm
http://www.conocimientosweb.net/dcmt/ficha509.html
http://www.unich.it/offerta/perfez2005/locandina_microscopia.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscop%C3%ADa
http://www.monografias.com/trabajos7/micro/micro.shtml
AUTOEVALUACIN
Seale la nica opcin de respuesta correcta
1. La teora celular sostiene que:
a) Las clulas son las unidades morfolgicas y fisiolgicas de todos los organismos vivientes.
b) Las clulas se originan slo de otras clulas y su
continuidad depende de su material gentico.
c) Las propiedades de un organismo depende de las
de sus clulas individuales.
d) Todo lo anterior es correcto.
2. Seale una de las opciones que caracterizan
slo a los seres vivos:
a) cidos nucleicos.
b) Compuestos de nitrgeno.
c) Compuestos de carbono.
d) Agua.
3. Es caracterstico de las clulas eucariontes:
a) Tener ncleos organizados.
b) Tener DNA circular.
c) No tener nuclolos.
d) Nada de lo anterior.
4. Los componentes basfilos de la clula son:
a) DNA y RNA.
b) RNA y mitocondrias.
c) REL.
d) Nuclolo y aparato de Golgi.
5. Seale cul de las siguientes alternativas se
debe usar para observar el DNA de clulas de
ratn:
a) Tcnica de PAS.
b) Tcnica inmunocitoqumica directa con anticuerpo
de ratn anti-RNA de conejo.
c) Tcnica de Feulgen.
d) Tcnica inmunocitoqumica con anticuerpo de cabra
antitubulina de ratn.
6. El grosor habitual de un corte para MET es:
a) Mayor que el de la membrana plasmtica y menor
que el dimetro de una clula vegetal.
b) Menor que el grosor de un corte para MO y mayor
que el dimetro de una mitocondria.
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7.
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