Las protenas son macromolculas de gran inters biolgico las cuales tienen diversas funciones en un organismo vivo.

Sus
caractersticas especificas han permitido su separacin de una gran masa de contenido biolgico. Esto se puede llevar a cabo
gracias a las tcnicas de separacin que se basan en caractersticas fsicas y/o fisicoqumicas de las protenas para obtener la(s)
de inters. Se determinaron los puntos isoelctricos de tres protenas: pepsina porcina, casena y albumina de huevo mediante estndares de diferente concentracin de acetato (0.1 M) y acido actico (0.1M y 0.01M). Se separaron las protenas
ovoalbmina y globulina del huevo mediante el mtodo de precipitacin salina o salado con una solucin de amonio; se centrifugo y se procedi a la identificacin de cada una. Tambin se llevo a cabo la elaboracin de queso (coagulacin de casena).
Los resultados obtenidos arrojaron que la protena pepsina porcina tiene un punto isoelctrico a un pH 4.1, la casena a pH
4.16 4.50 y la albumina de huevo de
. En la separacin de ovoalbmina y globulina por precipitacin salina la albumina se
identifico en el sobrenante con reactivo sulfato cprico y la globulina ( precipitado) se solubilizo con cloruro de sodio, se
transfiri a una membrana de dilisis y se identifico con reactivo de Biuret. En la la elaboracin de queso se caracterizo la
reaccin que existe entre la casena y las enzimas del cuajo para su gelificacin. Se determino que el punto isoelctrico es
caracterstico de cada protena y nos ayuda a separarla de soluciones u otras proteinas. El mtodo de salado es una forma sencilla de separacion pero requiere de una membrana de dilisis para purificacin de protena asi mismo la elaboracin de queso
es una coagulacion de la protena caseina con ayuda de enzimas del cuajo.

I-Introduccin.

Las protenas cuyo nombre significa el primero o

en primer lugar son macromolculas de gran
importancia en la clula; son los instrumentos moleculares mediante los que se expresan la informacin gentica; existen una gran cantidad de protenas las cuales estn especializadas en funciones
especificas a nivel celular[1]. A principios del siglo
XIX el qumico holands Gerardus Johannes Mulder investigaba las propiedades de las albuminas,
sustancias que se encuentran en la leche y los huevos y que coagulan por calentamiento ; despus
Mulder encontr que la albumina estaba compuesta de carbono oxigeno, nitrgeno e hidrogeno y
en 1938 , el cientfico sueco Jons Jacob Berzelius
denomino a estas sustancias como protenas y determino que tenan un gran papel biolgico[2]
En la actualidad sabemos que el estudio de las
protenas es de gran importancia en diversas
reas de trabajo y que sus caractersticas especificas han permitido su separacin de una gran masa de contenido biolgico. Esto se puede llevar a
cabo gracias a las tcnicas de separacin de protenas que se basan en caractersticas fsicas y/o fisicoqumicas de las protenas para obtener la(s) de
inters[2]. Se puede decir que la separacin o purificacin de una protena es un arte como una
ciencia y hay varias opciones para cada paso. Saber
algo de la protena diana (o las que de las cuales se
desea separar) simplifica la eleccin del procedimiento de separacin. Uno de las mtodos mas
antiguas de separacin de protenas es el salado o
precipitacin salina , la cual se basa en la baja solubilidad de las protenas en soluciones salinas concentradas ; la sal que mas se ha utilizado es el sulfato de amonio (NH4)2SO4 la accin de la sal es liberar el agua unida a la protena por puentes de hidrogeno, lo cual provoca su precipitacin[3]. Una
tcnica de separacin de proteinas es el enfoque
isoelctrico que se basa en un gradiente de pH en

en el estabilizante, separando por los diferentes

puntos isoelctricos (PI) de las protenas . El PI de
una protenas es cuando se encuentra con carga
neta igual a cero. Una forma simple de conocer el
punto isoelctrico de una protena, est en la determinacin del pH donde se presenta la solubilidad mnima de la protena [2]. En la actualidad
existen varias tcnicas sostificadas para la purificacin de protenas , por ejemplo electroforesis, cromatografas , centrifugacin, SDS-PAGE, entre
otras [4]. El objetivo de esta prctica es identificar
el punto isoelctrico de pepsina porcina, casena y
albumina de huevo .Separar la clara del huevo en
sus fracciones de globulina y albumina por el mtodo de precipitacin salina o salado ; as mismo
realizar una dilisis e identificar las protenas mediante una tcnica colorimtrica. Tambin elaborar
queso entendiendo el proceso a nivel biolgico.
II Metodologa.
Preparacin de las muestras para determinacin
del punto isoelctrico (PI).
Se prepar cada solucin de protena (pepsina porcina, casena y albumina de huevo). Principalmente
se coloc 0.25 gramos de la protena en un vaso
de precipitado de 50 mL. Se agreg 20 mL de agua
destilada y 5 mL de NaOH 1N, y se agit hasta lograr una solucin homognea. Una vez disuelta la
protena, se verti en un matraz aforado de 50 ml,
se adicion 5 mL de acido actico 1N y se afor con
agua destilada.
Determinacin del punto isoelctrico.
Se aadi 1 mL de la solucin de protena (pepsina
porcina, casena o albumina de huevo) a cada tubo
de estndares (Tabla 2). Se observ en tres tiempos: 10, 30 y 50 minutos y se registraron resultados.
Precipitacin salina o salado.
Principalmente se separ la clara y la yema de dos

blanquillos. Las claras se filtraron a travs de una

manta de cielo y enseguida se coloc 25 mL de
clara de huevo en un tubo de centrifuga y se adicion 25 mL de solucin saturada de sulfato de
amonio (NH4)2SO4 ; se mezcl suavemente. Enseguida las tres muestras de la sesin fueron pesadas
para equilibrar su peso (69 g) y poder centrifugar
en la centrifuga C-600 a 3000 rpm durante 15 minutos. Despus se llev una decantacin del lquido sobrenadante y se guard tanto el precipitado
como la fraccin sobrenadante. Enseguida se procedi a la identificacin de las protenas.
Identificacin de Albumina.
Se adicion 2 mL de solucin de NaOH al 20% a 2
mL de la fraccin sobrenadante, se mezcl y aadi de gota a gota la solucin de sulfato cprico al
0.5%. Se agit constantemente hasta la formacin
de una coloracin purpura.
Identificacin de globulina.
Se prob la solubilidad del precipitado en NaCl
0.15 M y dicha solucin se transfiri a una bolsa de
dilisis (membrana marca Sigma de 10 KD) y se dej en 500 mL de agua durante 3 das. Despus se le
adicionaron unas gotas de reactivo de Biuret en el
interior de la membrana para identificar la protena; dando como positivo una coloracin morada.
Elaboracin de Queso.
Se calentaron 2 litros de leche de vaca en una estufa hasta alcanzar una temperatura de 75 C, despus de llegar a esa temperatura se enfri a 40C y
se le adicionaron 70 gotas de renina (cuajo). Se dej reposar por 15 minutos y al formarse el cuajo se
mezcl para separar el suero del queso y se filtr
con manta de cielo.
III. RESULTADOS Y DISCUSIN:
Punto isoelctrico de la pepsina porcina:
La pepsina es una enzima digestiva que se segrega

Tabla 1. Disoluciones para la determinacin del punto

isoelctrico (PI) en las diferentes muestras de protenas.
Tubo
Acetato 0.1 N
Actico 0.1
Actico 0.01 N
(ml)
N (ml)
(ml)
1
0.50
9.5
_
2

1.00

9.00

1.50

8.50

2.00

8.00

3.00

7.00

4.00

6.00

6.00

4.00

8.00

2.00

6.00

4.00

10

8.00

2.00

en el estomago, se produce en las glndulas gstricas como una proenzima; es una enzima que trabaja a pH acido[4]. Si empezamos a alejarla de su
pH optimo , va a empezar a tener una carga neta
igual a cero. En este experimento utilizamos acetato sdico y acido actico para simular los cambios
de pH (tabla 2).
Tabla 2. Resultados de precipitacin de pepsina porcina.
Tubo
1

Observacin a los
10 minutos.
1

Observacin a los
30 minutos.
1

Observacin a los
50 minutos.
1

PH

3.71

4.03

4.10

4.25

4.45

4.62

5.0

5.36

5.87

10

6.26

0 = No se observ cambios.
1-2= opalencia.
3-4=precipitacin.

En la experimentacin se observ mayor precipitado en el tubo 3 (punto isoelctrico experimental),

Consultando diversas fuentes se encontr que la pepsina tiene un punto isoelctrico dc cercano a un pH
1 ; sin embargo no se encontr referencias que especificaran si la pepsina era porcina, por lo que se determina que los componentes fueron los suficientes
para neutralizar el medio y llegar al punto isoelctrico; as mismo se observo que los primeros tres tubos
tuvieron cambios (figura1) y sus valores de pH son
los mas cercanos a 1.

Tabla 3. Resultados de precipitacin de seroalbmina

Tubo

Observacin
a los 10
minutos.
3

Observacin
a los 30 minutos.
3

Observacin
a los 50
minutos.
3

PH

2.98

3.04

3.18

3.25

3.49

4.04

4.61

5.29

5.89

10

6.36

0 = No se observ cambios.
1-2= opalencia.
3-4=precipitacin.

Figura 1. Resultados de la determinacin del punto isoelctrico de pepsina porcina ( se observa que tubos 2 y 3 presentaron la mayor precipitacin .

Punto isoelctrico de la albumina srica :

La albumina es una protena que se encuentra en
mayores cantidades en la sangre de una persona, pero es este caso es la que sale del hgado de res de la
vaca y que se utilizo en este experimento para determinar su punto isoelctrico (tabla 3). Donde se obtuvo una mayor precipitacin en los tubos 3, 4 , 5 , 6 y
7 con un PH de 3.18 3.25, 3.49 4.04 y 4.61 respectivamente (figura 2) ;por lo que se determina que su
punto isoelctrico esta entre un pH de 3 a 5 ; consultando referencia se comprob que el punto isoelctrico de la seroalbmina es de 4.9 , por lo que se determina que se obtuvieron resultados precisos durante la experimentacin [5].
Punto isoelctrico de la casena:
Para determinar el punto isoelctrico de la casena se
presentaron dificultades a la hora de preparar la mu-

Figura 2. Tubos del 1 al 10 (izquierda a derecha) ; donde

se puede observar que hubo precipitacin de seroalbumi-

estra debido a su baja solubilidad. Dicha protena

no contiene enlaces disulfuro evitando as la formacin de una estructura terciaria. La carencia de
estructura terciaria facilita la localizacin de residuos hidrfobos al exterior, lo que facilita la unin
entre unidades proteicas y la convierte prcticamente insoluble en agua. Sin embargo es prcticamente soluble en soluciones salinas tales como
oxalacetato sdico y acetato sdico[6]. Por esa razn se utiliz en la experimentacin acetato sdico
para solubilizar a la casena. De acuerdo a las referencias consultadas esta protena tiene su punto

isoelctrico a pH 4.6 [6]. En la prctica se observ

que la protena precipito en los rangos de pH 3.67 a
5.18 (tabla 3 y figura 3); por lo tanto se determina
que las concentraciones de acetato y acido actico
aadido a cada tubo fueron los adecuados para hacer que la protena precipitara . En el tubo 6 se presento mas formacin de micelas ; siendo el pH medido de 4.5 ; el cual es muy preciso con el pH terico.
Tabla 4. Resultados de precipitacin de casena.
Tubo

Observacin a los
10 minutos.
1.5

Observacin a los
30 minutos.
3

Observacin a los
50 minutos.
3

3.67

4.5

3.79

2.5

4.04

4.5

4.14

4.36

3.5

4.5

4.5

4.50

3.5

4.87

5.18

5.78

10

6.21

0 = no se observ cambios.
1-2= opalencia.
3-4=precipitacin.
5= abundante precipitacin.

La ovoalbmina es la protena ms abundante de

la clara y representa mas de la mitad del contenido
proteico. Se desnaturaliza fcilmente por agitacin
o batido y forma espuma. Es una fosfoglucoproteina con un 3.2 % de hidratos de carbono, integrada
por tres fracciones A1, A2, A3, en una proporcin
de 85:12:3, respectivamente, que se diferencian
por su contenido en fosforo La ovoalbmina es rica
en cistena y metionina y presenta cuatro grupos
SH y dos uniones disulfuro[7].

PH

Figura 3. Tubos ordenados de 1 al 10 de izquierda a derecha. Se observ que en los tubos 4, 5, y 6 hubo mayor formacin de micelas y los tubos 9 y 10 no hubo precipitacin.

Solubilidad e insolubilidad de las protenas ovoalbmina y globulina con sulfato de amonio.

La albmina presente en la clara de huevo puede

ser separada de la globulinas; ya que la albumina
precipita nicamente si la solucin en la que se encuentra es saturada con sulfato de amonio, mientras que las globulinas precipitan cuando la solucin se encuentra en un 50% (m/v) de concentracin en sulfato de amonio [7] .Por lo que se determina que la solubilidad de las protenas est influenciado por la sal de sulfato de amonio . En el
caso de la ovoalbmina la solucin de sulfato de
amonio favoreci su solubilidad esto se debe a
que la sal disminuyo el coeficiente de actividad de
la protena por ende aumento su solubilidad porque hay una fuerza de atraccin entre los iones de
la protena y los iones de la sal a concentraciones
de sal baja el aumento en el logaritmo de la solubilidad de la protena es proporcional a la fuerza inica del disolvente. En cambio para la globulina las
interacciones en presencia de dicha sal se hacen
mayor por molculas protena-protena que las
interacciones protena agua, por lo que baja la movilidad de las cargas proteicas y la protena precipita (Figura 4) [ ]. Para la identificacin de la ovoalbmina (sobrenadante) se utiliz sulfato cprico y
la protenas en medio bsico (NaOH al 20%); donde el cobre forma un complejo coordinado con los
tomos libres del nitrgeno de los grupos aminos;
dicha formacin del complejo da una coloracin
morada, la cual indica la presencia de proteina
(figura 5) [ ].

Figura 4. Separacin de las protenas ovoalbmina

y globulina de la clara de huevo. Ovoalbmina se
encuentra en el sobrenadante y globulina en el
precipitado.

Reaccin de Biuret para determinar la presencia de

la ovoalbmina
La reaccin de Biuret determina protenas o pptidos
basado en la reaccin del sulfato de cobre con dos o
ms enlaces peptdicos en un medio alcalino, formando un complejo violeta. [x1]
Al reaccionar la globulina (precipitado) con Cloruro
de Sodio 0.15 M, se modific la fuerza inica del medio por lo cual la solubilidad de las protenas se elev. [x2]. Las protenas solubilizadas se transfirieron
en una bolsa de dilisis. La dilisis separa a las molculas segn el tamao del poro de una membrana
semipermeable, por el cual pasan las molculas pequeas como solventes o sales, pero las macromolculas al tener un mayor tamao no pueden pasar por
el poro, quedando dentro de la membrana [3]. Como
se observa en la Figura 6, en el medio acuosos donde
se encontraba la membrana semipermeable, al agregar el reactivo de Biuret no se observ ninguna coloracin purpura, por lo cual se concluye que por los
poros de la membrana solo pudo atravesarlo el solvente. En la Figura 7, al agregar el reactivo de Biuret
en el interior de la membrana semipermeable se observ la coloracin purpura la cual indico la presencia de las protenas (macromolculas) las cuales por
su tamao no lograron atravesar la membrana.

Figura 6. Al agregar el reactivo de Biuret con el solvente no se observ ninguna coloracin.

Figura 7. Al agregar el reactivo de Biuret a la

membrana de dilisis se forma la coloracin morada debido a la presencia de la protena globulina.

Elaboracin de queso

La coagulacin de la leche consiste en la desnaturalizacin de las protenas de la leche. Se puede realizar

de dos formas agregando cidos (producindolos por
va microbiana) o enzimas. La realizada en esta prctica fue por medio del cuajo o renina.
El cuajo, o renina, es un complejo natural de enzimas
presente en el jugo gstrico de los mamferos rumiantes para digerir la leche materna. Su funcin
biolgica en los mamferos es la de cuajar la leche,
de forma que se relentece su paso por el estmago
permitiendo as su absorcin. El cuajo contiene bsicamente dos enzimas: una mayoritaria, la quimosina
y otra minoritaria, la pepsina. La potencia de un cuajo se suele referir a la cantidad de quimosina que
contiene[ ]
Antes de adicionarle el cuajo es conveniente ajustar
a la temperatura entre 30 y 40 C que es el intervalo
ptimo para la actividad de estas enzimas[ ]. Se deja
en reposo aproximadamente unos veinte minutos y
para ayudar al proceso se le agrega cloruro de calcio
entre una concentracin 0.1 0.2 g/ litro de leche ya
que al aumentar el calcio disponible se favorece la
precipitacin de las protenas por la accin enzimtica, este paso se omiti en la prctica por lo que la
consistencia del queso que result fue blanda.

Figura 8. Estructura de micelas de la casena.

La leche est compuesta por carbohidratos (lactosa),

lpidos (triacilglicridos) y protenas (casena). Estas
ltima es la responsable de la coagulacin de la leche. La casena (alfa, beta y kappa) se encuentra en
la leche formando submicelas, unidas entre s a travs de fosfato clcico, constituyendo as micelas de
casena como se observa en la Figura 8 [ ].

Figura 9. Formacin de queso. Se observa la accin

enzimtica sobre la leche.

La accin de la quimosina que es una enzima proteasa asprtica acta directamente en el enlace de fosfato clcico. Al alterar dicha molcula se inicia la formacin de un gel que atrapa la mayora de los componentes slidos de la leche; este gel se contrae poco a poco y al contraerse va expulsando suero como
se observa en la Figura 9 [ ]. El suero dependiendo
de las caractersticas de la leche y la elaboracin del
queso contiene 4.9% de lactosa, 0.9 % protena cruda, 0.6% de cenizas 0.3% de grasas, y 93.2% de agua.
La protena verdadera est compuesta por lactoglobulina y la -lactoglobulina, adems el suero
contiene las vitaminas hidrosolubles de la leche [ ].
La coagulacin de la leche por la quimosina (figura
10 )o renina al hidroliza el enlace entre la 105-Phe y
la 106-Met de la kappa -casena. Durante la accin
enzimtica primaria, la parte hidrofbica de kappacasena (caseinomacropptido) que sobresale de la
superficie de la micela de casena, es hidrolizado.
Entonces la fuerza de repulsin entre micelas de casena decrece y sobresalen las interacciones hidrofbicas .

La hidrofobicidad de las micelas (kappa-casena, es

un componente hidrofbico de la casena) resultante permite la agregacin de ms micelas y finalmente
existe una red de gel tridimensional formada por cadena de micelas [ ]
Una vez que la leche se ha coagulado se debe cortar
el cogulo, en este caso se hizo con una cuchara haciendo cuadrantes en la misma olla en que se contena la leche coagulada. El proceso de prensado y modelado se realiz con la manta de cielo que ayud a
quitar el exceso de suero como se observa en la Figura 9. Cuando se le agrega sal al gusto puede ser para
dos razones proporcionar sabor al producto y si se
agrega demasiada sal se har un proceso de salado
que ayuda a que no crezcan microorganismos, ayuda
al desuerado y a contribuir a la formacin del queso
[ ].

permiti la separacin de estas del medio donde se

encontraban solubilizadas; as mismo los puntos isoelctricos obtenidos concuerdan con los puntos isoelctricos de las referencias consultadas. El mtodo
de precipitacin salina es una forma fcil de separacin de protenas pero requiere de una dilisis posterior , sise desea obtener a la protena de inters de
forma pura. La elaboracin de queso permiti entender el mecanismo biolgico de la coagulacin de la
casena por medio de enzimas provenientes del cuajo bovino.

V. Agradecimientos.

Agradecemos al almacn de la facultad de qumica

de la UAQ por los prestamos de material, reactivo e
instrumentos necesarios para realizar la prctica. Al
Doctor Aldo Amaro Reyes por la orientacin brindada a lo largo de la prctica y a los compaeros de la
sesin viernes del laboratorio de enzimtica que se
IV. Conclusin.
La separacin de protenas se basa en las caracters- comprometieron a traer los materiales necesarios
ticas fsicas y fisicoqumicas de estas para obtener la para la elaboracin de queso.
(s) de inters . El punto isoelctricos es una de las
caracterstica especifica de las protenas que nos

Figura 10. Etapas de la coagulacin de la leche por quimosina.

VI. Bibliografa.

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