Primer ao, Medicina

Bioqumica

Informe de Laboratorio
Trabajo Prctico N 5
Enzimologa

Integrantes: Mara del Mar Mora

Josefina Razmillic
Daniela Terrazas
Marcelo Valdes
Fecha: 21/11/2014

OBJETIVOS:
Generales:

Determinar las condiciones ptimas de la enzima Fosfatasa Alcalina (FA) mediante distintos
procesos experimentales que evidencian el efecto de las variables en la actividad enzimtica.

Especficos:

Realizar una curva de calibracin de Absorbancia neta (A405 neta) v/s Producto (pNP).
Determinar Km, Vmax, y concentracin ptima de sustrato
Determinar pH ptimo para la actividad enzimtica de FA.
Determinar temperatura ptima para la actividad enzimtica de FA.
Determinar el efecto de la concentracin de producto sobre la actividad enzimtica de FA.

DIAGRAMAS DE FLUJO:
Protocolo I: Generacin de curva de calibracin para p-nitrofenol

Rotular 6 tubos de la siguiente manera:

0 (blanco): 100uL NaOH (0,5 N); 400uL buffer (pH 9,6)
pNP 20: 100uL NaOH (0,5 N); 350uL buffer (pH 9,6); 50uL pNP (200 uM)
pNP 40: 100uL NaOH (0,5 N); 300uL buffer (pH 9,6); 100uL pNP (200 uM)
pNP 60: 100uL NaOH (0,5 N); 250uL buffer (pH 9,6); 150uL pNP (200 uM)
pNP 80: 100uL NaOH (0,5 N); 200uL buffer (pH 9,6); 200uL pNP (200 uM)
pNP 100: 100uL NaOH (0,5 N); 150uL buffer (pH 9,6); 250uL pNP (200 uM)
pNP 120: 100uL NaOH (0,5 N); 100uL buffer (pH 9,6); 300uL pNP (200 uM)

Generar estndares de pNP, haciendo diluciones de la solucin stock de acuerdo a los valores
anteriores

Para cada estndar, transferir 150 uL a un pozo de la microplaca. Registrar la ubicacin

Determinar la absorbancia

Protocolo II: Generacin de curva de calibracin para p-nitrofenol

Rotular 7 tubos de la siguiente manera:

pNPP 0 (blanco): 400uL buffer (pH 9,6); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pNPP 0,05: 398uL buffer (pH 9,6); 2 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pNPP 0,1: 396uL buffer (pH 9,6); 4 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pNPP 0,5: 380uL buffer (pH 9,6); 20 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pNPP 1: 360uL buffer (pH 9,6); 40 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pNPP 2: 320uL buffer (pH 9,6); 60 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL

Preparar las mezclas de reaccin, agregando a cada tubo los volmenes de soluciones indicados
anteriormente

Incubar en bao termorregulado a 37C

Luego de 15 minutos detener la reaccin enzimtica agregando 20 uL NaOH 10N a cada tubo

Para cada mezcla de reaccin transferir 150 uL a un pozo de la microplaca. Registrar ubicacin
de cada mezcla

Determinar el A405 en lector de microplaca

Protocolo III: efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Rotular 4 tubos de la siguiente manera:

pH 9,6 (blanco): 360uL buffer (pH 9,6); 40 uL pNPP (10mM); 5uL suero fisiolgico
pH 9,6: 360uL buffer (pH 9,6); 40uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pH 7,0: 360uL buffer (pH 7,0); 40 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL
pH 4,0: 360uL buffer (pH 4,0); 40 uL pNPP (10 mM); 5 uL fosfatasa alcalina 2ug/mL

Preparar las mezclas de reaccin, agregando a cada tubo los volmenes de soluciones indicados
anteriormente

Incubar en bao termorregulado a 37C

Luego de 15 minutos detener la reaccin enzimtica agregando 20 uL NaOH 10N a cada tubo

Para cada mezcla de reaccin transferir 150 uL a un pozo de la microplaca. Registrar ubicacin
de cada mezcla

Determinar el A405 en lector de microplaca

Protocolo IV: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

Rotular un tubo de 15mL: buffer + pNPP

En tubo de 15 mL, agregar 4,05 mL buffer fosfatasa alcalina pH 9,6 y 0,45 mL pNPP 10 mM

Mantener en hielo

Rotular 5 tubos de la siguiente manera:

37(blanco): 0,4 mL buffer + pNPP; 5 uL suero fisiolgico
100:0,4 mL buffer + pNPP; 5uL fosfatasa alcalina 2 ug/mL
60: 0,4 mL buffer + pNPP; 5uL fosfatasa alcalina 2 ug/mL
37: 0,4 mL buffer + pNPP; 5uL fosfatasa alcalina 2 ug/mL
0: 0,4 mL buffer + pNPP; uL fosfatasa alcalina 2 ug/mL

Preparar las mezclas de reaccin, agregando a cada tubo los volmenes de soluciones indicados
anteriormente

Incubar en bao termorregulado a 37C

Luego de 15 minutos detener la reaccin enzimtica agregando 20 uL NaOH 10N a cada tubo

Para cada mezcla de reaccin transferir 150 uL a un pozo de la microplaca. Registrar ubicacin
de cada mezcla

Determinar el A405 en lector de microplaca

Protocolo V: Efecto de la presencia de producto sobre la actividad enzimtica

Rotular 5 tubos de la siguiente manera:
0 (blanco): 390 uL buffer + pNPP; 10 uL Na2HPO4 (10mM); 5 uL suero fisiolgico
PO4 0: 390 uL buffer + pNPP; 10 uL suero fisiolgico; 5 uL fosfatasa alcalina (2ug/mL)
PO4 2,5: 390 uL buffer + pNPP; 2,5 uL Na2HPO4 (10mM); 7,5 uL suero fisiolgico; 5 uL fosfatasa
alcalina (2ug/mL)
PO4 5: 390 uL buffer + pNPP; 5 uL Na2HPO4 (10mM); 5 uL suero fisiolgico; 5 uL fosfatasa
alcalina (2ug/mL)
PO4 10: 390 uL buffer + pNPP; 10 uL Na2HPO4 (10mM); 5 uL fosfatasa alcalina (2ug/mL)

Preparar las mezclas de reaccin, agregando a cada tubo los volmenes de soluciones indicados
anteriormente

Incubar en bao termorregulado a 37C

Luego de 15 minutos detener la reaccin enzimtica agregando 20 uL NaOH 10N a cada tubo

Para cada mezcla de reaccin transferir 150 uL a un pozo de la microplaca. Registrar ubicacin
de cada mezcla

Determinar el A405 en lector de microplaca

RESULTADOS:
Protocolo I: Curva de calibracin
pNP (M)
0
20
40
60
80
100
120

Absorbancia a 405nm
0,063
0,147
0,220
0,312
0,394
0,448
0,466

Absorbancia corregida
0
0,084
0,157
0,249
0,331
0,385
0,403

Mediante estos resultados, se construye la siguiente curva de calibracin que nos permitir
interpolar la concentracin de producto en cada uno de los siguientes ensayos, para as
obtener la actividad enzimtica.

Curva de calibracin
0.5
f(x) = 0x
R = 0.99

0.4
0.3
Absorbancia corregida 0.2
0.1
0
0

20

40

60

80 100 120 140

Concentracin pNP (M)

Protocolo II: estimacin de Vmax y Km a travs de un grfico de dobles recprocos

pNPP (mM)
0
0,05
0,1
0,5
1
2

Absorbancia a 405nm
0,063
0,334
0,620
2,445
3,300
2,809

Absorbancia Corregida
0
0,271
0,557
2,382
3,237
2,746

GRFICO 2
A continuacin, utilizando la ecuacin de la recta obtenida a partir de la curva de calibracin, se
proceder a despejar la X, que en este caso corresponde a la concentracin de producto
obtenido (pNP)
Y= 0,0052x + 0.0055
1) pNP (M) = 0
0 = 0,0052x + 0,0055
X = -1,05769 0
X=0
2) pNP (M) = 20
20 = 0,0052x + 0,0055
X = 3.845,096154
3) pNP (M) = 40
40 = 0,0052x + 0,0055
X = 7.691,1
4) pNP (M) = 60
60 = 0,0052x + 0,0055
X = 11.537,40385
5) pNP (M) = 80
80 = 0,0052x + 0,0055

X = 15.383,55769
6) pNP (M) = 100
100 = 0,0052x + 0,0055
X = 19.229,71154
7) pNP (M) = 120
120 = 0,0052x + 0,0055
X = 23.075,86538
Despus de la obtencin de los valores en moles se procede a calcular el valor de V segn la
siguiente ecuacin.
Vo = moles/min
Debido a que la muestra se incub durante 15 minutos, se utiliza este valor en la ecuacin y los
moles se reemplazan segn la muestra analizada.
1) Vo = 0moles /15min
Vo = 0 moles/min
2) Vo = 1,634 moles /15min
Vo = 0,109 moles/min
3) Vo = 3.269moles /15min
Vo = 0,218 moles/min
4) Vo = 4,903 moles /15min
Vo = 0,327 moles/min
5) Vo = 6,538 moles /15min
Vo = 0,436 moles/min
6) Vo = 8,173 moles /15min
Vo = 0,544 moles/min
7) Vo = 9,807 moles/15min
Vo = 0,654 moles/min
Concentracin de producto generado (nNP)
pNPP(mM)
0
0,05
0,1
0,5
1

pNP(mM)
0

pNP(moles)
0

Vo(moles/min)
0

2
Concentracin
pNPP(mM)
0
0,05
0,1
0,5
1
2

de

Sustrato

Velocidad inicial (Vo)

0

pNPP v/s Absorbancia de pNP

Concentracin de sustrato v/s velocidad inicial: doble recproco

1/[pNPP(mM)]
0
20
10
2
1
0,2
0,1

1/[Vo (moles/min)]
0

Concentracin de sustrato v/s velocidad inicial

R ==0.86
f(x)
- 0x + 0.01

Utilizando la ecuacin de la recta obtenida del grfico anterior, es posible calcular los valores de
Km y de Vmax.
La pendiente de la ecuacin de la recta corresponde al valor de 1/Km, por lo tanto:
1/Km = 0,3789
Km = 1/0,3789
Km = 2,639
La interseccin de la recta en el eje y corresponde al valor de 1/Vmax. Por lo tanto,
reemplazando x=0 en la ecuacin de la recta, se obtiene:
Y= 0,3789x + 1,409
Y= 0,3789(0) + 1,409
Y= 1,409
Es decir,

pH
9,6 (blanco)
9,6
7,0
4,0

Absorbancia a 405nm
0,078
3,486
2,485
1,809

Absorbancia Corregida
0
3,408
2,407
1,731

1/Vmax=
1,409
Vmax=

1/1,409
Vmax= 0,7097

Protocolo III: Efecto del pH sobre la actividad de la fosfatasa alcalina

Interpolando los resultados de la absorbancia corregida a la curva de calibracin se obtuvo la
concentracin del producto generado (uM):

pH

Concentracin de Producto generado pNP (uM)

494,57

687,714

9,6

973.714

Actividad enzimtica versus pH

Una vez calculado el producto generado por cada valor de pH, se procede a calcular la
actividad enzimtica que supone cada uno.
Para calcular velocidad inicial:
V = Producto generado x (L totales x 10 )
Tiempo
V = Producto generado x (425 L x 10 )
15
O sea:
V = 494,57 x 425 x 10
15
V pH 4= 0,01401
V = 687,714 x 425 x 10
15
V pH 7 = 0.0195
V = 973.714 x 425 x 10
15
-6

-6

-6

0
0

-6

0
0

-6

V pH 9.6= 0.0276
Resultados
0

pH

Actividad
(MpNP/min)

Enzimtica Concentracin de Producto generado pNP (M)

4,
0

0,01401

494,57

7,
0

0,0195

687,714

9,
6

0,0276

973.714

A partir de estos datos, se genera la siguiente curva, que indica el efecto del pH sobrela
actividad enzimtica

Actividad enzimtica v/s pH

Protocolo IV: Efecto de la temperatura sobre la actividad de la fosfatasa alcalina

Resultados obtenidos:
Temperatura (C)
37 (blanco)
0
37
60
100

Absorbancia a 405nm
0,065
1,865
3,278
2,977
0,72

Absorbancia corregida
0
1,800
3,213
2,912
0,655

Clculos de producto generado a las distintas temperaturas segn la absorbancia

corregida:
Y= 0,0035x
0 C 1,800= 0.0035x
X= 514,285
37 C 3,213 = 0.0035x
X= 918
60 C 2,912 = 0.0035x
X= 832
100 C 0,655 = 0.0035x
X= 187,143
Clculos de velocidad enzimtica:
V0= Producto generado x (L totales x 10-6)
Tiempo
V0= Producto generado x (425 L x 10-6)
15
0 C 514,285 x 425 x 10-6
15
V0= 0.015
37 C 918 x 425 x 10-6
15
V0= 0.026
60 C 832 x 425 x 10-6
15
V0= 0.024
100 C 187,143 x 425 x 10-6
15

V0= 0.0053

Temperatura C v/s Actividad enzimtica (M/min)

Protocolo V: Efecto de la presencia de producto sobre la actividad de la fosfatasa

alcalina.
Resultados obtenidos:
PO4(mM)

Absorbancia Neta (405nm)

Absorbancia Corregida

0
0
2,5
5

0,070
3,455
1,619
1,147

0
3,385
1,549
1,077

10

0,857

0,787

Segn los resultados obtenidos, es posible interpolarlos a la curva de calibracin para

obtener la cantidad de producto generado.
Y= 0,0035x
0: 3,385=0.0035x
x=967,143
2.5: 1,549= 0.0035x
X= 442,571
5: 1,077= 0.0035X

X= 307,714
10: 0,787= 0.0035X
X= 224,857
Una vez obtenida la cantidad de producto generado es posible calcular la actividad
enzimtica
V = Producto generado x (L totales x 10 )
Tiempo
V = Producto generado x (425 L x 10 )
15
0: 967,143x 425 x 10
15
V = 0,0274
2.5: 442,571 x 425 x 10
15
V = 0,0125
5: 307,714x 425 x 10
15
V = 0,0087
10: 224,857 x 425 x 10
15
V = 0,0063
-6

-6

-6

-6

-6

-6

Resultados:
PO4(mM)

Actividad Enzimtica(umoles/min)

0 (blanco)

0,0274

2,5

0,0125

0,0087

10

0,0063

PO4 (mM) v/s Actividad enzimtica (M/min)

DISCUSIN:
Las enzimas son protenas altamente especializadas con la capacidad de catalizar
reacciones que no son termodinmicamente favorables y que tardaran demasiado tiempo en
ocurrir sin la presencia de stas. Son considerablemente especficas con respecto a sus
sustratos, lo que se explica porque en su sitio cataltico se encuentran grupos funcionales
capaces de formar enlaces transitorios solamente con ciertos sustratos. Por otro lado, la
funcin de una enzima depende de factores intrnsecos de sta, como su estructura, y es
ptima slo si se encuentra en un medio favorable, el cual vara dependiendo de la naturaleza
de cada enzima. Estos factores extrnsecos son la temperatura, el pH y la concentracin de
sustrato, enzima o producto del medio acuoso en el que ocurrir la reaccin.
En este laboratorio se medir la actividad de la fosfatasa alcalina (hidrolasa) en distintas
situaciones de pH, temperatura y concentracin de productos. Estas enzimas proceden de la
ruptura normal de clulas sanguneas y de otros tejidos, y se encuentran en la membrana

plasmtica de casi todos los tejidos del cuerpo.Los valores normales de fosfatasa alcalina en
adultos se encuentran entre 40 y 140 U/L, sin embargo estos valores pueden verse
disminuidos, indicando una malnutricin o dficit de protenas; o bien verse aumentados debido
a alcoholismo, anemia, colestasis, curacin de fracturas, enfermedades seas, hepticas,
renales, leucemia, osteomalacia, prostatisis. Adems es necesario recalcar que en nios los
valores normales son ms elevados, ya que se encuentran en periodo de crecimiento y los
niveles de fosfatasa alcalina aumentan cuando existe formacin de hueso.
Esta enzima La fosfatasa alcalina (ALP) tiene identificadas por lo menos 9 isoenzimas. Cada
una tiene varias propiedades de estabilidad al calor, inhibicin qumica, y movilidad
electrofortica. Entre ellas estn la rpida (pre-heptica), la heptica, la ALP del hueso,
placentaria, Regan, Nagao, renal, intestinal y PA.
Su actividad ms efectiva se logra en un medio alcalino (pH 9.6) y 37C. Esta hidrolasa
cataliza el p-nitrofenilfosfato (pNPP)

en p-nitrofenol (pNP),

cuyas estructuras son,

respectivamente:

El parmetro que indica la formacin

de producto en la solucin

es la coloracin de esta ltima (se torna de incolora a amarilla). Esto se debe a que en un
medio alcalino el p-nitrofenol sufre un rearreglo que genera una molcula de este color, y que
absorbe una longitud de onda de 405nm, la que puede ser medida espectrofotomtricamente.
Para que esto ocurra, la enzima debe estar en un medio favorable, como fue explicado
anteriormente. Parte de esta solucin se prepara aadiendo un buffer de pH 9.6, el que est
compuesto de bicarbonato de sodio (NaHCO3)y cloruro de magnesio (MgCl2).
Al momento de establecer las muestras de reaccin lo ltimo que debe ser agregado es
la enzima. Esto se explica porque se est evaluando la actividad de esta ltima en funcin de
cambios extrnsecos. Por esta razn, si se agrega en primer lugar, comenzara a catalizar el
sustrato independientemente de los cambios que vayan a realizarse despus, lo que se
reflejara en resultados poco significativos.

Por otra parte, despus de cada protocolo se debe agregar 20 uL hidrxido de sodio
(NaOH) 10N a cada tubo. Esto se hace para detener la reaccin. La explicacin de este
fenmeno se debe a que el NaOH reacciona con la solucin y altera el pH, por lo que la enzima
disminuye su actividad. Es necesario usar una base en vez de un cido debido a que el
producto formado tiene una coloracin ms notoria en un medio alcalino (proceso explicado
anteriormente).
Protocolo I. Generacin de curva de calibracin para p-nitrofenol
La curva de calibracin es un grfico de referencia hecho en base a cantidades
conocidas de sustancia, en este caso pNP (producto), que se utilizan para comparar la cantidad
de esa sustancia en una muestra determinada de concentracin desconocida. Este reactivo
absorbe luz a una longitud de onda de 405 nm que pueden cuantificarse en una
espectrofotometra, mostrando un pigmento amarillo. Se cumple en este caso una relacin
proporcional entre la intensidad de color y concentracin del reactivo en cuestin. Entonces, en
el grfico, a mayor absorbancia (intensidad de color), mayor concentracin de pNP. Mediante
esto, podemos interpolar la ecuacin de la recta y determinar la concentracin de una muestra
desconocida.
En este experimento, los datos obtenido son congruentes con los tericos, por lo que
podemos decir que la curva de calibracin es precisa debido a que las concentraciones base
poseen la concentracin correcta y el pipeteo fue adecuado.
Protocolo II. Estudio cintico de fosfatasa alcalina: determinacin de su Vmax y Km
El grfico se realiz mediante la variacin de la concentracin de sustrato que permite
calcular la actividad enzimtica, interpolada de la absorbancia obtenida, en la curva de
calibracin. Debido a la unin del sustrato con el sitio activo de la enzima, tericamente, a
medida que aumenta la cantidad de sustrato, habr mayor formacin del complejo enzimasustrato, y aumentar la formacin de producto. Dado esto, debera aumentar la absorbancia
de esta.
El grfico muestra que a medida que aumenta la cantidad de sustrato, la absorbancia
aumenta, por lo que existe formacin de producto, pudiendo hablarse de una relacin directa
entre la variable la concentracin de sustrato y la tasa de reaccin. Sin embargo, existe un
lmite, donde no existen ms sitios activos libres, y el aumento de sustrato deja de tener efecto.
Es decir, la saturacin de la enzima genera una estabilizacin de la velocidad enzimtica,

reflejada en la absorbancia. Si se acabase en sustrato, se dejan de producir reacciones y la

actividad enzimtica se detiene.
La constante de Michaelis-Menten (Km) indica la concentracin de sustrato que se
requiere para alcanzar la mitad de la velocidad mxima de la reaccin. La inversa de este
parmetro, 1/Km, mide la afinidad enzima-sustrato. La ecuacin se muestra a continuacin,
junto con los resultados de nuestro laboratorio.
V= Vmax [S]
Km + [S]
Km = 2,639
Esto nos indica la afinidad enzima-sustrato, siendo que mientras mayor sea Km, mayor es la
afinidad. Adems, Km grande indica inestabilidad del complejo ES, porque existe tendencia a
su destruccin para la consiguiente formacin de producto.
Protocolo III. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
El pH es puede modular la actividad enzimtica ya que cada uno de ellas tiene un pH
ptimo, es decir, en el cual su actividad es mxima. Sobre y bajo ese valor ptimo, el
funcionamiento de la enzima disminuye. El pH modifica los grupos aminos y carboxilo de la
superficie de la enzima en cuanto a su carcter inico, pudiendo afectar las propiedades
catalticas. Adems, un pH no adecuado puede inducir la desnaturalizacin de la enzima y su
prdida funcional. Al alterar la concentracin de protones no solo altera la estructura de la
enzima y el sustrato, sino que puede participar como sustrato o producto dentro de la reaccin.
En tal caso, la velocidad de la reaccin se ve afectada directamente.
En el caso de la enzima del experimento, la fosfatasa alcalina, su pH ptimo es 9,6.
Nuestro grfico result como lo esperado tericamente. La absorbancia con pH 9,6 fue
como la esperada, es decir, mxima. En este caso, la concentracin de protones especfica
mejora las interacciones entre enzima y sustrato, optimizando la velocidad de reaccin. El pH
tambin puede desprotonizar las enzimas, debido a que una alta concentracin de H+ atrae
molculas negativas.
Protocolo IV. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
La temperatura influye de manera directamente proporcional en la velocidad de la
reaccin enzimtica. La cual se define como 1.la cantidad de sustancia que se transforma en

una determinada reaccin por unidad de volumen y tiempo. Esto se debe a que, al igual que
cualquier reaccin qumica, el incremento de la entalpa(H) de un sistema permite que haya
ms colisiones entre las partculas hayaan mayor molculas con la energa de activacin
necesaria para que ocurra la reaccin, resultando en ms colisiones exitosas.
La influencia de la temperatura est descrita por la ecuacin de Arrhenius. La cual
plantea como regla general que las velocidad de reaccin se duplica por cada 10C, sin
embargo no siempre es as.
Dentro de las temperaturas evaluadas, la de 37C fue la que tuvo una mayor actividad
enzimtica. Sin embargo, al generar el grfico, la curva indica que la mxima actividad
enzimtica ocurre alrededor de los 50C. Posiblemente, con mayor cantidad de muestras, la
curva sera ms precisa e indicara un valor an ms cercano a 37C, como se esperaba
tericamente. debido a que se alcanza la mxima absorbancia.
Por otro lado, las enzimas son de naturaleza proteica por lo que conlleva el proceso de
denaturacin si es que la temperatura es muy elevada. Como la enzima Fosfatasa Alcalina (FA)
es una enzima que se encuentra en los tejidos del cuerpo humano su denaturacin es
aproximadamente a 45C. El proceso de denaturacin afecta la estructuras de las protenas de
orden superior, es decir, la cuaternaria, terciaria y secundaria. De esta manera se desorganizan
los puentes disulfuro, puentes de hidrgeno, enlaces inicos e interacciones hidrofbicas. En
otras palabras, la protena queda con una estructura primaria mantenindose solo los enlaces
peptdicos. Por lo que no se puede llevar a cabo la actividad cataltica de la enzima. Este
proceso es reversible por lo que puede ocurrir la renaturacin al volver a las condiciones
ptimas de la enzima.
Una temperatura muy baja tambin afecta una reaccin enzimtica debido a que
disminuye la entalpa y por ende, las colisiones efectivas entre las partculas. Pero hay que
considerar que a pesar de que la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se
detiene del todo. unas pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente
a 5C. En el grfico podemos ver como a 0C se establece la menor absorbancia debido a la
poca movilidad de las partculas dentro de la solucin y por pocas colisiones exitosas.
Las temperaturas de 60C y 100C nos sirven para hacer el grfico con la curva de calibracin
y con eso evidenciar la tendencia a aumentar la reaccin enzimtica al elevar la temperatura,
hasta un cierto punto donde las enzimas denaturan y la actividad enzimtica disminuye
considerablemente.
Protocolo V. Efecto de la presencia de producto sobre la actividad enzimtica

Por ltimo, se medir el efecto de la presencia de producto sobre la actividad de la

enzima. La reaccin de catalizacin realizada por la enzima est dada por la ecuacin:

Para efectos de este experimento, el sustrato utilizado es el p-nitrofenilfosfato (pNPP), y

los productos son p-nitrofenol (pNP) y fosfato (PO 4-3). En este caso, el fosfato acta como
inhibidor de la fosfatasa alcalina, ya que se une especficamente al sitio cataltico de esta
(debido a su gran afinidad) y disminuye su actividad. Es posible concluir lo anterior debido a los
resultados obtenidos, ya que a medida que aumenta la concentracin de producto (PO 4-3) es
posible observar una disminucin progresiva en la actividad cataltica de la enzima.
Es posible afirmar entonces que la actividad enzimtica es inversamente proporcional a
la concentracin de producto disponible, ya que a medida que se produce ms producto, ste
compite por el sitio activo de la enzima con el sustrato. Esto ltimo se debe a que la unin del
producto con la enzima impide que se produzca el complejo enzima-sustrato (ES). Por su parte,
si se agregara ms sustrato a la solucin, la actividad enzimtica aumentara progresivamente
debido a que habra una mayor cantidad de choques efectivos entre ambos, y por ende una
mayor posibilidad de que haya formacin de complejo ES. Algo similar ocurrira con la adicin
de enzima (aumento de concentracin de sta). Cabe destacar que en ambos casos existir
una concentracin de sustrato limitante, la que indica que a partir de esa concentracin en
adelante, no seguir aumentando la velocidad catalizadora de la enzima, ya que todas estas se
encontrarn reaccionando con el sustrato.
OTROS ERRORES:
CONCLUSIN:
La FA es una enzima saturable, visible en el grfico Concentracin de producto v/s Velocidad
de reaccin, ya que alcanza una velocidad mxima porque no existen ms sitios activos para la
formacin de complejos ES.
Su Km es 2,639 M.
Su Vmx 0,7097 mol/min.

Su pH ptimo es de 9,6.
Su temperatura ptima son 50 C.
La actividad enzimtica es inhibida por la alta concentracin de producto.
Los factores que afectan la actividad enzimtica son pH, T y concentracin del producto.

BIBLIOGRAFA:
http://www.scribd.com/doc/13590698/Quimica-Clinica-Fosfatasa-Alcalina revisado el 21/11/2014
http://www.tuotromedico.com/temas/fosfatasa_alcalina.htm revisado el 21/11/2014
Pre-paso TP Enzimas, 14/11/14, Medicina UDD