APUNTES BSICOS SOBRE TCNICA HISTOLOGICA

La histologa (estudio de los tejidos), es la ciencia que se encarga del estudio de la estructura de
clulas, tejidos y rganos. La comprensin de cmo la estructura de estos elementos se relaciona
con las funciones que ellos cumplen, requiere de un conocimiento de la composicin molecular de
los mismos y de las interacciones a nivel molecular entre clulas y, entre clulas y componentes
extracelulares, materias que se incluyen en la Histologa moderna.
La estructura del material histolgico se estudia en rebanadas muy delgadas, llamadas cortes de
tejido. Los cortes tienen un grosor menor que la mayora de las clulas (1-10 mm) y muestran en
un plano, estructuras tridimensionales de los tejidos. Estos cortes se analizarn en el microscopio
de campo brillante que entrega informacin de cortes de tejido delgados y bien contrastados.
MICROSCOPIO OPTICO DE CAMPO BRILLANTE
Los microscopios, que datan del siglo XVII, han tenido un desarrollo notable hasta la fecha. Existen
varios tipos de microscopios, cuyas propiedades se describen en los textos. El microscopio que se
usar para los trabajos prcticos, es el microscopio de campo claro o campo brillante cuyas
caractersticas se describen a continuacin:
Sistema ptico

a) Lente ocular: sistema de lentes planos convexos adosados a los extremos de un tubo, con un
diafragma circular entre ellos. Ampla la imagen virtual recogida por la lente objetivo y limita el
campo visual del ojo. En su microscopio, estas lentes estn unidas por un sistema de tubos
binoculares y entregan un aumento de 10 veces (lOx).

b) Lente objetiva: sistema de lentes convergentes de distinto aumento que se ubican en el revlver.
Es la nica lente de todo el sistema ptico que tiene poder de resolucin. Sus aumentos son 4x,
lOx, 40x, lOOx.
Dependiendo del ndice de refraccin del medio (n), se distinguen:

Lentes objetivas en seco, estn adecuadas al n del aire (n = 1), por lo que no debe
interponerse nada entre la lente y la preparacin. Sus aumentos son 4x, lOx, 40x.
Lentes objetivas de inmersin, adecuadas a n > 1 (generalmente n = 1.5), se utilizan
agregando una capa de lquido transparente (aceite de inmersin) entre la lente y la
preparacin. Este tipo de lentes se identifica por una lnea negra en su parte inferior, y en su
microscopio posee un aumento de lOOx. En estas clases prcticas, se usar un aumento
mximo de 40x.

c) Condensador: sistema de lentes convergentes dispuesto debajo de la platina, que proyecta sobre
la preparacin un haz de luz en forma de amplio cono.
d) Diafragma: nico elemento mecnico del sistema ptico. Su dimetro se puede modificar mediante
una palanca lateral, con el fin de regular el haz de luz proveniente de la fuente lumnica de modo tal
que ste quede centrado en el condensador.
e) Porta filtros: sistema de cristales pigmentados ubicado bajo el diafragma, que filtra selectivamente
el espectro de la luz blanca. El de uso frecuente es el de color azul violceo, que absorbe las
longitudes de onda del rojo y el amarillo, emitidas por el filamento metlico de la lmpara.
f)

Lente frontal: es una lente auxiliar para trabajar slo con mayores aumentos. Se acciona mediante
una palanca lateral, ubicada bajo el condensador.
Sistema mecnico
1) Pie o Base de Sustentacin: sobre l descansa la columna o estativo. Incluye un transformador
para el funcionamiento de una lmpara de bajo voltaje.
2) Tubo: pieza dispuesta en un ngulo de 45 respecto de la columna, que lleva en su extremo
superior dos lentes oculares para la observacin binocular de la preparacin. En su extremo inferior
est conectada al revlver.
3) Platina: plataforma para acomodar la preparacin mediante dos pinzas laterales, y que puede
moverse en un rango de 76 mm x 26 mm. con la ayuda de una gua dispuesta en el costado de la
platina.
4) Revlver: pieza giratoria que permite intercambiar las 4 lentes objetivas y obtener distintos
aumentos durante la observacin.
5) Tornillo macro-micromtrico integrado: permite enfocar correctamente la preparacin al
desplazar verticalmente la platina, alejndola o acercndola a la lente objetiva.
Sistema de Iluminacin
La fuente de luz corresponde a una lmpara de bajo voltaje (6V 5W) acoplada a un tubo de
iluminacin ubicado debajo del condensador. La intensidad de la iluminacin se puede regular
mediante un tornillo negro situado en el extremo inferior izquierdo del pie.

FACTORES INVOLUCRADOS EN LA OPTIMIZACION DE LA OBSERVACION BAJO EL

MICROSCOPIO
a) Poder de Resolucin (PR): es la capacidad de la lente, que permite hacer perceptible por
separado dos puntos que estn muy prximos entre s. Esta capacidad es inversamente
proporcional al lmite de resolucin (d), que es la menor distancia que debe existir entre dos
puntos para que stos puedan ser individualizados como unidades separadas.
PR = 1 / d
El valor "d" es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz (L = lambda) e
inversamente proporcional a la Apertura Numrica (AN) de la lente:
d = L/AN
En consecuencia, el PR es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada y
directamente proporcional a la apertura numrica de la lente del microscopio:
PR = AN / L
b) Apertura Numrica (AN) es el producto del ndice de refraccin del medio interpuesto entre la
muestra y la lente del objetivo, a travs del cual pasa la luz, multiplicado por el seno del ngulo
de apertura de la lente. Normalmente, la AN est indicada en el objetivo a utilizar.
AN = n x sen ngulo
Las lentes de inmersin incrementan la AN al utilizar aceite de inmersin, el cual posee un ndice
de refraccin mayor que el aire.
c) Poder de aumento: es la relacin existente entre el tamao del objeto y la imagen obtenida a
travs de las lentes. Depende directamente de las lentes con sus diferentes aumentos. En su
microscopio podr calcular el valor del PA multiplicando el poder de la lente ocular por el poder
de la respectiva lente objetiva.

INDICACIONES PARA EL MANEJO ADECUADO DEL MICROSCOPIO PTICO

1.Encienda la lmpara
2. Coloque la preparacin histolgica sobre la platina siempre con el cubreobjetos hacia arriba,
fijndola con las pinzas.
3. Suba la platina con ayuda del tomillo macro-micromtrico.
4. Inicie la observacin con el objetivo de menor aumento, para obtener una imagen panormica
del corte histolgico, y por tanto del rgano observado. Localice a este aumento (4x) las zonas que
se desea observar a aumentos mayores sucesivos.
5. Afine el enfoque mediante el tornillo macro-micromtrico, hasta que la imagen sea ntida.
6. Toda vez que cambie de lentes objetivos debe bajar la platina, para evitar que se rompa la
preparacin histolgica, al chocar contra los lentes. Gire el revlver, colocando en lnea de
observacin el objetivo con el aumento deseado, en el campo previamente seleccionado con el

objetivo de menor aumento. Si necesita una imagen ms ntida, regule con ayuda del tornillo
macro-micromtrico.
7. Optimice la iluminacin regulando la intensidad de la luz.
Al terminar la observacin:

baje la platina con el tornillo macro-micromtrico

deje el revlver en el objetivo de menor aumento
retire la preparacin histolgica
apague la fuente luminosa
cubra el equipo con su funda protectora

INTERPRETACIN DE LOS CORTES HISTOLOGICOS

Para una adecuada interpretacin de un corte observado al microscopio ptico, deben
considerarse los siguientes factores:
1) El plano de corte. Este aspecto es fundamental, pues se debe reconstruir la estructura
tridimensional de clulas, tejidos y rganos a partir de cortes bidimensionales. Es importante
considerar que los cortes que se estudiarn corresponden a:

rganos tubulares
rganos macizos
secciones corporales

2) Tincin empleada.
Interpretacin funcional. Es importante establecer las correlaciones entre estructura y funcin de lo
observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estticas del corte en las
dinmicas de la vida.
Artefactos
Durante la preparacin de los cortes histolgicos, pueden presentarse alteraciones denominadas
artefactos, que deben ser reconocidos y diferenciados de reas bien conservadas de tejidos.
Generalmente, se deben a errores en la preparacin del tejido, defectos en la cuchilla, que se
traducen en muescas en la preparacin, o errores de montaje como pliegues y arrugas.
Al analizar cortes de tejido, debe tenerse en cuenta que estos muestran en un plano
bidimensional las estructuras tridimensionales que forman los tejidos y rganos. La figura
muestra los posibles cortes que se pueden obtener de un tubo curvado.

TCNICAS DE PREPARACIN DE MATERIAL BIOLGICO PARA SU OBSERVACIN AL

MICROSCOPIO
El mtodo ms comnmente empleado en clases prcticas es la tcnica de inclusin en parafina,
que permite obtener preparaciones permanentes de tejidos (lminas o cortes histolgicos), para ser
observados en el microscopio ptico. Tiene como objetivo conservar la misma estructura y
composicin qumica que posean estos tejidos cuando estaban vivos, ideal que no se alcanza,
observndose en todas las preparaciones ciertos artefactos, consecuencia del proceso a que
fueron sometidos.
Etapas de la tcnica de inclusin en parafina
a) Obtencin de la muestra: el material debe extirparse de un animal anestesiado o
inmediatamente despus de su muerte. En el caso de material humano, los tejidos slidos
generalmente se obtienen por ciruga (biopsia), por endoscopa (como fragmentos de tejido
digestivo, bronquial, etc ) o biopsia.
b) Fijacin: tratamiento que estabiliza la estructura de un tejido en una etapa determinada, con un
mnimo de alteraciones de su estado in vivo. La fijacin puede realizarse por inmersin,
sumergiendo el tejido en la solucin del lquido fijador, o por perfusin, inyectando al fijador por
los vasos sanguneos del rgano.
Los fijadores comnmente empleados contienen formaldehdo en forma de solucin de formalina,
aunque tambin suele emplearse alcohol, bicloruro de mercurio, bicromato de potasio y ciertos
cidos (pcrico, actico), compuestos que fijan por coagulacin de las protenas presentes en el
tejido. Habitualmente, se emplean mezclas fijadoras que contienen proporciones variables de
fijadores simples como, por ejemplo, el lquido de Bouin y el lquido de Helly, de Zenker y de
Sousa. Los fijadores pueden o no conservar carbohidratos y lpidos, y su eleccin est determinada
por el tejido en particular o el componente del mismo que se va a estudiar, as como por el mtodo
de tincin que se usar.
Los fijadores qumicos ms usados son formaldehdo (H-CHO) y glutaraldehido (CHO-(CH2)3CHO), que actan principalmente sobre protenas. Los grupos aldehidos reaccionan con las
cadenas laterales de aminocidos que contienen-NH2, -SH, y -OH, formndose enlaces
covalentes, ya sea entre zonas de la misma cadena polipeptdica o entre molculas adyacentes.
Como ejemplo se ilustra el producto formado al reaccionar el formaldehdo con aminocidos cuyas

cadenas laterales contienen grupos NH2.

Rl-NH2+CH2=O

R1-NH-CH2OH+ R2-NH2 -

RI -NH CH2-NH-R2

+ H2O

c) Deshidratacin: la inclusin en parafina requiere reemplazar el agua del tejido por parafina, con
el objeto de endurecer la muestra lo suficiente para cortarla. La primera etapa es una
deshidratacin gradual, pasando la muestra de tejido por varias soluciones de alcohol de
concentraciones crecientes, hasta llegar al alcohol absoluto. La segunda etapa es el aclarado,
en que se reemplaza el alcohol por un solvente que pueda mezclarse con el agente de
inclusin (parafina), como es el xilol. Para ello, la muestra de tejido se pasa desde el alcohol
absoluto a dos cambios sucesivos de xilol.
d) Inclusin: el trozo de tejido impregnado en xilol es sumergido en cambios sucesivos de
parafina a 60 C. Este hidrocarburo es lquido a 60 C y llena todos los espacios ocupados
inicialmente por el agua tisular. La parafina lquida se endurece a temperatura
ambiente obtenindose un bloque de tejido.
e) Corte: los cortes de tejido se obtienen en instrumentos llamados micrtomos. En general, los
cortes en parafina tienen un grosor de 5-10 m, y para su manipulacin se adhieren a un
portaobjetos.
f)

Tincin: los tejidos se tien para aumentar el contraste natural y hacer ms evidentes los
componentes celulares. La mayor parte de los colorantes se usan en soluciones acuosas, por
lo cual la parafina que impregna al corte debe ser reemplazada por agua. Para remover la
parafina, los cortes se sumergen en xilol y luego se hidratan en soluciones de alcohol de
concentraciones decrecientes, hasta llegar al agua. El corte hidratado se sumerge en el
colorante elegido.

g) Montaje: para guardar en forma indefinida a la preparacin teida, es necesario cubrirla con un
cubreobjeto. Durante el proceso de montaje, el corte es nuevamente deshidratado con una
serie de alcoholes, a concentraciones crecientes hasta el alcohol absoluto, y luego se
reemplaza ste por xilol. Sobre el corte impregnado en xilol se pone una gota de un medio de
montaje soluble en xilol y sobre ella, el cubreobjetos. Cuando el xilol mezclado al medio de
montaje se evapora, el corte queda impregnado por el medio de montaje y el cubreobjeto
slidamente adherido al portaobjetos. El medio de montaje elimina el efecto de difraccin de la
luz.

TINCIONES HISTOLOGICAS
TINCION CON COLORANTES BASICOS Y ACIDOS
HEMATOXILINA - EOSINA
Tcnica usada de rutina en la que se tie con 2 colorantes:

Hematoxilina, un colorante catinico (o bsico) de color azul- prpura, y

Eosina, un colorante aninico (o cido) de color rosado-rojizo

Los colorantes bsicos y cidos son sales neutras que contienen un radical ya sea bsico (carga +)
o cido (carga -). La eosina es la sal sdica de tetra -bromofluorescena y el color reside en este
radical cido. La hematoxilina, acta como un colorante bsico porque en la solucin de tincin su
componente coloreado es el complejo hematena-Al

Los componentes teidos por la hematoxilina, de color azul, reciben el nombre de basfilos y los
teidos por la eosina, de color rosado intenso, se denominan acidfilos o eosinfilos.
En los tejidos, las molculas de protenas (nucleoprotenas, glicoprotenas, lipoprotenas) y de
carbohidratos (glicolpidos y glicosaminoglicanos, glicoprotenas) contienen radicales que pueden
formar enlaces electrostticos con estos colorantes. La cromatina nuclear es muy basfila por su
contenido en grupos -PO3. En cambio, las protenas mitocondriales son ricas en aminocidos
bsicos, por lo que el citoplasma de las clulas suele teirse con la eosina.

TINCIONES HISTOQUMICAS ESPECIFICAS

En el estudio de los tejidos, son de gran ayuda las diferentes tcnicas de fijacin, inclusin y
tincin, que permiten conservar o resaltar estructuras celulares y/o elementos tisulares importantes.
Tanto la fijacin como la inclusin determinan la conservacin o no de algunas molculas en el
interior de las clulas. Por otro lado, las diferentes tinciones entregan una variedad de alternativas
para diferenciar o contrastar agregados moleculares y estructuras de un tejido. El saber interpretar
la informacin proporcionada por las tinciones ser de gran ayuda para determinar caractersticas
estructurales y funcionales de las clulas que constituyen un tejido. En la mayor parte de los casos,
las reacciones son efectuadas sobre tejidos fijados. A continuacin se describen algunas de las
tcnicas especiales ms utilizadas en histologa.
1. Impregnacin con sales metlicas.
Estos mtodos emplean sales metlicas como el cloruro de oro, el nitrato de plata, etc. que
producen, en condiciones fsico-qumicas adecuadas, precipitados negros que se depositan
selectivamente sobre determinadas estructuras del tejido. La razn de la especificidad del
precipitado no ha sido an completamente comprendida. Como ejemplos de estas tcnicas
podemos mencionar la Tcnica de Del Ro Ortega para fibras reticulares y colgenas; la
impregnacin argntica con el mtodo de Golgi-Cox que permite observar los cuerpos neuronales y
sus prolongaciones, y el mtodo de Ramn y Caja! con sublimado de oro para ciertos tipos de
clulas gliales.

2. Tincin con Acido Perydico-Schiff (PAS)

Esta tincin permite la localizacin de macromolculas ricas en carbohidratos tales como
glicgeno, glicoprotenas y proteoglicanos. La especificidad de la reaccin de PAS, se basa en el
uso de 2 reactivos, el cido perydico ( HI04 ) y el reactivo de Schiff. El cido perydico oxida dos

grupos hidroxilo ubicados en carbonos adyacentes (por ejemplo la unin 1,2-glicol en las hexosas),
o grupos hidroxilo y amino adyacentes (como en las hexosaminas). Las uniones carbono-carbono
se abren y los grupos hidroxilo y amino vecinales se convierten en aldehidos. En las condiciones
de oxidacin usadas en el mtodo de PAS, la oxidacin se detiene a nivel de aldehidos.

Oxidacin de grupos aldehido vecinales con HIO4

(reactivo de Schiff)
El reactivo de Schiff reacciona con los aldehidos, formando un producto estable de color rojo
magenta.
Para microscopa electrnica de transmisin (MET), se aplica un mtodo similar, pero se
reemplaza al reactivo de Schiff por la metenamina de plata, la cul genera un producto de reaccin
opaco a los electrones.
3. Localizacin histoqumica de enzimas
Una variante del mtodo histoqumico, permite la demostracin de la presencia de diferentes
enzimas en el tejido. La enzima no es visualizada directamente, sino que lo que se observa es el
producto de la reaccin enzimtica, que permite inferir su presencia. Este tipo de tinciones posee
las caractersticas de las reacciones enzimticas: un pH ptimo, especificidad de cada enzima por
su sustrato y requiere de la presencia de agentes activadores e inhibidores especficos. La
formacin de un agente visible en el corte, en los sitios en que se ubica la enzima, se basa en la
precipitacin de uno de los productos de la reaccin enzimtica. El precipitado ser visible al
microscopio de luz, si es coloreado y, si contiene tomos de alto nmero atmico y, por lo tanto, es
denso a los electrones, aparecer como un depsito negro al microscopio electrnico de

transmisin (TEM).
a) Un ejemplo es la tcnica de Gomori para detectar fosfatasa cida. Para realizar la reaccin
histoqumica, el corte de tejido se incuba en presencia de un sustrato para la enzima (glicerofosfato
de Na) que contiene iones fosfatos. Estos iones fosfato son liberados del sustrato, por accin de la
enzima presente en el tejido, y se combinan con iones de plomo, provistos por cloruro de plomo
presente en el medio de incubacin. En aquellos sitios donde se encuentra la enzima, se genera un
precipitado visible al microscopio electrnico de transmisin. Si se desea analizar el material al
microscopio de luz, el precipitado se expone a vapores de sulfuro, que transforman el producto de
la reaccin (fosfato de plomo), en un producto de color negro (sulfuro de plomo) visible.

b) Localizacin de la peroxidasa
Para evidenciar esta enzima, los cortes de tejido se incuban en presencia de agua oxigenada
(H2O2), que corresponde al sustrato de la enzima, y diaminobencidina (DAB), reactivo que en
presencia de peroxidasa y H2O2 se oxida, dando origen a un producto coloreado insoluble. Este
producto coloreado, en presencia de tetrxido de Osmio (OsO4), forma un producto denso a los
electrones, visible al microscopio electrnico, denominado negro de Osmio.

4. Inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica es un mtodo altamente especfico que se vale de la capacidad que el
organismo tiene de generar anticuerpos (inmunoglobulinas) contra determinadas molculas
denominadas antgenos, con las que se unen especficamente para inactivarlas. La produccin de
anticuerpos puede ser inducida artificialmente, en animales de laboratorio, mediante la inyeccin
de un antgeno (protena, glicoprotena o polisacrido altamente purificados). Una vez generado el
anticuerpo, ste se purifica y se combina qumicamente con distintas substancias que se utilizan
como marcadores. Las molculas marcadoras son muy variadas (colorantes fluorescentes,
enzimas, tomos densos a los electrones como oro), y su presencia puede ser detectada de
diversas maneras dependiendo de su naturaleza qumica.

Mtodo directo: El anticuerpo especfico contra el antgeno cuya localizacin se desea establecer,

se marca con elemento marcador y se aplica al corte de tejido. El elemento marcador puede ser un
producto que se vea directamente (colorante fluorescente, oro coloidal) o que genere un producto
coloreado o denso a los electrones, luego de una reaccin enzimtica.
Mtodo indirecto: En este mtodo, los cortes de tejido se exponen a un anticuerpo especfico no
marcado (primer anticuerpo) formndose, en la zona donde se encuentra el antgeno, un complejo
antgeno-anticuerpo invisible. Luego se aplica un segundo anticuerpo marcado, especfico para el
primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se obtiene usando como antgeno el primer anticuerpo. Si
el primer anticuerpo se obtuvo inyectando el antgeno a un conejo, el segundo anticuerpo se
obtiene inyectando el primer anticuerpo (inmunoglobulinas de conejo) a otro animal, por ejemplo
cabra, que producir anticuerpos anti-inmunoglobulina de conejo. Este segundo anticuerpo se
marca para hacerlo visible al microscopio.

tcnica inmunocitoqumica directa

tcnica inmunocitoqumica indirecta

5. Autorradiografa
Este mtodo se basa en la capacidad de los compuestos radioactivos (de manera similar a la luz)
de generar una imagen sobre una emulsin fotogrfica. Permite estudiar la incorporacin de
molculas precursoras que contienen tomos radioactivos, a macromolculas propias de un
espcimen biolgico. La radioactividad proviene de tomos radioactivos que se han inyectado
previamente al animal vivo. Se usa generalmente tritio (Ha), un istopo que emite partculas de baja
energa y corto alcance.
Localizacin de la marca en cortes de tejido.
El animal que recibi la inyeccin de molculas radioactivas se sacrifica, y se preparan cortes del
tejido que se desea estudiar. Sobre el corte se coloca una capa de emulsin fotogrfica
(suspensin de haluro de plata en gelatina) y se deja exponiendo en la oscuridad. Durante este
perodo, las partculas emitidas por los tomos radioactivos, inciden sobre alguno de los cristales

de haluro de plata, produciendo una imagen latente invisible (que corresponde a sitios dentro del
cristal donde la plata inica se transformar en plata metlica). Pasado un tiempo de exposicin
adecuado, se trata el corte con un revelador qumico, que convierte todos los cristales de haluro de
plata que han sido activados por partculas (imagen latente) en plata metlica, obtenindose la
imagen real. Luego, se trata el corte con un fijador que disuelve todos los cristales de plata, pero
no afecta a la plata reducida. En aquellos lugares del corte donde haya molculas que emitieron
radiacin, se observa el depsito de granos negros de plata (granos de autorradiografa). Las
estructuras que se encuentran por debajo de estos granos, contienen las macromolculas que
incorporaron el precursor radioactivo.

Ejemplos:
a) Localizacin de clulas que se encuentran en proceso de divisin celular (mitosis) y migracin
posterior.
Se administra endovenosamente a un animal experimental, una dosis de timidina*, en la cul
alguno de los tomos de H est reemplazado por tritio. Esta timidina* ser captada por todos los
ncleos celulares que se hallan en fase S del ciclo celular. Al sacrificar el animal unas horas ms
tarde, y procesar el tejido extrado para autorradiografa, todos los ncleos cubiertos por granos de
plata (granos de autorradiografa) correspondern a ncleos de clulas que estaban en fase S al
hacerse la inyeccin. De esta forma se puede seguir el proceso de multiplicacin celular y el
destino de una poblacin de clulas.
b) La sntesis de protenas se puede estudiar inyectando un aminocido marcado y la sntesis de
carbohidratos mediante un monosacrido marcado. Los precursores radioactivos se incorporan a
macromolculas, a los pocos minutos de inyectados.
Clulas pancreticas de un animal sacrificado 10 min (A) y 45 min (B) despus de haber recibido
una inyeccin de leucina tritiada. La protena marcada se ubica en el aparato de Golgi (A) y luego
en los granos de secrecin (B)

6. Hibridizacin (hibridacin) in situ

Esta tcnica se fundamenta en la afinidad que las cadenas de cidos nucleicos tienen con
segmentos de cidos nucleicos que contengan bases complementarias. La tcnica permite la
identificacin, con gran precisin y especificidad, de secuencias de ADN y ARN contenidos en la
clula, las que denotan la codificacin gentica de, por ejemplo, una protena especfica.
Metodologa
Cuando una solucin de DNA se expone a condiciones denaturantes (100C y pH 13), la doble
hlice de la molcula se disocia en dos hebras, que se separan debido a la ruptura de los puentes
de hidrgeno entre bases complementarias. Cuando se realiza un estudio de RNA, que no adopta
la conformacin de doble hebra, el proceso de denaturacin permite desestabilizar el plegamiento
que el RNA adquiere naturalmente. Al someter esta solucin de DNA o RNA denaturado a una
temperatura de 65C por un perodo prolongado de tiempo, puede ocurrir una hibridizacin
(renaturacin), que restablece la conformacin natural de la molcula. De acuerdo a las
condiciones experimentales, la hibridizacin puede ocurrir entre dos cadenas cualesquiera de
cidos nucleicos (DNA con DNA, RNA con RNA o DNA con RNA), siempre cuando ellas posean
secuencias de nucletidos complementarias. Esta ltima propiedad es aprovechada por el mtodo
para producir un apareamiento, de alta especificidad, entre una secuencia particular de DNA o
RNA presente en la clula y una secuencia de DNA o RNA conocida, debidamente marcada
(sonda), producida en el laboratorio.
Las sondas se marcan uniendo a ellas elementos que puedan observarse al microscopio como:

istopos radioactivos, que se detectan por autorradiografa

molculas fluorescentes (fluorocromo) que se estudian al microscopio bajo luz UV
enzimas tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina, cuya localizacin se puede detectar
revelando su actividad enzimtica segn lo descrito anteriormente.
Sin embargo, el mtodo ms usado actualmente, es la sntesis de nucletidos que contienen
una cadena lateral modificada por la adicin de digoxigenina, un esteroide de origen vegetal.
Estos nucletidos son reconocidos por la DNA polimerasa e incorporados a las sondas
sintetizadas. La digoxigenina es luego localizada mediante anticuerpos antidigoxigenina
marcados con colorantes fluorescentes, que se visualizan al microscopio de luz UV, o enzimas
cuya presencia se puede revelar mediante tcnicas histoqumicas.

b) Localizacin de mRNA

Los granos de autorradiografa se ubicarn exclusivamente sobre el citoplasma de las clulas que
presenten mRNA de secuencias complementarias a las de la sonda que se us para la deteccin.