Practica#3 Molecular

Prctica # 3.
Electroforesis en geles de poliacridamida

desnaturalizantes SDS-page. Jessica Rodriguez pizaa. Matricula: 113000. Ingeniera
biomdica.
Introduccin.
diferente fuerza inica, pH y tamao de poro.
La electroforesis es una tcnica de separacin

de molculas en una mezcla por aplicacin de
un campo elctrico. Las molculas disueltas se
desplazan o migran en un campo elctrico a
El
isoelectroenfoque
utiliza
un
gel
con
gradiente de pH y se utiliza para sustancias

anftericas, lo cual sirve para conocer el punto
isoelctrico.[2]
una velocidad determinada por su relacin
Los geles de poliacrilamida se forman por la
carga-masa. Por ejemplo si dos molculas
polimerizacin
tienen masa y formas iguales, la de mayor
acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monmero
carga neta se desplazar ms rpido hacia un
entrecruzador N, N'-metilen-bis-acrilamida
electrodo. [1]
analizar el peso
molecular y determinar el
peso de protenas y acidos nucleicos. Existen

diferentes tipos de electroforesis cuy diferencia
radica en los distintos tipos de medios de
soporte: los geles de celulosa son usados para
molculas de bajo peso molecular como
aminocidos y carbohidratos,
los geles de
poliacridamida y agarosa se utilizan para

molculas de mayor peso molecular como:
ARN
electroforesis
verticales
protenas.
pueden
Los
ser
cilndricos.
Las
geles
de
horizontales,
condiciones
electroforticas pueden variar; por ejemplo en

la
electroforesis
de
zona
utiliza
un
amotiguador de pH constante durante todo el

tiempo de separacin. En la electroforesisde
gel discontinuo se utilizan dos diferentes geles,
uno concentrador y uno separador. Estos geles
son
del
monmero
CH2 = CH- CO - NH - CH2 - NH - CO - CH =
La electroforesis se utiliza comnmente para
ADN,
vinlica
separados
por
amortiguadores
de
CH2.
La polimerizacin se inicia con la formacin de
radicales
libres
del
monmero,
que
se
producen por radicales libres de oxgeno, por

causa de la accin de iones persulfato.1 Las
aminas terciarias como el N, N, N, Ntetrametilen-diamina (TEMED) se emplean
como catalizadores de esta reaccin, porque
causan la formacin de radicales libres del
persulfato.4
Esta reaccin es fuertemente
inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo

que la solucin debe ser desgasificada para
lograr una formacin de gel reproducible. Hay
muchos factores que desempean una funcin
importante en la separacin electrofortica,
como son pH,
fuerza inica, gradiente de
potencial, tiempo de corrida, concentraciones

de acrilamida y bis-acrilamida, etc. [3]
Prctica # 3. Electroforesis en geles de poliacridamida

biomdica.
Objetivo.
SDS.
Conocer los principios y aplicaciones de la
En los laboratorios, el SDS se emplea

comnmente en la preparacin de protenas
para electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE). El SDS acta rompiendo enlaces
no
covalentes
en
las
protenas,
electroforesis.
Metodologa.
Se prepar el gel de corrido al 15% en 15mL
con los siguientes reactivos.
desnaturalizndolas, provocando que estas
Tabla I. reactivos para elaborar el gel de
molculas proteicas pierdan su conformacin
corrido.
nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las

zonas apolares del polipptido. Adems, la
cantidad de SDS unido es similar para muchas
protenas: una molcula de SDS por cada dos
H2O d
RGB
A/MBA
TEMED
Persulfato
1.25mL
3.75mL
2.5mL
50L
150L
residuos aminocidos, correspondiendo a unos

1,4 g SDS/g protena. Ello proporciona al
polipptido una carga negativa que resulta
proporcional a la longitud de la cadena (el
nmero de aminocidos) y, por tanto, a la
masa molecular de la protena. Este aporte de
carga negativa es sustancialmente mayor que
la carga original de la protena. La repulsin
electrosttica creada por la unin del SDS a la
El TEMED y el persulfato se agregaron al final.

Se agito la mezcla tratando de no formar
burbujas, se aplic la solucin entre las dos
placas de vidrio procurando dejar un espacio
de 2cm para el gel Stacking, se rellen el
espacio con alcohol isopropanol y se dej
polimerizar.
protena es una de las causas de que la
Se prepar el gel Stacking con los siguientes
protena
reactivos.
pierda
su
conformacin
nativa,
eliminndose de este modo las diferencias en

conformacin de las diferentes protenas que
han de ser separadas en el gel.[4]
Tabla II.
Stacking.
Reactivos para elaborar el gel

biomdica.
H2O d
SGB
A/MBA
TEMED
Persulfato
con 15 L de las muestras y se procedi a
2.5mL
3.75mL
1.75mL
25L
75L
procedimiento para las dems muestra. Se

conect el equipo de electroforesis a 60 Volts
hasta que estas atravesaron el gel staking,
despus se subi el voltaje a 120 Volts y se
Se agit la solucin teniendo cuidado de que

no se formen burbujas y una vez polimerizado
el gel de corrido y habiendo retirado el alcohol
se procedi verter el gel staking en el espacio
de 2cm dejado con anterioridad entre las
placas, se coloc el peine para que se
formaran los poros y se aguard a que
polimerizara. En ese tiempo se procedi a
preparar las muestras que se utilizaran
calentndolas a ebullicin por dos minutos. Se
utiliz
hemoglobina,
albmina
dej correr por 2 horas.

Una vez pasadas las dos horas se procedi a
retirar el gel de las placas y se coloc en un
recipiente en el cual se aadi azul de
Coomasie para realizar la tincin, despus se
realiz
lavado
con
una
solucin
de
desteido, una vez que se hubo desteido se

procedi a realizar las mediciones de las
bandas.
bovina,
albmina de huevo y lisozima.

Una vez polimerizada el gel se verti varias
gotas de buffer carga (aprox. 4L), se mezcl
Resultados.
Frmula para calcular la movilidad relativa
MR= distancia que avanz la protena / distancia total del gel.
El tamao total del gel fue de 6 cm.
el

biomdica.
Tabla III. Clculos de la movilidad relativa y pesos de las muestras.

Muestra
Distancia de
Movilidad Relativa
Peso molecular
Logaritmo del
KDalton
peso molecular
14.4
45
66
64
4.15836
4.65321251
4.82205033
4.8061
la protena
Lisozima
Albmina de huevo
Albmina bovina
Problema
mm
55
13
6.5
50
0.9166
0.0216
0.108
.0833
(hemoglobina)
Movilidad reltiva VS Logaritmo del peso molecular de las muestras.

5
4.8
f(x) = - 0.66x + 4.77
4.6
Logaritmo del peso molecular de las muestras
4.4
4.2
4
3.8
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Movilidad reltaiva.
Grfica 1. Resultados de los clculos de movilidad relativa de todas las muestras sin incluir la
muestra problema.
Calculo de la muestra problema utilizando la ecuacin de la grfica.

biomdica.
Y=0.6599 X MR + 4.7747
Y=0.6599 X (.0833) +4.7747
Y= 4.82966
Aplicando antilogaritmo
4.82966
10
El peso molecular de la muetra problema es:
67.555 KDalton.
Discusin.
En
En esta prctica se utiliz como agente
presencia
de
algunos
compuestos
qumicos, las protenas pierden su estructura

nativa; tales compuestos, llamados agentes
desnaturalizante
al
SDS
el
cual
es un
detergente inico que posee carga negativa y

un fuerte carcter desnaturalizante. [5]
desnaturalizantes, producen el desplegamiento
Este tipo de electroforesis que se utiliz en
de la protena
algunas
esta prctica permite el clculo de parmetros
protenas hay puentes disulfuro entre los
moleculares, pues los complejos SDS-protena
residuos de Cys (para formar cistinas) de una
se separan estrictamente segn su tamao
misma
que queda. En
cadena
intracatenarios)
polipeptdica
(puentes
molecular.
de
cadenas
protenas
diferentes
El
SDS
interacciona
formando
con
complejos
las
de
(puentes intercatenarios) de algunas protenas
caractersticas comunes independientemente
con estructura cuaternaria. Estos puentes se
de las de cada protena. [6]
pueden romper mediante tratamiento con

determinados agentes reductores, como por
ejemplo, el
-mercaptoetanol
(-ME) o el ditiotreitol (DTT).
Las protenas unen una molcula de SDS por

cada dos aminocidos, lo que implica que las
cargas propias de las protenas quedan
enmascaradas
anuladas;
asimismo,
la
Otros agentes desnaturalizantes de protenas,
molcula de SDS proporciona una carga
son la urea y determinados detergentes. [5]
negativa, por lo que los complejos SDS-

biomdica.
protena estn cargados negativamente de
manera analtica el peso molecular de la
forma uniforme. [6]
muestras problema.
En esta prctica se deseaba conocer el peso
Bibliografa.
molecular de una muestra problema, en este

caso fue una conocida hemoglobina, la cual
tiene un peso molecular de 64 KDalton, dado
que en la movilidad de la misma fue de 50mm,
suponiendo que no se conoca de que protena
se trataba se realiz el clculo para obtener el
peso
molecular
utilizando
los
valores
graficados de los marcadores conocidos dando

este un valor bastante aproximado al peso
molecular de la hemoglobina por lo que se
1. Watson and Baker. (2008). Biologa

molecular
del
gen.
Buenos
Aires.
Editorial Panamericana.
2. Voet and Voet. (2006). Bioqumica.
Buenos Aires. Editorial Panamericana.
3. J. Urbina. (2003). Molculas de la vida.
Buenos Aires. Siglo XXI editores.
4. H. Lodish. (2006). Biologa celular y
molecular.
Montevideo,
Uruguay.
Editorial Mdica Panamericana

5. D. Freifelder. (2003). Tcnicas
de
puede afirmar que se realizaron las medicines
bioqumica y biologa celular. Espaa.
de manera correcta y que en efecto era
Editorial Revert
6. T. Brown. (2008). Genomas. Buenos
hemoglobina la muestra problema.
Aires: Medica Panamericana

Conclusin.
Se logr con xito conocer los principios de
funcionamiento de la tcnica de electroforesis,
adems se aprendi de manera satisfactoria el
cmo se elabora el gel de poliacridamida y se
observ a detalle cmo se realiza el proceso
de
electroforesis.
Tambin
se
realiz
satisfactoriamente la medicin y clculos de

movilidad relativa y se logr obtener de
7.

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Prctica # 3.

Electroforesis en geles de poliacridamida

diferente fuerza inica, pH y tamao de poro.

La electroforesis es una tcnica de separacin

gradiente de pH y se utiliza para sustancias

una velocidad determinada por su relacin

Los geles de poliacrilamida se forman por la

carga-masa. Por ejemplo si dos molculas

tienen masa y formas iguales, la de mayor

acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monmero

carga neta se desplazar ms rpido hacia un

peso de protenas y acidos nucleicos. Existen

poliacridamida y agarosa se utilizan para

electroforticas pueden variar; por ejemplo en

amotiguador de pH constante durante todo el

CH2 = CH- CO - NH - CH2 - NH - CO - CH =

La electroforesis se utiliza comnmente para

producen por radicales libres de oxgeno, por

Esta reaccin es fuertemente

inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo

fuerza inica, gradiente de

potencial, tiempo de corrida, concentraciones

Prctica # 3. Electroforesis en geles de poliacridamida

Conocer los principios y aplicaciones de la

En los laboratorios, el SDS se emplea

desnaturalizndolas, provocando que estas

Tabla I. reactivos para elaborar el gel de

molculas proteicas pierdan su conformacin

nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las

residuos aminocidos, correspondiendo a unos

El TEMED y el persulfato se agregaron al final.

protena es una de las causas de que la

Se prepar el gel Stacking con los siguientes

eliminndose de este modo las diferencias en

Reactivos para elaborar el gel

Prctica # 3. Electroforesis en geles de poliacridamida

con 15 L de las muestras y se procedi a

procedimiento para las dems muestra. Se

Se agit la solucin teniendo cuidado de que

dej correr por 2 horas.

desteido, una vez que se hubo desteido se

albmina de huevo y lisozima.

Prctica # 3. Electroforesis en geles de poliacridamida

Tabla III. Clculos de la movilidad relativa y pesos de las muestras.

Movilidad reltiva VS Logaritmo del peso molecular de las muestras.

Logaritmo del peso molecular de las muestras

Calculo de la muestra problema utilizando la ecuacin de la grfica.

Prctica # 3. Electroforesis en geles de poliacridamida

En esta prctica se utiliz como agente

qumicos, las protenas pierden su estructura

detergente inico que posee carga negativa y

desnaturalizantes, producen el desplegamiento

Este tipo de electroforesis que se utiliz en

esta prctica permite el clculo de parmetros

protenas hay puentes disulfuro entre los

moleculares, pues los complejos SDS-protena

residuos de Cys (para formar cistinas) de una

se separan estrictamente segn su tamao

(puentes intercatenarios) de algunas protenas

caractersticas comunes independientemente

con estructura cuaternaria. Estos puentes se

de las de cada protena. [6]

pueden romper mediante tratamiento con

(-ME) o el ditiotreitol (DTT).