UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

GUIA DE PRCTICAS
BIOQUIMICA
2012-1

INTRODUCCION

La Bioqumica es una de las ciencias modernas que mayor auge ha alcanzado en los
ltimos tiempos, es el arma ms poderosa con que se cuenta para interpretar el fenmeno
biolgico, con una profunda incidencia en numerosas reas incluyendo la medicina

Cada organismo, en realidad cada macromolcula, tiene propiedades nicas. Un

organismo vivo es la quinta esencia de un sistema sinrgico; esto es, el todo es ms que
la suma de sus partes. Sin embargo, como la complejidad de los fenmenos bioqumicos
imposibilita el anlisis de todo el sistema, la bioqumica ha intentado descubrir los
secretos de la funcin celular estudiando sus partes aisladamente. Por lo tanto, por
necesidad, la bioqumica ha sido siempre una ciencia deductiva

La presente gua de prctica comprende los aspectos bsicos necesarios y la

aplicacin experimental de los conceptos fundamentales.

DISPOSICIONES GENERALES

La presente Gua regula las prcticas de laboratorio en la sede para los

estudiantes de la EAPO

Los usuarios de laboratorio, debern seguir estrictamente, las reglas de

seguridad establecidas en el reglamento y aquellas que les recomiende el
profesor responsable

Pasados quince minutos de la iniciacin de la prctica no se permitir el

acceso de estudiantes al laboratorio.

Ninguna prctica se realizar sin la presencia del profesor.

Podrn ser retirados de la prctica los estudiantes que incumplan el

reglamento estudiantil

En ninguna circunstancia
laboratorio.

El estudiante no podr recibir

laboratorio durante la prctica.

ingiera alimentos

visitas

o tome bebidas

de otras

personas

en

el

ajenas

al

PRACTICA N1
BIOSEGURIDAD
OBJETIVO:
Proveer al alumno de conocimientos bsico sobre Bioseguridad que les permitan efectuar
una deteccin de los riesgos y prevencin de los mismos
FUNDAMENTO
La Bioseguridad es
la aplicacin del conocimiento, tcnicas y equipamiento para
prevenir la exposicin del personal, el laboratorio y el medio ambiente de agentes
potencialmente infecciosos.
Las Medidas de bioseguridad definen las condiciones
infecciosos se pueden manipular con seguridad.

bajo los cuales los agentes

El objetivo de las medidas de Bioseguridad es reducir la exposicin de las personas que

trabajan en el laboratorio.
La peligrosidad de un agente est directamente relacionada con el tipo de
microorganismo y la manipulacin a la que es sometido. Por ello es bsico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
2. Conocer la metodologa de trabajo del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Conocer las normas relacionadas con la seguridad biolgica.
Para que se produzca un accidente por agente biolgico deben concurrir bsicamente
cuatro elementos:
Un husped susceptible
Un agente infeccioso
Una concentracin suficiente de ste
Una ruta de transmisin apropiada.
De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisin.
Las rutas de transmisin ms comunes en el laboratorio son la area y la inoculacin
directa, muy por encima de todas las dems, aunque la oral, la percutnea y el contacto
directo con la piel o las mucosas tambin son posibles.
4

El Centro para la Prevencin y control de Enfermedades (CDC) estableci en 1995 el

concepto de Precauciones Estndar, definiendo a un conjunto de medidas que deben ser
utilizadas bajo el principio que todo paciente est potencialmente infectado y que todos
sus fluidos u objetos contaminados con stos que han sido utilizados en su atencin son
potencialmente infectantes, denominando a este concepto UNIVERSALIDAD. Por lo que
las medidas de Bioseguridad deben aplicarse SIEMPRE que se tenga contacto con
pacientes sin importan si tienen o no un diagnostico de enfermedad Infecciosas.
Estas son:
1.- Lavado de manos.
2.- Adecuada ventilacin e iluminacin natural de Ambientes.
3.- Uso de elementos de barrera segn los procedimientos: Uso de guantes,
mascarillas, mandiles, batas de proteccin, lentes protectores, etc
4.- Limpieza, desinfeccin, esterilizacin del instrumental y material mdico.
5.- Manejo y eliminacin de objetos afilados o punzantes.
6.- Manejo y eliminacin de desechos y de sus recipientes.
7.-Desinfeccin concurrente y limpieza terminal.
8.- Manejo de accidentes por contacto de sangre o secreciones.
9.- Manejo de accidentes en personal de salud.
10.- Aislamiento y / o flujos para la atencin de pacientes con Enfermedades
Infecciosas.

1.- LAVADO DE MANOS

Est demostrado que el lavado de manos es la mejor medida para prevenir la transmisin
de enfermedades no solo dentro del ambiente de trabajo de un laboratorio sino tambin
en la vida diaria.
Las superficies de las manos tienen pliegues, folculos pilosos, glndulas sebceas,
sudorparas, y uas que contienen microorganismos.
Hay flora residente de la piel que convive con nosotros, y flora transitoria, que se adquiere
tocando elementos o superficies y que luego las manos transportan. Es imposible
determinar cuantos virus, bacterias, hongos, y otros microorganismos tenemos en la piel
de las manos. Se calcula que las concentraciones de microorganismos resistentes crecen
en billones por mililitro en secreciones respiratorias o en la materia fecal en pocos das.
Por eso es necesario lavarlas continuamente antes y despus de cada procedimiento.
5

Tcnica del lavado de manos

Siempre retirar anillos y pulseras; las uas deben estar cortas y sin esmalte; las
mangas de la ropa o de los uniformes deben ser cortas.
Las manos deben lavarse con jabn comn o antisptico o con solucin alcohlica, si
no estn visiblemente sucias, en las siguientes ocasiones:
1. Antes de tocar al paciente
2. Despus del contacto con alguna fuente de microorganismos, aunque se hayan
utilizado guantes (Ej: fluidos corporales, piel no intacta, mucosas y objetos del
medio ambiente)
El lavado de manos antisptico est indicado sin discusin en las siguientes ocasiones:
1. Antes de realizar un procedimiento invasivo.
2. Cuando es importante reducir el nmero de flora residente, adems de la
transitoria.
Tcnica

Mojar la mano con agua corriente, si se utiliza jabn lquido.

Si el jabn es en barra, tomarlo con la mano seca.
Aplicar jabn y distribuirlo por toda la superficie de la mano luego con los dedos
entrelazados.
Frotar el dorso de la mano derecha con la izquierda y viceversa.
Frotar el primer dedo de ambas manos
Frotar las uas ambas manos en la palma opuesta.
Enjuagar profundamente.
Secar con papel toalla.
Serrar el cao con el papel toalla.
Descartar el papel toalla.

Tcnica de lavado seco

Aplicar una dosis de solucin alcohlica. (Isoproplico o etlico 60% - 70% con
emolientes) Distribuirla por toda la superficie de la mano y dedos aproximadamente
por 15 segundos. Friccionar hasta que la piel de las manos quede seca. La piel de las
manos no debe quedar mojada con alcohol; si es as, la asepsia no fue efectiva. En
lugares donde no hay fuentes o suministro de agua, las soluciones alcohlicas estn
indicadas y alcanzan una buena accin antisptica.

USO DE ELEMENTOS DE BARRERA

GUANTES
Los guantes deben cambiarse entre procedimientos sucios y limpios realizados en el
mismo paciente.

Cuando hay posibilidad de contacto con sangre y otros fluidos corporales.

Cuando tiene las manos lastimadas, con heridas o con eczemas.
Los guantes deben ser cambiados entre cada paciente.
Los guantes NUNCA deben ser lavados y rehusados en otros pacientes, ni con el
mismo paciente.
Con los guantes puestos no se deben tocar superficies del ambiente antes o
despus de tocar al paciente.
Los guantes deben protegerlo de los fluidos corporales.
Siempre lave sus manos despus de usar guantes, an si estos permanecen
intactos y sus manos no se mancharon con fluidos corporales; las bacterias de la
piel se desarrollan con facilidad en el calor y la humedad.
Algunos estudios han indicado que los microorganismos no siempre se remueven
del guante a pesar del lavado, friccin con antisptico y secado. Adems, el lavado
del guante disminuye la integridad del mismo.

MANDILONES

Los mandilones se utilizan para proveer una barrera efectiva de proteccin y

reducir las oportunidades de transmisin de microorganismos por la sangre o
fluidos corporales.
Es importante que el mandiln sea de material resistente a los lquidos, sobre todo
en las mangas y pecheras.
Se debe utilizar siempre que se este realizando procedimientos invasivos como la
toma de muestra sangunea. Se tendr en cuenta retirarlo antes de salir del rea
de trabajo y lavar las manos con soluciones antispticas inmediatamente.

LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

Se refiere principalmente a las tcnicas, procedimientos y sustancias que se

emplean para esterilizar Instrumental mdico que se va a utilizar para diagnostico
o procedimientos invasivos en pacientes.

En los procedimientos rutinarios de Laboratorio, no se debe reutilizar materiales,

todo debe realizarse en material descartable, ya que NO existen tcnicas
estandarizadas para reutilizar lminas, recipientes de muestras, tubos para toma
de muestras sanguneas, etc.

Para el proceso de muestras microbiolgicas, como tubos y placas, se tendr que

seguir procedimientos que se desarrollaran ms adelante.

Definiciones

Desinfectante. Sustancia qumica que destruye los microorganismos y que se

aplica sobre material inerte sin alterarlo de forma sensible
Antisptico. Sustancia qumica de aplicacin tpica sobre tejidos vivos (piel intacta,
mucosas, heridas, etc.), que destruye o inhibe los microorganismos sin afectar
sensiblemente a los tejidos donde se aplica
Limpieza. Empleo de un procedimiento fisicoqumico encaminado a arrastrar
cualquier material ajeno al objeto que se pretende limpiar.
Desinfeccin de bajo nivel. Empleo de un procedimiento qumico con el que se
pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, algunos
virus y hongos, pero no el Mycobacterium tuberculosis ni las esporas bacterianas.
Desinfeccin de nivel intermedio. Empleo de un procedimiento qumico con el que
se consigue inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, el complejo
Mycobacterium tuberculosis, as como la mayora de los virus y hongos, pero que
no asegura necesariamente la destruccin de esporas bacterianas.
Desinfeccin de alto nivel. Empleo de un procedimiento qumico con el que se
consigue destruir todos los microorganismos, excepto algunas esporas
bacterianas.
Esterilizacin. Empleo de un procedimiento fisicoqumico dirigido a destruir toda la
flora microbiana, incluidas las esporas bacterianas, altamente resistentes.
Dentro de los agentes qumicos se diferencia entre antispticos, que son los
germicidas de baja toxicidad y que por lo tanto se pueden emplear sobre la piel y
otros tipos de tejidos; y los desinfectantes, entendidos como germicidas de mayor
toxicidad y que se emplean sobre los objetos, ambiente y superficies inanimadas.
Dependiendo del nivel de bioseguridad del Laboratorio se utilizaran diferentes
mtodos de esterilizacin.
Manejo de material de vidrio Reciclable

CUESTIONARIO
1.- Cuales son los principios de bioseguridad?
2.- Explique la eliminacin de desechos?
3.- Esquematice el lavado de manos

PRACTICA N2
MATERIALES DE LABORATORIO
OBJETIVO

Demostrar y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en

un laboratorio.

Aprender el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un

laboratorio.
FUNDAMENTO
Para realizar con xito las practicas programadas para el curso, se requiere de
diferentes materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. As mismo
el uso de equipos e instrumentos como potencimetro, balanza, espectrofotmetro y
otros. Estos materiales y equipo tienen condiciones bsicas para su uso como el estar
calibrados, limpios y que sea el material correcto segn nuestras necesidades.
PIPETAS:
Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volmenes de lquidos.
Primero deber identificar si es una pipeta terminal (graduacin llega a la punta) o no
terminal (graduacin finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puede
medir con la pipeta (capacidad de la pipeta).
Modo de uso: Introduzca la pipeta en el lquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar
con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere,
tapar la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente su
dedo y deje salir el lquido hasta que logre enrazar el lquido (nivel deseado).
El profesor le ensear el correcto uso de las pipetas.
MICROPIPETAS:
Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volmenes muy pequeos en el
rango de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volmenes
(regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que es
especfico segn la capacidad de la micropipeta.
Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajstelo, regule el volumen a medir girando
el mando del mbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta,
presione suavemente e introduzca el tip al lquido a medir, suelte suavemente el mbolo y
observe que el lquido llene el tip, para depositar el contenido presione el mbolo
completamente y el lquido ser expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione el
mando expulsor. RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRA
BIOLOGICA EL TIP DEBE SER ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMO
LA LEJIA O SIMILAR.
9

El profesor le ensear el correcto uso de las micropipetas y dems materiales y equipos

de laboratorio.
Cuestionario
1.
Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa las
caractersticas de este material.
2.
Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones.
3.
El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la forma
correcta para el lavado de materiales de vidrio.
4.
Describa cada uno de los materiales mostrados durante la prctica y explique su
uso.

10

PRACTICA N3
pH

FUNDAMENTO
El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo
defini como el logaritmo negativo de la concentracin de iones de hidrgeno es decir:
pH = - log (H)

= [H + ] = 10 pH

= - log ( 1 )

H
Donde la concentracin del hidrogenin es dada en unidades moles.
La determinacin del pH es uno de los procedimientos analticos ms importantes y ms
utilizados en bioqumica puesto que esta medida determina caractersticas notables de la
estructura y la actividad de las macromolculas biolgicas, por consiguiente, la conducta
de las clulas y de los organismos.
CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION:
Procedimiento.Consiste en calcular la concentracin de iones hidrgeno [H+]
Calcular el logaritmo de base 10 de [H+]
El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1)
Soluciones Buffer, tampn o amortiguadores :
Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES
DEBILES y sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que
el cambio de este no sea el ms mnimo.
APLICACIONES:
En organismos vivientes, por ejemplo:
Para conocer las alteraciones producidas en la composicin qumica de la sangre.
Para conocer las alteraciones del pH de otros lquidos biolgicos: saliva, lagrimas, sudor,
lquido cefalorraqudeo, etc.
En ciertos fenmenos fisiolgicos: respiracin, aplicacin de enzimas (catalizadores), etc.
En qumica:
Para determinar el pH de una solucin.
Para determinar el punto final de una titulacin
Demostracin: reacciones qumicas con liberacin o consumo de iones H +.
Otros
11

Competencias
Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la accin de los sistemas buffer.
Utiliza las tcnicas para medir el pH.
METODOS DE DETERMINACION DEL pH:
Existen varios procedimientos:
Mediante indicadores
Mediante cintas o papel de pH universal
Mediante el potencimetro o pHmetro
DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:
Indicadores.-Son soluciones o cuerpos qumicos que se agregan a los lquidos para
dosar, con el fin de ver el momento preciso del trmino de la reaccin; manifestndose
por la aparicin, desaparicin o modificacin del color. Estas sustancias qumicas
pertenecen al grupo de los cidos y bases dbiles. Segn Glaser, se clasifican en tres
grupos:
1ero: Para valorar bases dbiles con cidos fuertes. Ejemplo: anaranjado de metilo, rojo
de congo, etc.
2do: Para valorar bases y cidos fuertes. Ejemplo : Tornasol, paranitrofenol, etc.
3ero: Para valorar cidos dbiles con bases fuertes. Ejemplo: fenolftaleina, etc.
Aplicacin:
1) En determinar el pH de una solucin deseada.
2) En determinar el punto final de una titulacin (volumtrica)
3) En determinar reacciones qumicas con liberacin o consumo de H
Comprende:
Eleccin de un indicador para una titulacin, para lo que se debe tener en cuenta
conceptos bsicos sobre disociacin de sales, la que est sujeta a una constante (pK) y a
una variacin de colores dependiente a su mayor o menor disociacin de pK; el pK se
emplea y se define como el log (1/Ka) el log Ka para definir la fuerza de un cido o de
una base.

Un cido cuya constante de ionizacin sea

10 4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es log Kb, para cualquier constante de
equilibrio Kb. (Ka constante de ionizacin de un cido; Kb, constante de ionizacin de una
base).
Determinacin del pH mediante el uso del papel indicador :
El papel Indicador:
Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que al
ponerse en contacto con la solucin a evaluar da un color que corresponde al pH
aproximado de la solucin problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles
12

indicadores, por ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH YDRIEN papel
(pH del 10 a 14)
Podemos observar la siguiente tabla de indicadores:

TABLA DE INDICADORES :

INDICADOR

Pk

LIMITES

COLOR

Azul de timol

1.50

0.5 2.8

rojo amarillo

Azul de bromofenol

3.98

3.0 5.0

amarillo azul

Verde de bromofenol

4.68

3.7 5.7

amarillo - azul

Anaranjado de metilo

4.00

3.5 4.5

anaranjadoamarillo

Rojo de clorofenol

5.98

5.0 7.0

amarillo rojo

Prpura de bromocresol

6.30

5.3 7.3

amarillo prpura

Azul de bromotimol

7.00

6.0 8.0

amarillo azul

Rojo de fenol

7.90

6.9 8.9

amarillo rojo

Fenolftalena

9.20

8.2 10.2

incoloro rojo

Rojo de metilo

5.10

4.4 - 6.0

rojo amarillo

DETERMINACIN DE pH MEDIANTE EL POTENCIMETRO O pHMETRO:

Fundamento.-

Se fundamenta en la generacin de una diferencia de potencial que se establece cuando

se emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentracin en las cuales se hace
pasar una corriente elctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a la
diferencia de concentracin(es) entre las soluciones.

Partes que lo constituyen.-

1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeo bulbo de vidrio soldado a un vstago de vidrio de

borosilicato (pirex) dentro de l existe una solucin de KCl 0.1N en la que est sumergido
un electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell,
13

quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermtico constituido por un dielctrico
de cera o plstico y un casco de metal o plstico.
2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell
3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo.
PARTE OPERATIVA:
La calibracin consiste en darle informacin al equipo mediante el uso de estndares de
pH, o sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado.
Pasos previos: Verificar la instalacin correcta del equipo, su conexin con la corriente
general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con
agua destilada y secando los electrodos con papel filtro.
Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio.
La aplicacin se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secndolos
con papel absorbente y sumergindolos en la solucin problema, obtenindose su pH que
se leer en el lector en una escala de 0 a 14.
Actualmente se usan pHmetros porttiles, que funcionan con bateras o con una corriente
alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros.
DESCRIPCION:
1. Determinacin del pH:
El alumno deber medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor
(leche, gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los mtodos descritos en la
prctica.
2. Titulacin Acido-Base:
2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un cido:
Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidrxido de sodio) 0.1N y tres gotas de
fenolftalena
Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (cido sulfrico) 0.1N
Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gast en la titulacin (gasto)
2.2.-Titular un cido (H2SO4 0,1 N) con una base:
Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gast en la titulacin (gasto)

14

3. Cambios de pH en un sistema Buffer:

3.1. El agua como buffer
Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hasta
que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gast en la titulacin.
3.2. Un cido dbil y su respectiva sal en diferentes proporciones:
Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de cido actico 0.1N, 0,5mL de
acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta
que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gast en la titulacin.
3.3. Un cido dbil y su respectiva sal en iguales proporciones:
Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de cido actico 0.1N, 1,0mL de
acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta
que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gast en la titulacin.

Cuestionario
1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, lquido seminal, lquido cefalorraqudeo,
lquido amnitico, saliva y su correlacin con alguna patologa.
2.-Principales sistemas buffer orgnicos.

15

PRCTICA N 04
ESPECTROFOTOMETRA
OBJETIVO
El alumno comprende los fundamentos de la espectrofotometra, adquiere habilidades y
destrezas en el manejo del espectrofotmetro, instrumento auxiliar y de apoyo en la
determinacin de los anlisis bioqumicos, valora la importancia de esta metodologa en la
prevencin y mantenimiento de una salud ptima.
FUNDAMENTO
Una de las propiedades de las molculas es que pueden absorber energa luminosa y
almacenarla en forma de energa interna. Esto se puede apreciar con se inicio de ciclos
vitales de muchos organismos, como es evidente el de la fotosntesis en plantas y
bacterias. La Mecnica Cuntica nos explica que la luz est compuesta de fotones cada
uno de los cules tiene una energa:
Efotn = h. = h.c/ ,
Donde c es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y h= 6.6 1034 Js es la constante de Planck. As si decimos que una sustancia qumica absorbe luz
de longitud de onda , significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones de
esa longitud de onda.
En esta prctica estudiaremos la absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325-420
nm) y en el visible (420-700 nm). Cuando una molcula absorbe un fotn en este
intervalo espectral, se excita pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a
un orbital excitado de energa superior. De est manera la molcula almacena la energa
del fotn, y lo hace en sus enlaces:
A + h. A*
E(A*) = E(A) + Efotn 11
Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de la
molcula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energa del fotn.
Es decir, una molcula slo puede absorber fotones cuya energa h. sea igual a la
energa de un estado molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados
excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrnica y que la
distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es
decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea
de identidad de cada sustancia o molcula.
En este sentido la Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms
utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin,
sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsicoqumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos.
Se denomina fotocolormetra al mtodo ptico de absorcin que nos permite cuantificar
sustancias y esta basada en la medicin de la intensidad de la luz monocromtica
16

(seleccionada segn la longitud de luz deseada), trasmitida a travs de una solucin

coloreada, ya sea que se trate de sustancia naturalmente coloreadas o que se han hecho
de tal clida mediante reacciones qumicas adecuada.
La mayora de los cuerpos en solucin tiene una capacidad de absorcin selectiva sobre
determinadas radiaciones luminosas, cuando sta absorcin se realiza en la zona
espectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las
radiaciones que no han sido absorbidas.
Cuando un haz de luz (Luz Incidente, I0) atraviesa una solucin, una parte de la radiacin
queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una reduccin de su
intensidad (Luz Transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorcin de dichas
molculas, otra parte de la radiacin se pierde por fenmenos fsicos como reflexin,
refraccin y difraccin de la luz.

La longitud de onda en la que las molculas de dichas sustancias absorbe con mayor
intensidad la luz, se denomina longitud de Mxima Absorcin o Lambda Mximo.
Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada de luz, la intensidad de la
luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el nmero de molcula que se
interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este nmero vara de acuerdo con
la concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos
factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rigen los principios de
la Colorimetra y cuyas formas de expresin son:
Log (lo / lt) = l c = A = D.O.

Donde:
Io = Intensidad de la Luz Incidente
lt = Intensidad de la Luz transmitida.
= Coeficiente de Extincin Molar. Valor constante dependiendo de la naturaleza de la
sustancia y de la longitud de onda.
l = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentracin de la solucin.
A = D.O. = Absorbancia = Densidad ptica = Extincin.
La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la tramitancia (T) y la relacin entre
ambas es logartmica.
CUESTIONARIO
1.- En que consiste la espectrofotometra?
2.- Cul es el significado de la luz en esta metodologa?
3.- Que factores alteran la ley de Lambert- Beer?
4.- Tiene alguna utilidad la espectrofotometra?.

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PRCTICA N 05:
DETERMINACION DE GLUCOSA
OBJETIVO
El alumno identifica los carbohidratos, determina, explica e interpreta a travs de mtodos
experimentales las propiedades los fundamentos en la comprobacin de carbohidratos,
valora la importancia de estas sustancias orgnicas, que forman parte de nuestras
estructuras, que nos proporciona la energa para nuestra subsistencia
FUNDAMENTO
Los hidratos de carbono, compuestos por carbono, hidrgeno y oxgeno, representan la
principal fuente de energa celular y son tambin constituyentes estructurales importantes
de las paredes celulares y de sustancias intercelulares. Los compuestos de carbono se
clasifican de acuerdo con el nmero de monmeros que contienen
En estos compuestos el carbono, hidrogeno y oxigeno se encuentran en proporcin de 2 a
1, los carbohidratos comprenden desde azucares simples con peso molecular bajo, como
la glucosa y la fructosa, hasta molculas grandes de peso molecular alto, como el almidn
y la celulosa.
Una prueba general para el reconocimiento de carbohidratos es la de Molish, en ella el
cido sulfrico con las pentosas y las hexosas en caliente dan furfural o 55-hidroximetil
furfural. Estos furfurales con el naftol se condensan formando cromgenos, que con el
cido sulfrico dan compuestos quinoides. Otras pruebas como la de Benedict da una
estimulacin semicuantitativa de la cantidad del azcar reductor existente y la prueba de
lugol indicara la presencia de almidn, glucgeno o de un monosacrido o disacrido.
MATERIALES Y REACTIVOS
Solucin de glucosa al 1 %
Solucin de almidn al 1 %
Jugo de naranja
Reactivo de Molish
Reactivo de Benedict
cido clorhdrico concentrado
Hidrxido de sodio al 10%
Lugol
5 tubos de ensayo
Gradillas
Pinzas de madera
PROCEDIMIENTO
Reaccin de Molish
En un tubo de ensayo se toman 2 ml. De la sustancia problema, se agrega 2 gotas del
reactivo de Molish recin preparado y se mezcla bien. Se inclina el tubo y se aade
cuidadosamente por las paredes aproximadamente 2 ml de cido sulfrico concentrado.
La formacin de un anillo violeta en la interfase indicara resultado positivo.
Con la Solucin de Benedit
En un tubo de ensayo se toman 0.5 ml. De la solucin de Benedict, luego se aade 1 ml
de la solucin problema y e calienta a ebullicin durante dos min. Luego se deja enfriar.
18

La formacin de un precipitado verde amarillo o rojo ladrillo indicara la presencia de un

azcar reductor, segn se encuentre en mayor o menor cantidad.
Prueba de Reconociendo del Almidn.
En un tubo limpio y seco se coloca 3 ml. De una solucin de almidn al 1%, se aade 5
gotas de cido clorhdrico concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se lleva al calor
hasta que hierva durante dos minutos anotar los resultados.
Luego se toma una alcuota (3 gotas) y se mezcla con una gota de solucin de lugol.
Anotar el resultado.
Se vierte en un tubo 3 gotas de la muestra problema, se aade 4 ml. De agual destilada y
dos gotas de solucin de lugol. Observar la coloracin azul violeta. Anotar.
El tubo de la muestra problema con cido clorhdrico se contina con la ebullicin durante
dos minutos o ms repetir la prueba con la solucin de lugol. Observa una coloracin rojo
parado. Anotar.
Continuar la ebullicin por 2 o 3 minutos y repetir la prueba con solucin de lugol por 2 a 3
veces ms. Anotar. Al final la reaccin negativa (color del reactivo) debido a que el
producto final de la hidrlisis del almidn es la glucosa.
El hidrolizado se neutraliza con solucin de NaOH al 10% y se realiza la prueba de
Benedict.
CUESTIONARIO
1.- Cual es el producto final de la digestin del almidn por la amilasa salival?
2.- Como se demuestra que el almidn sufri la accin de la amilasa salival en la
experiencia realizada
3.- Cual es el fundamento del reconocimiento de los azcares monosacridos en la
reaccin con el benedict?
4.- Cul es el fundamento de la reaccin de los almidones con el lugol?

19

PRACTICA N 6
DETERMINACION DE PROTEINAS
OBJETIVOS
- Introducir en la determinacin de la concentracin de protenas en plasma sanguneo.
- Entender y practicar los principios de la espectrofotometria.
- Aprender a manejar pipetas automticas
FUNDAMENTO
La sangre est formada por una solucin acuosa que contiene molculas de tamao
variable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre se
encuentran en suspensin en una solucin acuosa denominada plasma. Aunque el
plasma es el medio natural de las clulas sanguneas, la mayora de las determinaciones
qumicas se hacen en suero. Las protenas del plasma pueden clasificarse en dos
grupos: las que son sintetizadas por el hgado (albmina) y las inmunoglobulinas
(producidas por las clulas plasmticas de la mdula sea). El plasma humano tiene una
concentracin en protenas de 60-80 g/L (frecuentemente se expresa en g/dL; 6-8 g/dl).
Casi la mitad de esta protena plasmtica es albmina, cuyo rango de concentracin es
35-45 g/L. Es una protena de 62.000 D que acta como protena de reserva, adems de
importante transportador (cidos grasos, bilirrubina y frmacos) y regulador osmtico.
Es producida por el hgado. Su concentracin aumenta en casos de deshidratacin y
disminuye en casos de ascitis/edema, y dao heptico severo.
La determinacin de la concentracin de protenas en sangre puede ser llevada a cabo
por diferentes mtodos. En esta prctica vamos a utilizar dos de los mtodos que se
utilizan con mas frecuencia: Biuret y Bradford. Los dos mtodos tienen en comn que la
disolucin de protena se mezcla con algn reactivo que determina que aparezca o se
intensifique un color (azul) que se cuantifica midiendo la absorbancia a una determinada
longitud de onda frente a un blanco de reactivo. El color generado es poco estable y
depende de las condiciones de reaccin, por lo que hay que realizar una curva patrn
con soluciones de una protena de concentracin conocida (albmina bovina).
La base terica de la aplicacin de la espectrofotometria para medir la concentracin de
una sustancia en solucin y las instrucciones para el uso del Espectrofotmetro
Materiales
-Soluciones de suero sanguneo A y B de concentracin desconocida.
-Soluciones de protena patrn (albmina de suero bovina) de concentraciones conocidas
-Reactivo de Bradford
-Reactivo de Biuret
-Pipetas
-Tubos
-Agitadores
-Rotulador
-Espectrofotmetros (Colormetros)
Determinacin por el mtodo de Biuret
La concentracin de protenas se medir utilizando el mtodo del Biuret, que se basa en
la formacin de un compuesto coloreado o cromforo, de color azul-prpura, debido a la
20

formacin de un complejo entre el in cobre y los enlaces peptdicos a pH alcalino. Se

requiere un mnimo de dos enlaces peptdicos para la formacin del complejo coloreado,
que se mide a 550 nm. Es un mtodo poco sensible pero muy preciso, ya que la
abundancia de grupos peptdicos (por unidad de masa de protena) es prcticamente la
misma en cualquier protena.
Mtodo
1) Numerar 7 tubos
2)
Aadir al tubo 1 100 l de agua destilada (tubo blanco)
" " 2 100 l de solucin de protena 20 g/L
"" 3 "
l " " " "
40 g/L
"" 4 "
l " " " "
60 g/L
5 "
l " " " "
80 g/L
"" 6 "
l " " " "
problema A
"" 7 "
l " " " "
problema B
3) Aadir 4 ml de reactivo de Biuret a todos los tubos.
4) Mezclar el contenido de cada tubo.
4) Esperar 5 min. para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia a 550 nm
ajustando a cero con el tubo 1 (blanco).
Resultados
- En una hoja de papel milimetrado construir una grfica de A550 (eje y) frente a
concentracin de protena (eje x) de las soluciones patrn (tubos 2-5). Marcar el eje de
las x en g/l de protena.
- Determinar la concentracin de las soluciones problema A y B interpolando en la grfica
patrn los valores de las soluciones problema A y B. Expresarlo en g/L

21

PRACTICA N7
DETERMINACIN DE COLESTEROL
OBJETIVO
Reconocer la estructura del colesterol, determina experimentalmente en suero los valores
de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicridos, para lo que se utilizarn kits
comerciales, valora la importancia del conocimiento de la determinacin del colesterol
FUNDAMENTO
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura
Ciclopentanofenantreno. Aunque se le considera un lpido, no sirve, como fuente de
energa para el metabolismo, el organismo no puede degradar el anillo de colesterol.
Las Lipoprotenas LDL transportan de 65 al 75 % del colesterol plasmtico. La
hipercolesterolemia esta casi siempre asociada con la elevacin del colesterol LDL (tipo
IIa). Es muy raro que la elevacin este asociada con incremento en el colesterol HDL. Las
elevaciones del colesterol LDL pueden ser el resultado de alteraciones monognicas,
alteraciones polignicas o secundario a otras
enfermedades. Ejemplos:
hiprcolesterolemia familiar, defecto familiar de Apo B100, hipercolesterolemia polignica,
cncer de cabeza de pncreas, diabetes, hipotiroidismo, sndrome nefrtico, etc.
El colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y tambin se sintetiza en el hgado y
otros tejidos. El colesterol se excreta a la bilis como tal o tras su transformacin en sales
biliares primarias y secundarias.
Las concentraciones elevadas de colesterol LDL se asocian con un riesgo
progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.
Las concentraciones sricas de colesterol disminuyen (hipocolesterolemia) en:
desnutricin,
esteatorrea idioptica, hepatitis, hipertiroidismo, infecciones agudas,
anemia, cncer, malabsorcin y anorexia nerviosa.
El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico
ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.
Para las pruebas de perfil lipdico el paciente debe estar en ayuno total excepto agua,
durante un lapso de 12 a 24 horas antes de la prueba. No debe haber realizado ejercicio
vigoroso y bajo la dieta corriente el da anterior de la prueba.
FUNDAMENTO DEL MTODO (COLESTEROL OXIDASA/PEROXIDASA)
Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan, segn las
reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica
por espectrofotometra.

22

COMPOSICIN
A. Reactivo. Pipes 35 mmol/L, colato sdico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol
esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL,
aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.
S. Patrn de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L). Patrn primario acuoso.
MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar.
El colesterol en suero o plasma es estable 7 das a 2 - 8 C. Pueden utilizarse como
anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar a temperatura ambiente el reactivo.
2. Pipetear en tubos de ensayo:

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25 C) o
durante 5 minutos a 37 C.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color
es estable durante al menos 2 horas.
CLCULOS
La concentracin de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula
general:

CUESTIONARIO
1.- Qu es el colesterol y cules son sus funciones?
2.- Cul es la importancia clnica de la determinacin de colesterol?
3.- A qu se refiere cuando se habla del colesterol bueno y el colesterol malo? Explica.
4.- Por que es recomendable consumir mejor grasas de origen vegetal a la animal?
Explica:
5.- Qu es la arteriosclerosis? Quin tiene riesgos de padecerla? Por qu?
6.- Qu otros estudios deben realizarse adems del colesterol para determinar el riesgo
de enfermedades cerebro-vasculares y cmo calculamos el ndice aterognico?

23

PRACTICA N 8
ACTIVIDAD ENZIMATICA
OBJETIVO

Comprueba la accin de los factores que regulan la actividad enzimtica

Demuestra como la actividad enzimtica puede ser expresada.

FUNDAMENTO
Las Enzimas son protenas que intervienen en las reacciones qumico-biolgicas
acelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio.
Los substratos son las molculas sobre las que actan las enzimas.
En una reaccin bioqumica catalizada por una enzima, a medida que progresa la
reaccin, aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los
correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentracin de la enzima.
La Actividad Enzimtica se puede expresar como:
E + S

a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO.

E + P

b.- La APARICION del PRODUCTO

c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES

Factores que Modifican la Actividad Enzimtica

Son diversos:
1.- pH del medio
2.- Temperatura
3.- Concentracin de Enzima
4.- Concentracin de Substrato
5.- Accin de Inhibidores y Activadores

24

Donde:

= Enzima

= Substrato

= Producto

= Cofactor antes de la reaccin

= Cofactor despus de la reaccin

10.3

Materiales y equipos

Tubos 17x150mm

Pipeta 1mL

Indicador de pH 1-14

Solucin salina Fisiolgica

Potencimetro

Pipeta 5mL

Estandar de pH 4

Albmina de huevo en SSF

Bao mara

Pipeta 10mL

Estandar de pH 7

Pepsina en SSF

Hielo

Bagueta

Estandar de pH 10

Agua destilada

Beacker 500mL

Gradillas

Portacubetas

NaCO3 10%

Espectrofotmetro

HCl 1N

Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA.

La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de protenas convirtindolas
en cadenas pequeas.
La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrar por desaparicin del substrato, o sea la
disminucin de la turbidez de una solucin de Albmina de huevo sobre la cual actuar la
enzima. La turbidez se leer en el ESPECTROFOTOMETRO.
Procedimiento
Experiencia N1 EFECTO DEL PH
Principios Tericos.- Si acta una enzima sobre un

Efectos del pH sobre la Actividad Enzimtica.

substrato en cantidades equimoleculares (iguales)

variando el pH del medio de reaccin, se observar

A E

que existe una regin o punto de actividad ptima,

c n 1

correspondiendo al pH, al cual se denomina pH

OPTIMO, que vara con la pureza de la enzima, el
tipo de sustancia sobre el cual acta, las sales del
medio, etc. Ello debido a la interaccin ES (Enzima

t z
i i
v m

Substrato) que se realiza, en gran parte, a travs de

los grupos ionizados existentes en sus molculas. La

d t

concentracin de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-)

a i

presentes en el medio, alteran los grupos ionizados

d c

e impiden la asociacin de las molculas.

pH ptimo

Procedimiento Experimental:

Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente:

25

BAJO

pH

ALTO

Tubo N

H2O dest. (mL)

---

1,5

1,5

---

---

HCl 1N (mL)

2,0

0,5

---

---

---

Na2CO3 10%(mL)

---

---

---

0,5

2,0

---

Albmina (mL)

---

Pepsina

---

---

---

---

---

20

1.0

6.0

10

11.0

---

(mL)

pH del tubo

Incubar por 5 min los 6 tubos en Bao mara a 37C.

Aadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien.
Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en bao mara a 37C.
Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotmetro a una longitud de onda de
440nm, usando un blanco de agua destilada.
La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubacin, de no ser as, mantener los
tubos en agua helada hasta el momento de la lectura.
CALCULOS: Para obtener la actividad enzimtica se debe restar la mayor absorbancia
obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papel
milimetrado, colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimtica en las ordenadas.
RESULTADOS: Encontrar el pH ptimo de accin la PEPSINA sobre la ALBUMINA

Experiencia N2 EFECTO DE LA TEMPERATURA

Principios Tericos.- La temperatura acelera la

Efectos de la Temperatura sobre la Actividad

Enzimtica.

Velocidad de las reacciones al aumentar las colisiones

A E

efectivas entre los elementos reaccionantes.

c n 1

En una reaccin enzimtica tambin deben colisionar

E-S (Enzima-Sustrato) para que la reaccin progrese,

t z

Por tanto, las reacciones enzimticas sern ms rpidas a

i i

mayores temperaturas, sin embargo y dada la

v m

naturaleza proteica de las enzimas, la temperatura no

puede aumentarse indefinidamente, pues comenzarn a

Temperatura ptima

d t

romperse los puentes de hidrgeno, alterndose las

estructuras secundarias, situacin que se conoce como

a i
d c

26

a
0

DESNATURALIZACION (Ver esquema).

Procedimiento Experimental:
1 Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente:
Reactivo / Tubo N

CONTROL
H2O dest. (mL)

3,0

3,5

3,5

3,5

3,5

---

HCl 1N (mL)

---

0,5

0,5

0,5

0,5

---

Albmina (mL)

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

---

Pepsina

---

---

---

---

---

11

(mL)

Incubar por 5 min a 37C en bao mara

Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 e
inmediatamente incubar por 5min segn el esquema siguiente:
Tubo

Temperatura C

0 (hielo)

25(Ambiente)

37

100
(ebullicin)

Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la
reaccin, hasta el momento de su lectura.
Leer al espectrofotmetro
destilada.

los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con agua

CALCULOS: La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura de cada tubo

(1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un
papel milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimtica en
las ordenadas.
RESULTADOS: Encontrar la T ptima de accin la PEPSINA sobre la ALBUMINA

27

Cuestionario
1.- Explique el mecanismo de accin de la las enzimas
2.- Con los datos de la prctica elabore las grficas de pH vs Actividad y T vs Actividad, y
explique en funcin a la bibliografa recomendada.
3.- A que llamamos especificidad por el sustrato?
4.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnstico clnico, de ejemplos

28

PRCTICA N 9
DETERMINACIN DE UREA
OBJETIVO
el alumno tendr la capacidad para cuantificar urea en muestras biolgicas humanas
como la orina o la sangre.
INTRODUCIN
Cuando los aminocidos de la dieta exceden los requerimientos para la sntesis proteica
y otra va anablicas, el exceso es catabolizado para producir ATP o es convertido a
substratos para la sntesis de cidos grasos.
Es importante tomar encuentra que slo los esqueletos de carbono de los aminocidos y
no los grupos amino pueden ser usados en el proceso antes mencionado.
La eliminacin del nitrgeno de los aminocidos es una parte importante en el
catabolismo de los aminocidos, es txico para el cerebro en forma de amonio, por lo que
el organismo humano lo debe de eliminar en forma de urea, compuesto no txico soluble
en agua cuya nica funcin en el metabolismo es la excrecin de nitrgeno.
La urea puede determinarse en el hombre en muestras como: la sangre o la orina, por
diferentes mtodos los ms usados son los mtodos enzimticos.
MATERIAL Y REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Suspensin de ureasa.-Ureasa 3.5 Ku/L.

Solucin patrn de urea.-Urea 40 mg/dL=6.66mmol/l
Reactivo de fenol.- 150 mmol/L nitroprusiato de sodio 0.47mmol/ L
Solucin de hipoclorito.- hipoclorito de sodio 13mmol/L; NaOH 130mmol/L.
Tubos de ensayo
Espectrofotmetro
Suero humano fresco (PROBLEMA)

TCNICA
Prepare la siguiente serie de tubos:
REACTIVO

TUBO
PROBLEMA
PATRN
BLANCO
UREASA (mL)
0.2
0.2
0.2
UREA (mL)
0.0
0.02
0.0
PROBLEMA (mL)
0.02
0.0
0.0
Mezclar y dejar en reposo por 30 min. a temperatura ambiente
FENOL (mL)
5.0
5.0
5.0
HIPOCLORITO DE SODIO 5.0
5.0
5.0
(mL)
Mezclar y dejar reposar por 30 min. a temperatura ambiente
Medir en el espectrofotmetro a 620 nm
29

DETRMINACIN DE LA CONCENTRACIN

C = D.O. X 6.66/D.O P.
C = concentracin en mmol/L
D.O.= Densidad ptica del problema
D.O.P.= Densidad ptica del patrn
CUESTIONARIO

30

PRACTICA N 10
DETERMINACION DE ACIDO URICO
OBJETIVOS

Determinar la concentracin de cido rico en suero

Relacionar la importancia de los niveles elevados con un trastorno metablico

FUNDAMENTO
Los nucletidos de una clula se estan renovando continuamente. Los
degradan por hidrlisis a nuclesidos, por medio de las

nucleotidos se

nucleotidasas. Las nuclesidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforoltica de los

nuclesidos para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de
una base nitrogenada de tipo purnica
A pH fisiolgico, el cido rico pierde un protn dando lugar a urato. En los seres
humanos, el urato es el producto final de la degradacin de las purinas y se excreta en
la orina. Niveles elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en la
que las sales de urato forman cristales que deterioran las articulaciones y los riones.
En algunos casos se utiliza el alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar la
gota.
Tambin existen otros desrdenes que transcurren acompaados de hiperuricemia,
tales como leucemia, policitemia, mieloma mltiple, intoxicacin plmbica, incluyendo
alteraciones medicamentosas en los tratamientos con citostticos o con tiazidas.
Mientras que otros medicamentos (drogas uricosricas tales como salicilatos y la
fenilbutazona) aumentan la excrecin del cido rico, disminuyendo los niveles sricos
del mismo
Materiales y equipos
Micropipeta 10 a 200 ul

Tips amarillo

Pipetas 5 mL

Suero

Gradilla

Estndar de cido urico 10 mL x grupo

Tubos 3 x mesa

Rvo Enzimtico de acido rico

grupo

Espectrofotomtro

Bao Mara

31

10 mL x

Fundamento del mtodo

El cido rico es oxidado por la enzima especfica uricasa, generndose alantona y
H2O2, el cual en una reaccin mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3
dimetiaminobenzoico y 4 AAP producindose un compuesto coloreado con un mximo
de absorcin a 555 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de cido rico presente en
la muestra.
Acido rico uricasa

Alantona + H2O2

H2O2 + DMAB + 4- AAP

POD

H2O + Complejo coloreado

9.11 Procedimiento
BLANCO

STANDARD

MUESTRA

Muestra

(ml)

---

Standard

(ml)

---

Reactivo

(ml)

1,00

---

0, 025

0, 025
1, 00

--1, 00

Mezclar e incubar 10 minutos a 37 C, o 20 minutos a temperatura

ambiente (20 a 25C).
Leer a una longitud de onda ptima 555 nm.
Llevar a cero con agua destilada el espectrofotmetro

Anote la absorbancia de la muestra:.

La frmula matemtica a usar es el factor de calibracin

FACTOR

10 mg/mL
Absorbancia Estndar

ACIDO RICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

32

VALORES DE REFERENCIA:
En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl.
Mujeres......................

2, 4 a 5, 7 mg/dl.

Cuestionario
1.- Cules son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades cardiacas y
vasculares, Adems del exceso de colesterol?
2.- Qu tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno?
3.- Cmo afecta a los nios el colesterol, y cul es el nivel de colesterol recomendable
en la infancia?

33

PRCTICA N 11
DETERMINACIN DE UNA PRUEBA DE EMBARAZO EN ORINA
OBJETIVO
El alumno realiza la deteccin de la hormona gonadotropina corinica como un
mecanismo para determinar el estado de embarazo, comprueba experimentalmente a
travs una muestra de orina de la paciente que se sospecha que est embarazada y
valora la importancia de estas pruebas en el diagnstico del embarazo.
FUNDAMENTO
Los aos de funcin reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rtmicos en las
tazas de secrecin de las Hormonas Femeninas y cambios correspondientes en los
rganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse en
dos fases principales; primera: la Preparacin del Cuerpo para la Concepcin y la
Segunda: el Periodo de Gestacin o Embarazo.
La gonadotropina corinica humana (hCG) es una hormona glicoproteica que se produce
en condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el
embarazo. La hCG, junto a la hormona folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante
(LH) y la hormona estimulante del tiroides (TSH), est constituida por una cadena alfa,
estructuralmente similar entre ellas, y una cadena beta especfica que determina su
actividad biolgica.2 Esta hormona estimula la produccin de hormonas esteroides por el
cuerpo lteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del embrin.
El principal uso de la determinacin de la hCG es el diagnstico precoz del embarazo; sin
embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales,
embarazos ectpicos y ovricos.
Una funcin principal de la Gonadotropina Corinica Humana (GCH) es administrar los
factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para
mantener en ptimas condiciones el endometrio y la 69 cavidad uterina, lo que en caso
contrario de no haber concepcin o cantidad insuficiente de esta hormona se perdera en
forma de lquido menstrual.
La deteccin precoz del embarazo por las pruebas bioqumicas se fundamenta en la
determinacin de la gonadotropina corinica humana (HCG) en suero o en orina.
Una vez producida la fecundacin y la implantacin del blastocisto en la decidua
endometrial, las clulas trofoblsticas empiezan a sintetizar HCG.2 Las cifras de HCG se
incrementan rpidamente en las primeras semanas del embarazo y a los 35 das de
amenorrea alcanzan cifras de 1800 UI/L.
La HCG est compuesta de 2 subunidades alfa y beta, diferentes entre s; mientras la
subunidad alfa es compartida por las restantes glicoprotenas hipofisarias, la subunidad
beta le confiere sus caractersticas biolgicas e inmunolgicas distintivas.2
La combinacin del empleo de los anticuerpos monoclonales contra la subunidad beta de
la HCG (beta HCG) y los inmunoensayos enzimticos, ha posibilitado el auge de mtodos
semicuantitativos y cualitativos rpidos, sensibles y especficos con valores de
sensibilidad de 50 UI/L que pueden ejecutarse en las propias consultas mdicas y donde
el resultado se ofrece en menos de una hora.

34

EMBARAZO
El primer signo de embarazo es la ausencia de una menstruacin esperada. Si los
ciclos son regulares, el retraso de la regla durante 1 semana o ms es la base de
presuncin de embarazo. El mdico diagnosticar embarazo por medio de procedimientos
exploratorios y utilizando diversos sistemas diagnsticos (doppler, test de embarazo, etc.)
La hCG (Hormona del embarazo) estimula el cuerpo lteo del ovario para mantener las
secreciones de estrgenos y progestgenos a fin de garantizar la integridad del
embarazo. Como regla general, los niveles de hCG se duplican al doble cada dos o tres
das. Una mujer embarazada tendr de 10 a 50 mUI/mL de concentracin de hCG en
suero la primera semana siguiente a la concepcin (al final de la tercera semana del
ciclo), alcanzando la mxima concentracin entre el segundo y tercer mes, seguido de un
descenso a partir de la 12 semana.
Mtodos de determinacin de la Gonadotropina Corinica humana (hCG, -hCG,
hormona del embarazo)
La hCG se sintetiza en la placenta y aparece en el suero y en la orina relativamente
pronto despus de la concepcin.La hCG es una glucoprotena compuesta por dos
subunidades polipeptdicas: alfa y beta. La subunidad alfa es esencialmente idntica a la
cadena alfa de otras hormonas hipofisiarias (TSH, LH y FSH). Es la variacin de las
subunidades beta donde reside la especificidad de la actividad biolgica de estas
hormonas.
Con los mtodos cuantitativos de laboratorio pueden detectarse cantidades muy
pequeas de -hCG (sensibilidad entre 0,05 y 0,1 mUI/mL). Dichos mtodos son:
radioinmunoanlisis (RIA), enzimoinmunoensayo (EIA, ELISA), inmunoanlisis de
fluorescencia (FIA). Casi todos ellos usan dos tcnicas: Inhibicin competitiva (RIA, FIA),
y tcnicas sndwich de doble anticuerpo (EIA, FIA). Todos estos ensayos cuantitativos
requieren instrumentacin especial y largos tiempos de anlisis (de 30 minutos a 3 horas)
Tradicionalmente se han utilizado pruebas cualitativas urgentes en orina, de aglutinacin
en portaobjetos, como indicadores para visualizar una reaccin positiva. Estas tcnicas
han cado en desuso tras la aparicin de los tests rpidos en dispositivos
inmunocromatogrficos, proporcionando sensibilidades de 25 mUI/mL en tiempos de
ensayo por debajo de los 3 minutos.
La aparicin de una nueva generacin de mtodos inmunoabsorbentes con partculas de
oro coloidal recubiertos de anticuerpos anti -hCG (DONNATEST Embarazo) permite
mejorar la sensibilidad de deteccin de esta hormona en orina por debajo de 20 mUI/mL
en menos de dos minutos.
Estas pruebas se utilizan como mtodo cualitativo, tanto en laboratorio, en formato de tira
reactiva para suero y orina, o en formato de dispositivo como prueba rpida de uso
personal, y con la sensibilidad suficiente para detectar la hormona desde el primer da de
la falta.
MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla, tubos de 13X100
Centrifuga, Gasas
Tiras reactivas para deteccin de la fraccin beta de la hormona
Muestra reciente de orina
PROCEDIMIENTO
1. Procedimiento opcional: recoger la orina en un vaso limpio. Sumergir la zona
absorbente del dispositivo durante 10 segundos. Esperar que aparezca el resultado a
partir de un minuto.

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PIPETA, MICROPIPETAS, TUBO DE ENSAYO, GRADILLA, CENTRIFUGA,

MICROSCOPIA, ESPECTROFOTOMETRO, VASO DE PRECIPITADO, MATRAZ
PROBETAS.

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