UNIVERSIDAD VERACRUZANA

QUMICA CLNICA
ACADEMIA DE BIOLOGA
MORFOLOGA Y FISIOLOGA
PERIODO: FEBRERO-JUNIO 2014

MANUAL DE LABORATORIO DE
TCNICAS HEMATOLOGICAS
SECCIN: A

UNIVERSIDA
D
VERACRUZA
NA

ELABORADO CON LA COLABORACIN

DE:
M.E. MA. LUISA HERNNDEZ HUERTA

UNIVERSIDAD
VERACRUZANA

CONTENIDO
Pg.
GENERALIDADES
ANTICOAGULANTES

4
TOMA

DE

MUESTRA

SANGUINEA

5
EXTENCION

DE

FROTIS

EN

PORTAOBJETOS

CUBREOBJETOS.

8
TINCION DE FROTIS SANGUINEO POR EL METODO DE WRIGHT YGIEMSA
10
TINCION
12

DE

IDENTIFICACION
14
OBSERVACION

MAY
DE

DE

GRUNWALD

GIEMSA

SERIES

LAS

SERIE

ROJA

NORMAL

ANORMAL.

21
DETERMINACION

DE

MICROHEMATOCRITO

DE

MACROHEMATOCRITO

26
DETERMINACION

28
30

DETERMINACION DE VELOC. DE SEDIMENTACION GLOBULAR (VGS

CURVA

DE

CALIBRACION

DE

HEMOGLOBINA

32
CUANTIFICACION

DE

HEMOGLOBINA

34
CAMARA

DE

NEUBAUER

36
DILUCION EN PIPETA DE THOMA PARA GLOBULOS BLANCOS Y GLOBULOS ROJOS

30
RECUENTOS
31

DE

GLOBULOS

ROJOS
33

CONSTANTE DE CORPUSCULARES Y CLASIFICACION DE ANEMIAS

HEMATOLOGIA DE SERIE ROJA 2015

RECUENTO

DE

RETICULOCITOS

35
37

FORMULA ROJA COMPLETA

PRUEBA

DE

INDUCCION

DE

DREPANOCITOS

COOMBS

DIRECTA

GRUPO

SANGUINEO

55
PRUEBA

DE

41
DETERMINACION

DEL

62
FRAGILIDAD

OSMOTICA

DE

LOS

ERITROCITOS

64
BIOLOGIA MOLECULAR EN EL AREA DE HEMATOLOGIA

48

GENERALIDADES:
El presente manual ha sido elaborado con la finalidad de que el
estudiante de la Lic. En Qumica Clnica comprenda cada uno de los
procedimientos que se llevan a cabo dentro del laboratorio en el rea de
Hematologa. Ademas, se le da a conocer al alumno los aspectos
principales sobre las tcnicas bsicas realicadas en un laboratorio de
hematologa.

OBJETIVO

Al final de cada practica el alumno ser capaz de realizar de forma

correcta los procedimientos que se llevan a cabo dentro de un
laboratorio de hematologa, realizando de manera pertinente las
diferentes tcnicas hematolgicas que inician con una buena toma
de muestra sangunea (siguiendo la pauta pre-analtica) hasta el
procesamiento de la misma (fase analtica) en la determinacin de una
formula roja completa, finalizando con la emisin de los resultados (fase
post-analtica) y la interpretacin de dichos resultados.

CAMPO DE APLICACIN

Los datos de laboratorio, elaborados por un qumico se emplean para

confirmar el diagnstico presuntivo del medico

ANTICOAGULANTES
La formacin de cogulos es un mecanismo complejo que tiene como
finalidad prevenir el sangrado tras sufrir un dao. Sin embargo, en
ocasiones la formacin de cogulos puede desencadenar un infarto de
miocardio, infarto cerebral, o formacin de cogulos en las venas o
dentro de las aurculas del corazn, y en estos casos, la administracin
de frmacos anticoagulantes es fundamental.
Los anticoagulantes, como su propio nombre indica, son frmacos que
impiden la coagulacin de la sangre, evitando por tanto la formacin de
cogulos o impidiendo su crecimiento y favoreciendo su disolucin
(desaparicin) en caso de que ya se hayan formado.
Las heparinas son medicamentos que actan inhibiendo indirectamente
la trombina (formacin de cogulos) unindose a la antitrombina
acelerando su mecanismo de accin. Las heparinas no fraccionadas
(HNF) son de administracin intravenosa y requieren un control estricto
para evitar la sobre o subdosificacin.
Las heparinas de bajo peso molecular (HBPM) surgen como resultado de
la depolimerizacin (fraccionamiento) qumica o enzimtica de la HNF,
dando lugar a molculas ms pequeas. Al igual que las HNF actan
sobre la misma va para producir su efecto anticoagulante; sin embargo,

a diferencia de estas se unen menos a las clulas, se absorben mejor por

va subcutnea y tienen menor unin a protenas plasmticas lo que
hace que solo requiera su administracin 1 o 2 veces al da y que no
requieran control de laboratorio.
En la patologa cardiaca, estas heparinas (fundamentalmente la
enoxaparina o fondaparinux; heparinas de bajo peso molecular) son
esenciales en el tratamiento del sndrome coronario agudo (angina
inestable o infarto de miocardio). Tambin es imprescindible durante el
cateterismo, para prevenir que se formen cogulos al introducir los
catteres y ponerlos en contacto con la sangre, y al manipular las
arterias coronarias.

FUNDAMENTO:
Sustancia que previene o se opone a la coagulacin de la sangre.

ANTICOAGULANTES MS USADOS:
Mezcla de oxalato amnico y potsico.
Se utilizan tres partes de oxalato amnico por dos de potasio (mezcla de
Heller y paul o de Wintrobe). La sal de amonio aumenta el volumen de
los glbulos rojos y la del potasio lo disminuye, con la proporcin los
eritrocitos no se alteran impide que el calcio intervenga en la
coagulacin precipitndolo con sal (oxalatos). Se emplea a razn de 0.1
ml por cada ml de sangre.
Ventajas: precio, facilidad de preparacin no requiere dilucin.
Adecuado para medicin de Ht, Hb, GB y GR.
Desventajas: no puede hacerse frotis despus de unos cuantos
minutos, produce degeneracin nuclear de los leucocitos y reduccin del
volumen del protoplasma.
Preparacin:
Oxalato de amonio
1.2 gr
Oxalato de potasio
0.8 gr
Agua destilada
100 ml

 El Oxalato de Potasio.
Se utiliza como anticoagulante en bioqumica 0.01de una solucin al
30% por ml de sangre.
Citrato de sodio al 3.8%.
Se emplea a razn de una parte de solucin de citrato por cuatro partes
de sangre para determinacin de: VSG de Westergren. Y una parte de
citrato por nueve de sangre para las pruebas de coagulacin.
EDTA (Sequestreno o Verseno).
Es la sal dipotsica o disdica del Ac. Etilendiaminotetraacetico, se
utiliza a una concentracin de 1-2 mg/ml de sangre, es el anticoagulante
preferido para los recuentos celulares y los estudios morfolgicos
cuando no es posible hacer directamente las extensiones a partir de
sangre fresca.

Ventajas: Se puede hacer extensiones de sangre despus de 2-3 hrs; se

la muestra est refrigerada el recuento celular es vlido durante 24 hrs,
evita la agregacin plaquetaria y es el preferido para el recuento de
plaquetas.
Preparacin:
EDTA: 1 gr
Agua destilada para hacer 100 ml
HEPARINA.
Se emplea a razn de 0.1 0.2 mg/ml de sangre, no afecta el tamao
celular ni el Ht. Se emplea en la exanguinotransfusin.
Ventajas: Es el mejor anticoagulante para la prevencin de la hemolisis y
para las pruebas de fragilidad osmtica.
Desventajas: No es satisfactorio para recuentos leucocitarios o
plaquetarios, produce agregacin celular provoca un fondo azul en las
extensiones teidas con Wright, es caro.
ACD (Citrato dextrosa acido).
Se emplea para las transfusiones de sangre, es til para preservar los
antgenos de glbulos rojos para su estudio.
Preparacin:

Citrato disdico (mono cido): 2 gr

Dextrosa:
3 gr
Agua destilada (sin pirgeno):
120 ml
Se emplea a razn de 4 ml de sangre por 1 ml de ACD y se
conserva a 4C.

TOMA DE MUESTRA SANGUINEA

Las muestras hematolgicas debern ser obtenidas bajo una tcnica
muy precisa con la finalidad de alcanzar resultados confiables.
Casi todas las muestras se obtienen por puncin venosa. La puncin
suele hacerse en la vena mediana ceflica, se localiza o se palpa
fcilmente en casi todos los pacientes (salvo en los obesos). Suele ser
muy notable en los trabajadores manuales.Puede hacerse resaltar la
vena diciendo al paciente que cierre y abra su mano o mediante masaje
o por combinacin de ambas tcnicas.

En el caso de una vena de calibre grueso generalmente en los varones,

se recomienda no picar directamente sobre la vena, que solamente se
ligue y que cierre el puo el paciente de sentir aun resistencia en el
embolo quitar la ligadura y tomar la muestra.
En ocasiones se tiene que usar las venas del dorso de la mano, teniendo
cuidado de no formar hematomas, es recomendable en personas
mayores, o en pacientes con el brazo muy grueso.
La puncin de la yugular externa se realizar a bebs recin nacidos,
siempre y cuando el mdico pida adems de BH otro examen que
requiera suero como determinacin de electrolitos etc. De ser solo una
BH se podr obtener por puncin del taln, del dedo o del lbulo de la
oreja del beb. Se requiere ayuda de 2 personas una que sujete al nio
previamente envuelto en una sabanita y otra la cabecita del beb.
Cuando se tenga un paciente quemado y sea difcil localizar la vena, se
recomienda puncionar en el dorso del pie, tomando siempre en cuenta
avisar al paciente que se le va hacer y pidiendo ayuda del personal en la
sala para sostener el pie.
Cuando la muestra requerida sea para gases arteriales, ser tomada de
la arteria femoral, o radial llevando previamente preparada una jeringa
baada en heparina y puesta en hielo.
Si la muestra requerida es de un nio de 4 o 5 aos se le pedir ayuda al
padre de familia para sujetarlo.
Si la muestra es para un nio de 8 a 10 aos se le pedir al padre de
familia que salga del rea de toma de muestra para ser manejado por el
personal de laboratorio.
Si se punciona al paciente y no se logra extraer sangre puede ser debido
a:

Puncionar al lado de la vena, pero no est.

Una puncion superficialmente
Una puncin de la vena pero atravesada

Toma de muestra con

sistema de vaco

Toma de muestra con

jeringa

Toma de muestra en
nios.

Toma de muestra en
tamiz.

Toma de muestra en vena

yugular externa.

EXTENCION DE FROTIS EN PORTAOBJETOS Y

CUBREOBJETOS.
Es la tcnica ms til y econmica par observa las caractersticas
morfolgicas de la clula sangunea, por lo que su adecuada realizacin
asegura una buena interpretacin del estado hematolgico del paciente.
Este corresponde a un extendido de gota de sangre obtenida idealmente
de una puncin venosa y tiene zonas claramente visibles.
Para tener una buena extensin de sangre o mejor conocido como frotis
sanguneo es necesario seguir algunas recomendaciones, tales como:

No tomar el porta objetos de forma inadecuada, poniendo los

dedos en los costados del portaobjetos para no dejar grasa.


El frotis debe ser delgado, ya que un frotis con una capa
sumamente gruesa de sangre no servir al momento de leer al
microscopio.
El frotis tiene tres partes que se dividen en: cabeza, cuerpo y cola.
La parte ideal para leer un frotis en el microscopio es la parte donde se
unen el cuerpo y la cola.
Estos
algunos

son
errores

que se deben evitar en la tcnica al momento de realizar la extensin:

Errores que se deben evitar durante la extensin del frotis.
Se seguirn los pasos de los esquemas para la realizacin de un
extendido correcto

TINCIN DE FROTIS SANGUNEO POR EL MTODO DE

WRIGHT, GIEMSA Y MAY-GRUNWALD GIEMSA.
FUNDAMENTO:
Los colorantes cidos se unen a los componentes bsicos de las clulas
(citoplasma). Inversamente los colorantes bsicos son atrados por los
compuestos cidos de la clula y se combinan con ellos (cidos
nucleicos y nucleoprotenas del ncleo). La eosina es un colorante cido
por lo que se pueden emplear indistintamente tintreas de los
componentes celulares.
GENERALIDADES:
Ehrlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina y despus
colorantes acido-bsicos (neutros) logrando su colorante tricido. Jenner
(1889) encontr que el p.p. obtenido de la mezcla de eosina y azul de
metileno poda disolverse en alcohol metlico para formar un colorante
til. El colorante de Jenner es muy parecido al de May-Grunwald-Giemsa
Romanowsky (1890) encontr que al mezclar una solucin de azul de
metileno vieja (madura y por lo tanto policromtica) con eosina y
disolviendo el p.p. en alcohol metlico se obtena un colorante mejor que
el de Jenner que poda teir los ncleos celulares y los grnulos de las
plaquetas que el de Jenner no tea. El colorante de Wright es semejante
al mtodo original de Romanowsky.
COLORANTE DE WRIGHT
El colorante de Wright es una solucin de eosina y una mezcla compleja
de tiacinas que incluyen el azul de metileno (normalmente del 50 al
75%) Azur B (10 a 25%) y otros derivados. Es un colorante
policromtico, por que produce varios colores.
Principio:
El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente rojo purpura,
se basa en la interaccin molecular entre eosina y un complejo azur BADN. ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la
coloracin depende del contenido de azur B y de la relacin entre azur B
y eosina amarilla. el resultado de tincin puede ser influido por
diferentes factores como el valor del pH de la solucin y de la solucin
tampn, las substancias tampn(amortiguadores), el tiempo de tincin y
la fijacin
Condiciones de almacenamiento y estabilidad:

Las condiciones deben almacenarse entre 15c y 30C y

protegidos de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado
entre 15C y 30C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha
de caducidad indicada
Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar colorantes de las
soluciones colorantes
Los frascos deben mantenerse siempre cerrados

PREPARACIN
Se disuelven 0.1 gramos de colorante en polvo en 60 ml de alcohol
metlico absoluto qumicamente puro (excepto de acetona). El polvo a
0.1 gramos se tritura con mortero aadiendo poco a poco gotitas de
alcohol hasta que alcanza 60 ml y todo el colorante se haya disuelto; el
proceso dura de 20 a 30 minutos. La solucin debe dejarse reposar uno
o dos das y se filtrara una vez preparada, as como antes de usarla. La
solucin tampn (pH 6.4) contiene 6.63 gramos de (KH 2PO4) y 2.56
gramos de (Na2HPO4) anhidro y agua destilada para hacer un litro.
PREPARACIN
Eosinato de azul de metileno
0.25 gr
Alcohol metlico puro
100 ml
Buffer fosfatos pH 6.8-7.0
Solucin A: fosfato monopotsico
9.1gr/1000ml
Solucin B: fosfato disdico anhidro
9.5gr/1000ml
Nota: Diluir el colorante con 1 o 2 volmenes de buffer fosfato 6.8-7.0

Procedimiento:
1. Realizar en una placa un extendido de la muestra con el borde de
otra placa. dejar secar
2. Colocar los frotis de sangre completamente secos, en la gradilla de
tincin adecuada.
3. Cubrir el portaobjetos con 1-2 ml de colorante de Wright Solucin
4. Tras 1 min, aadir un volumen igual de buffer para Wright, soplar
para homogenizar hasta permitir que la mezcla adquiera un brillo
verde metablico
5. Se deja actuar de 3 a 6 min.
6. Lavar con agua corriente, limpiar la parte de debajo de la misma
con un algodn de alcohol para retirar las manchas de colorante y
dejar secar a temperatura ambiente

7. Leer al microscopio con objetivo de 40X 0 100X y aceite de

inmersin.
Resultado:
Tipo de clulas
Linfocito
Monocito
Granulocitos
neutrfilos
Granulocito
eosinofilo
Granulocito basfilo
Trombocitos
(plaquetas)
Eritrocitos

Resultado
Ncleo azul violeta citoplasma azul
Ncleo (lobulado) azul violeta citoplasma azul
claro
Ncleo azul oscuro
Citoplasma rosa plido
Grnulos tono rosado a azul claro
Ncleo azul
Citoplasma rosa plido
Grnulos rojo ladrillo
Ncleo purpura a azul oscuro
Granulo azul oscuro-negro
Azul
Rojo

TINCION DE
WRIGHT

COLORANTE DE GIEMSA

Es la mejor modificacin de Romanowsky para descubrir parsitos de la

sangre y otros protozoos y muy satisfactorio para las tinciones de sangre
habituales.
Es una tincin general que se emplea mucho en hematologa, permite
distinguir, por su coloracin, los grnulos de los diferentes leucocitos
polimorfonucleares. Contienen una mezcla de colorantes catinicos (azul
de metileno y aninicos (eosina)
Preparacin:
Azur II Eosina
3gr
Azur II
0.8gr
Glicerina
250ml
Alcohol metlico
250ml
Su preparacin es difcil se recomienda comprarlo ya hecho, se emplea
diluido al dcimo con agua destilada.
Muestra:
Se debe usar lminas nuevas y prelavados con alcohol de 96% para
quitar la grasa
Se toman dos lminas, una gota gruesa y la otra para el extendido, se
limpia el dedo del paciente con alcohol, y deja secar.
Se realiza la puncin, la primera gota se descarta y con las lminas se
recoge una sola gota en cada una de ellas (no se debe tocar la piel con
la lmina). En una de las placas se hacen movimientos circulares hasta
alcanzar un dimetro de 1 cm para la gota gruesa, en la otra lamina se
hace un extendido delgado y corto.
Procedimiento:
Procedimiento de gota gruesa:
1. Se deja secar la lmina durante 20 min.
2. Se deshemoglobiniza con azul de Metileno, Fosfatado,
sumergiendo la lmina por 5 segundos y se lava varias veces con
buffer fosfatado.
3. Se deja secar la lamina
4. Realizar la coloracin de Giemsa preparando 1 gota de colorante y
1 ml de buffer (Aprox. 3 ml por cada lamina). se colorea la lmina
15 minutos boca abajo.
5. Se lava con agua corriente y se deja secar.

PROCEDIMIENTO DEL EXTENDIDO:

1. se deja secar la lmina durante 10 min
2. se fija el extendido con alcohol metlico durante 3 a 5 min y se
deja secar
3. se realiza la coloracin de Giemsa que se prepara 2 gotas de
Giemsa y 1 ml de buffer fosfatado (aprox. 3 ml por cada lamina)
4. se colorea la lmina boca abajo durante 30 min y se lava con agua
del chorro y se deja secar.
Nota: la gota gruesa se usa para ver la concentracin del parasito y el
extendido para ver la especie.

Resultado:
Tipo de clula
Parasito sanguneo

Resultado
Ncleo rojo
Citoplasma del protozoario azul

Linfocitos

Ncleo azul violeta

Citoplasma azul
Ncleo (lobulado) azul violeta
Citoplasma azul claro
Ncleo azul oscuro
Citoplasma rosa plido
Grnulos tono rosa a azul claro
Ncleo azul
Citoplasma rosa plido
Granulo rojo ladrillo
Ncleo purpuras a azul oscuro
Granulo azul oscuro a negro
Azul
Rojizo

Monocitos
Granulocitos neutrfilos

Granulocitos eosinofilos

Granulocitos basfilos
Trombocitos
Eritrocitos

TINCION DE
GIEMSA

TINCION DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA
Para esta mecnica se utiliza las siguientes soluciones

La solucin de May-Grunwaild, que contiene eosina (como

colorante anionico) azul de metileno(como colorante catdico)
disuelto en metanol
La solucin de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y
productos de la oxidacin del azul de metileno(azur A, azur B,
violeta de metilo y azul de metilo)
Los colorantes anionicos se van a unir a las sustancias catinicas
(bsicas) y los colorantes catinicos a las sustancias anionicas
(acidas) formando sales insolubles de diferentes matices de
coloracin.
Existen dos procesos de tincin, el clsico y la tcnica rpida
En el clsico el proceso son de los siguientes pasos:

1. Comprobar que el extendido se encuentre seco

2. Colocar varias gotas de solucin de May-Grunwald cubriendo
todo el preparado y dejar actuar durante 2 o 3 min. si se
termina la solucin de May Grunwald se puede reemplazar por
el alcohol medicinal obtenido un resultado similar
3. Lavar con abundante agua, eliminando toda solucin anterior, y
dejar el prepasado bien cubierto de agua durante 1 min.
4. Colocar aproximadamente 12 gotas de Giemsa sobre el
extendido cubierto de agua se puede soplar sobre el extendido
para homogenizarlo. Dejar actuar la solucin durante 10 o 15
min
5. Lavar con abundante agua removiendo el colorante remanente
y luego dejar secar
6. Si se observan muchas sales precipitadas en el preparado, se
puede realizar un lavado rpido con alcohol( con el preparado
en posicin casi vertical), dejar caer alcohol sobre el mismo y
luego inmediatamente lavar bien con agua

TINCION DE MAY
GRUNWALD GIEMSA

En la tcnica rpida se disminuyen los tiempos, con resultados similares

en la tincin, de la siguiente manera:
Exposicin a la solucin de May Grunwald 1 min, lavar con agua y dejar
cubierto de agua durante 1 min. Exponer la solucin de Giemsa durante
5 min, lavar y dejar secar.

IDENTIFICACION DE LAS TRES SERIES

(SERIE BLANCA, SERIE ROJA Y PLAQUETAS)
GENERALIDADES
Para determinar si la tincin queda bien, debern ver en perfectas
condiciones las clulas de las tres series (Serie blanca, roja y plaquetas)
con objetivo de inmersin, de otra manera no ser vlida la tincin.
Las clulas sanguneas forman un 40% de la composicin de la sangre y
existen tres tipos: leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Los leucocitos son
clulas que estn principalmente en la sangre y circulan por ella con la
funcin de combatir las infecciones o cuerpos extraos; pero en
ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una
parte de las defensas inmunitarias del cuerpo humano.
Las clulas tienen diferentes caractersticas morfolgicas mediante las
cuales se les puede reconocer, pero cuando estas son poco claras, el
aspecto ms til para su identificacin es la morfologa de la cromatina
nuclear.
Para su identificacin es necesario tener un frotis delgado. Los
neutrfilos maduros (polimorfonucleares PMN segmentados) leucocitos,
teidos con la tcnica de Wright el ncleo es azul obscuro con cromatina
bastante condensada. Tienen citoplasma abundante de coloracin
roscea y los lisosomas (grnulos) se tien de coloracin neutra a
roscea.

El eritrocito mide de 7-8 micras de dimetro y en su citoplasma

predomina el color rosa con tincin de Wright.
Las plaquetas se encuentran normalmente de 3 a 8 plaquetas por 100
glbulos blancos, son redondas ovaladas o en forma de bastoncito
miden de 2 a 4 micras de dimetro, pueden tener prominencias
puntiagudas o alargadas, se tien de color purpura.
Los glbulos rojos, tambin denominados hemates eritrocitos,
son las clulas sanguneas ms numerosas, cuyo caracterstico
color rojo se debe a una protena que se halla en su interior
llamada hemoglobina, responsable de ligar el oxgeno para
transportarlo desde los pulmones a todos los tejidos del organismo
para que las clulas respiren.
Los glbulos blancos, o leucocitos, se encargan de proteger al
organismo contra el ataque de bacterias, virus, hongos y
parsitos. Cuando hay una infeccin aumentan su nmero para
mejorar las defensas. Unos se forman en la mdula sea y otros en
el sistema linftico (bazo, ganglios, etc)
Las plaquetas, o trombocitos, son las clulas sanguneas ms
pequeas. Intervienen en la coagulacin de la sangre impidiendo
las pequeas hemorragias que se producen habitualmente en las
arterias, venas y capilares; adems de producir
diversas
sustancias que ayudan a la cicatrizacin de las heridas.
El plasma es la parte lquida de la sangre. Compuesto
fundamentalmente de agua y protenas, interviene en mltiples
procesos metablicos bsicos para el organismo como la
coagulacin de la sangre, la inmunidad y el transporte de varias
sustancias y medicamentos.
Entre las sustancias ms importantes que transporta el
plasma se encuentran las siguientes:

La Albmina: Es una protena que ayuda a mantener el agua del

plasma en una proporcin equilibrada.
Las Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa
de nuestro organismo frente a las infecciones. Su disminucin
acarrear una bajada de defensas.
Factores de Coagulacin: Son imprescindibles para evitar las
hemorragias. La ausencia de algn factor de coagulacin puede
ocasionar trastornos hemorrgicos ya que se dificulta la
formacin del cogulo.

Otras protenas transportan sustancias necesarias para el

normal funcionamiento de las clulas (grasas, azcares,
minerales, etc).

Eritroci
Leucocito

Plaquetas

OBSERVACION DE SERIE ROJA NORMAL Y ANORMAL.

FUNDAMENTO
La extensin de sangre es una de las pruebas de laboratorio de mayor
importancia diagnostica y tambin una de las ms sencillas, si bien para
establecer un diagnstico definitivo es necesario otras pruebas
confirmatorias. La extensin de sangre constituye una exposicin de las
alteraciones de las morfologas de los eritrocitos los distintos factores
involucrados en la patogenia de una anemia determinada. En esta
prctica presentamos las alteraciones ms notables con respecto al
tamao, forma, cambios estructurales y peculiaridades de tincin de los
hemates.
A) Alteraciones que se refieren al tamao de los hemates.
Anisocitosis: cuando existe gran variedad en el tamao de los
hemates.

Microcitos: son hemates cuyo tamao es inferior a 6.5 micras de

dimetro. (Caracterstico de anemias ferropenicas)
Macrocitos: son hemates con dimetro mayor a 8.5 micras,
repletos de Hb y con VCM mayor que lo normal. Se observan en
anemia megaloblastica.
Esferocitos: tienen forma esfrica, son ms pequeos y
caractersticos de las anemias hemolticas.

B) Alteraciones en la forma:

TERMINOLOGIA
Equinocitos

Acantocito

DESCRIPCION

Crenocitos
Clula erizo

ESTADOS PATOLOGICOS

Deficiencia por piruvato

quinasa
cncer
de
estmago,
Uremias,
Enfermedades hepticas.

Clula crenada

Hipotiroidismo,
Dao
heptico crnico, Mala
Dracocitos,
Clula espuela o absorcin de grasa.
Poiquilocitos
asta
Anemia mielociticas.
Clulas
en
Talasemias.
diana
Cel. En forma de
gota.
Hemoglobinopatas.
Eliptocitos
Talasemias,
Esplenectomas,
Enf.
Cel. En blanco de Renales.
tiro.
Drepanocitos
Anemia
macrocitica
megaloblastica
o
por
deficiencia de hierro.
Queratocitos Cel.
Lpiz
o
cigarro.
Hemoglobinopatas
Anemia africana.
Esferocitos

Esquistocitos

Cel. En forma de Anemias hemolticas

hoz.
Microanginopatia.

Leptocitos

Anemias
hemolticas,
Cel. En forma de Hereditarias
o
casco.
adquiridas.

Estromatolito Cel.
Fragmentadas.
s

Cel. Delgada.

Cncer,
Quemaduras
graves,
Anemia
hemoltica
Microanginopatica.
Talasemia, Anemia por
deficiencia de hierro.

Cel. En forma de
boca.
Esferocitos,
Cirrosis
alcohlica, Neoplasias.

Anemia que
acompaa a la
leucemia.
Eliptocitos
hereditaria.
Talasemia.
Anemia Macrocitica
Megaloblastica.
Anemia por
deficiencia de
Alargados
y
con hierro.
ambos
extremos
Drepanocitos
terminados
en Pacientes con Hb
eritrocitos
punta: hoz, luna anormal s
falciformes.
Enfermedades por
Clula en forma creciente o canoa.
clulas falciformes
de hoz.
Hemoglobinopatas
(C.
Harlem
Memphis/S)
Eritrocitos en forma Anemia africana.
de luna creciente y
con
extremos Anemias
Eritrocitos
ovalados
elpticos.
Clula lpiz
cigarro.

Eritrocito en forma
ovalada
alargada,
elipsoide, con rea
o plida central y Hb
en los 2 extremos.

Queratocitos
(clulas
en
forma de casco,
yelmo o asta).

terminados
en
pequeas
dilataciones
esfricas,
con
proyecciones
en
una
o
varias
muescas
que
semejan astas en
los 2 extremos.

Esferocitos.

Eritrocitos en forma
de esfera con Hb
densa
(hipercromatico).
Carecen de rea
central plida.
Aumento de la
fragilidad osmtica.

hemolticas
Microanginopatia
Hemolisis
por
prtesis
vlvula
cardiaca
Glomerulonefritis
Hemangiomas
cavernosos
Anemia hemoltica
por
cuerpos
de
Heinz.
Anemias
hemolticas
hereditarias o
adquiridas.
Esferocitos
hereditaria.
Pacientes recin
transfundidos
Quemaduras graves
Incompatibilidad
ABO
Anemias
por
cuerpos de Heinz.

C) Alteraciones en el color

Hipocroma: cuando el grado de coloracin del eritrocito es menor

que en circunstancias normales y la zona clara central del hemate
se encuentra aumentada o es mayor que una tercera parte del
dimetro dela clula debido a la falta de Hb. Se acompaa de
micrositosis.
Hipercroma: en el eritrocito normal su contenido est saturado de
Hb. Ejemplo el esferocito.
Anisocromia.- este trmino se emplea para designas aquellas
situaciones donde hay una variacin en la intensidad de color en
los eritrocitos, es decir hay normales e hipocromicos.

Policromatofilia.- se refiere al hemate joven (reticulocito) que se

presenta en la extensin teida de sangre perifrica una muestra
de basofilia, se observan de color azul.
Punteado Basfilo.- cuando la velocidad de produccin de los
eritrocitos se encuentra aumentada se observan eritrocitos
policromatofilos, se encuentra en las

INCLUCIONES ERITROCITARIAS
Granulaciones de Shchuffner.- aparecen en el paludismo por efecto
parasitario del plasmodium vivas.
Grnulos sideroticos (cuerpos de pappenhirmer).- se llaman
sideroticos a los eritrocitos que contienen pequeas partculas de
hierro, son grnulos azulados con tincin de azul de prusia de perls.
Corresponde al hiero o hemoglobnico, aparece en anemias
sideroacresticas y tras esplenectoma.
Punteado basfilo.- restos de
agregados de ribosomas que se
observan como puntos mltiples, basfilos finos o gruesos dispersos
en el eritrocito, se observan en anemias severas, talasemias,
intoxicacin por plomo, dficit de pirimidin 5-nucleotidasa.
Cuerpos de Howell Jolly.- granulo grueso esfrico generalmente
purpurico. Son restos nucleares y se ven en los esplenectomizados,
anemias megaloblasticas severas, anemias graves en general.
(Defectos del bazo).
Anillos de Cabot.- filamento de membrana nuclear se observan como
figuras de 8, de color rojo purpura, se ven en anemias graves,
perniciosas y hemolticas.
Cuerpos de Heinz.- grnulos intereritrocitarios por p.p de la Hb. Se
encuentran en hemoglobinopatas.

En esta imagen se muestran

eritrocitos normociticos
normocrmicos.

microci
En esta imagen se
encuentra una anisocitosis,
se muestran Microcitos,
normocitos, y macrocitos.

macroc

DETERMINACION DE MICROHEMATOCRITO
FUNDAMENTO
La concentracin de glbulos rojos en sangre anticoagulada es medida
por el hematocrito, (que es el porcentaje del volumen total de ocupada
por glbulos rojos) que nos ayudan a diagnosticar una anemia,
politicemia y nos ayuda a calcular ndices sanguneos. Este puede
determinarse por varios mtodos, el macromtodo manual de Wintrobe,
el micromtodo manual y los mtodos automatizados que clasifican
electrnicamente por tamao los glbulos rojos y miden su
conductividad.
Material

Tubos capilares
Lmpara de alcohol
Gasa o papel sanitario

Material biolgico

Sangre con anticoagulante (EDTA 2.0ml)

Equipo

Microcentrfuga
Disco lector

Tcnica
1.- El micromtodo se efecta en un tubo capilar de 7cm. Con un
dimetro interior de ms o menos 1mm.
2.- Colocar el extremo de un tubo capilar sobre la gota de sangre en el
dedo o tubo y llnese el capilar por gravedad, regularmente del lado
marcado con color (azul sin coagulante, rojo con EDTA) con la finalidad
que la parte sellada no quede manchada por la flama.
3.- Cierre el tubo capilar al fuego por el lado contrario al que se llen,
comprobando que quede completamente cerrado (invirtindolo).
4.- Colocar el capilar en la centrifuga para microhematocrito tomando en
cuenta que debe ponerse la parte sellada hacia fuera, cerrar ambas
tapas de la centrifuga y ygirara el botn del cronometro en sentido de
las manecillas del reloj a 11000 r.p.m ya estabilizadas aproximadamente
7 minutos.
5.- Leer en el disco lector.

Nota:
Los capilares azules se emplean para trabajar muestras inmediatas ya
tomadas; los capilares rojos se emplean para tomar muestras que
requieren de tiempo para llegar al rea de laboratorio. Ambos valores
son los mismos.
Es muy importante no olvidar poner la primera tapa de la centrifuga
para evitar que se rompan completamente.
Colocar correctamente el capilar para no obtener una lectura errnea.
El capilar nos permite darnos cuenta si el plasma del paciente esta
ictrico.
Toda muestra hemolizada correr un ligero rango de error.
Rango de valores normales segn la OMS
Hematocrito
Wintrobe a nivel del mar
Ht%
Rangos
Hombres
40%
42 52%

Mujeres
Mujeres embarazadas
Nios de (1 ao)
Nio de (0 13 aos)
Recin nacido

38%
36%
36%
38%
45%

37 47%

44 54%

Tubos con marca roja tubos

con anticoagulante
heparina.
Tubos con marca azul sin
anticoagulante.

Centrifuga para tubos

capilares

DETERMINACION DE MACROHEMATOCRITO
Fundamento
El mtodo de Wintrobe emplea sangre anticoagulada no diluida con una
mezcla de oxalatos y un tobo con una columna de 100mm. El volumen
de glbulos rojos sedimentados se determina por centrifugacin de
sangre, el objeto de la centrifugacin de sangre, el objeto de la
centrifugacin, es asegurar una ptima sedimentacin de los eritrocitos.
Material
Tubo de Wintrobe
Aguja de Wintrobe
centrifuga
Metarialbiologico

Sangre con anticoagulante 3ml. (EDTA, Heparina seca o mezcla de

oxalatos)

Tcnica
1.- Mezcla cuidadosamente la sangre con el anticoagulante, invirtiendo
lenta y completamente no menos de 30 veces (no rota el frasco menos
sculo ya que esto puede daar las clulas).
2.- Llenar el tubo con la pipeta de Wintrobe, de preferencia de una sola
vez. Se introduce la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo, a medida
que se llena se eleva al puta de la pipeta pero debe permanecer por
debajo del menisco de sangre para no formar espuma.
3.- Se tapa el tubo para evitar la evaporacin durante la centrifugacin
de 30min. A 2500G.
4.- La lectura se hace en la columna de la derecha del tubo de Wintrobe
que va de 0 a 100 mm de abajo hacia arriba sin mover la muestra el
resultado se calcula por la sig. Formula:
100 L 1
Hematocrito (%) =
L2
Donde L1 es la altura de la columna de hemates en mm y L2 es la altura
de toda la muestra (hemates y plasma), la capa blanco griscea de
leucocitos y plaquetas de encima de los eritrocitos no se incluyen en
L.La columna den tubo Wintrobe viene marcada de 0 a 10 cm que
equivale a 100mm. Por lo que al empaquetarse los glbulos rojos y
marcan por ejemplo: En el nmero 4 cm ser = 40 mm y aplicando la
formula tendremos:
Hematocrito (%)=

40 mm( L)
100 =40
100 mm ( L)

Tubo de wintrobe

DETERMINACION DE VELOCIDAD DE SEDIMENTACION

GLOBULAR (VGS)
FUNDAMENTO:
La velocidad de sedimentacin globular (habitualmente referida
como VSG) o eritrosedimentacines. Una prueba diagnstica de
laboratorio utilizada frecuentemente en medicina. La velocidad con la
cual se produce el descenso de estos hemates se denomina velocidad
de sedimentacin globular (VSG).
Esencialmente es una medida aproximada de la concentracin anormal
de fibringeno y de algunas seroglobulinas, (estos componentes del

plasma aumentan el apilamiento eritrocito, q se sedimenta con mayor

rapidez por su mayor peso).
La velocidad de este proceso depende de 3 factores principales: 1)
Formacin de Roleaux 2) Concentracin de fibringeno en plasma y 3)
concentracin de globulinas alfa y beta en el plasma
Material
Tubo de Wintrobe
(EDTA)
Aguja de Wintrobe
Gradilla para VSG

Material biolgico
Sangre con anticoagulante 3 ml.

Generalidades
La VSG se observa en tres fases:
1) El periodo inicial de agregacin. Durante esta fase se produce el
apilamiento y la sedimentacin es bastante lenta, durante unos 10
min de un periodo de observacin de 1 hr.
2) Una vez llenado se coloca el tubo en posicin vertical en su
gradilla especial y se deja a temperatura ambiente durante una
hora exactamente, sin moverse.
3) Transcurrido el tiempo requerida se har la lectura en la columna
de la izquierda que est marcada de arriba hacia debajo de 1 a
100 mm.
4) El resultado ser dado en mm/hr.
5) Los valores normales segn Wintrobe sern:
Hombres

7 mm

4 mm

Mujeres

15 mm

10 mm

Nios

15 mm

5-10 mm

INTERPRETACION:
La determinacin de la velocidad de sedimentacin globular (VSG) est
ampliamente extendida y los mdicos la utilizan a menudo, aunque el
resultado es poco significativo para determinadas enfermedades. Por
ejemplo, en todos los procesos inflamatorios y en enfermedades
cancergenas avanzadas existe una aceleracin de la sedimentacin

globular. Un procedimiento estandarizado para su determinacin es el

mtodo de Westergreen. En l se registra la sedimentacin globular en
milmetros por unidad de tiempo.

CURVA DE CALIBRACION DE HEMOGLOBINA

Fundamento
La
hemoglobina
el
reaccionar
con
ferrocianuro
forma
la
metahemoglobina, la cual con el cianuro de potasio forma la cianometa
hemoglobina, los compuestos de estas soluciones son relativamente

estables. El contenido de Hb lo usamos como patrn o referencia por

diferentes mtodos.
Material

Equipo

5 Tubos de 13 100

espectrofotometro

2 Pipetas de 5 ml
1 Pipeta de 2ml
Gradilla
Papel milimtrico
Reactivos
Estndar de Hycel con una Conc. De 80g/dl
Solucin valorada de cianometa hemoglobina
Tcnica
Tubo 1
STD
Cianometa
Concentraci
n

5 ml
Blanco

Tubo 2
1.25 ml
3.75 ml
5 gr/dl

Tubo 3
2.5 ml
2.5 ml
10 gr/dl

Tubo 4
3.75 ml
1.25 ml
15 gr/dl

Tubo 5
50 ml
20 gr/dl

Mezclar y reposar 3 min (dependiendo de la cianometa) y leer a 540

nanmetros.
Hacer una tabla para registrar valores y trazar curvas. Ejemplo:
Tubos:
2
3
4
5

Lecturas:

Abs.

T%

0.17
0.30
0.44
0.59

72
50
37
26

Concentraci
n
5 gr/dl
10 gr/dl
15 gr/dl
20 gr/dl

Las lecturas son efectivas con blanco de agua o de cianometa segn

reactivo.

Generalidades
La concentracin de lo estndar se refiere a las concentraciones en
mg/100ml de la cianometa hemoglobina en la solucin para obtener
los valores de una cantidad de hemoglobina en 100 ml de sangre diluida
deben multiplicarse estos valores por el factor de dilucin y dividirse
entre 1000, si se agrega 0.02 ml de sangre a 5 ml de diluyente, el factor
diluido es 251.
Manera de sacar el factor de dilucin en la pipeta de Hb.
0.02 ml= sangre medida en una pipeta de shali
5.0= solucin diluyente (cianometa).
0.02ml +5.0 ml
=251(factordiluido)
0.02 ml
Manera de sacar factor:
ConcentraciondelStd .
20 gr /dl
=FactorEjemplo
=39.52(Factor )
Lectura
0.506

Nota: La curva de calibracin se debe trazar cada vez que se termine la

cianometa que se ha valorado.

CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA
Fundamento
El examen de hemoglobina casi siempre se hace comoparte de un
conteo sanguneo completo (CSC). La hemoglobina es el componente
ms importante de los glbulos rojos y est compuesto de una protena
llamada hemo, que fija el oxgeno, para serintercambiado en los
pulmones
por
dixido
de
carbono.
Anomalas de un individuo del valor de hemoglobina puede indicar
defectos en el balance normal entre los glbulos rojos de produccin y la
destruccin. Ambosbajos y altos valores puede indic enfermedad
estados.
La hemoglobina se transforma en cianometahemoglobina, mediante la
adicin de ferrocianuro de potasio y cianuro de sodio. El ferrocianuro
convierte el hierro ferroso de la hemoglobina en frrico para formar
metahemoglobina que se combina con el cianuro y forma
cianometahemoglobina. La densidad del cloro es directamente
proporcional a la cantidad de hemoglobina presente.
Material
Material

material biolgico

1 tubo de 13x100
espectrofotometro
Pipeta de shali

sangre con anticoaulante

Gradilla

Preparacin de la solucin de drabkin:

Bicarbonato de sodio
Cianuro de potasio
Ferricianuro de potasio
Agua destilada

reactivo

1.00 gr
0.05 gr
0.20 gr
1000 ml

equipo
cianometa

Tcnica
1.- Medir 5.0 ml de solucin de cianometa en un tubo de ensaye de 13
100 limpio y seco.
2.- Medir 0.02 ml de sangre en la pipeta de Shali (Hb) de manera exacta
hasta marcar, si se ha tomado un ligero exceso se eliminara tocando
ligeramente la punta de la pipeta con una gasa.
3.- Transferir la sangre medida al tubo con cianometa, enjuagar la pipeta
en el lquido de dilucin 3 veces y posteriormente mezclar por inversin
con tapn o papel parafilm. Dejar reposar 3min.O 20 min. Si la
cianometa no es comercial sino preparada.
4.- Transferir la lectura a la curva de calibracin para obtener el valor de
la Hb en gr/dl.
Valore normales
Varones
14 18 gr/100ml
Mujeres
12 16 gr/100ml
Nota: Los varones de Hb varan segn la altura y los rangos de los
valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes
laboratorios. Hable con el mdico acerca del significado de los
resultadosespecficos de su examen.

CAMARA DE NEUBAUER
Fundamento
El tipo de hematocrito o cmara de recuento consiste en un portaobjetos
de cristal, compacto en incoloro sobre cuyo tercio medio se han fijado
tres plataformas paralelas extendidas a travs de todo el portaobjetos.
Generalidades
La cmara contadora o hemocitometro presenta dos reas rayadas en el
relieve de su superficie, cada una de las cuales contiene un cuadrado de
3 mm dividido en 9 grandes cuadrados cada uno de los cuales mide 1
mm cuadrado.
El cuadrado central que se utiliza para contar glbulos rojos, se
subdivide en 25 cuadrados ms pequeos de los cuales cada uno ocupa
un rea de 0.04 mm cuadrados.
Se cuentan los glbulos rojos en 5 cuadrados de la cuadricula central. La
profundidad de la cmara es de 0.1 mm. Cada uno de estos cuadrados a
su vez tienen 16 cuadrados ms pequeos.

Los 4 cuadrados grandes de los ngulos, cada uno de 1 mm cuadrado de

superficie, se subdivide en 16 cuadrados y se emplea para la cuenta de
glbulos blancos.
La cmara de recuento y los cubreobjetos (de cuarzo) deben tener un
trato especial para evitar que se rayen, deben lavarse en agua tibia,
nunca en agua caliente, inmediatamente despus de su uso; el agua que
quede en la cmara de Neubauer puede secarse con un pao limpio y
sin hilos, la cmara de recuentos y el cubreobjetos pueden dejarse secar
al aire libre. Las superficies son muy delicadas por lo que no se debe
utilizar gasa o tejido grueso, ye que pueden araar la superficie.

Material
Cmara de neubauer
Microscopio
Sangre perifrica

Procedimiento
1.- Tomar una muestra de sangre perifrica. Con jeringa o tuvo
vacutainer.
2.- Se deshecha la primera gota de sangre y se aspira la siguiente con la
pipeta de dilucin perfectamente limpia y seca hasta la seal 1 o 0.5
3.- A continuacin se toma con la pipeta lquido de Hayem, isotnico con
la sangre, hasta la seal 1; as, la sangre queda diluida al 1/10, si
tomamos sangre hasta la seal 1, o al 1/20 si tomamos hasta 0.5.. (Si
hemos utilizado la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido
en 2 o 4 ml de lquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).
4.- Tomamos la pipeta (o el tubo de ensayo) entre los dedos ndice y
pulgar y agitamos. A travs de la goma de conexin con la pipeta,

soplamos para despreciar las primeras gotas por corresponder al lquido

que estaba en el capilar.
5.- Se adapta un cubreobjetos sobre una cmara cuenta glbulos limpia
y seca y se coloca una gota en uno de los lados del cubre; esta gota
penetra por capilaridad y rellena el retculo de la misma.
6.- Una vez preparada la cmara se coloca sobre la platina del
microscopio dejndose unos minutos en reposo para que sedimenten los
glbulos. Disponemos el condensador bajo y luz dbil; enfocamos
primero con el objetivo dbil seco y luego se cambia al fuerte seco para
proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadrados pequeos del
retculo marcado en color rojo. Finalizado el recuento se procede a la
limpieza de la pipeta, agua destilada y alcohol-ter sucesivamente.

DILUCION EN
PIPETA DE THOMA
PARA GLOBULOS
BLANCOS Y
GLOBULOS ROJOS
Fundamento
Para preservar la constancia
del medio interno, las
clulas hemticas han de mantenerse
constantes. Por eso las clulas viejas o
desgastadas son destruidas y renovadas
continuamente. La cantidad de cada tipo
de clulas sanguneas constituye un
parmetro constante para cada especie,
con las variaciones normales debidas a la
edad y al sexo. Este parmetro slo se ver
alterado en determinadas circunstancias
ambientales o patolgicas.
El recuento de clulas hemticas, tanto de
eritrocitos como de leucocitos, es una de

las pruebas clsicas en analtica clnica. El recuento de plaquetas no se

suele hacer, salvo cuando se sospecha que el paciente tiene alguna
anomala grave (normalmente de tipo leucmico).
Estas pruebas tienen por objeto determinar la concentracin de los
distintos tipos celulares presentes en la sangre. Permiten detectar
anomalas como anemias y policitemias en el caso de los glbulos rojos,
yleucopenias y leucocitosis en el de los glbulos blancos.
La importancia clnica atribuida al recuento, sobre todo en el caso de los
eritrocitos, ha fluctuado a lo largo de la historia. Actualmente se le da un
valor menor, debido sobre todo a su inexactitud. Para determinar la
anemia se considera ms exacto y simple el valor hematocrito (relacin
entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre).
Pipeta de Glbulos blancos:
1.- si se llena la pipeta con sangre hasta la marca de 0.5 y se completa
hasta 11 con lquido de dilucin se tendr una dilucin 1:20.
2.- Si se llena la pipeta con sangre hasta la marca de 1.0 y se completa
hasta 11 con lquido de dilucin 1:20.
3.- Para una cuenta normal de Leucocitos se emplea la dilucin 1:20.
4.-si se tiene una cuenta de Leucocitos muy baja (leucopenia se diluye
menos y se emplea la dilucin 1:10.
5.- Si por el contrario se tiene una cuenta muy elevada de leucocitos
(Leucocitosis) se emplea la pipeta de glbulos rojos y se llena hasta 0.5
con sangre y se completa hasta 101 con lquido de dilucin (Turk) la
dilucin ser 1:200.
Pipeta de Glbulos rojos:
1.- Si se llena la pipeta con sangre hasta la marca de 0.5 y se completa
hasta 101 con lquido de dilucin (Hayen o Gower) se tendr una
dilucin 1:200 (se contara en la misma cuadricula de glbulos blancos.
2.- Si se llena la pipeta con sangre hasta la marca de 0.1 y se completa
con lquido de dilucin hasta 101 se tendr una dilucin 1:100.
Nota: Si el paciente tiene pocos glbulos rojos se empleara la dilucin
1:100.

PIPETA DE THOMA PARA

GLOBULOS BLANCOS Y
GLOBULOS ROJOS

BOQUILA PARA CONTEO DE

GLOBULOS BLANCOS Y ROJOS
OBSERVACIN ATREVES DEL
MICROSCOPIO

RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS

FUNDAMENTO
El recuento de eritrocitos o glbulos rojos, consiste en contar el nmero de ellos
en un milmetro cbico de sangre.
La cantidad total de eritrocitos se relaciona directamente con las necesidades
fisiolgicas y/ patolgicas del individuo. Las alteraciones orgnicas tambin
modifican los valores normales, pudiendo stos aumentar o disminuir. En estado
normal la cantidad de eritrocitos en un individuo vara dependiendo de la altitud en
relacin con el nivel del mar, de la actividad fsica, el clima, estado nutricional, el
sexo, la edad, etc.
Los procesos patolgicos en donde se modifican los valores normales en el
nmero de eritrocitos se conocen como policitemia y anemia, segn que aumenten
o disminuyan dicho volumen, respectivamente.
Principio del recuento, el milmetro cuadrado con sus 400 pequeos cuadros en el
centro del rea cuadriculada tiene una capacidad de 0.1 mm.
Hay que conocer el nmero de eritrocitos que hay en un milmetro cubico de
sangre sin diluir, para ello se calcula el nmero de hemates que hay en 1 mm de
sangre diluida y se multiplica por la dilucin.
Se puede emplear sangre venosa o sangre capilar.
MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
CANTIDAD

DESCRIPCIN

Tubo de 12 X 72

Pipeta de Thoma para Glbulos rojos

Cmara de Neubauer

Gradilla

Agitador Mecanico

Microscopio

REACTIVOS
Liquido de Haven:
Bicloruro de mercurio
Sulfato sdico
Cloruro sdico
Agua destilada

5.5gr
5.00 gr
1.00 gr
200.00 ml

Liquido de Gower
Sulfato sdico
cido actico glacial
Agua destilada

12.50 gr
33.33 gr
200.00 ml

MATERIAL BIOLGICO
Sangre con anticoagulante. (EDTA)
PROCEDIMIENTO
1.- Mezclar la sangre cuatro o cinco veces antes de llenar la pipeta de Thoma para
glbulos rojos.
2.- Llenar la pita en posicin horizontal casi en ngulo recto a la lnea de visin
hasta la marca de 0.5 con sangre y completar con lquido de dilucin (Gower o
Hayem) hasta la marca de 101, (dilucin 1:200).
3.- Una vez llenada con precisin se coloca en el agitador mecnico por unos
minutos, posteriormente se le conecta la boquilla y se desecha liquido de dilucin
hasta la mitad del bulbo.
4.- Se llena la Cmara de Neubauer se deja reposar un minuto y se efecta el
conteo de los eritrocitos que hay en 5 cuadrados de 16 cuadros cada uno de la
cuadricula del centro, cuatro extremos y un centro, es decir el total de eritrocitos
que se encuentran en 16 5 = 80 cuadros.
Clculos

0.02 mm = al volumen de sangre diluida que est en la cmara sobre los 80

cuadros.
El nmero de eritrocitos contados en 80 cuadros se multiplica por 50 para convertir
de esta manera el numero de 0.02 mm el nmero que contiene 1 mm.
El contenido de 1 mm se multiplica por 200 para compensar la dilucin 1:200
que se hizo en la pipeta.
El factor de conversin combinado es 50

200 = 10 000.

Por lo tanto el nmero de eritrocitos contados en 80 cuadros se multiplica por 10

000

DIAGRAMAS DEL RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS

RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS

Fundamento
Los glbulos rojos se producen en la mdula sea y son los que llevan el
oxgeno a todo el organismo. El RBC es la cantidad de glbulos rojos que
son producidos en unas 20 gotas de sangre (1 milmetro cbico). Los
niveles normales de RBC fluctan entre 4.5 y 6.1 millones por milmetro
cbico para los hombres, y entre 4.0 y 5.3 millones para las mujeres
Se puede emplear sangre venosa o sangre capilar.
Material
Equipo
Reactivos
Pipeta de Thoma (G.R)
Boquilla
5.5gr
Cmara de Neubauer
Cubreobjetos de cuarzo
1.00 gr
Gasa o papel sanitario
200.00 ml

Microscopio

-liquido de hayen

Agitador mecnico

bicloruro de mercurio
sulfato sdico

5.00 gr

cloruro sdico
agua destilada
liquido de gower
Sulfato sdico 12.50 gr
Agua destilada

200.00 ml
Tcnica

1.- Mezclar la sangre cuatro o cinco veces antes de llenar la pipeta de

Thoma para glbulos rojos.
2.- Llenar la pita en posicin horizontal casi en ngulo recto a la lnea de
visin hasta la marca de 0.5 con sangre y completar con lquido de
dilucin (Gower o Hayem) hasta la marca de 101, (dilucin 1:200).
3.- Una vez llenada con precisin se coloca en el agitador mecnico por
unos minutos, posteriormente se le conecta la boquilla y se desecha
liquido de dilucin hasta la mitad del bulbo.
4.- Se llena la Cmara de Neubauer se deja reposar un minuto y se
efecta el conteo de los eritrocitos que hay en 5 cuadrados de 16
cuadros cada uno de la cuadricula del centro, cuatro extremos y un
centro, es decir el total de eritrocitos que se encuentran en 16 5 =
80 cuadros.
Clculos
0.02 mm = al volumen de sangre diluida que est en la cmara sobre los
80 cuadros.
El nmero de eritrocitos contados en 80 cuadros se multiplica por 50
para convertir de esta manera el numero de 0.02 mm el nmero que
contiene 1 mm.
El contenido de 1 mm se multiplica por 200 para compensar la
dilucin 1:200 que se hizo en la pipeta.
El factor de conversin combinado es 50

200 = 10 000.

Por lo tanto el nmero de eritrocitos contados en 80 cuadros se

multiplica por 10 000.

PIPETA DE GLBULO
ROJOS.

AGITADOR DE PIPETAS DE
GLBULOS ROJOS

CMARA
NEUBAUER
ENFOCAR CMARA
DEDE
NEUBAUER
EN MICROSCOPIO

CONSTANTES CORPUSCULARES Y CLASIFICACION

DE ANEMIAS.
Fundamento
Wintrobe ha introducido procedimientos para el estudio de las anemias
que han sustituido los estndares cuantitativos objetivos, y son
constantes corpusculares: El Volumen Corpuscular Medio (VCM), la
Hemoglobina Corpuscular Media (HCM) y la Concentracin Corpuscular
Media de Hemoglobina (CCMH).

La Anemia puede clasificarse segn la dimensin de la clula y su

contenido de Hemoglobina.La anemia puede clasificarse segn la
dimensin de la clula y su contenido de hemoglobina.
Procedimiento:
Con los datos de hemoglobina, hematocrito y recuentos de glbulos
rojos se puede calcular los ndices eritrocitarios y as conocer las
dimensiones y el contenido hemoglobnico de los eritrocitos; puede
determinarse utilizando las siguientes frmulas de Wintrobe.
Volumen Corpuscular Medio (VCM)
Es el volumen medio de los hemates individuales en micras cubicas.
VCM = (Hematcrito X 10 / Numero de glbulos rojos) =
Valores de referencia
Mujere 81 99
s
Hombr 83 95
Hemoglobina
Corpuscular Media
es
Es el contenido (peso)
de hemoglobina en un
hemate individual medido en picogramos. (pg )
HCM= (Hemoglobina X 10 / Numero de glbulos rojos) = pg.
Valores de referencia

Mujeres
Hombre
s

27 32 pg
27 32 pg

Concentracin Corpuscular Media de Hemoglobina.

Es la concentracin media de hemoglobina/100 ml de hemates
concentrados en porcentaje (%).
CCMH = (Hemoglobina / Hematcrito) X 100
Mujere
s
Hombr
es

30
34gr/100ml
30
34gr/100ml

Valores de Referencia

Las anemias se pueden clasificar en:

Anemias Microcticas con
VCM menos de 81.
Anemias
MicrocticasHipocromcas:
HCM <27 pg.
Por
deficiencia
de
hierro
Anemia sideroblastica
Talasemias

Anemias Macrociticas
con VCM mayor de 99
.
Anemia
Megaloblastica
Anemia refractaria
Anemia inducidas por
drogas
Eritroleucemias

Anemias
NormociticaNormocrmi
ca con VCM 81 99 .
Insuficiencia primaria
de la M.O.
Anemia aplasica
Linfomas
y
otras
neoplasias

RECUENTO DE RETICULOCITOS
El recuento de reticulocitos es un anlisis de sangre que mide a qu
velocidad los glbulos rojos llamados reticulocitos son producidos por la
mdula sea y liberados en la sangre. Los reticulocitos estn en la
sangre durante aproximadamente 2 das antes de convertirse en
glbulos rojos maduros.
El recuento de reticulocitos aumenta cuando hay mucha prdida de
sangre o en ciertas enfermedades en las que los glbulos rojos son
destruidos de forma prematura, como en la anemia hemoltica. Adems,
estar a grandes alturas puede hacer que el recuento de reticulocitos
aumente para ayudarlo a adaptarse a los niveles de oxgeno menores.

Fundamento
El reticulocito es una clula joven de la serie eritrocitica, carente del
ncleo y que solamente puede identificarse mediante el empleo de
tinciones supra vitales. Cuando se tie de azul de cresilo brillante u otros
colorantes supravitales que penetran en la clula viva antes de la
fijacin, se precipita el cido ribonucleico y aparece como una red azul
que da el nombre de reticulocito a la clula eritrocitaria. Este
procedimiento tambin identifica la Policromatofilia.
Las clulas rojas no nucleadas permanecen en la mdula sea hasta 4
das pasando por varios estadios de maduracin Debido a que la
sntesis de Hemoglobina no es completa, las coloraciones habituales
permiten observar a los reticulocitos como clulas policromatfilas.
Material y equipo de laboratorio
CANTID
AD
1 Tubo de 12 X 72
10 Lamina portaobjetos
2 Pipeta Pasteur
1 Gradilla
1 Cronometro
1 Bao Maria
1 Microscopio
Reactivos

DESCRIPCIN

Nuevo Azul de Metileno

Oxalato de Potasio
Agua destilada

0.5 gr
1.6 gr
100 ml

Azul de Cresilo Brillante

Sucosa
Citrato Sdico
Agua destilada

0.3 gr
8.0 gr
0.4 gr
100 ml

Material biolgico
Sangre con anticoagulante. (EDTA)
Tcnica

1.- Mezclar 2 gotas de sangre fresca y dos gotas de solucin del nuevo
azul de metileno en un tubo de ensaye de 12 75 tapar e incubar
durante 30 min en bao mara a 37C.
2.- Con una pipeta Pasteur despus de la incubacin poner una gota en
el portaobjetos y extender el frotis, leer con objetivo de inmersin.
3.- Se lee el nmero de reticulocitos presentes en 500 eritrocitos
marcando en una tecla de piano cuenta clulas el nmero de
reticulocitos y con otra el nmero de eritrocitos presentes por campo
hasta llegar a 500 eritrocitos, se para la cuenta y se hace una regla de 3.
Valores de referencia

Adultos
Nios

0.5 1.5 %
0.5 - 4.0 %

Lactantes

0.2 5.0%

Nota:El recuento de reticulocitos es uno de los procedimientos

esenciales en el diagnstico de la Hematologa, debido a que el nmero
de reticulocitos en sangre perifrica es un reflejo exacto de la actividad
eritropoyetica.

RETICULOCITOS TEIDAS CON AZUL DE CRESILO

FORMULA ROJA
Fundamento:

Este tipo de prueba consiste en el estudio cualitativo y cuantitativo de

los eritrocitos, adems es un parmetro importante para el medico en
prdidas agudas de sangre y alteraciones de la medula sea.
Algunos factores que afectan hematocrito, hemoglobina y conteo
eritroctico son:.
Cambios que inciden directamente en la circulacin de eritrocitos:
Valor disminuido: Se denomina anemia y valor aumentado
policitemia los tres parmetros disminuyen aunque este
decremento puede ser desproporcionado cuando existen cambios
en el tamao eritroctico y/o la cantidad de hemoglobina contenida
en ellos, por lo que el clculo e interpretacin de los ndices de la
formula roja son de ayuda en estos casos.
Valor aumentado: Denominado policitemia, donde aumente el
nmero de eritrocitos circulantes denominado policitemia
absoluta, tambin puede darse un aumento transitorio en los
eritrocitos circulantes denominado policitemia relativa (descritos
posteriormente).

Cambios en el volumen plasmtico:

Valor aumentado: Se presenta en estados de deshidratacin.
Valor disminuido: Se presentan en sobrehidratacin con fluidos
administrados parenteralmente dando unalectura que simula
anemia

La frmula roja comprende la determinacin de:

Glbulos Rojos
ERITOCIT
HematocritoOS
Hemoglobina

NEUTROFI Millones/mm
LINFOCIT
MONOCIT
LOS
OS
%OS
gr/dl

HCM

Pg

CCMH
VGM

gr/100ml
/clula

EDAD

TOTALES
(K/ul)

EOSINOFIL
OS

RANGO

PROMEDIO

1 DIA

9.4-34.0

1
SEMAN
A
1 MES
6
MESES
2 aos
4 aos
6 aos
8 aos
12
aos

3/13/200
1
v38254

PROMEDI
O
6

PROMEDIO

61

PROMEDI
O
31

5.0-21.0

45

41

6.0-17.5

35
32

56
61

7
5

3
3

33
42
51
53
54

59
50
42
39
38

5
5
5
4
4

3
3
3
2
2

5.15-15.5
4.5-13.5

13:20:26

LAB. ZABALA DELFIN Q.F.B. ROSA ZAVALA

IVANEZ
C.
LPB
932-41-43 931-39-22 V.URIBE 621 - 627
VERACUZ VER.
LABORATORY NORMAL RANGES
LO
HIGH
LOW
HIGH
LOW HIGH
W
WB 4.5 10.5
RBC male 4.04
6.10
femal 4.10 5.50
C
e
NE
42. 85.0
HGB male 14.0
18.0
femal 12.0 16.0
#
0
e
LY# 20. 50.0
HTC
male 42.0
52.0
femal 37.0 47.0
5
e
MO 1.7 12.0
MCV male 83.0
95.0
femal 81.0 99.0
#
e
EO
0.0 7.0
MCH
27.0
32.0
#
BA
0.0 3.0
MCH
30.0
34.0
#
C
NE
1.5 7.0
RDW
11.0
14.5
#
LY# 1.0 4.2
PLT
130
400

MO
#
EO
#
BA
#

0.1

1.0

MPV

7.4

10.4

0.0

0.7

PCT

0.158

0.425

0.0

0.3

PDW

12.0

16.5

EDAD

ERITROCIT
OS
(M/uL)
-3 4.0-6.5

1
DIAS
2
SEMANA
S
1 MES

2 6
MESES
6M 2
AOS
2 6
AOS
6 12
AOS

3.9-6.1

3.2-5.2
3.1-4.5
3.7-5.3
3.9-5.3
4.0-5.2

Hb
(Gg./dl)

Ht
(%)

V.G.M
(Fl)

HGM
(Pg)

Cm Hb c
%

14.520.5
12.518.5

44-64

95-117

31-37

29-37

39-59

86-117

28-37

28-37

10.016.0
9.9-14.5

32-52

84-115

28-37

29-37

30-42

74-108

26-34

30-36

10.513.5
11.513.5
11.515.5

33-39

70-86

23-31

30-36

34-40

75-87

24-30

31-36

35-45

77-95

25-33

31-36

TCNICA CONFIRMATORIA DE ANEMIA AFRICANA

PRUEBA DE INDUCCION DE DREPANOCITOS
(CON METABISULFITO DE SODIO)
Fundamento
Drepanocito es un eritrocito atpico, en forma de media luna, que
contiene hemoglobina S, una forma anormal de hemoglobina
caracterstica de la anemia drepanoctica.
El metabolismo del sodio reduce la tensin de oxgeno en la sangre
ocasionando que los eritrocitos que contienen hemoglobina S adopten la
forma de hoz o de Drepanocitos
CANTIDAD
DESCRIPCIN
1

Cubreobjetos

Lamina portaobjetos

Pipeta Pasteur

Gradilla

Pipeta automtica de 50 microlitros

Parrilla

Parafina

Aplicador

Microscopio

Material y equipo de laboratorio

Reactivos
Metabisulfito de Sodio al 2%
Material biolgico
Sangre con anticoagulante. (EDTA)
Tcnica:
1.-Sobre un portaobjetos depositar una
pequea gota de sangre
problema y una o dos gotas de metabisulfito de sodio al 2%.
2. Mezclar con aplicador de madera y colocar un cubreobjeto
3. calentar previamente parafina para sellar los bordes del cubreobjeto
con ayuda de un aplicador de madera.
4.-Observar al Microscopio con objetivo de 40X la presencias de clulas
falciformes.
Interpretacin
Los eritrocitos que contienen hemoglobina S adoptan la forma semilunar
en hoz o Drepanocitos. El nmero de Drepanocitos observados y el y el
tiempo en que aparecen es proporcional a la cantidad de hemoglobina S
presente. En la mayora de los portadores los Drepanocitos se
encuentran una hora despus, sin embargo se debe esperar que
transcurran las 24hrs antes de informar una prueba como negativa.
Positivo: presencia de clulas en forma semilunar o de drepanocitos.
Negativo: Ausencia de clulas en forma semilunar o de drepanocitos.

Clulas falciformes

ESQUEMAS DE LA INDUCCION DE DREPANOCITOS CON

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

Fundamento
Cuando los anticuerpos de clase IgM reaccionan con los antgenos de la
superficie de los eritrocitos, generan reacciones de aglutinacin, en
cambio los anticuerpos IgG pueden unirse a las clulas manifestando o
no la aglutinacin, esto depende tanto de la concentracin de antgeno
superficial como de la cantidad de anticuerpo presente por lo que este
clase de anticuerpos requieren de ciertas conducciones para poner de
manifiesto la reaccin de aglutinacin.
Generalidades
En 1945 Coombs y Cols introdujeron el uso de la antigamaglobulina
humana como una herramienta alterna para demostrar la unin de
anticuerpos IgG a clulas (sensibilizacin) los cuales por s mismo no
generan aglutinacin. Sin embargo dicha reaccin se favorece cuando el
reactivo de Coombs forma un puente entre los anticuerpos previamente
unidos a los eritrocitos.
La prueba de Coombs o de la antiglobulina se divide en directa e
indirecta. La prueba directa se emplea para demostrar la sensibilizacin
de eritrocitos in vivo lo cual ocurre en la incompatibilidad materno-fetal
que se manifiesta clnicamente como la anemia hemoltica del recin
nacido, en la anemia hemoltica autoinmune, anemia hemoltica inducida
por drogas y en transfusiones incompatibles.
Material y equipo de laboratorio
CANTID
DESCRIPCIN
AD
1
Tubos de 13 X 100
4
Tubos de 12 X 75
2
Pipeta Pasteur
1
Gradilla
1
Papel parafilm
1
Centrifuga
Reactivos
Suero de Coombs
Solucin Salina Fisiolgica
Material biolgico
Sangre con anticoagulante. (EDTA)

Tcnica
1.- Se obtiene por centrifugacin el paquete celular de la muestra
sangunea del paciente.
2.- Se lavan las clulas con 3ml de solucin salina isotnica y se
centrifuga a 2500 rpm.
3.- Con el paquete de eritrocitos lavados se prepara una suspensin al
2% en solucin salina isotnica (una gota de eritrocitos 49 gotas de
solucin salina isotonica)
4.- Se rotulan 4 tubos de la siguiente manera:
p. de Coombs directa
p. de Coombs auto testigo
p. de Coombs testigo positivo
p. de Coombs testigo negativo
5.- En el tubo para la prueba directa se depositan 2 gotas de la
suspensin al 2% de eritrocitos de paciente y 2 gotas del suero de
Coombs.
6.- En el tubo para el auto testigo se depositan 2 gotas para la
suspensin al 2% de eritrocitos del paciente y 2 gotas de suero del
paciente.
7.- Para el testigo positivo se depositan en el tubo 2 gotas de la
suspensin al 2% de eritrocitos sensibilizados con IgG y 2 gotas suero de
Coombs.
8.- Para el testigo negativo se depositan en el tubo 2 gotas de la
suspensin al 2% de eritrocitos no sensibilizados con anticuerpo y 2
gotas de suero de Coombs.
9.- Se agitan los tubos y se centrifugan a 1000 rpm durante 1 minuto.
10.- Se realiza la lectura resuspendiendo suavemente el botn celular. Si
se observa una reaccin de aglutinacin se demuestra la presencia de
anticuerpos unidos a las determinantes antignicas de los eritrocitos.

Interpretacin
Es POSITIVA cuando hay reaccin de aglutinacin, y nos indica que
hubo sensibilizacin in vivo de los eritrocitos (COOMBS DIRECTO).
El coombs directo es positivo en anemias hemolticas autoinmunes,
Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido, anemias hemolticas
inducidas por drogas.

DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO

Fundamento
La prueba se basa en la percepcin inmunolgica especifica antgeno
anticuerpo.
Para identificar los antgenos de los grupos A, B y O se usan antisueros
contra ellos y su presencia se pone de manifiesto por la aglutinacin de
los eritrocitos.
La mayora de estas reacciones antgeno anticuerpo implican la
aglutinacin de los hemates; por eso los anticuerpos se suelen
denominar hemaglutininas y los antgenos hemaglutonogenos.
Reactivos
Suero hemotipificador anti-A
75
Suero hemotipificador anti-B
Suero hemotipificador anti-AB
Material biolgico
Sangre fresca de origen venoso o
Capilar con o sin anticoagulante

Material
Tubos de ensaye de 10 x
Portaobjetos
Aplicadores de madera
Equipo
Centrifuga
Lmpara

Tcnica
Mtodo de placa:
1.- Se puede usar sangre total o bien una suspensin de glbulos rojos al
5% en solucin salina fisiolgica.
2.- Colocar una gota de suero anti-A, una de anti-B y otra de suero antiAB.
3.- Adicionar a cada gota de suero una gota de sangre total o de la
suspensin de glbulos rojos.

4.- Usando un aplicador de madera distinto para cada suero mezclar

bien e incline suavemente el portaobjetos a uno y otro lado durante 2
minutos.
5.- Observe si hay aglutinacin. No lea por ms de 2 minutos. La
periferia de las gotas tiende a secarse, no debiendo interpretarse como
positivo tal fenmeno.
Mtodo de tubo
1.- prepare una suspensin de glbulos rojos al 5% usando solucin
salina al 0.9% o bien el propio suero o plasma de la muestra de sangre.
2.- adicione una gota de suspensin a tres tubos de ensaye de 10X75.
3.- marque los tubos como A, B, y AB (Anti-A, Anti-B y Anti-AB)
4.- agregue a cada tubo una gota de suero Anti-A, Anti-B y Anti AB.
5.- Mezcle y centrifugue a 1000 rpm durante 1 min. O bien a 3400 rpm
por 20 segundos.
6.- re suspenda los glbulos con agitacin ligera del tubo, observe si hay
aglutinacin.

INTERPRETACION DE RESULTADOS
Las reacciones posibles son las siguientes:
SUERO HEMOCLASIFICADOR
Anti-A

Anti-B

Anti-AB

Grupo

AB

Antisueros

Ejemplos de
reacciones

TCNICA CONFIRMATORIA DE ANEMIA HEMOLITICA

ESFEROCTICA
FRAGILIDAD OSMOTICA DE LOS ERITROCITOS
Fundamento
La susceptibilidad del glbulo rojo a la rotura cuando se coloca en
solucin es hipotnica, depende sobretodo de la proporcin entre
superficie y volumen del hemate. El esferocito clsico es el que tiene la
menor superficie posible. Todo aumento en el contenido de esta clula
tiene por consecuencia su rotura. Como estas clulas se conducen como
verdaderos osmmetros perfectos, el agua entra en ellas en las
soluciones hipotnicas. Es este volumen adicional el que ocasiona la
rotura.
En el otro extremo de la escala se all la clula voluminosa y aplanada
de la talasemia o la clula aplanada irregularmente de la anemia

drepanocitica. En ambos casos el rea de la superficie de esta aumenta

en proporcin al volumen del hemate y penetra mayor volumen de agua
en estos glbulos rojos sin romperlos. Son ms resistentes a las
soluciones hipotnicas que las clulas normales.
La actividad metablica en el interior de la clula desempea tambin
cierto papel en la integridad estructural de las mismas. Este carcter es
el que se pone de manifiesto por incubacin.
El aumento de la fragilidad osmtica o la reduccin de resistencia a la
hemolisis es un rasgo de losesferocito, por los tanto esta prueba puede
indicar esferocitosis congnita, anemia hemoltica idioptica adquirida,
enfermedad hemoltica isoinmune del recin nacido, y otras anemias
hemolticas,
por
consiguiente
se
muestra
un cuadro
de
enfermedades identificadas de acuerdo al aumento o disminucin de la
fragilidad osmtica.
ENFERMEDADES QUE CURSAN CON ALTERACIONES DE
FRAGILIDAD OSMOTICA ERITROCITARIA (FOE)
AUMENTO DE LA FOE
DISMINUCION DE LA FOE
Esferocitosis hereditaria
Talasemias
Estomacitosis
congnita
o Anemia Ferropenica
Hidrocitosis
Anemia Hemoltica autoinmune Hemoglobina S
con esferocitosis
Anemia
Hemoltica Hemoglobina C
microangiopatica
Tcnica:
1. Se colocan los 16 tubos en una gradilla y se enumeran de la
izquierda ala derecha 3.8, 3.4 hasta 0.8
2. Se colocan 3.8 ml de solucin de cloruro sdico en el primer tubo,
3.6 en el segundo y as sucesivamente quitando 2 decimas hasta
llegar al tubo 16.
3. Se aade a cada tubo la cantidad de agua destilada necesaria
para que el volumen total alcance a 5 ml.
4. Se obtienen 5 ml de sangre venosa mediante agua y jeringa secas
y se mesclan en un frasco con 7.5 mg de heparina en condiciones
estriles.
5. Se mide 0.2 ml de sangre para cada tubo, y los tubos se invierten
con cuidado para asegurar la mezcla.
6. Hay que preparar tambin una serie de tubos de control utilizando
sangre normal.
7. Las gradillas que contienen los tubos se dejan en un refrigerador a
4C por 2 o 3 horas.

8. Se examinan los tubos observando en qu punto se empieza la

hemolisis y en qu punto se completa. El menor indicio de color
rojo en el lquido que sobrenada inicia destruccin de los glbulos
menos resistentes. La hemolisis completa queda inculcada por
una solucin rojo claro y ausencia de residuo en el fondo del tubo
o de enturbiamiento ala guitar ligeramente el tubo.
9. El resto de las muestras estriles de sangre del paciente y de su
control normal se incuban durante 24 horas a 37C y vuelve a
efectuarse la prueba.
Reactivos
Solucin de cloruro sdico qumicamente puro al 1%. La solucin salina
debe conservarse en un frasco con tapn de vidrio cerrado
hermticamente.
Material:
15 pequeos tubos de ensayo (tubos Wasserman)
Calculo:
Sangre normal

sol. Salina
1%
H2O
destilada
Conc. NaCl
sangre

sol. Salina
1%
H2O
destilada
Conc. NaCl
sangre

Hemolisis ligera
0.44% a 0.40%

Hemolisis completa
0.32% a 0.28%

tubo
1
3.8

tubo
2
3.6

tubo
3
3.4

tubo
4
3.2

tubo
5
3

Tubo
6
2.8

tubo
7
2.6

tubo
8
2.4

1.2

1.4

1.6

1.8

12

2.2

2.4

2.6

0.76
%

0.725

0.68
%

0.64
%

0.60
%

0.56
%

0.52
%

0.48
%

tubo
9
2.2

tubo
10
2

tubo
11
1.8

tubo
12
1.6

tubo
13
1.4

tubo
14
1.2

tubo
15
1

tubo
16
0.8

2.8

3.2

3.4

3.6

3.8

4.2

0.44
%

0.40
%

0.36
%

0.32
%

0.28
%

0.24
%

0.20
%

0.16
%

Tubo
s
Sol.
salin
a 9
2.2
Agua
2.8
NaCl
0.4
4
sang
re

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

10
11
12
13
14
15
16
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.40.8 2.6
3.0 0.7
3.2 0.6
3.4 0.6
3.6 0.6
3.8 0.54.0 0.54.2 0.4
0.7
6 0.4 2 0.3 8 0.3 4 0.2 0 0.2 6 0.2 2 0.1 8
0
6
2
8
4
0
6

Antes

Despus

BIOLOGIA MOLECULAR
rea Hematologa

El diagnstico molecular en hematologa permite la identificacin rpida, p

recisa y sensible de
translocaciones,

alteraciones

deleciones,

genticas

mutaciones

especificas

puntuales

como

asociadas

fenotipos leucmicos y coagulopatias. Tienen tambin un importante

valor

pronstico al permitir estratificar a los pacientes en diferentes

grupos de riesgo. La cuantificacin de estos marcadores genticos es

imprescindible para la evaluacin de la respuesta teraputica.
Marcadores moleculares de Leucemias
Patologa

Estudio

Muestra

LMC

Reordenamiento
BCR- ABL
cualitativo (RTPCR)
Cuantificacin
de BCR-ABL (QPCR)
Mutacin T 315 I
en dominio TK
del ABL
Mutacin en
dominio TK del
ABL
Mutacin V617F
en gen JAK2

10 ml de
sangre con
EDTA

SMPc

EOSINOFILIA
S

Gen
FIP1.L1/PDGFRA

LMA

Gen FLT 3.ITD y

mutacin D835

LMA-M2

AML1-ETO
t(8;21):

10 ml de
sangre con
EDTA
10 ml de
sangre con
EDTA
10 ml de
sangre con
EDTA
10 ml de
sangre con
EDTA
Mdula
sea con
EDTA
Debut:10 ml
sangre con
EDTA
Seguimient
o: MO con
EDTA
Debut 10 ml
sangre con
EDTA
Seguimient

Entrega de
Resultados
5 das

20 das

10 das
20 das

10 das

10 das

10 das

10 das

LMA-M3

PML-RARa
t(15;17)

LLA-B

Clonalidad:
reordenamiento
s IgH
BCR-ABL t(9;22)

MLL-AF4 t(4;11)

TEL-AML1 t
(12;21)
E2A-PBX1
t(1;19)

o: MO con
EDTA
Debut: 10
ml sangre
con EDTA

Mdula
sea con
EDTA
Mdula
sea con
EDTA
Mdula
sea con
EDTA
Mdula
sea con
EDTA
Mdula
sea con
EDTA

Seguimiento
: MO con
EDTA 48
horas
10 das

10 das

10 das

10 das

10 das

rea Hematologa
La irrupcin en los ltimos aos de las tcnicas moleculares y la mejora
de las tcnicas citogenticas ha revolucionado el diagnstico y
pronstico de las enfermedades hematolgicas provocando incluso el
cambio de la clasificacin de la OMS de algunas neoplasias
hematolgicas.
La Citogentica junto a la Biologa Molecular se han integrado con las
tcnicas
clsicas
(Citologa,
Inmunologa)
en
el
diagnstico
hematolgico.
El empleo de la mdula sea (sobre todo en leucemias agudas) aumenta
el rendimiento diagnstico respecto a la sangre perifrica (aunque sta
est infiltrada). En linfomas por el contrario deben estudiarse adems
ganglios o tejidos implicados, mientras que en la LLC la sangre perifrica
puede resultar ser la muestra adecuada para estudios citogenticos. En
general (en trastornos mieloproliferativos crnicos, mielodisplsicos y
leucemias agudas) la mdula sea es la muestra de eleccin para la
extraccin de cidos nucleicos (ADN y ARN) y efectuar los cultivos

citogenticos.
El valor diagnstico de los hallazgos citogenticos y moleculares se
conjuga con el no menos importante valor pronstico de muchos de
ellos.
rea Agentes Infecciosos
La deteccin y/o cuantificacin de oncogenes consiste en la deteccin
mediante tcnicas de PCR en tiempo real y/o secuenciacin de los
principales genes implicados en los trastornos hematolgicos. La
cantidad de oncogen es monitorizada a lo largo del tratamiento del
proceso hematolgico, como si de un marcador tumoral clsico se
tratara, con el objetivo final de llegar a desaparecer (curacin
molecular).
PATOLOGIA MIELOIDE
LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS:
Cariotipo convencional y sondas FISH para:
t(9;22) BCR/ABL
t(8;21) AML/ETO
inv(16) CBPB/MYH11
t(15;17) PML/RARA
11q23 MLL
RT-PCR cualitativa y cuantitativa para:
BCR/ABL
AML/ETO
CBPB/MYH11
PML/RARA
MLL
Deteccin de mutaciones en
FLT3
NPM1
WT1
c-KIT
SINDROMES MIELODISPLASICOS:
Cariotipo convencional y sondas FISH para:
del(5)(q31) y del(5)(q33-34)
del(7)(q31)
del(17)(p13) (p53)
del(20q)
CEP (8)
SINDROMES MIELOPROLIFERATIVOS:
-LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA
Cariotipo convencional y sondas FISH para:
t(9;22) BCR/ABL
RT-PCR cualitativa y cuantitativa para:
BCR/ABL
Estudio de mutaciones gen ABL (secuenciacin)
-OTROS SINDROMES MIELOPROLIFERATIVOS
(POLICITEMIA VERA,TROMBOCITEMIA ESENCIAL,MIELOFIBROSIS
IDIOPATICA):

Cariotipo convencional y sondas FISH para:

del(20)(q12)
PCR cualitativa y cuantitativa para:
V617F JAK-2 y mutaciones exn 12 JAK-2
MPL
-SINDROME HIPEREOSINOFILICO:
Cariotipo convencional y sondas FISH para:
FIP1PDGFRalfa
PDGFRbeta

PATOLOGIA LINFOIDE
LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS:
Cariotipo convencional y sondas FISH para:
t(9;22) BCR/ABL
t(12;21) TEL/AML
11q23 MLL
MYC/IgH
RT-PCR cualitativa y cuantitativa para:
BCR/ABL

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRONICOS:

Cariotipo convencional y sondas FISH para:
LEUCEMIA LINFOIDE CRONICA:
CEP 12
11q23 (ATM)
del(17)(p13) (p53)
del(13)(q14)
del(6)(q23)
Reordenamientos B (IgH)
Reordenamientos T (TCR)
LINFOMA:
t(11;14) BCL-1/IgH
t(14;18) BCL-2/IgH
t(8;14) IgH/c-MYC
t(14;18) MALT/IgH
3q27 BCL-6
2p23 ALK
PCR cualitativa y cuantitativa para:
BCL-1
BCL-2

BCL-6
MIELOMA MULTIPLE:
del(13)(q14)
del(17)(p13) (p53)
Aneuploidas (CEP 5, CEP 9 y CEP 15)
Reordenamiento IgH: (si reordena)
t(4;14) FGRF3/IgH
t(14;16) IgH/MAF
t(11;14) CCND1 Tx/IGH
si las anteriores son negativas:
t(14;20) IgH/MAFB
t(6;14) CCND3/IgH

OMOLECULARES (FISH)
La citogentica convencional consiste en el anlisis visual del juego
completo de cromosomas (cariotipo) obtenidos en metafase tras un
cultivo celular (requiere clulas en divisin). Permite analizar todos los
cromosomas en una sola prueba pero queda limitada por la resolucin
del bandeo cromosmico: no detecta alteraciones inferiores a 10Mb.

La citogentica molecular consiste en el anlisis mediante sondas

fluorescentes (FISH) de zonas o regiones concretas de uno o varios
cromosomas. Su principal ventaja es que puede aplicarse sobre clulas
en interfase (no requiere clulas en divisin) y facilita su anlisis sobre
un mayor nmero de clulas. Segn el diseo de la sonda de hibridacin
especfica, la FISH puede ser: centromrica, de locus especfico, de
brazos cortos y/o largos, de pintado cromosmico. Existen unas tcnicas
de FISH ms complejas que por combinacin de sondas marcadas con
diferentes fluorocromos se combinan permitiendo identificar cada
cromosoma de un color distinto (Cariotipo espectral) o bien cada banda
de un solo cromosoma (Multibanding). Estas tcnicas sirven para
resolver anomalas complejas y/o cromosomas marcador, no
identificables por las tcnicas citogenticas convencionales.

CITOGENTICO HEMATOLOGICO
El anlisis citogentico es el estudio de los cromosomas de las clulas en
metafase. Las anomalas cromosmicas pueden deberse a defectos en la
estructura a modificaciones en el nmero de los cromosomas.
diagnstico:
Es importante para establecer y/o confirmar el diagnstico, establecer
pronstico y monitorear respuesta al tratamiento en Anemias,
Leucemias y Linfomas; asimismo para establecer aceptacin rechazo
al trasplante.
La muestra que se cultiva en los estudios Citogenticos puede proceder
de cualquier tejido:

sangre perifrica
medula sea

Lquido amnitico y productos de la concepcin.

Ganglio
Bazo
Masas tumorales o efusiones tumurales,

Es imprescindible que la muestra no est contaminada en el momento

de su siembra y que el transporte hasta el Laboratorio de Citogentica
sea lo ms rpido posible. Las condiciones de cultivo varan en relacin
con el tipo de tejido que se pretende analizar y con el diagnstico de
sospecha de la enfermedad.
Tcnicas de estudio citogentico convencional
ESTUDIO
Prenatal

TECNICA Y DIAGNOSTICO
El medio ms efectivo de
prevenir
las
enfermedades
genticas.
La
amniocentesis,
extraccin de una muestra de
lquido amnitico en la semana
14-16 de gestacin

Biopsia Embrionaria

Biopsia de Vellosidades
Corinicas

Anlisis Cromosmico en Sangre

Perifrica

Estudio de Mdula sea

Consiste en extraer 1 o 2 clulas

de un embrin, se realiza un
pequeo orificio en la cubierta
externa del embrin, la zona
pelcida,
lo
cual
permite
introducir una fina micropipeta
(35 micras) para aspirar la clula
embrionaria
diagnstico temprano para poder
determinar si su beb esta
padeciendo alguna anormalidad
cromosmica como el Sndrome
de Down, trisomas 13 y 18,
Sndrome de Turner y Klinefelter,
etc.
El objetivo es obtener clulas en
reproduccin. Se consigue con
una muestra de sangre comn,
con rigurosa asepsia.
Este estudio se realiza en
patologas hematolgicas como
leucemias y linfomas, ya que se
observan
anomalas
cromosmicas. El cultivo es
semejante
al
descrito
para
sangre perifrica, salvo que no es
necesario estimular para que sus
clulas comiencen a dividirse ya
que lo hacen regularmente.

Las tcnicas de citogentica convencional su inters no es slo histrico,

sino que siguen proporcionando valiosa informacin clnica. En la
actualidad el anlisis de los cromosomas es obligado en el estudio de las
cromosomopatas, las hemopatas malignas, y de los tumores en los
procesos oncolgicos. En algunas ocasiones se dispone de sondas
especficas que complementan los hallazgos obtenidos por citogentica.

REFERENCIAS

www.hematologia.com.mx/
www.nietoeditores.com.mx/revista-de-hematologia.html
www.juntadeandalucia.es/averroes/recursos...4/frotissangre.html
www.uv.mx/.../06/HEMATOLOGIA-SERIE-ROJA-ANEMIAS.pptx
www.emagister.com/...hematologia.../hemograma-serie-roja-s... - E
spaa
www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/hemoglobina.pdf
www.uhclatino.com/.../Pruebasdelaboratorio/tabid/131/.../Default.asp
...
www.a14.san.gva.es/laboratorio/web/coombs.htm
bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8180/.../NN_27_1_1996_pag_55_60.pdf
http://www.alexanderfleming.org/View/121/citogenetica.aspx
http://www2.uah.es/biomodel/citogene/dynacare/geninfo.htm
http://www.cialab.com/oncohematologia.php
http://www.ivfpanama.com/es/teacutecnicasdeestudiocitogeneacuteti
coconvenciona.html
Goodnough LT. Transfusion medicine. In: Goldman L, Ausiello D, eds.
Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier;
2007:chap 183.

Este manual de Laboratorio de Tcnicas Hematolgicas ha sido

elaborado con la colaboracin de la maestra de la E.E. M.E. Ma. Luisa
Hernndez Huerta..
Alumnos:
-

Cynthia Kinabet Catana Chavarria

Apsara Nayibe Lira Uscanga

Airam soledad Salazar Aguilar

Jazmn Snchez Barahona