LABORATORIO DE BIORREACTORES

ELABOR: GARIBAY BENTEZ GUILLERMO, JUAN

CARLOS SIERRA RODRGUEZ, ROSA ISELA JIMNEZ CASTILLO

PRCTICA 1.1. PREPARACIN

MEDICIN DE CRECIMIENTO

DE

INCULOS

INTRODUCCIN.
CURVA DE CRECIMIENTO
Las clulas en un cultivo por lote atravesarn fases distintas. La fase lag, la cual puede o
no estar presente, es descrita como de poco o nulo crecimiento al inicio de la
fermentacin debido al equilibrio fisicoqumico que ocurre despus de la inoculacin
entre el microorganismo y el ambiente. La fase lag puede ser costosa y consumir
tiempo, resulta de tal manera que sea altamente deseable minimizar esta fase. Esto
puede ser logrado, creciendo el inoculo en un medio comparable al del biorreactor y
dentro de condiciones de crecimiento similares (pH, temperatura, etc.). Un mnimo de 5%
de volumen de clulas en crecimiento exponencial debera ser usado como inculo. Una
vez que las clulas han sido adaptadas a las nuevas condiciones de crecimiento, estas
entran en fase exponencial. Posteriormente, la clave para minimizar la duracin de la
fase lag es asegurarse que el cultivo que vaya a ser transferido tenga los niveles mnimos
de estrs posible. De manera prctica esto significa mantener ambos sistemas de
fermentacin lo ms parecidos posible. En realidad, esto no es sencillo, por lo general un
cultivo tardo en fase exponencial de matraz agitado existir en un ambiente donde los
niveles de substrato son reducidos, bajos niveles de oxgeno y elevados niveles de
dixido de carbono, el pH puede ser muy diferente del inicio del proceso. Claramente,
este cultivo ser transferido a un fermentador cargado con medio fresco, altamente
aireado y bajos niveles de CO 2. La inoculacin de fermentadores que minimicen la fase
lag es un compromiso que involucra experiencia emprica y conocimiento del carcter del
cultivo.

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Figura 1. Curva caracterstica de un microorganismo en cultivo en lote. 1, Fase Lag (no
siempre presente), 2 Fase transitoria de aceleracin, 3 Fase exponencial, 4 Fase de
desaceleracin, 5 Fase estacionaria, 6 Fase de muerte
Consumo de nutrientes y formacin de inhibidores (excretados de manera tpica, tales
como etanol, cido lctico, metanol y compuestos aromticos) tienen el efecto de
desacelerar el crecimiento y la clulas entran en fase estacionaria donde la velocidad de
crecimiento celular iguala a la de muerte. Eventualmente las clulas entran en fase de
muerte y se caracteriza por una cada en la densidad ptica y los niveles de biomasa en
la mayora de los cultivos.
PROTEASAS DE BACILLUS SUBTILIS
Bacillus subtilis ha sido ampliamente utilizada para producir enzimas, aditivos
alimentarios, vitaminas, antibiticos e insecticidas ya que es un eficiente sistema
productor de protenas homologas extracelulares, adems de servir como plataforma de
expresin para protenas heterlogas no glicosidasas. Bacillus subtilis es una bacteria con
forma de varilla o cilindro, de 4-10 m de largo y 0.25 a 1 m de dimetro. Las proteasas
rompen enlaces peptdicos que pueden ser internos (endopeptidases), N-terminal
(aminopeptidasas) o C-terminal (carboxipeptidasas). Las enzimas proteolticas se pueden
dividir en 4 clases basadas en su mecanismo de accin: a) las proteasas cistenicas (tiol
proteasas o sulfhidrlicas) b) las proteasas sernicas c) metaloproteasas y d) proteasas de
aspartato (carboxil proteasas y proteasas cidas. Los nombres indican uno de los grupos
catalticos claves en el sitio activo. Bacillus subtilis secreta dos proteasas teniendo a pH
ptimo de 7 y 9. Una de las isoformas puede ser caracterizada como una proteasa
sernica alcalina, la cual exhibe una estabilidad trmica a 60C y es activa en un intervalo
de pH de 9 a 11.

Figura 2. Micrografa de Bacillus subtilis

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OBJETIVO
Determinar condiciones de inoculacin y crecimiento de Bacillus subtilis.

MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES Y EQUIPO:
2 matraces 500 mL (1 por cada medio)
6 tubo falcon 50 mL por equipo.
1 Vaso precipitado 600 mL

Microscopio ptico
Espectofotometro
MICROORGANISMO:
Bacillus subtilis

HCl 1M
NaOH 1M
Camara de Neubauer
Micropipeta 1000 L
2 pipeta pasteur
Incubadora 37C, 180 rpm
pH metro
MEDIOS DE CULTIVO:
Medio 1
MEDIO 1

MEDIO 2

Descripcin

Cantidad
(g/L)

Descripcin

Cantidad
(g/L)

Extracto de Levadura

20

Sulfato de Amonio

Glucosa

Fosfato Bsico de potasio

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Sulfato de Magnesio
Heptahidratado

0.5

Fosfato cido de potasio

Cloruro de Calcio Dihidratado

0.01

Sulfato de Magnesio
Heptahidratado

0.4

Sulfato de Manganeso

0.01

Sulfato de Fierro
Heptahidratado

0.01

Extracto de Levadura

Extracto de Carne

15

Xilosa o Glucosa

15

Ajustar a pH 7 antes de esterilizar

Ajustar a pH 7 antes de esterilizar

MTODOS ANALTICOS
CONTEO CMARA DE RECUENTO
La cmara de recuento es un aprato de
precisin hecho de vidrio ptico especial.
Se utiliza para contar clulas u otras
partculas en suspensiones bajo el
microscopio.
Llenado de la cmara de recuento:
Posicionamiento del cubre-objeto: os soportes exteriores se humedecen conagua
destilada. Luego se coloca el cubreobjeto a suave presin desde delante sobre la cmara
de recuento. La creacin de lneas de interferencia (anillos de Newton) entre los soportes
exteriores y el cubre-objeto indica que el cubre-objeto est
colocado correctamente.
Cargar: Limpiar y secar la pipeta por fuera y mantenerla inclinada hasta que se haya
formado una pequea gota en la punta. Esta gota se sita en el punto entre el
cubreobjeto y la cmara de conteo. Por efecto de capilaridad el espacio entre el cubreobjeto y el fondo de la cmara se llena. Antes de que la solucin de sangre pueda
desbordar esta parte de la cmara, se debe retirarla. Si hay burbujas de aire o si se ha
desbordado lquido a las ranuras, la cmara tiene que ser limpiada y nuevamente
cargada.
RECUENTO DE PARTCULAS
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El recuento requiere un exacto conocimiento de las lneas del retculo de la respectiva
cmara de recuento. En la ilustracin se ve las lneas triples del sistem Neubauer
mejorado.
Para que las clulas, que estn encima o cerca de las lneas de limitacin, no se cuenten
dos veces o se olvidan en el recuento, hay que cumplir determinadas reglas
Se cuentan todas las clulas que se encuentran dentro de una definida zona de medicin.
Tambin se cuentan las clulas (marcadas en negro) que tocan o estn encima de 2(!)
lneas en un lado, p.ej. en la lnea de medida izquierda y superior.

Esto tambin es vlido para el tipo de operacin de recuento que debe realizarse en
forma de meandro. El recuento empieza en el ngulo superior izquierdo en direccin de la
flecha.

Comentarios acerca del recuento:

a) En todos los recuentos con cmaras, el diagrama del condensador en el microscopio
deber estar cerrado en gran parte.
b) La diferencia de las clulas contadas entre los cuadrados grandes y los cuadrados de
grupos no deber ser superior a 10 clulas.
c) En todos los recuentos de clulas, hay que realizar dobles determinaciones. Despus
del recuento del retculo superior, se recuenta como control tambin el retculo inferior.
Hay que tener en cuenta que la cmara no est resecada. Esto se puede evitar si se llena
la cmara inferior justo poco antes del recuento y se recuente despus del tiempo de
sedimentacin.
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d) La diferencia entre las sumas de los recuentos de ambos retculos de recuento no debe
sersuperior a 10 clulas. El valor intermedio de los recuentos se aplica luego en la
frmula de clculo o se multiplica con el factor correspondiente.
CLCULO:
Frmula

Nmero de clulas
=clulas por 1 L
Superficie recontada ( mm ) profunidad de la cmara ( mm ) dilucin
2

El retculo est compuesto de una divisin cuadrada que slo se puede ver debajo del
microscopio (aprox. 100 aumentos). A continuacin se describe la cmara de recuento
ms utilizada:
Neubauer-improved:
Cuadrado grande: 1 mm2
Cuadrado de grupo: 0,04 mm2
Cuadrado pequeo: 0,025 mm2
Profundidad de la cmara = 0,100 mm.

MEDICIN DE ABSORBANCIA
Utilice como blanco medio estril a temperatura ambiente sin esterilizar. Cada muestra
que cuente en cmara de neubauer lea absorbancia a 660 nm.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Prepare 250 mL de cada medio en un matraz de capacidad correspondiente. Inocule en
campana, permita que el medio se homogenice en la incubadora con agitacin a 180 rpm
a 37C por dos minuto. Posteriormente vace 15 mL en tubos falcon de 50 mL (3 tubos
por cada medio). Tome muestra inicial para comenzar conteo. No cierre hermticamente
los tubos, coloque cinta adhesiva a la tapa para evitar que se caiga por la agitacin.
Incube a 180 rpm por 37C por 12 h, tomando muestra y contando crecimiento mediante
cmara de neubauer y midiendo absorbancia a 660 nm. Durante 12 horas. Realice curvas
de crecimiento y determine duracin de cada fase de crecimiento. Correlacione medicin
de biomasa con densidad ptica. Realice un cronograma de actividades en el que se
dividan actividades e indiquen actividades correspondientes a cada persona. Los
experimentos se realizan por triplicado.
TABLA 1. Ejemplo de cronograma de actividades

HORA

USUARIO

CONTEO CMARA

ABSORBANCIA
660 nm

07:00

Fulano

3 clulas / 100 L

0.210

08:00

Zutano

4 clulas / 100 L

0.214
6

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09:00

Mengano

8 clulas / 100 L

0.420

Etc.

RESULTADOS Y DISCUSIN.

El alumno elaborara un informe, el cual contendr los siguientes puntos:

Diagramas en los que se muestre las fases de crecimiento medido con conteo en
cmara y en espectrofotmetro.
Determinar parmetros cinticos de crecimiento (, max, tiempo de duplicacin).
Diagrama de correlacin entre conteo vs absorbancia.
Determinar la duracin de fase lag, para determinar el tiempo de preparacin de
inoculo para escalamiento.
Propondr un mtodo (s) para medir producto y sustrato
OBSERVACIONES Y MEMORIA DE CLCULO. D EBE ANEXAR GRFICAS, CLCULOS , E

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ROMN

J.M., RODRGUEZ SIERRA

RAMREZ SENZ D., SALGADO

J. C.

OBSERVACIONES
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REFERENCIAS.
1. McNeil B. y Harvey L.M., Practical Fermentation Technology, John Wiley & Sons, Ltd, ISBN
978-0470-014349, (2008).
2. Ravinshankar K. et al., Isolation of alkaline protease from Bacillus subtilis AKRS3, African
Journal of Biotechnology, Vol. 11 No. 69, pp. 13415 13427, (2012).
3. Kuo-Jen H. y Chung-Yi W., Microfiltration characteristics of Bacillus subtilis fermentation
broth, Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, Vol. 43, pp 347-353, (2012).
4. Chatterjee J. et al., Production and characterization of thermostable alkaline protease of
Bacillus subtilis (ATCC 6633) from optimized solid-state fermentation, Biotechnology and
Applied Biochemistry, DOI: 10.1002/bab.1309, (2015).
5. Manual de Usuario cmaras de recuento tipo Neubauer, Superior, Marienfeld.

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