Generacin de un solo paso de ratones portadores de mutaciones en mltiples genes por

CRISPR / Ingeniera Cas mediada por Genoma

Resumen
Los ratones que portan mutaciones en mltiples genes son tradicionalmente generados por
una recombinacin secuencial en clulas madres embrionarias y / o entrecruzamiento en
consumo de tiempo en ratones con una sola mutacin. Los sistemas CRISPR/Cas han sido
adaptados como una eficiente tecnologa de reconocimiento de genes con el potencial para la
edicin de genomas multiplexados. Nosotros demostramos que la edicin gentica
CRISPR/Cas- mediada permite la interrupcin simultanea de cinco genes (Tet1, 2, 3,Sry, Uty - 8
alelos) en las clulas embrionarias madre del ratn (ES) con alta eficiencia. La inyeccin
conjunta de CAS9 ARNm y una sola gua de RNAs (sgRNAs) focalizoTet1 y Tet2 dentro de
cigotos de ratones generados con mutacin bialelica en ambos genes con una eficiencia del
80%. Finalmente, se muestra que la inyeccin conjunta de Cas9 ARNm / sgRNA con oligos
mutantes genero mutaciones puntuales precisas simultneamente en dos genes objetivos. As,
el sistema / Cas CRISPR permite la generacin de un solo paso de aquellos animales que portan
mutaciones en mltiples genes, un enfoque que se acelerar en gran medida el estudio en
vivo de genes redundantes funcionalmente las interacciones de genes epistaticos.
Introduccin
los ratones genticamente modificados representan una herramienta fundamental para la
comprensin de la funcin de genes en el desarrollo y la enfermedad. Los ratones mutantes
son convencionalmente generados por mutagnesis de insercin o por mtodos gen de la
orientacin. En los mtodos de gen de la orientacin convencionaleslas mutaciones se
introducen a travs de recombinacin homloga en clulas madre embrionarias (ES) de ratn.
clulas dirigidas ES inyectadas en blastocistos de tipo salvaje (WT) pueden contribuir a la lnea
germinal de animales quimricos, generando ratones que contiene la modificacin de genes
especficos. Es costoso y requiere mucho tiempo para producir ratones knockout de un solo
gen, y ms an para hacer doble ratones mutantes. Por otra parte, en la mayora de otras
especies de mamferos, las lneas de clulas ES establecidas no estn disponibles estas
contribuyen eficazmente a animales quimricos, lo que limita en gran medida los estudios de
gentica en muchas especies.
Los mtodos alternativos han sido desarrollados para acelerar el proceso de modificacin del
genoma mediante la inyeccin directa de ADN o ARNm de nucleasas especficas de sitio en el
embrin de una clula para generar rotura de doble cadena de ADN (OSD) en un locus
determinado en diversas especies. DSBs inducidas por estas nucleasas especficas de sitio
pueden ser reparados debido a propensos errores de recombinacin no homloga (NHEJ),
resultando en ratones y ratas que llevan deleciones o inserciones en el sitio de corte de
mutantes. Si se inyecta un plsmido donante con homologa a los extremos que flanquean el
OSD, de alta fidelidad de la recombinacin homloga puede producir animales con
integraciones especficas. Debido a que estos mtodos requieren los complejos diseos de
nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) o nucleasas de efectores como activador de transcripcin
(TALENs) para cada gen diana y debido a la eficiencia de direccionamiento puede variar
sustancialmente, Ningn gen multiplexado orientado en animales ha sido reportado hasta la

fecha. Para diseccionar las funciones de los miembros de la familia de genes con funciones
redundantes o para analizar las relaciones epistaticos en vas genticas, ratones con dos o ms
genes mutados son requeridos, lo que provoc el desarrollo de tecnologas eficientes para la
generacin de animales portadores de mltiples genes mutados.
Recientemente, el tipo de sistema CRISPR/Cas bacteriana tipo II se ha demostrado como una
tecnologa de gen de la orientacin eficiente con el potencial para la edicin genoma
multiplexada. Las bacterias y las arqueas han desarrollado un sistema inmune adaptativo
basado en el ARN que utiliza CRISPR (agrupado interspaced regularmente repeticin capica
corta) y CAS (CRISPR-asociado) protenas para detectar y destruir la invasin de virus y
plsmidos. Protenas de CAS, CRISPR RNAs (crRNAs), y complejos de ribonucleoprotenas forma
trans-activacin crRNA (tracrRNA), que se dirigen y degradan los cidos nucleicos extraos,
guiados por CRNAs. Se demostr que la endonucleasa de Cas9 de Streptococcus pyogenes tipo
sistema / Cas II CRISPR puede ser programado para producir la secuencia especfica de DSB in
vitro, proporcionando un ARN gua nica sinttica (sgRNA) que consiste en una fusin de
crRNA y tracrRNA. Ms intrigante, Cas9 y sgRNA son los nicos componentes necesarios y
suficientes para la induccin de la escisin de ADN especfica en clulas humanas cultivadas,
as como en el pez cebra.
Un informe reciente demostr tambin la interrupcin de un transgn GFP en ratones usando
el sistema de CRISPR / Cas. La facilidad de diseo, construccin y entrega de mltiples shRNAs
sugieren la posibilidad de edicin de multiplexado genoma de los mamferos. De hecho, un
estudio demostr que dos loci separados por 119 bp podran ser escindidos de forma
simultnea en clulas humanas cultivadas en una baja eficiencia. La extensin de la edicin
genoma multiplexado alcanzable todava no se ha demostrado en las clulas madre, as como
en los animales. Aqu, nosotros usamos el sistema / Cas CRISPR para accionar tanto la
interrupcin de genes basados en NHEJ de reparacin y homologa dirigida (HDR) basado en la
edicin gen precisa para lograr la orientacin altamente eficiente y simultnea de mltiples
genes en clulas madre y ratones.
Resultados

Orientacin simultanea de hasta 5 genes en clulas ES

Para probar la posibilidad de apuntar genes funcionalmente redundantes de la misma familia
de genes, diseamos sgRNAs a la diez-once miembros de la familia desplazamiento (Tet), Tet1,
Tet2 y Tet3 (Figura 1A). Protenas de tet (Tet1/2/3) convierten 5-METILCITOSINA (5mC) a 5hidroximetilcitosina (5hmC) en varios tejidos embrionarios y adultos y ratones mutantes para
cada uno de estos tres genes han sido producidos por recombinacin homloga en clulas
madre embrionarias. Para probar si el sistema CRISPR/Cas podra producir hendidura
especfica en el genoma del ratn, transfectadas plsmidos que expresan tanto el mamferocodn optimizado Cas9 y un sgRNA dirigidas a cada gen en las clulas ES de ratn y determina
la eficacia de la divisin dirigida por el anlisis del topgrafo. Los tres transfecciones Cas9sgRNA producen la escisin en loci diana con una alta eficiencia de 36% a Tet1, 48% en Tet2, y
36% en Tet3 (Figura 1B). Debido a que cada locus diana contiene un sitio de reconocimiento de
enzima de restriccin (Figura 1A), PCR amplifica un fragmento de bp 500 alrededor de cada

sitio de destino y digeridos los productos PCR con la enzima correspondiente. Un alelo
especfica correctamente perder el sitio de la restriccin, que puede ser detectado por no
unirse al tratamiento enzimtico. Un alelo correctamente dirigido perder el sitio de
restriccin, que puede ser detectado por el fracaso para escindir por tratamiento enzimtico.
El uso de esta restriccin de longitud de fragmentos polimrficos (RFLP) de ensayo, que
proyectar 48 clones de clulas ES de cada experimento de focalizacin individual. En
consonancia con el anlisis del topgrafo, un alto porcentaje de clones de clulas ES fueron
blanco, con una alta probabilidad de tener ambos alelos mutados (Figura S1 A disponible en
lnea). Los resultados resumidos en la Tabla 1 demuestran que entre 65% y 81% de los clones
de clulas ES probados mutaciones realizadas en los genes Tet con hasta 77% tienen
mutaciones en ambos alelos.
La alta eficacia de la modificacin de un solo gen nos llev a probar la posibilidad de apuntar a
los tres genes simultneamente. Para esto la transfeccin de clulas ES con las construcciones
que expresan Cas9 y tres sgRNA dirigidos Tet 1, 2, y 3. De los 96 clones seleccionados
utilizando el ensayo de RFLP, 20 clones fueron identificados como que tienen mutaciones en
los seis alelos de los tres genes (Figuras 1C y S1B y Tabla 1). Para excluir un sesgo que la PCR
podra dar resultados falsos positivos, se realiz un anlisis de transferencia de Southern y
confirm completo acuerdo con los resultados de RFLP (Figura 1C). Subclono y ordenamos los
productos PCR de Tet1, Tet2 y regiones orientada a Tet3 orientada que todos los ocho clones
ensayados realizadas mutaciones biallicos en los tres genes con la mayora de los clones que
muestran dos alelos mutantes para cada gen con pequeas inserciones o deleciones ( indeles)
en el sitio diana (Figura 1D). Para probar si estos alelos mutantes suprimian la funcin de las
protenas Tet, se compar el nivel 5hmC de clones dirigidos a clulas madre embrionarias WT.
Anteriormente, se inform de un agotamiento de 5hmC en Tet1 / knock-out clulas ES Tet2
obtenidas utilizando mtodos tradicionales gen de la orientacin (Dawlaty et al., 2013). Como
era de esperar de la prdida de alelos de funcin, se encontr una reduccin significativa de
los niveles de 5hmC en todos los clones que llevan mutaciones biallicos en los tres genes
(Figura 1E).
Para probar an ms el potencial de multiplexado de orientacin por el sistema / Cas CRISPR,
diseamos sgRNAs a dos genes ligados, Sry y Uty (figura S1C). Cortos productos PCR
codificacin sgRNAs dirigida a todos los cinco genes (Tet1, Tet2, Tet3, Sry y Uty) se agruparon y
se transfectaron con un plsmido que expresa Cas9 y el casete PGK puroR en clulas ES. De los
96 clones que fueron seleccionados usando el ensayo de RFLP, 10% lleva a mutaciones en los
ocho alelos de los cinco genes (Figura S1D y en la Tabla S1), lo que demuestra la capacidad del
sistema de CRISP / Cas9 para el gen de multiplexado altamente eficiente orientacin.
Generacin de un solo paso en ratones con genes simples mutantes por inyeccin de cigotos
Hemos probado si los ratones mutantes podran ser generados en vivo mediante la
manipulacin de embriones directa. El poliadenilado cubierto Cas9 mRNA fue producido por la
transcripcin in vitro y la inyeccin conjunta con sgRNAs. Inicialmente, para determinar la
concentracin ptima de Cas9 ARNm para la orientacin en vivo, se microinyect cantidades
variantes de Cas9 que codificando ARNm con Tet1 enfocando sgRNA a una concentracin
constante (20 ng / ml) en fase pro-nuclear (PN) una clula de embrion de ratn y se evalu la

frecuencia de alelos alterados en la fase de blastocistos utilizando el ensayo de RFLP. Como era
de esperarse, una mayor concentracin de ARNm Cas9 llev a ms eficiencia la alteracin del
gen (Figura S2A). Sin embargo, incluso los embriones inyectado con la mayor cantidad de Cas9
mRNA (200 ng / ml) mostraron un desarrollo normal de blastocistos, sugiriendo una baja
toxicidad.
Para investigar si los ratones post-natales portadores de mutaciones objetivas podran ser
generados, cuando se inyecta shRNAs dirigidos Tet 1 O Tet2 con diferentes concentraciones de
Cas9 mRNA. Los blastocistos derivados de los embriones inyectados se transplantaron a
madres adoptivas y se obtuvieron cras recin nacidas. Como se resume en la tabla 2,
alrededor del 10% de los blastocistos transferidos desarrollado nacimiento independiente de
las concentraciones de RNA utilizadas para inyeccin, que sugiere baja toxicidad fetal de Cas9
mRNA los sgRNA. RFLP, Southern blot y secuenciacin anlisis demostraron que entre 50 y
90% de los ratones postnatales llevaron mutaciones bialelicos en cualquier gene de la blanco
(Figuras 2A, 2B y 2C y tabla 2).
Sorprendentemente, especfica D9 Tet1 y alelos mutantes especficos D8 y D15 TET2 se
recuperaron varias veces en ratones derivados de forma independiente. generacin
preferencial de estos alelos probablemente es causada por una repeticin corta secuencia que
flanquea el OSD (vase la Figura S2B) consistente con informes previos que demuestran que
las secuencias microhomology perfectos que flanquean los sitios de escisin puede generar
microhomology mediada por deleciones preciso por el mecanismo de reparacin del extremo
(MMEJ) (Figura S2 B). Una observacin similar se hizo tambin cuando TALEN mRNA se inyect
en embriones de rata de una sola clula. Tambin se dedujo a partir de blastocistos cigotos
inyectados con ARNm y Cas9 Tet3 sgRNA. El genotipado de los blastocistos demostr que los
embriones de ocho tres eran homocigotos y tres eran mutantes heterocigotos Tet3 (dos
intentos fallidos para amplificar) (Figura S2C). Algunos blastocistos fueron implantados en
madres adoptivas y, tras la cesrea, que fcilmente identificado varios ratones de tamao ms
pequeo (Figura S2D), muchos de los cuales murieron poco despus del parto. La
genotipificacin se muestra en la Figura S2E indic que todos los cachorros con mutaciones en
ambos alelos Tet3 murieron neonatally. Slo 2 de cada 15 ratones sobrevivieron que eran o
mutantes heterocigotos Tet3 o WT (Figura S2F). Estos resultados son consistentes con el
fenotipo neonatal letal de ratones knockout Tet3 generados utilizando los mtodos
tradicionales, a pesar de que todava no hemos establecido que de las mutaciones Tet3
produce prdida de la funcin en lugar de alelos hypomorphic.

Generacin de un solo paso de ratones doble gen mutante por inyeccin de zigoto
Para probar si Tet1 / TET2 ratones doble mutantes podran ser producidos a partir de
embriones individuales, que coinjected Tet1 y Tet2 sgRNA con 20 o 100 ng / ml mRNA Cas9 en
cigotos. Un total de 28 cras nacieron a partir de 144 embriones transferidos a madres
adoptivas (21% de tasa de nacidos vivos) que haban sido inyectados en la fase de cigoto con
altas concentraciones de ARN (Cas9 ARNm a 100 ng / ml, sgRNA a 50 ng / ml ), consistente con
baja o ninguna toxicidad del ARNm Cas9 y sgRNAs (Tabla 3). RFLP, anlisis de transferencia
Southern, y la secuenciacin identificaron 22 ratones portadores de mutaciones dirigidas en

las cuatro alelos de los genes Tet1 y TET2 (Figuras 2D y 2E) con el resto de los ratones
portadores de mutaciones en un subconjunto de alelos (Tabla 3). La inyeccin de cigotos con
baja concentracin de ARN (Cas9 ARNm a 20 ng / ml, sgRNA a 20 ng / ml) produjo 19 cras de
75 embriones transferidos (25% de tasa de nacidos vivos), que es una tasa de supervivencia
ms alta que a partir de embriones inyectados con 100 ng / ml de Cas9 ARN. Sin embargo, ms
de 50% de los cachorros eran mutantes dobles Tet1 / TET2 biallicos (Tabla 3). Estos resultados
demuestran que los ratones postnatales que llevan mutaciones biallicos en dos genes
diferentes pueden ser generados dentro de un mes con una alta eficiencia (Figura 2F).
Aunque la alta tasa de nacidos vivos y el desarrollo normal de los ratones mutantes sugieren
toxicidad baja del sistema CRISPR/Cas9, se intent determinar los efectos off-target (fuera de
alcance) en vivo. Trabajos previos in vitro en bacterias y en clulas cultivadas humanas
sugieren que la secuencia adyacente de protospacer de adorno (PAM) NGG y el 8 a 12 base ''
semilla secuencia '' al final 30 de lo sgRNA es ms importantes para determinar la especificidad
del clivaje de ADN. Sobre la base de esta regla, slo existen tres y cuatro blancos potenciales
fuera en el genoma del ratn para Tet1 y Tet2 sgRNA, respectivamente (Tabla S2 y
Procedimientos Experimentales), con cada uno de ellos combina perfectamente la secuencia
de semillas de 12 pb en el 30 extremo y el NGG PAM secuencia de la gRNA (no hay potencial
sitio fuera del objetivo de Tet3 sgRNA el uso de esta regla de prediccin). De siete ratones
mutantes producidos a partir de doble inyeccin con alta concentracin de ARN PCR
amplificado de 400 a 500 pb fragmentos de los siete loci potencial fuera del objetivo y
encontramos ninguna diferencia de peso en el ensayo Surveyor (Figura S3), lo que sugiere una
alta especificidad de CRISPR / Cas sistema.
Multiplexado de la edicin del genoma mediada por HDR precisa en Vivo
Las mutaciones de gene mediada por NHEJ descritas producen alelos del mutante con
diferentes e impredecibles inserciones y delecciones de tamao variable. Exploramos la
posibilidad de reparacin precisa homologa dirigida (HDR)-mediada por la edicin del genoma
por coinjecting Cas9 mRNA, sgRNAs y oligos de ADN monocatenario en embriones de una
clula. Para esto hemos diseado un oligo dirigidos a Tet1 para cambiar los dos pares de la
base de un sitio de restriccin SacI y crear en su lugar un sitio de EcoRI y un segundo oligo a
Tet2 con dos cambios de par que convierten un sitio EcoRV en un sitio de EcoRI (Figura 3A).
Blastocistos fueron derivadas de cigotos inyectadas Cas9 mRNA y sgRNAs y oligos dirigido a
Tet1 o Tet2, respectivamente. ADN fue aislado, amplificado y digerido con EcoRI para detectar
eventos HDR oligo-mediada. Seis de los nueve embriones dirigidos a Tet1 y 9 clientes de los 15
embriones orientada en Tet2 incorporan un sitio de EcoRI en el lugar de destino respectivo,
con varios embriones tener ambos alelos modificados (figura S4A). Cuando Cas9 mRNA,
sgRNAs y oligos de ADN monocatenario dirigidos a Tet1 y Tet2 fueron coinyectado en cigotos,
de embriones de 14, cuatro fueron identificado que fueron objeto de la oligo en el locus Tet1,
siete que fueron dirigidas con oligo en el locus Tet2 y un embrin (2) que tena un alelo de
cada gen modificado correctamente (figura S4B). Se secuenciaron todos cuatro alelos del
embrin 2, confirmando un alelo de cada gen contiene los cambios bp 2 dirigidos por el oligo,
mientras que los otros alelos fueron interrumpidos por eliminacin mediada por NHEJ y la
insercin (figura S4C).

Los blastocistos con inyecciones dobles oligo se implantaron en madres adoptivas y un total de
10 cras nacieron a partir de 48 embriones transferidos (21% de tasa de nacidos vivos). Tras el
anlisis RFLP utilizando EcoRI, se identificaron siete ratones que contienen sitios EcoRI en el
locus Tet1 y ocho ratones que contienen sitios EcoRI en el locus Tet2, con seis ratones que
contienen sitios EcoRI en ambos Tet1 y loci Tet2 (Figura 3B). Tambin se aplic el anlisis de
RFLP utilizando SacI y EcoRV para Tet1 y Tet2 loci, respectivamente, lo que demuestra que
todos los alelos que no va dirigida oligos contenan las interrupciones, que est en consonancia
con la alta tasa de mutacin biallico por Cas9 ARNm y la inyeccin de siRNA. Estos resultados
se confirmaron por secuenciacin de las mutaciones que demuestran en los cuatro alelos de
ratn 5 y 7 (Figura 3C). Nuestros resultados demuestran que se pueden generar ratones con
HDR-mediada exacta mutaciones en mltiples genes en un solo paso por CRISPR/Cas-mediada
por la edicin del genoma.
Discusin
La manipulacin gentica de los ratones es un enfoque fundamental para el estudio del
desarrollo y la enfermedad. Sin embargo, la generacin de ratones con mutaciones especficas
es una labor intensiva e implica la focalizacin de genes por recombinacin homloga en
clulas madre embrionarias, la produccin de ratones quimricos, y, despus de la transmisin
de la lnea germinal de las clulas madre embrionarias focalizadas, al cruce de ratones
heterocigticos para producir a los animales de experimentacin homocigticas, un proceso
que puede tardar de 6 a 12 meses o ms (Capecchi, 2005).
Para producir ratones que llevan mutaciones en varios genes se requiere tiempo cruzando
ratones de una sola mutacin. Del mismo modo, la generacin de las clulas madre
embrionarias que portan mutaciones homocigticas en varios genes generalmente se logra
mediante una divisin (focalizacin) secuencial, un proceso intenso, que requiere mltiples
clonaciones de pasos consecutivos para seleccionar los genes y para borrar los marcadores
seleccionables.
Como se resume en la figura 4, se han establecido tres enfoques diferentes para la generacin
de ratones que portan mltiples alteraciones genticas. Demostramos que la edicin mediada
del genoma CRISPR/Cas en clulas madre embrionarias puede generar mutaciones simultneas
de varios genes con alta eficiencia, en un solo paso que permite la produccin de clulas con
mutaciones en cinco genes diferentes (Figura 4A). Se eligieron los tres genes Tet como objetivo
porque los respectivos fenotipos mutantes han sido previamente bien definidos (Dawlaty et al,
2011, 2013;.. Gu et al, 2011). Las clulas mutantes para Tet1, 2 y 3 se redujeron 5hmC como
era de esperar por la prdida de la funcin mutaciones de los genes (Dawlaty et al., 2013). Sin
embargo, no se ha establecido hasta ahora, cul de las mutaciones genticas mediadas por
Cas9 produce la prdida de funcin mutante en lugar de alelos hipomorfos.
Tambin se muestra que los embriones de ratn se pueden modificar directamente mediante
la inyeccin de Cas9-ARNm y sgARN en el vulo fertilizado lo que resulta en la produccin
eficiente de ratones portadores de mutaciones bi-allico en un gen dado. Ms
significativamente, la inyeccin de Cas9 con Tet1 y Tet2 sgARN en cigotos, produjo ratones que
llevan mutaciones en ambos genes (Figura 4B, superior). Se encontr que hasta el 95% de los
ratones recin nacidos eran mutantes bi allicos en el gen seleccionado cuando se inyect solo

sgARN, y cuando se inyectaron simultneamente con dos tipos diferentes de sgARN, hasta el
80% llevaba mutaciones bi-allicas en ambos genes seleccionados. Por lo tanto, los ratones
que lleva mltiples mutaciones se pueden generar dentro de 4 semanas, el cual es un perodo
de tiempo ms corto del que se puede lograr por seleccin consecutiva de los genes de
manera convencional en las clulas madre Embrionarias y evita consumir tiempo cruzando
ratones con una sola mutacin.
La introduccin de las DSBs por CRISPR/Cas genera alelos mutantes con diferentes supresiones
o inserciones, muy diferente a las mutaciones diseadas puntualmente creadas por
recombinacin homloga. Las introducciones de mutaciones puntuales en las clulas madre
humanas, lneas de clulas cancerosas, y el ratn por ZNF o TALEN junto con oligo-ADN han
sido previamente demostradas (Chen et al, 2011;. Soldner et al., 2011; Wefers et al., 2013). Se
demuestra que la seleccin mediada por CRISPR/Cas es til para generar alelos mutantes con
alteraciones predeterminadas, e inyecciones simultneas de oligonucletidos de cadena
sencilla pueden introducir mutaciones diseadas puntualmente en dos genes seleccionados en
un solo paso, lo que permite la edicin de genes mltiples en una forma controlada (Figura 4B,
abajo). Ser de gran inters para evaluar si este sistema de focalizacin permite la produccin
de alelos condicionales, o la insercin precisa de fragmentos de ADN ms grandes como
marcadores de GFP para generar eliminaciones condicionadas y ratones referenciados para
genes especficos.

Existen varias limitaciones potenciales de la tecnologa CRISPR/Cas. Primero, el requisito de

una secuencia NGG PAM de S. pyogenes Cas9 limita el espacio a seleccionar en el genoma del
ratn. Se ha demostrado que el Streptococcus thermophilus LMD-9 Cas9 utilizando diferentes
secuencias PAM, pueden tambin inducir la escisin del ADN en clulas de mamferos (Cong et
al., 2013). Por lo tanto, la explotacin de diferentes protenas Cas9 pueden permitir
seleccionar la mayor parte del genoma del ratn. En segundo lugar, aunque el sgARN utilizado
aqu mostr una alta eficacia en la seleccin, se necesita mucho trabajo para dilucidar las
reglas para el diseo de sgARN con la consecuente alta eficiencia de la focalizacin, que es
esencial para la ingeniera de los genomas mltiples. En tercer lugar, aunque nuestro desviado
anlisis de los siete objetivos ms probables por fuera de los sgARN Tet1 y Tet2 no pudo
detectar mutaciones en estos lugares, es posible que otras mutaciones se indujeran siguiendo
patrones no identificados. Un anlisis ms completo de la secuencia para un gran nmero de
sgARN proporcionar ms informacin sobre el potencial de los no seleccionados en el sistema
de CRISPR/Cas y dar lugar a una mejor prediccin de posibles sitios de fuera de los objetivos.
Por ltimo, la reparacin mediada por oligos permite la edicin precisa del genoma, pero el
otro alelo es a menudo mutado a travs de NHEJ (figuras 3B, 3C, y S4C). Se ha demostrado aqu
que el uso de una menor concentracin de Cas9ARNm genera ms ratones con mutaciones
heterocigticas. Por tanto, puede ser posible optimizar el sistema para la generacin ms
eficiente de ratones con slo un oligo-alelo modificado. Adems, el empleo de Cas9 es
probable que evite esta complicacin, porque induce principalmente a rompimientos de ADN
de una sola cadena, que suele ser reparado a travs de HDR (Cong et al, 2013;.. Mali et al,
2013).

Es probable que un nmero mucho mayor de lugares genmicos que objetivos en el presente
trabajo puedan ser modificados de forma simultnea Cuando se introducen agrupaciones de
sgARN. Los mtodos presentados aqu abren la posibilidad para la ingeniera sistemtica del
genoma en ratones, lo que facilita la investigacin en muchos caminos, de fenotipos letales
sintticos o de genes que tienen funciones redundantes. Una aplicacin particularmente
interesante es la posibilidad de producir ratones que porten mltiples alteraciones en lugares
candidatos que se han identificado en estudios GWAS como los que desempean un papel en
la gnesis de enfermedades multignicas. En resumen, la edicin del genoma mediada por
CRISPR / Cas hace posible la generacin de clulas madre embrionarias y ratones que portan
mltiples alteraciones genticas y facilitar la diseccin gentica en el desarrollo de
enfermedades complejas.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Procedimientos para la generacin de sgARN vector de expresin
El vector de expresin bicistrnico que expresa Cas9 y sgARN (Cong et al., 2013) fueron
digeridos con BbsI y tratado con fosfatasa de la Antrtida, y el vector linealizado se purific en
gel. Un par de oligonucletidos para cada sitio de focalizacin (Tabla S3) fue reforzado,
fosforado, y se lig al vector linealizado.
Cultivo de clulas y transfeccin
Las clulas madre embrionarias (en un 129/Sv x C57BL/6 F1 de antecedentes hbridos) se
cultivaron en placas recubiertas de gelatina con condiciones estndar de cultivo celular ES. Las
clulas son transfectadas con un plsmido que expresa un codn optimizado de mamferoCas9 y sgARN (una sola seleccin), tres plsmidos que expresan Cas9 y sgARN para la
focalizacin Tet1, Tet2, y Tet3 (triple focalizacin), o cinco productos de PCR para cada
codificacin para de sgARN Tet1, Tet2, Tet3, Sry, y Uty, junto con un plsmido expresando
PGK-puroR usando el reactivo FuGENE HD (Promega) de acuerdo con la Instrucciones del
fabricante. Doce horas despus de la transfeccin, se volvieron a sembrar las clulas ES a una
densidad baja en capas alimentadoras de MEF DR4. Puromicina (2 mg / ml) era aadido 1 da
despus del replateo y despegue despus de 48 horas. Despus de recuperarse de 4 a 6 das,
las colonias individuales se seleccionaron y se genotiparon por RFLP y anlisis blot del Sur, y el
resto de clulas madre embrionarias en la placa para el ensayo Suveryor.
Ensayo de Suveryor y anlisis de RFLP para la modificacin del genoma
El ensayo de Suveryor se realiz como se describe en (Guschin et al., 2010). El ADN genmico
para el tratamiento y el control de las clulas madre embrionarias o la seleccin y control de
los ratones fueron extradas. Las muestras de ADN genmico de ratn se prepararon a partir
biopsias de la cola. Los productos de PCR se realizaron usando Tet1-, 2-, y 3- (Tabla S3) en las
siguientes condiciones: 95C durante 5 min; 35 x (95C durante 30 s, 60C durante 30 s, 68C
durante 40 s); 68C durante 2 min; mantener a 4 C. Los productos de PCR fueron entonces
desnaturalizados, recocidos, y se trat con nucleasa Suveryor (Transgnica). La concentracin
de ADN de cada banda se midi en un teido con etidio-bromuro al 10% de gel de acrilamida
Criterion-TBE (BioRad) y se cuantific utilizando el software ImageJ. Los mismos productos de

PCR se utilizaron para el ensayo de Suveryor para el anlisis RFLP. Diez microlitros de Tet1,
Tet2, o Tet3 de PCR producido se digiri con SacI, EcoRV, o XhoI, respectivamente. El ADN
digerido se separ en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio (2%). Para la
secuenciacin, Los productos de PCR se clonaron usando el kit de clonacin original TA
(Invitrogen), y las mutaciones se identificaron mediante la secuenciacin de Sanger.
La mancha de punto
Se extrajo ADN de las clulas ES siguiendo procedimientos estndar. El ADN se transfiri a una
membrana de nylon utilizando un aparato colector de ranura BioRad de transferencia de vaco.
Anti-5hmC (Active Motif 1: 10.000) se utiliz para detectar 5hmC siguiendo el protocolo del
fabricante.
La produccin de ARNm y Cas9 sgARN
El promotor T7 se aadi a la regin de codificacin Cas9 mediante amplificacin por PCR
usando como base Cas9 F y R (Tabla S3). El producto de T7-Cas9 PCR se purific en gel y se
utiliz como la plantilla para la transcripcin in vitro (IVT) utilizando mMESSAGE mMACHINE T7
kit ULTRA (Life Technologies). Se aadi el promotor T7 a la plantilla de sgARN mediante
amplificacin por PCR usando el cebador Tet1 F y R, Tet2 F y R, y Tet3 F y R (Tabla S3). El
producto T7-sgARN PCR se purific en gel y se us como la plantilla para IVT usando el kit
MEGAshortscript T7 (Life Technologies). Tanto el ARNm Cas9 como los sgRNAs se purificaron
usando MEGAclear kit (Life Technologies) y se diluy en agua libre de RNasa.
Inyeccin de una sola de clula de embrin
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH y
aprobado por el Comit de Cuidado de Animales en el MIT.) cepas de ratones hembra y de
ratn ICR B6D2F1 (C57BL / 6 X DBA2 fueron utilizados como donantes de embriones y madres
sustitutas, respectivamente. Las superovuladas ratones hembra B6D2F1 (7- 8 semanas de
edad) fueron apareadas con machos sementales B6D2F1, y los embriones fertilizados se
recogieron de los oviductos. Cas9 mARNs (de 20 ng / ml a 200 ng / ml) y sgARN (de 20 ng / ml a
50 ng / ml) se inyect en el citoplasma de los vulos fertilizados con proncleos bien
reconocidos en medio M2 (Sigma). Para la inyeccin con oligos, Cas mRNA (100 ng / ml),
sgRNA (50 ng / ml), y oligos donantes (100 ng / ml) se mezclaron y se inyectaron en cigotos en
la fase de proncleos. Los cigotos inyectados se cultivaron en KSOM con aminocidos a 37 C
con 5% de CO2 en aire hasta la etapa de blastocito en 3,5 das. A partir de entonces, 15-25
blastocitos fueron transferidos al tero de hembras ICR pseudopreadas a 2,5 dpc.
Transferencia de Southern
El ADN genmico se separ en un gel de agarosa al 0,8% despus de la digestin restringida
con las enzimas apropiadas, se transfiri a una membrana de nylon (Amersham) e hibridada
con base aleatorio 32P (Stratagene) marcado con sondas.

Prediccin de los objetivos potenciales

Los objetivos potenciales de sgARN CRISPR se encontraron usando las reglas sealadas en
(Mali et al., 2013). Para una secuencia dirigida a 20 nt de sgARN nnnnn nnMMM MMMMM
MMMMM, donde M son las semillas bases procedentes del PAM secuencia de NGG, cuatro
secuencias de bsqueda se generaron (MMM MMMMM MMMMM AGG; MMM MMMMM
MMMMM CGG; MMM MMMMM MMMMM GGG; MMM MMMMM MMMMM TGG). Se
encontraron coincidencias exactas a stas secuencias buscadas en el genoma del ratn (mm.9)
fueron encontradas usando bowtie y reportados como posibles objetivos de la CRISPR sgARN.
INFORMACIN SUPLEMENTARIA
Informacin adicional incluye cuatro figuras y tres tablas y puede ser encontrada con este
artculo en lnea en http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.025.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Ruth Flannery y Kibibi Ganz para la ayuda con el cuidado de los animales y
experimentos. Agradecemos a los miembros del laboratorio Jaenisch til para los debates
sobre el manuscrito. Agradecemos tambin a G. subvencin Welstead y Daniel B. Dadon por la
ayuda de la edicin del manuscrito. M.M.D es un Damon Runyon Postdoctoral Compaero.
A.W.C. con el apoyo de una beca Croucher. R. J. es asesor Stemgent y cofundador de Fate
Teraputica. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R37-R01-HD045022 y
CA084198 a RJ.

Figura 2. Simple y doble orientacin de genes en vivo por inyeccin en vulos fertilizados
(A) Genotipado de ratones Tet1 orientada individual. (B) Parte superior: genotipado de Tet2
ratones simple-focalizado. Anlisis de RFLP; inferior: Southern blot anlisis.
(C) La secuencia de ambos alelos del gen focalizado en Tet1 bi-allico ratn mutante 2 y
biallico Tet2 ratn mutante 4.
(D) El genotipado de Tet1 / Tet2 ratones doble mutantes. Se muestra el anlisis de los ratones
de 1 a 12. Parte superior: RFLP anlisis; inferior: anlisis de transferencia Southern. el Tet1
locus se muestra en el locus Tet2 izquierda y a la derecha.
(E) La secuencia de los cuatro alelos mutantes de ratn con doble mutacin en 9 y 10. Las
secuencias de PAM estn marcados en rojo.
(F) los ratones con doble mutacin de tres semanas de edad, Todo RFLP y digestiones del Sur y
las sondas son la mismos que los utilizados en la Figura 1. Vase tambin las Figuras S2 y S3.
Figura 3. multiplexado HDR-mediada por Genoma Edicin En Vivo

(A) Representacin esquemtica de los sitios oligo-focalizacin en Tet1 y Tet2 loci. La

orientacin de la secuencia sgARN est subrayado, y la secuencia de PAM est marcado en
verde. Oligo focalizacin cada gen ha sido expuesta en el sitio de destino, con 2 cambios pb
marcada en rojo. Sitios de enzimas de restriccin utilizados para el anlisis de RFLP estn en
negrita y en mayscula.
(B) Anlisis de RFLP de los ratones dobles de inyeccin de oligo con orientacin mediada HDR
en los loci Tet1 y Tet2.
(C) Las secuencias de ambos alelos de Tet1 y Tet2 en ratn 5 y 7 muestran simultneamente
HDR mediada por la focalizacin a un alelo o dos alelos de cada la alteracin del gen, y NHEJmediado en los otros alelos. Vase tambin la figura S4.
Figura 4. Edicin Multiplexada de Genoma en clulas madre embrionarias de ratn
(A) gen de mltiple focalizacin en clulas madre embrionarias.
(B) generacin de un solo paso de ratones con mutaciones mltiples. Superior: mltiple
mutaciones dirigidas al azar con indeles introducen a travs de NHEJ. Inferior: predefinidas
mltiples mutaciones introducidas mediante la reparacin o S4 mediada HDR.