UNIVERSIDAD VERECRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

APUNTES DE CROMATOGRAFIA
La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de
solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos
que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a
travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual
puede ser lquida o slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla
determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la
separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los
mismos.
Principios
La palabra Cromatografa significa Escribir en Colores, porque cuando fue
desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una
tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con
que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase
mvil) a travs de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se
distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs
o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla
presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la
separacin se da por el movimiento de la fase mvil en relacin con la
estacionaria y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las
molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludas ms rpido
que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que
tienden a quedar retenidas. En resumen se
fundamenta

en

la

separacin

entre

la

fase

estacionaria slida o liquida y la fase mvil liquida o

gaseosa
Los fenmenos rectores del proceso de retencin y
separacin son la adsorcin y la absorcin.
El

primero

queda

delimitado

a la

superficie

interfacial es decir se refiere a la fijacin o retencin

de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas

qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida,
temperatura, naturaleza del absorbente y concentracin. El segundo fenmeno
determina la retencin de una especie qumica por parte de una masa y
depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o reaccionar
qumicamente con la misma.
Clasificacin de la Cromatografa
Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su
fase mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de
dos sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el
eluente es un lquido y puede ser lquido-liquido, liquido-slido. Por el
mecanismo de retencin-separacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en
la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de
reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las
fases se denomina de columna o superficie plana. Tambin se puede clasificar
teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y
gradientes.
Tcnicas cromatogrficas
Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la
estacionaria, se distinguen dos tcnicas:
Columna

Se usa un tubo cilndrico

Plana: El soporte es una placa plana o Capa fina

los intersticios de un papel

Papel (particin)

Cromatografa en capa fina.

Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para
anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina
adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie
por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de
hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel de
silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del
adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas

placas

tienen

indicador

de

fluorescencia

f254

f366.

La placa seca se coloca en el tanque

cromatogrfico o cmara, en el cual debe
encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil
lquida).El eluente ascender o desplazara
por capilaridad en la placa y arrastrar los
componentes a lo largo de sta produciendo
manchas

que

representan

los

componentes, la separacin se da por

migracin diferencial, es decir que la fase
mvil arrastra a las substancias apolares y
aquellas ms polares son retenidas por la
fase estacionaria dando lugar a la separacin.
Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de
mtodos qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados
coloreados o fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico
para carbonizar compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos
pticos

utilizando

radiacin

UV

luz

visible.

El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero

se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre
otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e
intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin
conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin
a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde
la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia.
Cromatografa en papel.
El proceso es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de
papel cromatogrfico en el tanque cromatogrfico.

Cromatografa en Columna.
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de
Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual

queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en

plstico o vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la solucin que
lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de
la columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se suministra
desde

un

contenedor

por

la

parte

superior

de

la

columna.

La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se

encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que
cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se
separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la
separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La
banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a
procesos

difusinales,

disminuyendo

por

tanto

la

resolucin.

Cromatografa de gases.
Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas
(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido
(Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin
(Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte
(Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases esta constituido

normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de

inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara
termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar,
registrar e imprimir el cromatgrama.
La muestra se introduce a travs del sistema de
inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde
ocurre la separacin. La columna

de aluminio,

acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase

estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la
superficie por un soporte que es generalmente de
slice. La fase mvil o gas portador transporta los
componentes de la muestra a travs de la columna,
por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase
estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la
columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las
sustancias,

midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las

sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se

amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el
momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la
sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan
medidas como la altura y el rea del pico.

Cromatografa Liquida de alta eficiencia o

rendimiento (HPLC).
Es una Cromatografa de alta presin es
decir se aplica el flujo a presin (entre 1500
a 2200 psi). El tamao de partcula es entre
3 y 10 micras, la longitud de la columna es

entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras

proteicas. La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el
interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas,
aumentando

por

tanto

la

resolucin.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una

bomba que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de
slica requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la
mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y
el inyector permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se
coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y
si se desea recuperar las molculas que eluyen de la columna, se requiere un
colector.
En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la
cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su
contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con
estndares, que permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla.
La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la
curva del pico correspondiente.

Cromatografa

de

intercambio inico.
La Fase Estacionaria es
una resina de intercambio
inico que contiene grupos
cargados,

teniendo

propiedad

de

especies

la

separar
ionizadas

(Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin

amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se
basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las
protenas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada protena a los
grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la
concentracin de iones en solucin (concentracin salina) que compiten con la
protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la
matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la
concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente
de concentracin.

Cromatografa por Permeabilidad en Gel.

Es til para la separacin de protenas.

La Cromatografa de exclusin molecular, tambin llamada de filtracin en gel,

separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un
polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de
mayor tamao migran ms deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo
tamao, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros
de las bolas de polmero y por tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo
largo de la longitud de la columna. Las protenas de menor tamao, entran en
los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta.
Cromatografa de Afinidad.
La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por
su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las
protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen
especficamente a un ligando que previamente
se ha unido covalentemente a la matriz de la
columna. Despus de que las protenas que no
se unen al ligando son lavadas o eluidas a
travs de la columna, la protena de inters que
ha quedado retenida en la columna se eluye o
libera mediante el empleo de una solucin que
contiene bien ligando libre u otro compuesto que
rompa la interaccin entre el ligando y la

protena.

Cromatografa de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la
que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores
enzimticos, lectinas y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y
enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos
(analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva.
Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la
biologa molecular.
Fundamento de la cromatografa de afinidad
En la figura

se muestra de forma esquemtica el fundamento de las

separaciones

mediante

cromatografa

de

afinidad.

Un

volumen

no

excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la

columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia
activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo
existe interaccin especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de
la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elucin
de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que
no influye en el acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase movil
que desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios activos del
inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos; generalmente se utiliza un
cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos; se eluye as
el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la
regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo
de la primera fase mvil y constituye una etapa rpida.
La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la
distinguen de otros tipos de cromatografa lquidas
Alta selectividad en el mecanismo de retencin
Campo de aplicacin restringido
Separacin de un solo soluto analito
Empleo de sistema de baja presin
Columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica
Ligandos de afinidad

Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente

sobre el soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica
de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los
mismos: Segn su naturaleza, pueden ser macromolculas biolgicas o bien
moleculas

de

bajo

peso

molecular

de

biomolculas

pequeas

macromolculas bioqumicas, respectivamente. Y segn su actuacin. Que se

fundamenta en la selectividad en la retencin que condiciona las caractersticas
de la cromatografa de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos
especficos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo
soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de
compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

Tipos de cromatografa
Naturaleza de fase estacionaria
Naturaleza

de

fase Slido

estacionaria

Adsorcin
Exclusin
Cambio inico
Afinidad

Lquido
Naturaleza

de

fase Liquido

mvil

Particin
Lquido-lquido ((particin)
Lquido-slido)adsorcin,
exclusin, Afinidad.

Gas

Gas-lquido (CGL)
Gas-slido (CGS)

cambio

Esquema de un cromatograma de afinidad.

Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con
el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran
superficie, tamao del grano controlable, porosidad controlable, carcter
suficientemente hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas
u otras molculas, estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta
presin.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgnicos
derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de
acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.
Inmovilizacin de ligandos
La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en
cada caso tiene connotaciones especficas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento
de enlaces qumicos covalente con el soporte slido activado y un grupo
reactivo del ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa de
bioadsorcin.

El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa

del ligando bioqumico que conserve su actividad especfica con plenitud.
La inmovizacin del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos
etapas secuenciales:
Activacin del soporte, que consiste en el ataque qumico con diferentes
reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que
secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad
de procedimientos el ms comn es el ataque con bromuro de ciangeno sobre
la matriz de polisacrido. Segn el pito de matriz se originan grupos diferentes:
steres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, segn reacciones
uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente
orgnico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje qumico del ligando
que se da mediante la reaccin de grupos amino del mismo, fundamentalmente
con el soporte activado.
Metodos de elusin
Segn la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y
teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave
distinguir los procedimientos generales de elucin como: Elucin bioespecfica:
La fase mvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado
inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo
peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolcula
biolgica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos
de bajo peso molecular, producindose en todos los casos una elucin por
desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular
ligados o no, con el sitio activo de la macromolcula biolgica ligada o libre. Se
distinguen 2 tipos de elucin bioespecfica la normal y la invertida.
La elucin normal se basa en la interaccin inhibidor-analito, que es la situacin
ms frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida
por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que
es tambin de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del
analito, por lo que es retirada del slido y eluida. Ejemplo, la purificacin de la
lectina.

La elucin invertida, se basa en la interaccin inhibidor-ligando de afinidad. El

cual es una biomacromolcula que retienen especficamente el analito. La
presencia del inhibidor en la fase mvil provoca un desplazamiento anlogo al
anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoprotena.
En la elucin no bioespecfica, la fase mvil provoca la denaturacin del ligando
inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y
reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se
interrumpe la adsorcin bioespecfica mediante eliminacin de una o varias de
las causas que la provocan.

NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA

TERMINO
Cromatografa. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que
los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales
est en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve
en una direccin definida.
Cromatgrafo. El instrumento empleado para realizar una separacin
cromatogrfica.
Cromatgrama. Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un
detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada
como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente
o al tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel
o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las
partculas de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las
partculas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por
polimerizacin in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento.
Fase Mvil. Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en
una direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas
(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido
Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas

Portador para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para

la fase mvil la expresin Eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografa de elucin. El proceso de elucin se puede
detener mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho
cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se
prefiere el trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografa plana.
Efluente. La fase mvil que abandona la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya
separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos
por la fase mvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la
muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no
retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o
retenidos permanentemente. Se aceptan tambin los trminos Eluito y Analito
para un componente de la muestra
Mtodos principales
Cromatografa Frontal: Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa)
se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna
fase mvil adicional
Cromatografa de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase mvil
contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido ms fuertemente que
los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema
en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve.
Cromatografa de Elusin: Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de
forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se
suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un
tiempo breve.
Clasificacin de acuerdo al lecho cromatografico
Cromatografa en Columna: Tcnica de separacin en la que el lecho
estacionario est contenido dentro de un tubo. Las partculas de fase
estacionaria slida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria lquida,
pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar
concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta,

no restringida, para el paso de la fase mvil por el centro del tubo (Columna
Tubular Abierta).
Cromatografa plana: Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est
en forma de plano o sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva como
tal o que est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria
(Cromatografa en Papel), o una capa de partculas slidas extendida sobre un
soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografa en Capa Fina, TLC). A
veces a la cromatografa plana se la llama tambin Cromatografa de Lecho
Abierto.
Literatura

recomendada

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