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Departamento de Qumica
Tesis Doctoral
Directores
Dr. ngel Maquieira Catal - Dra. Rosa Puchades Pla
Valencia, 2008
1. Introduccin
1. Introduccin
1. Introduccin
kg/ha
1990
39.562
16.010
1991
39.147
16.034
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
34.023
15.327
35.070
15.102
36.332
15.076
38.027
15.082
40.894
14.533
40.727
14.749
41.586
14.628
47.445
14.182
1992
31.839
15.911
1993
29.406
15.415
1994
31.243
14.953
1995
27.852
14.983
1996
33.236
15.284
1. Introduccin
Insecticidas
1,93
0,85
1,72
0,80
14,67
4,09
0,47
0,20
2,14
6,41
1,97
1,02
2,48
0,83
4,65
0,48
0,98
1,42
Fungicidas
3,84
0,79
1,00
1,20
68,38
5,60
0,81
0,54
4,46
5,09
1,76
4,56
12,48
0,71
7,52
0,57
5,26
2,44
Herbicidas
2,86
1,18
7,54
0,86
6,76
11,02
0,71
1,36
3,09
5,90
1,78
2,91
4,11
3,01
4,12
1,95
5,00
2,07
Otros
3,42
0,35
4,92
3,30
35,25
7,43
0,38
0,14
1,67
9,01
1,35
0,99
2,06
0,91
5,86
0,39
2,10
1,86
Total
12,05
3,17
15,18
6,16
125,05
28,14
2,37
2,25
11,36
26,41
6,86
9,48
21,13
5,46
22,15
3,40
13,33
7,79
1. Introduccin
Disulfotn
Endosulfan
Endrn
Fenitrotin
Fentin
Heptaclor
HCB
Linurn
Malatin
MCPA
Mecoprop
Metamidofos
Mevinfos
Monolinurn
Ometoato
Oxidemetn-metil
Paratin-etil
Paratin-metil
Phoxim
Propanilo
Pirazona
Simazina
2,4,5-T
Triazofos
Triclorfon
Trifularina
1. Introduccin
1. Introduccin
Precio/muestra ()
19
25
25
49
49
61
240
73
Fuente: Orden SCO/47/2004, de 14 de enero, por la que se fijan los precios pblicos por la realizacin
de actividades del Centro Nacional de Alimentacin. Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria
1. Introduccin
1. Introduccin
11,25
Miles de toneladas
6,75
4,5
Insecticidas organofosforados
2,25
Otros insecticidas
0
Ao
En general, los OFs son productos de elevada reactividad qumica, lo que les
confiere ciertas ventajas; al tratarse de compuestos muy activos, las dosis aplicadas son
bajas. Adems, se degradan con relativa facilidad, bien mediante reacciones de
hidrlisis que dan lugar a productos inocuos para el medio ambiente, o por reacciones
de oxidacin que conducen a metabolitos ms o menos txicos, pero ms fciles de
hidrolizar. Por ltimo, son productos cuya toxicidad aguda es, en general, mayor que la
de los OCs, mientras que la crnica es inferior, ya que tienden a hidrolizarse en lugar de
acumularse en las grasas (38).
Los steres de los organofosforados son muy susceptibles a la hidrlisis, que es la
va de degradacin ms comn. Uno de los factores ms importantes que afecta a la
hidrlisis es el pH del medio. As, por ejemplo, el diazinn se hidroliza rpidamente a
valores altos o bajos de pH (41). Por otro lado, el malatin es un clsico ejemplo de la
complejidad que presenta el estudio de sus productos de hidrlisis, ya que, adems de
8
1. Introduccin
1. Introduccin
Algunos organofosforados son sistmicos (ver Tabla 4), es decir, son adsorbidos
por las plantas (ya sea a travs del follaje o las races) e introducidos en el sistema
vascular de los vegetales. Posteriormente, son translocados -en su forma original o
modificada- a las diferentes partes de la planta por medio de la savia, siendo su modo de
accin ms eficaz contra insectos chupadores, actuando tambin sobre las personas que
ingieren el alimento, aunque ste se lave previamente.
Tabla 4. Principales plaguicidas organofosforados utilizados en agricultura
Tipo
No Sistmicos
Nombre comn
Azinfos-metil
Clorpirifos
Diazinn
Diclorvos
Fenitrotin
Leptofos
Malatin
Paratin
Paratin-metil
Triclorfn
Nombre comercial
Guthion, Gusathion
Dursban, Lorsban
Basudin, Diacide, Diazil
Lainsec, Vapona
Sumithion, Folithion
Phosvel, Abar
Malathion, Cythion
Folidol
Folidol-M, Metacide
Dipetrex, Neguron, Dylox
Sistmicos
Dimetoato
Fentin
Forato
Metamidofos
Mevinfos
Oxidemetn-metil
Glifosato (Herbicida)
Cygon, Perfektion
DMTP, Lebaycid, Fenthion 4E
Thimet
Monitor, Tamarn
Phosdrin
Metasyst ox
Roundrup
Una vez en el interior del organismo, los OFs son activados por desulfuracin
oxidativa, transformando los grupos P=S en P=O (54). Estos derivados P=O atacan al
sistema nervioso y, ms concretamente, a la ACE, enzima encargada de hidrolizar la
acetilcolina en colina y cido actico a nivel de la sinapsis nerviosa. La poblacin
afectada por la accin txica de estos plaguicidas presenta inhibicin de la actividad
enzimtica de la ACE al encontrarse sta fosforilada, lo que provoca desde anoxia y
dolores de cabeza a dosis bajas, hasta nuseas, contracciones musculares e incluso la
muerte por fallo respiratorio y paro cardaco, a mayores dosis (55).
Por otra parte, la biotransformacin de la mayor parte de los plaguicidas tiene lugar
por combinacin de varias reacciones qumicas, desarrollndose -generalmente- en dos
fases (56, 57):
10
1. Introduccin
1. Introduccin
espectrometra de masas (SIM) para la deteccin de niveles traza (78-80). Sin embargo,
estos mtodos presentan los mismos inconvenientes expuestos previamente en la
seccin 1.1.1., as como la imposibilidad de realizar determinaciones in situ.
Por otro lado, diferentes biosensores basados en la inhibicin de la colinesterasa han
sido desarrollados para la deteccin de plaguicidas. Algunos se basan en la
determinacin del cido actico producido por la hidrlisis de la acetiltiocolina, bien por
medidas conductimtricas (81, 82), o utilizando un sensor de fibra ptica que detecta el
cambio de color de un indicador de pH (83). Un electrodo de pH modificado con una
organofosforado hidrolasa inmobilizada tambin se ha utilizado para la determinacin
potenciomtrica directa de insecticidas organofosforotionatos y fosfatos (84, 85). Estos
biosensores electroqumicos, aunque son sensibles (detectan niveles de ng/mL de
organofosforados en agua), presentan como principal limitacin su baja selectividad. La
deteccin espectofotomtrica (86) ha sido tambin utilizada en biosensores usando
acetiltiocolina como substrato de la acetilcolinesterasa, de modo que la tiocolina
producida reacciona con el reactivo de Ellman (87) para dar un color amarillo.
12
1. Introduccin
1. Introduccin
en
1. Introduccin
1. Introduccin
una cadena ligera por otro puente disulfuro. En la regin constante, las cadenas pesadas
tienen hidratos de carbono como grupo prosttico.
a)
b)
1. Introduccin
UNIN A PROTENA
(CONJUGADO HAPTENO-PROTENA)
RESPUESTA INMUNE
Figura 6. Esquema del proceso seguido para la obtencin de anticuerpos policlonales
En la terminologa utilizada habitualmente, a los compuestos de baja masa
molecular que se unen covalentemente a una sustancia inmunognica (generalmente una
protena), se les denomina haptenos. Los conjugados hapteno-protena capaces de
producir respuesta inmune son los inmungenos.
La generacin de anticuerpos para molculas pequeas requiere llevar a cabo las
siguientes etapas:
1. Diseo de molculas derivadas del analito que contengan un grupo
funcional apropiado (hapteno) para su unin al transportador
2. Sntesis de haptenos
3. Conjugacin covalente del hapteno al transportador
4. Purificacin del inmungeno
5. Inmunizacin del animal
17
1. Introduccin
Los principios bsicos para el diseo de haptenos han sido ampliamente descritos
(117-120). El hapteno tiene que ser lo ms similar posible al analito en estructura y
geometra, distribucin electrnica y capacidad de establecer puentes de hidrgeno, as
como en sus propiedades hidrofbicas (117).
Otro aspecto importante a tener en cuenta, es la introduccin de un brazo espaciador
que disponga en su extremo un grupo adecuado para su unin directa a la protena
transportadora, como por ejemplo COOH, -OH, -NH2 y SH. Este brazo debe estar
posicionado lo ms lejos posible de los sitios de reconocimiento del hapteno para
favorecer la exposicin del hapteno al sistema inmunitario. Es generalmente aceptado
que la longitud del brazo espaciador es un factor importante en la produccin de
anticuerpos con alta afinidad por el analito, y que la sensibilidad del inmunoensayo
mejora al aumentar la longitud del mismo (33, 121, 122). Un brazo espaciador largo
puede evitar el enmascaramiento del hapteno por la protena, pero si es demasiado largo
puede conducir al plegamiento del hapteno y reducir su exposicin al sistema
inmunitario (33, 122). Sin embargo, los resultados experimentales que soportan estas
hiptesis son limitados y contradictorios.
En algunos estudios, los haptenos con brazo espaciador de tamao medio (3-6
tomos de carbono) dieron lugar a los ensayos ms sensibles comparados con aquellos
que utilizaban un brazo espaciador ms corto (123-125), con los que se obtuvieron
resultados contrarios (126-128).
En el caso de plaguicidas organofosforados aromticos, el brazo espaciador puede
unirse tanto al grupo tiofosfato como al anillo aromtico. Generalmente, los haptenos
derivatizados por el grupo tiofosfato usan un aminocido como brazo espaciador.
McAdam et al. (129, 130) desarrollaron un mtodo general para sintetizar este tipo de
haptenos, que ha sido aplicado con xito al desarrollo de ELISAs para varios
plaguicidas organofosforados (126, 131-134). Este mtodo se basa en la unin del brazo
espaciador al grupo tiofosfato, e implica varios pasos de proteccin y desproteccin del
mismo. La aplicacin de esta metodologa a la sntesis de haptenos para diazinn ha
demostrado no ser viable, ya que el intermedio final se hidroliza en el paso de
desproteccin que conduce al hapteno. Por ello, Beasley et al. (135) adoptaron una
estrategia diferente, utilizando un aminoalcohol como brazo espaciador para obtener
anticuerpos policlonales contra diazinn. Actualmente, hay trabajos que usan un brazo
aminocarboxlico que no requiere demasiadas etapas de proteccin y desproteccin
(136).
18
1. Introduccin
As, y para cada tipo de compuesto, deben sintetizarse diferentes molculas que,
manteniendo la estructura base, estn funcionalizadas para su unin directa a protenas
transportadoras (inmungenos) o a los marcadores correspondientes (trazadores), con el
fin de obtener los reactivos necesarios para efectuar los ensayos.
Como ya se ha comentado, para estimular la produccin de anticuerpos frente a
molculas no inmunognicas es necesario ligarlas a una protena transportadora capaz
de provocar la respuesta inmune. Las protenas ms utilizadas para este fin son:
seroalbmina bovina (BSA), seroalbmina humana (HSA), ovoalbmina (OVA),
hemocianina del molusco Megathura crenulata (KLH) o IgGs de diferentes especies.
Los criterios de seleccin de una protena u otra se basan en su poder inmunizante
(cantidad de determinantes antignicos), solubilidad y facilidad de conjugacin.
Adems de protenas, tambin pueden utilizarse polipptidos sintticos como la poli-Llisina o polisulfona funcionalizada, azcares, e incluso carbn activo y oro coloidal.
El hapteno debe unirse covalentemente a la protena transportadora, proceso que
generalmente se lleva a cabo utilizando una carbodiimida -que da lugar a un enlace
amida entre un carboxilo del hapteno y un grupo amino de la protena-, entre otros
mtodos de conjugacin ampliamente descritos (137).
Cuando se administra un inmungeno in vivo a un animal, se produce la
estimulacin de distintas clulas del sistema inmunitario (como macrfagos, linfocitos T
y B) del mismo. Los linfocitos B activados y diferenciados a clulas plasmticas,
secretan una mezcla de anticuerpos derivados de la activacin de numerosos clones de
linfocitos B. Este tipo de respuesta se denomina policlonal, y al suero de un animal que
contiene una mezcla de anticuerpos frente a un inmungeno se le denomina antisuero
policlonal. Los sueros policlonales suelen obtenerse en conejos, aunque tambin se
emplean otros animales como ratones, ovejas, cabras, gallinas, etc. La produccin de
anticuerpos policlonales (PAbs) es sencilla, y no requiere equipamiento sofisticado o
medios especiales. Su principal inconveniente radica en la diferente respuesta entre
animales. Un antisuero policlonal es una mezcla heterognea de anticuerpos de
diferentes clases en proporciones arbitrarias, y con diferentes afinidades y selectividades
hacia el analito para el que se ha obtenido.
Una alternativa a los Pabs son los anticuerpos monoclonales (MAbs) (33, 138).
Estos anticuerpos se obtienen utilizando el sistema inmunitario de ratn o rata
(actualmente, incluso conejos), seguido de la aplicacin de la tecnologa de hibridomas.
La tcnica original (ver Figura 7), diseada por Khler y Milstein (139), fusiona
19
1. Introduccin
ANTGENO
ANTICUERPOS
POLICLONALES
Antisuero
Clulas esplnicas
(resistentes a HAT)
Clulas mieloma
HGPRT-
HGPRT-: Hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferasa
Fusin celular
con PEG
Cultivo en HAT
(Seleccin)
Ensayos para
seleccionar cultivos
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
1. Introduccin
Monoclonales
Mezcla homognea de Igs
Suministro ilimitado
Propiedades idnticas
Altos costes de produccin
Obtencin en seis meses
1. Introduccin
1. Introduccin
S
No
Heterogneo
Homogneo
Reactivo limitante
S
No
Competitivo
Desplazamiento
No competitivo
Especie inmovilizada
Ab
Conjugado hapteno-protena
Directo
Indirecto
Marcador
Enzima
Istopo radiactivo
Fluorforo
Otros
EIA
RIA
FIA
23
1. Introduccin
A) FORMATO DIRECTO
Adicin de muestra y
trazador
Anticuerpo
inmovilizado
Adicin
de substrato
enzimtico
Lavado
B) FORMATO INDIRECTO
Adicin de muestra y
anticuerpo especfico
Lavado
Adicin de
anticuerpo
secundario
marcado.
Lavado
Adicin de
substrato
enzimtico
S
Soporte
24
1. Introduccin
(cromognicos,
fluorescentes
bioluminiscentes),
alcanzndose
1. Introduccin
mientras que los lmites superiores varan entre 10 y 100 g/L (158). En este tipo de
curvas de calibrado (Figura 9), el intervalo de trabajo o rango dinmico se define
como el intervalo de concentraciones de analito que produce una seal entre el 80% y el
20% del intervalo definido por las asndotas mxima y mnima (Amax y Amin).
Amax
90%
SEAL
80%
50%
20%
Intervalo
de trabajo
Amin
LD
IC50
[ANALITO]
1. Introduccin
uno previamente establecido como umbral (163)- permite eliminar las muestras
negativas y, si es pertinente, confirmar las positivas mediante un mtodo de referencia
que, en la mayora de los casos, es cromatogrfico, lo que supone un ahorro de tiempo y
costes.
En el campo del anlisis inmunoqumico de plaguicidas, la mayora de los mtodos
directos de monitoreo descritos en la bibliografa se han aplicado a matrices
medioambientales (164-166). En el caso de matrices ms complejas como los alimentos,
numerosos kits comerciales para la determinacin de plaguicidas (Tabla 7) necesitan
efectuar un pre-tratamiento de muestra, lo que supone una cierta traba para estos
procedimientos como mtodos de barrido. Otro inconveniente es que las metodologas
inmunoqumicas slo permiten la determinacin de uno o dos analitos simultneamente
(167-169).
27
28
Alimentos
Matriz
108
100
86,5
74,6
100
0,02 mg/Kg
Millipore
Placa
100
62-1.200 ppb
0,38 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
Extraccin
acetona y kit
preparacin de
alimentos
Frutas y
vegetales
Benomilo
100
1-14 ppb
5 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
SFE dinmica,
limpieza SPE
y extraccin
ACN/HX
Carnes
Benomilo
68,5
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
Carbaril
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador de
la matriz
Alimentos
Carbendazima
LD: lmite de deteccin, RD: rango dinmico, R: recuperacin, PM: partculas magnticas, SPE: extraccin en fase slida, SFE: extraccin con fluido supercrtico, ACN: acetonitrilo, MeOH: metanol, HX:
hexano
R(%)
1-14 ppb
1-14 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
RD
Strategic
Diagnostics
Frutas y
vegetales
Benomilo
(MCB/TBZ)
SFE
Extraccin
dinmica, MeOH/H2O
limpieza
(1/10)
SPE y
extraccin
ACN/HX
Carnes
Atrazina
1 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
Atrazina
1 ppb
Strategic
Diagnostics
Strategic
Diagnostics
Fabricante
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
Aldicarb
LD
PM
PM
SFE dinmica,
limpieza SPE
y extraccin
ACN/HX
Carnes
Alacloro
Formato
Alacloro
Analito
Tabla 7. Aplicacin de kits comerciales basados en inmunoensayo para la determinacin de residuos de plaguicidas en alimentos
1. Introduccin
Alimentos
Matriz
100
R(%)
30,4
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
Cianazina
0,22- 3 ppb
0,1 ppb
Strategic
Diagnostics
Inc.
PM
Extraccin
con ACN
o MeOH
Frutas y
granos
Clorpirifos
100
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
para bebes
Clorpirifos
0,01-2 ppm
Millipore
Placa
Extraccin
MeOH y
concentracin
a 10 mL
Granos
Clorpirifosmetil
97,8-104
0,5-10 ppb
Millipore
Tubo
70% de
alcohol
isoproplico
y agitacin
2 min
Granos
Clorpirifosmetil
0,2 ppm
Millipore
Placa
Extraccin
con
MeOH/H2O
(1/10)
Frutas y
vegetales
2,4-D
Strategic
Diagnostics
PM
SPE, ACN
como
modificador
de la matriz
Alimentos
2,4-D
140
14 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
SFE dinmica,
limpieza SPE y
extraccin
ACN/HX
Carnes
2,4-D
LD: lmite de deteccin, RD: rango dinmico, R: recuperacin, PM: partculas magnticas, SPE: extraccin en fase slida, SFE: extraccin con fluido supercrtico, ACN: acetonitrilo, MeOH: metanol, HX: hexano
1-14 ppb
RD
79,5
3 ppb
Strategic
Diagnostics
Strategic
Diagnostics
Fabricante
LD
PM
PM
SFE dinmica,
limpieza SPE
y extraccin
ACN/HX
Carnes
Carbofurano
Formato
Carbofurano
Analito
Tabla 7. cont.
1. Introduccin
29
30
Carnes
Frutas y
vegetales
Matriz
Abraxis
Strategic
Diagnostics
Inc.
0,5 ppb
30-500 ppt
87
Fabricante
LD
RD
R(%)
0,3-3 ppm
Millipore
Placa
Extraccin
MeOH y
concentrado a
10 mL
Granos
Fenitrotion
Leche
PCP
72,6
Strategic
Diagnostics
PM
Millipore
Tubo
Alimentos
Metolacloro
Vino
>100
0,5-2 ppm
Millipore
Placa
109
2-100 ppb
Strategic
Diagnostics
PM
2 ppb
Strategic
Diagnostics
Inc.
PM
Sin
tratamiento,
filtracin
Vino
Procimidona Procimidona
Extraccin
Dilucin de
MeOH y
la muestra
concentrado a
10 mL
Granos
Pirimifosmetil
Leche
Triazinas
70,2-102,9
5-80 ppb
0,6 ppb
Millipore
Tubo
Millipore
Placa
Extraccin
Sin
tratamiento
Na2SO4,
etilacetato,
evaporacin,
reconstruccin
en ter de
petrleo y SPE
Pimiento
Procimidona
LD: lmite de deteccin, RD: rango dinmico, R: recuperacin, PM: partculas magnticas, SPE: extraccin en fase slida, SFE: extraccin con fluido supercrtico, ACN: acetonitrilo, MeOH: metanol, HX: hexano
Tubo
Placa
Formato
SPE y
Pretratamiento Extraccin
MeOH y
solubilizacin
de muestra
limpieza SPE con 2 mL de
0,01%
Tween 20
Dieldrin
Diazinn
Analito
Tabla 7. cont.
1. Introduccin
1. Introduccin
1. Introduccin
32
1. Introduccin
ACEITE DE
GIRASOL
ACEITE DE
OLIVA
ACEITE DE
SEMILLAS
ACEITE DE
ORUJO
ACEITE
Aceite de OLIVA
Aceite de ORUJO
Aceite de GIRASOL
Otros aceites de SEMILLAS
TOTAL
Fuente: Anierac. Ao 2006
33
1. Introduccin
punto de vista econmico, sin olvidar los aspectos sociales, culturales, paisajsticos y
agronmicos.
Tabla 9. Produccin espaola de aceite de oliva (t) por
comunidades autnomas
CC.AA.
Andaluca
Castilla La Mancha
Extremadura
Catalua
Comunidad Valenciana
Aragn
Otras comunidades
Total
Campaa 2006/2007
681.360
43.459
43.207
22.093
18.040
9.239
12.077
829.475
34
1. Introduccin
Portugal
1%
Turqua
5%
Siria
4%
Marruecos
3%
Tnez
8%
Grecia
18%
Italia
25%
Figura 12.
Espaa
36%
Millones de toneladas
3500
Marruecos
3000
Siria
2500
Turqua
2000
1500
Portugal
1000
Grecia
500
Italia
0
1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Espaa
Ao
35
1. Introduccin
Millones de toneladas
36
1. Introduccin
Los componentes del aceite de oliva pueden clasificarse en dos grupos, la fraccin
saponificable y la insaponificable. La primera est constituida por triglicridos (steres
de cidos grasos y glicerina) y cidos grasos libres. Entre los cidos grasos ms
abundantes (Tabla 10) se encuentran el cido oleico monoinsaturado y, en menor
proporcin, los cidos poliinsaturados linoleico y linolnico. Los cidos grasos
saturados se encuentran en cantidades similares -o incluso menores- a las de otros
aceites vegetales.
Tabla 10. Contenido en los principales cidos grasos
de los aceites vegetales ms consumidos
Tipo de aceite
Oliva
Girasol
Maz
Soja
37
1. Introduccin
En una almazara, la extraccin del aceite de oliva virgen se puede llevar a cabo,
fundamentalmente, por dos mtodos: presin y centrifugacin. El sistema clsico es el
de presin, en el que la pasta procedente de las aceitunas molidas se reparte en
capachos, obtenindose por prensado. En una almazara moderna la pasta es batida y se
centrifuga en un equipo de eje horizontal, obtenindose tres fases -aceite, alpechn y
orujo- (Figura 16).
En los ltimos aos se ha asistido a un cambio tecnolgico en el sistema continuo
de centrifugacin, obteniendo slo dos fases. Se ha demostrado que utilizando este
nuevo sistema de extraccin, el rendimiento industrial es similar y la calidad del aceite
comparable al que proporciona tres fases.
Desde un punto de vista econmico, el sistema clsico de presin no puede
competir con el sistema continuo o de centrifugacin, debido -fundamentalmente- a los
elevados costes de elaboracin (requiere ms mano de obra), a la discontinuidad de la
produccin, y al elevado coste de los materiales filtrantes.
1. Introduccin
la disminucin del peso (20%), y por tanto del rendimiento. Pero lo ms importante es
el dao indirecto que causa en la calidad del aceite de la aceituna atacada. El desarrollo
de la larva origina en los frutos un gran nmero de galeras y agujeros, por donde
penetran hongos (Gloeosporium olivarium) y bacterias que alteran gravemente la
calidad de los aceites -aumento de acidez y deterioro de las caractersticas
organolpticas-.
39
1. Introduccin
40
1. Introduccin
Plaga
Mosca del olivo
(Dacus oleae)
Tratamiento
Fecha de aplicacin
Dimetoato, diazinn, Julio
deltametrn, malatin,
triclorfn, formotin,
metidatin, fosmet,
fentin
Dimetoato, carbaril,
endosulfan, triclorfn,
clorpirifos, diazinn,
formotin, fosmet,
metidatin
Antes de la floracin y
eventualmente sobre las
aceitunas en fase de
crecimiento
Dimetoato, formotin,
malatin, triclorfn
Primavera y verano
Escarabajo picudo
(Coenrrhinus cribipennis)
steres fosfricos
Formotin, dimetoato,
metidatin
Carbaril, fosmet,
pirimifos-metil
Agosto
Fosmet, clorpirifos,
fenitrotin
Abril-mayo y octubre
Serpeta
(Lepidosaphes ulmi)
Malatin
Verano
Carbaril, dimetoato
Primavera
Dimetoato y malatin
Actualmente se han prohibido algunos de los fitosanitarios recomendados. Su sustitucin no est bien
resuelta a la hora de evaluar su eficacia como plaguicidas para el olivo; de aqu la necesidad de
implementar programas efectivos de vigilancia de la calidad del aceite de oliva.
41
1. Introduccin
Tratamiento de muestra
/ Tcnica de
determinacin
SPE/GC-NPD
Concentracin
(g/kg)
10
Procedencia
Espaa
214
SPE/GC-NPD
90
Italia
116
Espaa
246
Clorpirifos-metil
SPE/GC-NPD
80
Italia
116
Diazinn
SPE/GC-NPD
83
Italia
116
31
Espaa
246
Dimetoato
SPE/GC-NPD
61
Italia
116
Dimetoato
HS-SPME/GC-FTD
33
Grecia
254
Endosulfn
570
Grecia
226
Endosulfn sulfato
31
Espaa
246
Etin
HS-SPME/GC-FTD
51
Grecia
254
Fentin
SPE/GC-NPD
73
Italia
116
Fentin
HS-SPME/GC-FTD
93
Grecia
254
Fentin
350
Italia
255
Fentin sulfxido
HS-SPME/GC-FTD
93
Grecia
254
Formotin
SPE/GC-NPD
82
Italia
116
Malaoxon
HS-SPME/GC-FTD
22
Grecia
254
Metidatin
SPE/GC-NPD
63
Italia
116
Ometoato
HS-SPME/GC-FTD
33
Grecia
254
Paratin
SPE/GC-NPD
80
Italia
116
Paratin-metil
SPE/GC-NPD
56
Italia
116
Acefato
Azinfos-etil
Carbaril
Diurn
42
Ref.
1. Introduccin
1. Introduccin
lquido (75, 210, 222), cromatografa de permeacin en gel (GPC) (212, 213),
extraccin en fase slida (117, 214, 223, 224) con diferentes adsorbentes -florisil (225),
almina neutra (226) o C18 (227)-, microextraccin en fase slida (SPME) (228-233)
usando fibras de slice fundida recubiertas con diferentes fases [polidimetilsiloxanodivinilbenceno (PDMS-DVB), PDMS, carboxeno-polidimetilsiloxano (CARPDMS),
DVB-CAR-PDMS, etc.], dispersin de matriz en fase slida (MSPD) (215, 234-236),
extraccin con microondas (237, 238) o extraccin con fluidos supercrticos (SFE) (239,
240).
La extraccin lquido-lquido se usa para eliminar sustancias insolubles o poco
solubles en agua, no requiere equipamiento especial y es fcil de realizar. Sin embargo,
presenta desventajas como: elevado consumo de disolventes, posibilidad de formacin
de emulsiones en la interfase disolvente-muestra, bajo rendimiento de extraccin,
prdidas de analito durante las operaciones de transferencia y evaporacin, y dificultad
de automatizacin (241). La extraccin tradicional tipo Soxhlet es una tcnica
mejorada de extraccin lquida de matrices slidas (237) que utiliza un extractor
especial, en el cual se depositan generalmente de 5 a 10 g de muestra y 100 mL de
disolvente orgnico, y cuya duracin vara entre 4 y 48 horas. Actualmente se utilizan
mtodos acelerados de extraccin con disolventes (Soxhlet semi-automatizado) que
acortan el proceso usando disolventes a elevada presin y temperatura, permitiendo una
extraccin ms rpida y segura, a la vez que se reduce la cantidad de disolvente
utilizada.
La cromatografa de permeacin en gel (GPC) es un procedimiento de limpieza
basado en la exclusin molecular, que utiliza disolventes orgnicos y un gel hidrofbico
(generalmente un copolmero entrecruzado de divinilbenceno-estireno) parar separar
macromolculas. La GPC se usa para eliminar interferencias de alto peso molecular, y
se recomienda para separar lpidos, polmeros, protenas, pigmentos, resinas naturales y
componentes celulares de una muestra antes de su anlisis.
Un ejemplo es el GPC AutoPrep 2000 system de OI Analytical (Figura 17). Este
sistema comercial posee un muestreador automtico para inyectar hasta 60 muestras y
recoger las fracciones purificadas. La metodologa recomienda usar GPC para separar
grasas o aceites de matrices alimenticias antes del anlisis de plaguicidas usando GC, ya
que si se inyectan extractos de muestras con alto contenido en lpidos, tanto el puerto de
inyeccin como la propia columna se contaminan fcilmente, provocando baja
44
1. Introduccin
Figura 18. Cromatogramas GC-PFPD de aceite de oliva tras una etapa de limpieza
mediante GPC. a) muestra dopada con 50 ng/mL de FAPAS Series 9
OP mix 1. b) muestra de aceite de oliva sin dopar.
Reproduccin de O.I. Analytical, Inc.
1. Introduccin
contacto con el adsorbente (C18, C8, slice, divinilbenceno, estireno, etc.) dispuesto en
cartuchos, discos, etc., y, posteriormente, se lava el slido y se eluye el analito con el
disolvente apropiado. La miniaturizacin de la SPE ha dado lugar al desarrollo de la
denominada microextraccin en fase slida (SPME), que utiliza agujas o barras
agitadoras recubiertas de Carbowax, divinilbenzeno, Carboxeno o PDMS, para la
adsorcin y preconcentracin de los analitos (245).
Entre los mtodos multirresiduo aplicados a plaguicidas organofosforados, destaca
por su sencillez el descrito por Cabras et al. (210) -para 13 compuestos-, que realiza una
extraccin con acetonitrilo como nica etapa de limpieza. Para niveles de dopaje de
aproximadamente 100 g/kg y utilizando GC-NPD, obtiene recuperaciones del 94%
para diazinn y 98% para fentin.
Dugo et al. (246) describen un mtodo para plaguicidas organofosforados en aceite
de oliva basado en extraccin con acetonitrilo y centrifugacin. La determinacin se
realiza mediante GC-FPD y el lmite de deteccin para fentin es 3 g/kg. Sin embargo,
estos mtodos acortan la vida de las columnas y del sistema cromatogrfico, haciendo
necesaria una mayor limpieza de los extractos.
Hiskia et al. (204) realizan el anlisis por GC utilizando diferentes detectores (FPD
y NPD), tras la extraccin de la muestra con hexano y limpieza mediante particin entre
hexano y acetonitrilo. Con GC-FPD alcanzan lmites de deteccin de 0,5 g/kg para
diazinn y malatin, y 0,1 g/kg para fentin y clorpirifos.
Entre las metodologas que utilizan GPC para determinacin de estos compuestos,
encontramos la descrita por Guardia-Rubio et al. (247). Tras extraer con hexano
saturado en acetonitrilo y concentrar el extracto, realizan GPC seguida de GC-TSD (5
g/kg de LD y 97% de recuperacin para diazinn, y 2 g/kg de LD y 87% y 97% de
recuperacin para malatin y clorpirifos, respectivamente) o GC-ECD (5 g/kg de LD,
y recuperaciones de 100% para malatin y 98% para diazinn). Las muestras positivas
se confirmaron por GC-MS/MS (2 g/kg de LD y 99% de recuperacin para diazinn, y
0,2 g/kg de LD y 105% de recuperacin para clorpirifos).
Vreuls et al. (213) utilizan GPC, transfiriendo el eluido on-line al sistema
cromatogrfico, alcanzando recuperaciones del 100% para diazinn y fentin a niveles
entre 20 y 60 g/kg. Jongenotter et al. (212) utilizan tambin un sistema automtico online GPC-GC-FPD, con lmites de deteccin de 1 g/kg para diazinn y fentin (indican
que este ltimo se descompone lentamente) y 2 g/kg para malatin.
46
1. Introduccin
1. Introduccin
1.4.4.1. Diazinn
El diazinn es un insecticida organofosforado no sistmico, inespecfico, usado
extensivamente en muchos cultivos para combatir a una gran variedad de insectos. As,
se ha aplicado en suelos, materia vegetal, csped, plantas ornamentales y jardinera
(258, 259). Controla plagas como pulgn, chicharras, araa roja, picudos, minador de
hoja, pulgas y chinches, entre otras. Es uno de los insecticidas ms populares para el
hogar y ha sido usado durante ms de 40 aos. Hasta el ao 2000, se utilizaban
alrededor de 5.000 toneladas / ao de productos con diazinn.
48
1. Introduccin
S
(mg/L)
log Kow
LD50
(mg/kg)
ADI
(mg/kg)
Pv
(mPa)
60
3,11-3,3
1250
0,002
12
4,2
4,17-4,84
250
0,007
0,74
145
2,74-2,94
1375-2800
0,02
5,3
1,4
4,96-5,11
135-165
0,01
2,7
Frmula
Diazinn
(CAS:333-41-5)
O
P
Fentin
S
P
(CAS:55-38-9)
Malatin
(CAS:121-75-5)
P
S
Cl
Cl
N
Clorpirifos
O
P
(CAS:2921-88-2)
Cl
S: solubilidad en agua a 25 C; Kow: constante de distribucin octanol-agua; LD50: dosis letal media para
ratas; ADI: dosis diaria aceptable; Pv: presin de vapor
1.4.4.2. Fentin
El fentin es un insecticida organofosforado moderadamente txico (clasificacin
de toxicidad II de la Agencia de Proteccin Medioambiental, U.S. EPA) utilizado contra
gran cantidad de plagas, principalmente para el control de la mosca de la fruta y el
mosquito adulto, aunque tambin se usa para matar aves (261). Algunos nombres
comerciales de este plaguicida son DMTP, Lebaycid y Fenthion 4E y se estima un
consumo de 100-150 toneladas / ao de fentin.
El fentin se acumula en los tejidos grasos y, segn el Instituto Nacional de la Salud
norteamericano, es una sustancia cancergena (262). En marzo de 2003, como resultado
de la presin pblica ejercida por la American Birds Conservancy (un grupo para la
conservacin de las aves) y debido a que la U.S. EPA requera ms pruebas que
49
1. Introduccin
hubieran resultado costosas, la empresa fabricante (Bayer) retir el fentin del mercado
estadounidense de forma voluntaria (261).
El fentin es un insecticida clasificado como Muy Txico segn el Real Decreto
3349/83, y los Reales Decretos 162/91 y 443/94, que establecen las normas para la
fabricacin, comercializacin y utilizacin de productos fitosanitarios.
La Decisin 2004/140/CE de 11 de febrero de 2004 publicada en el Diario Oficial
de la Unin Europea L 46 de 17 de febrero de 2004, hace referencia a la retirada de las
autorizaciones de los productos fitosanitarios que contuvieran esta sustancia activa. As,
en su artculo 1, seala que el fentin no se incluir como sustancia activa (anexo I de
la Directiva 91/414/CEE). El artculo 2 indica, adems, que las autorizaciones de los
productos fitosanitarios que contengan fentin sean retiradas antes del 11 de agosto de
2004 y que, a partir del 17 de febrero de 2004, no se conceda ni renueve (en virtud de la
excepcin contemplada en el apartado 2 del artculo 8 de la Directiva 91/414/CEE)
ninguna autorizacin de productos fitosanitarios que contengan fentin.
No obstante, Espaa se ha reservado su uso como cebo en ctricos y melocotones,
por lo que las autorizaciones de los productos que contengan fentin podan mantenerse
en vigor hasta el 30 de junio de 2007.
1.4.4.3. Malatin
El malatin es un insecticida que suele utilizarse para el control de mosquitos y
otros insectos que atacan frutas, verduras, plantas ornamentales y arbustos. Tambin se
utiliza en perros y gatos para el control de pulgas, garrapatas y hormigas. Dado que el
malatin es un insecticida eficaz contra la mayora los insectos, es usado en los hogares
para controlar moscas comunes, cucarachas y mosquitos, entre otros. Aplicado en
paredes y tejados se utiliza tambin como insecticida residual para el control de la
malaria. Es un compuesto moderadamente txico (clase III), no sistmico y de amplio
espectro, desarrollado por primera vez en 1950. Los ltimos datos indican que el uso
agrcola estimado de este plaguicida en EE.UU. es de 1.134 toneladas / ao (263).
1.4.4.4. Clorpirifos
El clorpirifos es el insecticida organofosforado ms utilizado en agricultura (264) y
est clasificado como moderadamente txico (toxicidad II) por la Agencia de Proteccin
50
1. Introduccin
fue
re-aprobado
para
su
uso
en
agricultura
en
el
2005.
51
2. Objetivos
2. Objetivos
52
3. Materiales y mtodos
3. Materiales y mtodos
3.1.1. Plaguicidas
Los patrones de los plaguicidas objetos de estudio, as como de los compuestos
relacionados utilizados para evaluar la selectividad de los ensayos, fueron adquiridos a
Dr. Ehrenstofer (Augsburg, Alemania), Riedel-de-Han (Seelze-Hannover, Alemania),
PolyScience (Niles, IL, EE.UU.) y Sigma-Aldrich Qumica (Madrid, Espaa).
Atrazina, simazina e irgarol 1051 fueron cedidos por Ciba-Geigy (Barcelona,
Espaa) y clorpirifos por Laboratorios Alcotn (Sevilla, Espaa).
Las disoluciones estndar se prepararon en metanol, acetona o dimetilsulfxido, y
se almacenaron a -80 C.
3.1.2. Reactivos
Albmina de suero bovino (BSA), ovoalbmina (OVA), peroxidasa de rbano
picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), casena, gelatina, adyuvante de Freunds
completo e incompleto, o-fenilendiamina (OPD), Tween 20, anticuerpos de cabra anticonejo marcados con HRP, anticuerpos de cabra anti-conejo marcados con AP,
substrato lquido de fosfatasa alcalina BCIP/NBT, substrato lquido de peroxidasa
3,3,5,5-tetrametilbenzidina (TMB), CDP-Star, sales sdicas de cidos hmicos,
tributilamina (TBA), cloroformiato de isobutilo (CFI), carbonildiimidazol (CDI), N-etil-
53
3. Materiales y mtodos
3.1.3. Tampones
Tampn carbonato (CB): Na2CO3 15 mM y NaHCO3 35 mM, pH 9,6
Tampn fosfato salino (PBS): Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM, NaCl 137 mM y
KCl 2,7 mM, pH 7,5
Tampn PBS-T: PBS conteniendo 0,05% de Tween 20
Tampn de revelado: citrato sdico 25 mM y fosfato sdico 62 mM, pH 5,5
Tampn MES: cido 2-(N-Morfolino)etanosulfnico 0,1 M, pH 4,7
Tampn TBS: tris(hidroximetil)aminometano 10 mM, NaCl 145 mM, pH 8,0
Tampn TBS-T: TBS conteniendo 0,05% de Tween 20
3.1.4. Haptenos
Los haptenos para diazinn, fentin, malatin y clorpirifos fueron diseados y
sintetizados por personal del grupo de investigacin SYM, siguiendo los protocolos
descritos en las publicaciones asociadas a esta Tesis.
El hapteno denominado 2d (N-(4-cloro-6-isopropilamino-[1,3,5]triazin-2-il)-6-cido
aminohexanoico) fue preparado siguiendo el protocolo descrito por Gascn et al. (266).
54
3. Materiales y mtodos
55
3. Materiales y mtodos
sistema a una bomba peristltica (Minipuls-3, Wilson, Villiers LeBel, Francia), la cual
controla el flujo y proporciona el vaco necesario.
Para el anlisis de imagen de membranas se utiliz un escner Epson modelo Twain
5 y el paquete informtico Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, Berkshire, Reino
Unido).
56
3. Materiales y mtodos
O
HN
OH
(Hapteno)
(DCC)
OH
(NHS)
O
Protena
N
H
Protena
Protena-NH
NH22
O
R
OH
(Hapteno)
Cl
(CFI)
(TBA)
Protena-NHNH
Protena
2 2
N
H
Protena
57
3. Materiales y mtodos
et al. (135). Para ello, 0,21 mmoles de hapteno se mezclan con 0,25 mmoles de CDI en
2 mL de acetonitrilo anhidro. La reaccin se mantiene en agitacin durante 48 h a 0 C y
bajo atmsfera de argn. A continuacin, se aaden 16 mg/mL de hapteno activado en
DMF a 4 mg/mL de protena en tampn fosfato pH 9,1, dejando reaccionar la mezcla
durante 48 h a 4 C en agitacin constante (Figura 21).
Los conjugados obtenidos se purifican por cromatografa de exclusin molecular y
en las fracciones obtenidas se cuantifica el contenido en protena mediante Bradford
(268).
O
OH
Protena-NH2
(CDI)
O
Protena
N
H
H3N
NH3+
NH3+
EDC
-
EDC
H2N
NH2
N
H
O-
O-
H
N
O+
H3N
H3N
O
NH3+
58
3. Materiales y mtodos
H3N
NH3
NH3+
CH2O
N
H
H3N
OH
H+
+
N
H
O-
O-
H
N
H
N
R
+
H3N
O
NH3+
H3N
R
NH
OH
59
3. Materiales y mtodos
KLH) disuelta en tampn fosfato. Para ello, los patrones y las muestras (diluciones
seriadas) se colocan en una placa ELISA (20 L/pocillo), se aaden 200 L/pocillo del
reactivo de Bradford -diluido 1:5 en agua MilliQ- y, tras 5 minutos en oscuridad, se lee
la absorbancia a 595 nm.
La protena HRP se cuantific por medida directa de la absorbancia a 404 nm.
Para conocer el ttulo de los anticuerpos se llevaron a cabo ensayos tipo ELISA no
competitivos, tanto en formato directo como indirecto, siguiendo los protocolos usuales
de inmunoensayo (270). Los ensayos competitivos (directos e indirectos) se realizaron
con aquellas concentraciones de inmunorreactivos que dieron seales de absorbancia
entre 0,5 y 1,2 unidades. A continuacin se detallan los protocolos utilizados en ambos
casos.
A. Ensayo de titulacin en formato directo
1- Tapizar la placa con el suero (100
L/pocillo a diferentes
60
3. Materiales y mtodos
61
3. Materiales y mtodos
62
3. Materiales y mtodos
63
3. Materiales y mtodos
64
3. Materiales y mtodos
65
4. Resultados
4. Resultados
66
4. Resultados
67
4. Resultados
CH(CH3)2
DIAZINN
OCH2CH3
P
H3C
OCH2CH3
HAPTENOS
TIPO I
CH(CH3)2
D1 R = -CH2-COOH
N
D2 R = -(CH2)3-COOH
R
H3C
D3 R = -(CH2)5-COOH
R'
TIPO II
N
D4 R = -S-CH2-COOH
OCH2CH3
D5 R = -S-(CH2)3-COOH
P
H3C
D6 R = -S-(CH2)5-COOH
OCH2CH3
TIPO III
CH(CH3)2
OCH2CH3
D7
P
H3C
NH
OH
CH(CH3)2
O
COOH
P
H3C
D8
68
4. Resultados
H3C
S
FENTIN
P
H3CO
H3C
OCH3
HAPTENOS
TIPO A
H3C
F1 R = -CH2-COOH
R
S
F2 R = -(CH2)3-COOH
F3 R = -(CH2)4-COOH
F4 R = -(CH2)5-COOH
H3C
F5 R = -CH2-(C6H4)-COOH
F6 R = -CO-(CH2)2-COOH
H3C
S
TIPO B
F7 R = -OH
P
H3C
H3CH2CO
F8 R = -COOH
NH
R'
HOOC
TIPO C
S
S
P
H3C
H3CO
F9
OCH3
69
4. Resultados
H3CO
COOCH2CH3
MALATIN
P
H3CO
S
COOCH2CH3
HAPTENOS
H3CO
COOH
H3CO
COOCH2CH3
S
P
P
H3CO
H3CO
S
COOH
COOCH2CH3
M1
O
H3CO
H3CO
H3CO
P
H3CO
COOH
M3
M2
O
COOCH2CH3
HOOC
H3CO
S
O
P
S
COOCH2CH3
M4
H3CO
NH
COOCH2CH3
COOH
M5
70
4. Resultados
H3CH2CO
Cl
S
P
H3CH2CO
CLORPIRIFOS
Cl
Cl
HAPTENOS
H3CH2CO
P
H3CH2CO
Cl
S
N
COOH
N
O
Cl
Cl
Cl
Cl
C5
(Triclopir)
C1
H3CH2CO
Cl
S
P
HOOC
N
O
Cl
C2 R = -NH-(CH2)5-COOH
C3 R = -NH-(CH2)3-COOH
C4 R = -NH-(CH2)3-OH
Cl
71
4. Resultados
transportadora y del hapteno. Los nmeros romanos (I, II) hacen referencia a sueros
obtenidos con el mismo inmungeno en animales diferentes.
En total se obtuvieron 72 sueros -16 para diazinn, 18 para fentin, 18 para
malatin y 20 para clorpirifos-.
a) Formato directo
Ninguno de los sueros obtenidos proporcion suficiente seal con los diferentes
trazadores, lo que impidi continuar con el desarrollo de un inmunoensayo para
diazinn en formato directo.
b) Formato indirecto
Los resultados obtenidos en los ensayos de titulacin indirecta se muestran en la
Tabla 14, donde se observa que hay diferencias significativas de ttulo de un mismo
conjugado de tapizado segn el suero ensayado. Con el fin de facilitar la lectura de las
Tablas, los valores de absorbancia leidos para cada par suero/conjugado de tapizado se
han asociado a un color.
En primer lugar, hay que indicar que con este tipo de ensayos es difcil establecer
conclusiones claras, ya que la diferente respuesta inmunitaria entre individuos es una
variable incontrolable. Sin embargo, los resultados muestran que los anticuerpos
obtenidos a partir de haptenos de un tipo dado presentan un ttulo alto o medio cuando
se utiliza ese mismo tipo de haptenos en el conjugado de tapizado y que, en todos los
casos, fue mayor en condiciones homlogas. Tambin se observa, que la avidez de
algunos sueros disminuye al aumentar la longitud del brazo espaciador en el conjugado
72
4. Resultados
de tapizado. As, de los 16 sueros, 13 presentan menor ttulo cuando se usan haptenos
con el brazo espaciador ms largo (haptenos D3, D6 y D8) como conjugados de
tapizado. Esto podra atribuirse al enmascaramiento de los grupos funcionales del
hapteno en el conjugado de tapizado, debido al plegamiento de la molcula.
Conjugado de tapizado
OVA-D1
OVA-D2
OVA-D3
OVA-D4
OVA-D5
OVA-D6
OVA-D7
OVA-D8
BSA-D1-I
BSA-D1-II
BSA-D2-I
BSA-D2-II
BSA-D3-I
BSA-D3-II
BSA-D4-I
BSA-D4-II
BSA-D5-I
BSA-D5-II
BSA-D6-I
BSA-D6-II
BSA-D7-I
BSA-D7-II
BSA-D8-I
BSA-D8-II
0,2
0,5
73
4. Resultados
a) Formato directo
Los sueros obtenidos para fentin slo mostraron cierto grado de reconocimiento en
formato directo cuando se utiliz el hapteno F7 como trazador (respuesta muy dbil,
seales de absorbacia <0,5).
b) Formato indirecto
La Tabla 15 muestra los resultados de los ensayos de titulacin indirecta para
fentin. Puede observarse que los sueros obtenidos al inmunizar con el hapteno F1 menor brazo espaciador- no presentaron ttulo con ninguno de los tapizados, mientras
que los producidos con los haptenos F2 a F6, que slo difieren en la longitud del brazo
espaciador, mostraron ttulos altos.
Tabla 15. Resultados de los ensayos de titulacin para fentin en formato indirecto
Suero
Conjugado de tapizado
OVA-F1
OVA-F2
OVA-F3
OVA-F4
OVA-F5
OVA-F6
OVA-F7
OVA-F8
OVA-F9
BSA-F1-I
BSA-F1-II
BSA-F2-I
BSA-F2-II
BSA-F3-I
BSA-F3-II
BSA-F4-I
BSA-F4-II
BSA-F5-I
BSA-F5-II
BSA-F6-I
BSA-F6-II
BSA-F7-I
BSA-F7-II
BSA-F8-I
BSA-F8-II
BSA-F9-I
BSA-F9-II
0,2
0,5
74
4. Resultados
Los sueros obtenidos con el hapteno F5 dieron ttulos altos frente a todos los
conjugados preparados con haptenos que conservan el grupo tiofosfato, probablemente
debido a la mayor densidad electrnica de su brazo espaciador aromtico.
Los sueros desarrollados a partir de F6 slo proporcionaron ttulos altos en
condiciones homlogas, en contraste con otros haptenos del mismo tipo (F2 a F5) cuyo
brazo espaciador fue unido al tomo de oxgeno, quizs debido a la introduccin de un
grupo carbonilo.
El hapteno F7 (brazo espaciador unido al grupo tiofosfato) dio lugar a sueros con
mayor ttulo que los producidos con haptenos cuyo brazo espaciador est unido al
tomo de oxgeno (F1 a F6).
El hapteno F9, que carece de grupo metilo en el anillo aromtico, dio sueros con
ttulos elevados nicamente en condiciones homlogas.
a) Formato directo
Los sueros obtenidos slo mostraron reconocimiento en formato directo al utilizar
el hapteno M5 como trazador en condiciones homlogas, siendo el suero KLH-M5-II el
nico que proporcion un ttulo elevado. En contraste, con los sueros BSA-M5-I y
KLH-M5-I las seales obtenidas fueron bajas.
b) Formato indirecto
Los resultados mostrados en la Tabla 16 indican que los sueros obtenidos con los
haptenos M1, M2 y M3 dieron ttulos ms bajos que los obtenidos con los haptenos M4
y M5, a pesar de que no contienen el enlace P-S.
75
4. Resultados
Conjugado de tapizado
OVA-M1 OVA-M2 OVA-M3 OVA-M4 OVA-M5
BSA-M1-I
BSA-M1-II
BSA-M2-I
BSA-M2-II
BSA-M3-I
BSA-M3-II
BSA-M4-I
BSA-M4-II
BSA-M5-I
BSA-M5-II
cBSA-M2-I
cBSA-M2-II
cBSA-M5-I
cBSA-M5-II
cBSA-Ma-I
cBSA-Ma-II
KLH-M5-I
KLH-M5-II
Suero
Conjugado de tapizado
BSA-M2 BSA-M3 BSA-M4
BSA-M1
BSA-M5
KLH-M5-I
KLH-M5-II
Absorbancia
0,2
0,5
76
4. Resultados
a) Formato directo
Los sueros obtenidos para clorpirifos no mostraron ttulo en formato directo con
ninguno de los trazadores ensayados (HRP-C1, HRP-C2, HRP-C3, HRP-C4 y HRPC5).
b) Formato indirecto
La Tabla 17 muestra los resultados de los ensayos llevados a cabo en formato
indirecto con los sueros obtenidos con BSA y KLH, utilizando como conjugados de
tapizado tanto los OVA-hapteno como los BSA-hapteno. Los sueros obtenidos con el
hapteno C1 -que posee el brazo espaciador unido al anillo aromtico- presentan ttulos
bajos cuando se utilizan los conjugados de tapizado obtenidos con los haptenos C2, C3
o C4.
77
4. Resultados
Conjugado de tapizado
OVA-C2 OVA-C3 OVA-C4
OVA-C5
BSA-C1
Conjugado de tapizado
BSA-C2 BSA-C3 BSA-C4
BSA-C5
BSA-C1-I
BSA-C1-II
BSA-C2-I
BSA-C2-II
BSA-C3-I
BSA-C3-II
BSA-C4-I
BSA-C4-II
KLH-C2-I
KLH-C2-II
KLH-C3-I
KLH-C3-II
KLH-C4-I
KLH-C4-II
Suero
KLH-C2-I
KLH-C2-II
KLH-C3-I
KLH-C3-II
KLH-C4-I
KLH-C4-II
Dilucin de suero 1:1.000
Concentracin de conjugado de tapizado 1 mg/L
Absorbancia
0,2
0,5
Los haptenos C2 y C3, que slo difieren en la longitud del brazo espaciador, dieron
sueros con mayor ttulo, especialmente C2 que posee el brazo espaciador ms largo. Sin
embargo, C4 -cuya estructura es similar a C3, pero en el que la unin a protena se
produce a travs de un grupo hidroxilo en lugar de carboxilo, produjo sueros con ttulos
ms bajos.
Los haptenos que mejor reconocimiento mostraron como conjugados de tapizado
fueron aquellos que carecen de grupo tiofosfato y poseen el brazo espaciador unido por
78
4. Resultados
el
desarrollo
de
inmunoensayos
competitivos
para
los
insecticidas
79
4. Resultados
Trazador
HRP-F7
HRP-F7
IC50 (ng/mL)
500
285
80
4. Resultados
Conjugado de tapizado
OVA-D4
OVA-D1
OVA-D7
OVA-D4
OVA-D2
OVA-D7
OVA-D7
IC50 (ng/mL)
2010
69
30
27
627
7,5
7,5
ENSAYO A
ENSAYO B
Conjugado de tapizado
OVA-F6
OVA-F7
OVA-F3
OVA-F6
OVA-F8
OVA-F1
OVA-F1
OVA-F2
IC50 (ng/mL)
5300
550
2300
14200
1200
0,45
96
544
81
4. Resultados
IC50 (ng/mL)
2.400
1.900
4.100
600
4.800
1.800
50
20
2
200
>5.000
>5.000
IC50 (ng/mL)
1.600
32
0,04
3
10
7
2
7
7
4
3
ENSAYO D
ENSAYO C
82
4. Resultados
83
4. Resultados
Diazinn, ensayo A
14
Diazinn, ensayo B
11
0,70
0,55
13
10
0,50
A0 (u.a.)
0,65
11
IC50 (ng/mL)
12
A0 (u.a.)
IC (ng/mL)
50
10
0,60
0,45
0,55
7
6,5
7,0
7,5
8,0
6,5
7,0
7,5
pH
8,0
pH
F en ti n
0 ,5 3
Malatin
0 ,8 0
1,1
0 ,5 2
0 ,4 9
0 ,7 4
IC50 (ng/mL)
0 ,5 0
A0 (u.a.)
IC (ng/mL)
50
0 ,7 6
0 ,4 8
1,0
0,9
0,8
0,7
A0 (u.a.)
0 ,7 8
0 ,5 0
0 ,7 2
0 ,4 7
0 ,7 0
0 ,4 6
0 ,4 5
0 ,6 8
4
0,6
5,0
5,5
6,0
pH
6,5
7,0
pH
1 ,1 0
C lorpirifos, ensayo C
Clorpirifos, ensayo D
0,08
2 ,5
1,0
0 ,9 5
0,9
0,06
0,8
A0 (u.a.)
2 ,0
IC50 (ng/mL)
1 ,0 0
A0 (u.a.)
IC (ng/mL)
50
1 ,0 5
0,04
0,7
0 ,9 0
1 ,5
0 ,8 5
0,6
0,02
0,5
0 ,8 0
4
pH
pH
84
4. Resultados
Diazinn, ensayo A
16
Diazinn, ensayo B
0,65
0,53
14
0,63
0,52
0,50
0,49
10
0,55
10
0,51
12
0,48
0,53
0,51
0,47
0,46
0,49
10
20
40
A0 (u.a.)
0,57
IC (ng/mL)
50
(ng/mL)
12
IC
50
0,59
A0 (u.a.)
0,61
14
80
10
PBS (mM)
20
40
80
PBS (m M)
1,2
Fentin
Malatin
1,2
1,2
8
1,0
IC50 (ng/mL)
0,8
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,8
1,0
6
A0 (u.a.)
1,0
5
0,6
0,8
0,6
0,4
3
0,4
5
10
20
40
0,6
80
10
PBS (m M)
20
40
80
PBS (m M )
Clorpirifos, ensayo C
0,8
1,05
Clorpirifos, ensayo D
12
0,9
1,00
0,8
0,7
0,4
A0 (ng/mL)
IC
0,90
IC50 (ng/mL)
0,95
A0 (u.a.)
0,6
50
(ng/mL)
10
0,6
0,85
0,2
0,5
2
0,80
10
20
PBS (m M)
40
80
10
20
40
80
PBS (m M)
85
4. Resultados
mM fue la que proporcion las mejores relaciones A0 / IC50, seleccionndose sta para
futuros desarrollos.
En el caso del malatin, los resultados indicaron que la mxima seal se produca
con PBS 5 mM, valor a partir del cual la seal disminua gradualmente al aumentar la
concentracin salina. Sin embargo, la sensibilidad mejoraba (menor valor de IC50) al
crecer la fuerza inica, seleccionando 20 mM como concentracin de compromiso entre
seal y sensibilidad.
Para clorpirifos, la sensibilidad aument a medida que lo hizo la fuerza inica,
mientras que la seal slo se increment a concentraciones superiores a 20 mM.
Nuevamente, se seleccion 20 mM para mantener una buena relacin seal/sensibilidad.
Como puede observarse en la Figura 29, las desviaciones obtenidas en los ensayos
para clorpirifos fueron ms elevadas que para los otros organofosforados estudiados.
Este hecho puede ser debido a la dificultad que presenta llevar a cabo inmunoensayos
para clorpirifos dada su hidroficidad. La bibliografa recoge esta problemtica, y son
varios los autores (285, 286) que indican que el clorpirifos se adsorbe en los materiales
plsticos, lo que provoca bajas recuperaciones y elevadas desviaciones en los
resultados. As pues, es necesario que los ensayos se realicen cuidadosamente,
especialmente al manipular el material (pipetas, puntas, placas ELISA, etc.), con el fin
de minimizar los posibles errores.
86
4. Resultados
se observa que para diazinn tanto los valores de seal como de IC50 disminuan al
aumentar el porcentaje de surfactante (hasta 0,1% para el ensayo B), por lo que se
seleccion una concentracin de Tween 20 del 0,1% como compromiso entre
sensibilidad y ausencia de interacciones no especficas.
20
Diazinn, ensayo A
35
Diazinn, ensayo B
0,70
18
0,60
30
0,68
20
15
10
0,55
14
0,64
12
0,62
10
0,60
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,66
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
16
25
0,50
0,45
5e-3
0,01
0,05
0,1
0,5
5e-3
% Tween 20
0,01
0,05
0,1
0,5
% Tween 20
M alatin
Fentin
2,0
1,0
1,5
0,9
1,2
1,0
IC50 (ng/mL)
A0 (u.a.)
IC (ng/mL)
50
1,1
6
1,0
5
0,8
0,9
4
0,5
0,7
5e-3
0,01
0,05
0,1
0,5
0,8
5e-3
%Tween 20
0,01
0,05
0,1
0,5
% Tween 20
Clorpirifos, ensayo C
Clorpirifos, ensayo D
0,16
75
1,2
1,0
0,14
65
35
25
0,8
1,0
A0 (u.a.)
0,9
45
IC50 (ng/mL)
0,12
55
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
A0 (u.a.)
0,10
0,08
0,8
0,06
0,04
15
0,6
0,02
5
0,7
0
5e-3
0,01
0,05
% Tween 20
0,1
0,5
5e-3
0,01
0,05
0,1
0,5
% Tween 20
87
4. Resultados
Para fentin y malatin, las seales eran menores y los valores de IC50 mayores, a
medida que aumentaba la concentracin de Tween 20 en el medio de ensayo,
obtenindose los valores de IC50 ms bajos con porcentajes de Tween 20 de 0,005% y
0% para fentin y malatin, respectivamente.
En el caso de clorpirifos se seleccion un 0,5% de Tween 20 para el inmunoensayo
C, ya que los valores de IC50 fueron menores al aumentar el porcentaje de surfactante.
Para el ensayo D se decidi trabajar sin surfactante, dado que la presencia de ste no
proporcion ninguna mejora en la respuesta.
Fentin
Malatin
2,5
0,065
IC50 (ng/mL)
0,9
0,055
A (u.a.)
0
IC50 (ng/mL)
0,060
0,8
1,1
A0 (u.a.)
1,2
1,0
2,0
1,0
0,050
0,7
0,045
0,9
1,5
0,6
30
45
15
60
30
0,45
Clorpirifos, ensayo C
60
Clorpirifos, ensayo D
1,0
0,012
0,40
A0 (u.a.)
0,8
IC50 (ng/mL)
0,30
1,2
0,010
0,9
0,35
IC50 (ng/mL)
45
tiem po (min)
tiempo (min)
1,1
0,008
1,0
0,006
0,25
0,7
0,20
A0 (u.a.)
15
0,004
0,9
0,002
0,15
0,6
15
30
45
tiempo (min)
60
15
30
45
60
tiempo (min)
88
4. Resultados
pH
Ensayo A
Ensayo B
Ensayo C
Ensayo D
7,5
7,5
7,5
6,5
6,0
6,0
PBS
(mM)
20
20
20
20
20
20
Tween 20
(%, v/v)
0,1
0,1
0,005
0
0,5
0
t*
(min)
60
60
30
15
45
30
89
4. Resultados
Ensayo A
Ensayo B
1,0
0,8
1,0
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
10-3
10-2
10-1
100
101
102
10-5
103
1,0
1,0
0,8
0,8
10-3
10-2
10-1
100
101
102
[Fentin] (ng/mL)
[Diazinn] (ng/mL)
0,6
0,4
0,2
Ensayo
C
Ensayo
D
Ensayo
D
Ensayo
C
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
10-3
10-4
10-2
10-1
100
101
102
[Malatin] (ng/mL)
103
104
10-1 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
[Clorpirifos] (ng/mL)
Figura 32. Curvas patrn obtenidas para los cuatro organofosforados (media de tres
rplicas)
90
4. Resultados
Ensayo A
Ensayo B
Ensayo C
Ensayo D
LD (ng/mL)
0,4
0,85
0,0006
0,1
0,0003
0,00007
RD (ng/mL)
1,3-71,3
1,2-32,0
0,03,-1,0
0,2-10,9
0,004-16,5
0,0004-0,3
IC50 (ng/mL)
7,5
7,5
0,05
1,6
0,3
0,007
Los inmunoensayos desarrollados para diazinn fueron menos sensibles que los kits
comerciales (InSite Diazinon Plate Kit -LD 0,03 ng/mL- y EnviroGard Diazinon Plate
Kit -LD 0,022 ng/mL-) a pesar de que se utilizaron nuevas rutas sintticas para la
obtencin de haptenos. Hay que sealar que no se dispone de informacin sobre los
inmunorreactivos utilizados en estos kits.
Con posterioridad a la obtencin de estos resultados, Lee et al. (293) han puesto a
punto un ELISA indirecto para diazinn basado en anticuerpos monoclonales -IC50 de 4
ng/mL y LD de 0,7 ng/mL- con prestaciones similares a las de nuestro ensayo A
desarrollado para este plaguicida.
El ELISA desarrollado para la determinacin de residuos de fentin presenta mayor
sensibilidad que los ensayos en placa descritos a la vez en la bibliografa por Kim et al.
(294, 295). Esta mejora podra deberse a la diferencia entre los haptenos utilizados conjugacin a protena via grupo alcohol para obtener el inmungeno y mayor
heterologa con el hapteno de tapizado que carece del grupo tiofosfato-.
Recientemente, Zhang et al. (296) han descrito otro ELISA para fentin ligeramente
menos sensible (IC50 de 0,08 ng/mL) inmunizando con un hapteno que posee el brazo
espaciador unido al anillo aromtico por la posicin del tomo de azufre (careciendo de
este elemento); como hapteno de tapizado usan uno de los descritos previamente por
Kim et al. (294). Meses despus, estos mismos autores han mejorado las prestaciones
del inmunoensayo (297) utilizando una nueva combinacin de haptenos de
inmunizacin -con el brazo espaciador unido al anillo aromtico- y de tapizado con el
brazo espaciador en el grupo tiofosfato-, obteniendo una IC50 de 0,01 ng/mL.
En el caso del ensayo para malatin, es de destacar la mejor sensibilidad alcanzada en
comparacin con los inmunoensayos descritos por Nishi et al. (298) utilizando
91
4. Resultados
92
4. Resultados
Hapteno de inmunizacin
Diazinn
D6
CH(CH3)2
Hapteno de tapizado
CH(CH3)2
D7
CH(CH3)2
N
N
OCH2CH3
P
H3C
H3C
OCH2CH3
P
OCH2CH3
OCH2CH3
OCH2CH3
(H2C)5
NH
OH
HOOC
Fentin
F7
F1
H3C
H3C
S
H3C
S
H3CO
P
H3C
CH2COOH
H3CH2CO
H3C
OCH3
NH
H3C
OH
Malatin
M5
M2
O
H3CO
COOCH2CH3
H3CO
P
S
H3CO
COOCH2CH3
C2
Cl
S
P
H3CH2CO
COOH
Cl
C5
Cl
S
P
N
H
COOH
H3CH2CO
HOOC
N
O
H3CO
NH
COOCH2CH3
Clorpirifos
H3CH2CO
H3CO
H3CO
N
O
Cl
HOOC
Cl
N
O
Cl
Cl
Cl
Cl
93
4. Resultados
Compuesto
Diazinn
(H3 C)2HC
S
N
N
Ensayo B
IC50
RC
(ng/mL)
(%)
7,5
100
OEt
OEt
H3 C
Diazinn
hidroxi-metabolito
(H3C)2 HOC
S
N
N
157
4,8
434
1,7
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
6.166
0,12
>10.000
<0,075
662
1,1
1.923
0,39
268
2,8
785
0,96
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
>10.000
<0,075
3.084
0,24
OEt
OEt
H 3C
O
AMPA
H2NH2C
OH
OH
Cl
Atrazina
N
N
NHCH(CH3) 2
N
H3CH2CHN
O
Azinfos-metil
S
N
OMe
OMe
Clorpirifos
Cl
S
N
Cl
OEt
OEt
Cl
O
Diclorvos
Cl
O
Cl
Fenitrotin
OEt
OEt
S
O2 N
OMe
OMe
Fentin
S
H3 CS
OMe
OMe
H3C
Glifosato
H
N
HOOC
OH
OH
Paratin-metil
S
O2 N
OMe
OMe
Pirimifos-etil
(H3CH2 C)2 N
S
N
N
OEt
OEt
H 3C
(H3CH2 C)2N
Pirimifos-metil
N
N
OMe
OMe
H 3C
Tetraclorvinfos
Cl
Cl
O
Cl
O
Cl
Simazina
OMe
OMe
Cl
N
N
NHCH2 CH 3
N
H3CH 2CHN
RC-Reactividad cruzada
RC (%) = [IC50 (analito) / IC50 (interferente)] 100
94
4. Resultados
95
4. Resultados
IC50(ng/mL)
0,05
RC (%)
100
13,7
0,4
818,9
610-3
>10.000
<510-4
>10.000
<510-4
5.000
10-3
>10.000
<510-4
1,6
3,1
OH
>10.000
<510-4
OMe
5.297
910-3
>10.000
<510-4
>10.000
<510-4
S
H3CS
OMe
OMe
H3C
Fentin-sulfxido
S
H3COS
OMe
OMe
H 3C
4-(Metiltio)-m-cresol
H3CS
OH
H 3C
Atrazina
Cl
N
N
NHCH(CH 3)2
N
H3CH 2CH N
Azinfos-metil
O
S
N
OMe
OMe
N
Cl
Clorpirifos
N
Cl
O Et
OEt
Cl
Diazinn
(H3C)2HC
S
N
N
OEt
OEt
H3C
Fenitrotin
S
O2N
OMe
OMe
H3C
Glifosato
H
N
HOOC
P
OH
Paratin-metil
S
O2N
OMe
Pirimifos-metil
(H3CH2C)2N
S
N
N
OMe
OMe
H3C
Pirimifos-etil
(H3CH 2C)2N
S
N
N
OEt
OEt
H3C
RC-Reactividad cruzada
RC (%) = [IC50 (analito) / IC50 (interferente)] 100
96
4. Resultados
O
EtO
EtO
RC (%)
100
118
1,3
>5104
<3,210-3
>5103
<3,210-2
>2,5104
<6,310-3
>5104
<3,210-3
200
0,8
2103
7,910-2
>5104
<3,210-3
>5104
<3,210-3
>5103
<3,210-2
4103
410-2
199
0,8
>5104
<3,210-3
>5104
<3,210-3
OMe
OMe
Malaoxon
IC50 (ng/mL)
1,58
EtO
EtO
OMe
OMe
Acefato
O
O
N
H
OMe
SMe
Cl
Clorpirifos
N
Cl
OEt
OEt
Cl
Diazinn
(H3C)2H C
S
N
N
OEt
OEt
H 3C
Diclorvos
O
Cl
O
Cl
Fentin
OEt
OEt
S
H3CS
OMe
OMe
H3C
Fenitrotin
S
O2N
OMe
OMe
H3C
Glifosato
H
N
HOOC
OH
OH
Metamidofos
S
N
H
OH
OMe
Ometoato
O
HN
S
O
Paratin-metil
OMe
OMe
S
O2N
OMe
OMe
Tiometn
S
S
S
OMe
OMe
Cl
Triclorfn
Cl
Cl
OMe
OH OMe
Vamidotin
O
O
S
HN
OMe
OMe
RC-Reactividad cruzada
RC (%) = [IC50 (analito) / IC50 (interferente)] 100
97
4. Resultados
Compuesto
Clorpirifos
Ensayo D
IC50 (ng/L) RC (%)
Cl
S
N
Cl
271
100
194
140
14
661
41
15
46
OH
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
NHCH(CH3)2
>5106
<610-3
>5106
<210-4
2106
0,014
2106
3,510-4
2,5106
0,011
1.700
OEt
OEt
100
Cl
Cl
S
Clorpirifos-metil
Cl
OMe
OMe
50
Cl
Cl
O
Clorpirifos-oxon
Cl
OMe
OMe
Cl
Cl
N
TCP
Cl
Cl
Cl
N
Atrazina
N
N
H3CH 2CHN
O
Azinfos-metil
OMe
OMe
N
Cl
S
Bromofos-etil
Br
OEt
OEt
0,4
Cl
Cl
S
Bromofos-metil
Br
OMe
OMe
319
85
28
25
Cl
(H3C)2H C
S
Diazinn
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
>5106
< 610-3
53.000
0,01
2106
0,014
>5106
< 610-3
1,3106
510-4
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
>5106
< 610-3
1,5106
510-4
OEt
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
OMe
>5106
< 610-3
>5106
<210-4
>5106
< 610-3
5105
1,410-3
>5106
< 610-3
5,6105
1,310-3
OEt
OEt
H3C
S
Cl
Diclofentin
OEt
OEt
Cl
Cl
S
Fenclorfos
Cl
OMe
OMe
47
15
Cl
S
O2N
Fenitrotin
OMe
OMe
H3C
S
H3CS
Fentin
OMe
OMe
H3C
O
H
N
HOOC
Glifosato
OH
OH
O
EtO
Malatin
EtO
OMe
OMe
S
O2N
Paratin-metil
OMe
OMe
(H3CH 2C)2N
S
Pirimifos-etil
P
OEt
H3C
(H3CH2C)2N
S
Pirimifos-metil
OMe
H3C
Cl
Tetraclorvinfos
Cl
O
Cl
O
OMe
OMe
Cl
Cl
N
Triclopir
Cl
COOH
Cl
RC-Reactividad cruzada
RC (%) = [IC50 (analito) / IC50 (interferente)] 100
98
4. Resultados
La capacidad de los disolventes orgnicos de interferir en las propiedades fsicoqumicas de las protenas es bien conocida (305-307). Los efectos de estos disolventes
son generalmente atribuidos a los cambios en las interacciones no covalentes de las
protenas, incluyendo enlaces de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y la solvatacin
de grupos inicos y dipolos. Estas alteraciones pueden modificar la estructura terciaria
de las protenas provocando, en mayor o menor grado, su desnaturalizacin.
La conformacin que una protena mantiene en un disolvente depende de la
proporcin de regiones hidrofbicas e hidroflicas que sta posee en su superficie. Para
99
4. Resultados
estabilizar la estructura nativa de la protena, esta proporcin debe tener un cierto valor.
Cambios en esta proporcin provocan un reordenamiento de los puentes de hidrgeno,
lo que resulta en cambios conformacionales de la molcula (308, 309).
Sin embargo, es ampliamente aceptado que la eficiencia de las reacciones
enzimticas en medio orgnico es comparable, o incluso mayor en algunos casos, a la
que tiene lugar en medio acuoso, siempre que las enzimas estn rodeadas de una capa de
agua, la cual es necesaria para la retencin de su actividad (310).
Por analoga con las enzimas, es presumible que la hidrofobicidad de los
disolventes no cause un desplazamiento de la pelcula de agua que rodea a las molculas
de anticuerpo, manteniendo su inmunorreactividad. Sin embargo, y en contraste con las
enzimas, no son muchas las investigaciones realizadas sobre el comportamiento de los
anticuerpos o de los conjugados de tapizado protena-hapteno en medios orgnicos.
Los efectos de los disolventes orgnicos descritos para sistemas inmunoanalticos
incluyen cambios en la especificidad y algunos ejemplos de incremento de la afinidad
(127). La afinidad del anticuerpo est relacionada con la polaridad del disolvente y la
solubilidad del hapteno en el mismo (311). Sin embargo, en un estudio sobre el efecto
del tipo de disolvente en la interaccin antgeno-anticuerpo utilizando inmunoglobulinas
anti-testosterona (312), no se encontr correlacin entre la afinidad aparente y algunas
propiedades de los disolventes tales como constante dielctrica, polaridad y momento
dipolar, pero fue inversamente correlacionada con la masa molecular del disolvente.
Esto sugiere que la inhibicin del enlace puede relacionarse con la capacidad del
disolvente de desplazar la capa de agua que rodea al hapteno. En dicho estudio se
observ un aumento en la capacidad de reconocimiento del anticuerpo a medida que
disminua la concentracin de algunos disolventes.
La mayor parte de los estudios de compatibilidad de los anticuerpos en medios
orgnicos han sido desarrollados utilizando la tcnica ELISA, usando disolventes
miscibles en agua, generalmente a bajas concentraciones. En este sentido, son escasas
las publicaciones que describen ensayos en relacin con efectos matriz (313), efectos en
la enzima marcadora (314), la afinidad del anticuerpo (315) o la cintica de la unin
(316) en medios orgnicos.
En general, en los formatos en placa, en raras ocasiones se pueden utilizar
concentraciones de disolventes orgnicos miscibles con agua superiores al 10% (v/v).
Comnmente, la sensibilidad alcanzada en medio orgnico es menor, pero se ha
demostrado que la unin antgeno-anticuerpo es efectiva en estos medios. Por otro lado,
100
4. Resultados
101
4. Resultados
0,9
0,9
7,5
50
7,0
0,8
0,7
6,0
0,7
30
0,6
A0 (u.a.)
6,5
IC50 (ng/mL)
40
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,8
5,5
0,6
0,5
20
5,0
0,4
0,5
4,5
10
4,0
0,3
0
10
% Metanol (v/v)
10
% Acetonitrilo (v/v)
0,9
35
0,8
30
0,9
14
0,6
0,8
0,7
25
0,6
20
0,5
12
A0 (u.a.)
0,7
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
16
IC50 (ng/mL)
18
0,5
15
0,4
10
0,4
0,3
10
0,3
10
% Dimetilsulfxido (v/v)
10
% 2-propanol (v/v)
102
4. Resultados
1,10
1,00
0,20
1,05
1,00
0,15
A0 (u.a.)
0,90
IC50 (ng/mL)
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,95
0,95
2
0,85
0,10
0,90
0,80
0,85
0,75
0,05
0
0
10
12
14
16
18
20
% Acetonitrilo (v/v)
% Metanol (v/v)
0,25
0,85
0,30
0,9
0,80
0,75
0,20
A0 (u.a.)
0,8
0,15
IC50 (ng/mL)
0,25
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,20
0,70
0,15
0,10
0,7
0,65
0,10
0,60
0,05
0,05
0,6
0
% Acetona (v/v)
% Dimetilsulfxido (v/v)
1,6
1,4
0,8
0,85
1,4
1,2
0,8
0,7
1,0
A0 (u.a.)
0,75
IC50 (ng/mL)
IC50 (ng/mL)
1,0
A0 (u.a.)
0,80
1,2
0,8
0,6
0,70
0,6
0,65
0,4
0,6
0,4
0,5
0,2
0,60
% 2-propanol (v/v)
0,2
103
4. Resultados
104
4. Resultados
0.9
6.5
0.9
6.0
5.5
4.5
0.7
A0 (u.a.)
IC50(ng/mL)
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0.8
0.8
4.5
3.5
3.0
0.7
0.6
2.5
1.5
0.6
0
1.5
0.5
10
% Metanol (v/v)
% Acetonitrilo (v/v)
5.0
10
0.9
0.9
4.5
0.8
3.0
0.7
6
A0 (u.a.)
0.8
IC50 (ng/mL)
3.5
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
4.0
0.6
4
2.5
0.5
2.0
0.7
2
0.4
1.5
0
% Acetona (v/v)
10
% Dimetilsulfxido (v/v)
2.5
0.8
2.0
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0.9
0.7
0.6
1.5
10
% 2-propanol (v/v)
105
4. Resultados
0,85
0,6
0,80
0,5
0,75
0,9
IC50 (ng/mL)
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0,35
0,8
0,30
A0 (u.a.)
0,7
0,70
0,4
0,7
0,25
0,65
0,3
0,6
0,60
0,2
0
10
12
14
16
18
20
% Metanol (v/v)
10
12
14
16
18
20
% Acetonitrilo (v/v)
0.9
0.9
0.8
300
0.7
IC50 (ng/mL)
0.6
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
0.7
200
0,7
A0 (u.a.)
0,8
0.8
0.5
100
0.6
0.4
0,6
0.3
0
0.5
0
10
12
14
16
18
20
10
12
14
16
18
20
% Dimetilsulfxido (v/v)
% Acetona
500
1,2
0,8
6
4
0,8
A0 (u.a.)
300
IC50 (ng/mL)
1,0
0,6
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
400
200
0,4
0,6
100
0,4
0,2
0
0
10
12
14
16
18
20
% 2-propanol (v/v)
0
0
10
12
14
16
18
20
106
4. Resultados
2,0
6
0,010
1,5
0,008
0,006
A0 (u.a.)
0,95
IC50 (ng/mL)
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
1,00
1,0
2
0,90
0,004
0,5
0
0
10
12
14
16
18
20
% Metanol (v/v)
10
12
14
16
18
20
% Acetonitrilo (v/v)
20
1,2
1,0
1,0
10
0,6
0,9
0,8
0,8
0,6
0,4
5
A0 (u.a.)
0,8
A0 (u.a.)
IC50 (ng/mL)
15
IC50 (ng/mL)
1,0
0,7
0,4
0,2
0,6
0
0,0
0,2
0
10
12
14
16
18
20
1,05
10
12
14
16
18
20
3,0
1,00
2,5
0,90
IC50 (ng/mL)
0,005
A0 (u.a.)
0,006
0,95
1,0
0,8
2,0
A0 (u.a.)
0,007
IC50 (ng/mL)
% Dimetilsulfxido (v/v)
% Acetona
1,5
0,6
0,004
0,85
0,003
0,80
0,75
0,002
0
10
12
14
16
18
20
% 2-propanol (v/v)
1,0
0,4
0,5
0,0
0
10
12
14
16
18
20
107
4. Resultados
y = -0,52+0,94x
r = 0,99
GC-MS (ng/mL)
18
16
14
12
10
8
8
10
12
14
16
18
20
ELISA (ng/mL)
Figura 38. Correlacin entre los resultados obtenidos mediante GC-MS y ELISA
108
4. Resultados
1
2
3
4
5
6
7
8
Media
15
10
20
15
10
20
20
10
-
[Diazinn] determinada
ELISA
Media DS
14,1 1,0
11,0 2,0
18,0 2,0
14,4 1,6
10,4 1,1
19,7 1,3
20,0 2,0
9,9 1,5
-
R (%)
93
110
90
96
104
98
100
99
99
GC-MS
Media DS
R (%)
13,7 1,1
91
9,6 0,4
96
16,4 2,5
82
14,8 1,0
99
8,1 1,5
81
17,6 2,0
88
17,5 2,0
87,5
8,5 1,0
85
89
109
4. Resultados
[Diazinn]
adicionada
50
50
50
50
50
20
20
20
20
20
20
20
15
15
15
15
10
10
10
10
10
5
5
5
-
[Diazinn] determinada
(Media DS)
52,8 0,4
43,4 0,6
48,6 1,5
43,0 3,0
50,0 4,0
22,3 0,8
21,0 2,0
21,5 1,8
19,0 2,0
19,0 6,0
20,0 6,0
18,0 4,0
16,8 1,7
15,5 0,5
16,6 1,6
14,4 3,7
11,3 1,9
11,0 3,0
11,3 1,1
8,4 1,6
12,0 0,8
6,6 0,1
6,2 0,8
5,6 1,0
-
R
(%)
106
87
97
86
100
112
105
108
95
95
100
90
112
103
111
96
113
110
113
84
120
132
124
112
105
110
4. Resultados
[Fentin]
adicionada
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
V8
V9
V10
Media
100
5
10
5
50
10
50
50
100
10
-
[Fentin]
determinada
(Media DS)
91,09,0
4,60,3
9,30,1
4,60,2
48,02,0
11,30,8
56,04,0
42,05,0
88,06,0
8,11,1
-
R
(%)
91
92
93
92
96
113
112
84
88
81
94
111
4. Resultados
demuestran que este inmunoensayo puede ser aplicado como mtodo de control y
cuantificacin de residuos de malatin en aguas de bebida a concentraciones de ng/mL.
[Malatin]
adicionada
[Malatin]
determinada
(Media DS)
R
(%)
W1
W2
W3
W4
W5
W6
W7
W8
W9
W10
W11
W12
W13
W14
W15
W16
W17
W18
W19
W20
W21
W22
W23
W24
Media
100
100
100
100
100
50
50
50
50
50
20
20
20
20
20
10
10
10
5
5
5
2
2
2
-
94,6 4,9
93,8 7,8
83,9 12,6
94,5 2,5
105,3 16,6
52,4 7,7
49,7 6,0
49,1 7,0
51,5 4,0
48,5 5,3
20,8 1,9
19,5 0,8
23,0 4,4
20,3 2,0
19,9 1,4
10,0 0,7
10,0 0,8
10,1 0,4
5,0 0,1
5,0 0,6
4,5 1,2
2,0 0,1
2,2 0,7
1,6 0,2
-
95
94
84
95
105
105
100
98
103
97
104
98
115
102
100
100
100
101
100
100
90
100
111
81
98
112
4. Resultados
113
4. Resultados
[Malatin] = 5 ng/mL
Muestra
[Malatin]
ELISA
(Media DS)
[Malatin]
GC-MS
(Media DS)
[Malatin]
ELISA
(Media DS)
[Malatin]
GC-MS
(Media DS)
10,1 0,1
11,5 0,4
5,0 0,1
5,2 0,2
10,5 0,4
9,9 0,5
4,5 0,5
5,0 0,4
10,3 0,9
9,3 0,7
4,3 0,4
4,6 0,3
11,5 1,9
9,8 1,0
6,1 0,4
5,3 0,4
9,8 0,7
10,8 0,6
5,1 0,8
4,6 0,5
9,3 0,7
10,9 0,5
5,7 0,2
5,4 0,3
9,6 0,3
9,6 0,4
4,4 0,3
5,5 0,2
10,0 0,6
11,6 0,6
4,9 0,3
4,8 0,4
9,6 0,4
10,9 0,2
4,9 0,2
5,2 0,2
10
11,9 0,6
10,5 0,5
5,1 0,7
5,3 0,3
Por otro lado, para estudiar el efecto de la materia orgnica -es conocido que su
contenido en aguas superficiales afecta negativamente a la determinacin tanto
inmunoqumica como cromatogrfica de plaguicidas (319), dado que adsorbe los
analitos con gran facilidad -, se prepar una nueva muestra (mezcla de 100 mL de cada
una de las aguas previamente analizadas) cuyas caractersticas fueron: conductividad
elctrica 1.280 S/cm; pH 7,9; materia orgnica disuelta 3,4 mg O2/L; materia orgnica
suspendida 110,6 mg O2/L; slidos totales 1299 mg/L; dureza 46,0 grados franceses;
proporcin de adsorcin de sodio 2,1; 84,0 mg Ca2+/L; 44,0 mg Mg2+/L; 100,2 mg
Na+/L; 11,0 mg K+/L; 108,7 mg Cl-/L; 273,3 mg SO42-/L; 218,2 mg HCO3-/L. Tras
adicionar 5 ng/mL de malatin y diferentes niveles de cidos hmicos (entre 1 y 50
mg/L), la determinacin mediante ELISA proporcion recuperaciones prximas al
100% para las submuestras que contenan hasta 10 mg/L de cidos hmicos. Sin
embargo, para niveles superiores, los valores de recuperacin fueron anormalmente
114
4. Resultados
Recuperacin (%)
1000
800
600
400
200
[malatin] = 5 ng/mL
0
0
10
20
30
40
50
115
4. Resultados
116
4. Resultados
4. Resultados
observndose efecto matriz con los extractos acuosos. Las temperaturas ms elevadas y
los tiempos ms largos de agitacin proporcionaron las mejores recuperaciones, aunque
estas fueron muy bajas (1,6% con agua a 80 C, 5 minutos). La sensibilidad alcanzada
fue de 2,3 ng/mL.
Sin embargo, en la prctica, la determinacin de atrazina en muestras de aceite de
oliva queda limitada a concentraciones superiores a 15 ng/mL, debido a las bajas
recuperaciones obtenidas en la extraccin. Adems, la extraccin de atrazina con agua a
altas temperaturas (80 C) puede conducir a la formacin de hidroxiatrazina (323), lo
que sera problemtico, ya que se produciran prdidas de analito.
A la vista de los resultados obtenidos, se seleccion metanol como disolvente ms
adecuado para la extraccin directa de atrazina de aceite de oliva, y se procedi a
mejorar el proceso de limpieza de los extractos y el rendimiento de la extraccin,
llevando a cabo el proceso a bajas temperaturas. Para ello, se mezcl 1 mL de aceite de
oliva con 1 mL de metanol y se homogeneiz en vrtex durante 15 minutos; la mezcla
se mantuvo durante 1 hora a -20 C y a -80 C. Posteriormente, se recogieron los
extractos metanlicos y se acondicionaron por dilucin 1/25 en tampn fosfato antes de
su anlisis mediante ELISA.
A -20 C la congelacin del aceite no era completa y fue necesario emplear tiempos
mayores para la separacin. Por otro lado, los resultados del ELISA obtenidos con los
extractos realizados a -80 C fueron ms reproducibles, probablemente debido a que se
consigue una mejor limpieza a esta temperatura. Utilizando este pretratamiento de
muestra se obtuvo una recuperacin media del 32%.
Los resultados obtenidos al ensayar diferentes tiempos de agitacin (5, 10 y 15 min)
-manteniendo constante la cantidad de metanol, el tiempo y la temperatura de
congelacin (1 mL, 1h, -80 C)- fueron similares, seleccionandse 5 minutos como
tiempo ptimo de agitacin en vrtex.
Tambin se probaron diferentes proporciones aceite/extractante; por ejemplo, con
un volumen de aceite y cinco de metanol, se obtuvieron recuperaciones del 30%. Sin
embargo, esta va requiere utilizar el rotavapor para concentrar el extracto metanlico,
por lo que el proceso se vuelve ms lento y costoso.
Los resultados de recuperacin obtenidos fueron similares, con independencia de la
cantidad de muestra (0,5, 1 2 mL) utilizada en la extraccin, siempre que la
proporcin muestra/disolvente sea 1/1 (v/v).
118
4. Resultados
119
4. Resultados
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
[Atrazina] (ng/mL)
Figura 41. Curvas de calibrado de atrazina en metanol (2%) (A, ), extracto dopado (B,
) y aceite de oliva virgen extra (C, ). Cada punto representa la media y la
desviacin estndar de doce placas y tres rplicas de cada muestra
120
4. Resultados
mtodo aqu propuesto muestra un lmite de deteccin inferior (33 ng/mL en aceite) y,
adems, es ms simple que los anteriores.
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
Tipo de calibrado
R (%)
50 ng/mL
250 ng/mL
A
23
28
B
42
46
C
88
98
A
10
13
B
21
25
C
75
60
A
30
30
B
68
49
C
93
102
A
22
27
B
53
57
C
92
98
A
54
35
B
88
77
C
100
115
A
41
28
B
87
48
C
112
98
A
29
33
B
41
48
C
96
83
A
8
12
B
17
26
C
72
64
A
20
25
B
44
43
C
90
92
A
31
32
B
69
52
C
109
107
A
19
30
B
36
50
C
78
101
Recuperacin media para cada tipo de calibrado
A: 26, 4
B: 49,4
C: 92,0
A: curva en tampn con 2% metanol; B: curva en extracto dopado, C: curva en aceite de oliva
121
4. Resultados
1.0
1,0
0.8
0,8
0.6
0,6
0.4
0,4
0.2
0,2
0.0
0,0
-2
1e-2
10
-1
1e-1
10
1e+0
100
1e+1
101
1e+2
102
1e+3
103
1e+4
104
1e+5
105
1e+6
106
[Analito] (ng/mL)
Figura 42. Curvas patrn de atrazina en diferentes aceites de oliva virgen extra
Para ensayar la selectividad del mtodo, se prepararon curvas patrn en aceite de
oliva para las triazinas ms utilizadas. Los resultados obtenidos (Tabla 36) indican que
slo la propazina es un interferente a considerar -como recoge la bibliografa (325) para
otras matrices-, pudiendo ser detectada a niveles de pocos ng/mL. Dado que la
propazina se utiliza raramente en olivos, el ensayo puede considerarse especfico para
atrazina.
A continuacin, dado que la reproducibilidad es uno de los parmetros analticos
ms importantes, se efectu un estudio dopando once submuestras de un mismo aceite
de oliva, a dos niveles de atrazina (75 y 250 ng/mL). Las muestras se analizaron
siguiendo la metodologa propuesta, utilizando la curva patrn en aceite de oliva para la
cuantificacin. Como se aprecia en la Tabla 37, la reproducibilidad fue excelente, con
valores medios de 85% 17% y 87% 15% para niveles de adicin de 75 y 250
ng/mL, respectivamente. Estos resultados muestran la utilidad de la metodologa para la
deteccin rpida de residuos de atrazina en aceite de oliva.
122
4. Resultados
IC50 (ng/mL)
175
5.865
>176.000
4.268
>176.000
>176.000
3.143
162
11.000
>176.000
1.720
>176.000
RC (%)
100
3,0
<0,1
4,1
<0,1
<0,1
5,6
108
1,6
<0,1
10,2
<0,1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
Media SD
123
4. Resultados
[Atrazina]
adicionada
(ng/mL)
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
Media
0
10
40
60
80
100
120
150
200
400
500
[Atrazina] determinada
(ng/mL)
ELISA
Media DS
<LD
<LD
32 8
45 10
71 16
100 4
100 13
120 30
210 20
470 30
460 40
GC-MS
R (%) Media DS R (%)
<LD
n.d.
80
n.d.
75
66 7
110
89
73 8
91
100
103 10
103
83
92 8
77
80
119 11
79
105
166 13
83
118
453 9
113
92
498 12
99
91,3
94,4
ELISA (ng/mL)
GC-MS (ng/mL)
DS: desviacin estndar relativa, LD: lmite de deteccin, n.d: no detectada. R: recuperacin
[Atrazina] (ng/mL)
124
4. Resultados
125
4. Resultados
Recuperacin (%)
Diazinn
26
6
9
9
27
26
41
3
40
45
25
Fentin
Malatin
15
6
10
10
16
14
16
1
3
15
9
23
8
19
14
26
21
44
32
24
44
12
Clorpirifos
8
4
6
7
9
10
14
2
3
14
5
126
4. Resultados
para todos los ensayos, ya que en estas condiciones ninguno de los inmunoensayos
mostraba prdidas de seal ni de sensibilidad, y una misma dilucin del extracto poda
ser utilizada para la determinacin simultnea de residuos de los cuatro
organofosforados. Hay que comentar que estos valores de recuperacin obtenidos son
bajos debido al efecto matriz como se ver ms adelante.
Cuando se ensayaron diferentes volmenes de muestra (0,5, 1 y 2 mL) se
obtuvieron recuperaciones similares en todos los casos, siempre que se mantuviera la
proporcin muestra/disolvente (v/v). No obstante, las recuperaciones fueron ligeramente
superiores con proporciones 2/1 que 1/1, aunque fue necesario efectuar la extraccin en
dos etapas, lo que alarga el proceso. Esta mejora no se observ al utilizar mayores
cantidades de muestra (3/1 y 5/1).
Por
otro
lado,
cantidades
ms
elevadas
de
disolvente
(proporciones
muestra/disolvente 1/2, 1/3 y 1/5) hacan necesaria la eliminacin del exceso del mismo
en rotavapor y posterior reconstitucin en tampn -conteniendo un 2% de metanol- para
mantener la sensibilidad del ensayo. Dado que esta alternativa no resulta adecuada para
anlisis de rutina, se seleccion la proporcin 1/1 como ptima.
Con el fin de mejorar los rendimientos de la extraccin, se ensayaron diferentes
temperaturas (20, 4, -20, -30, -60 y -80 C) en la etapa de separacin de fases. Los
rendimientos mejoraron para los cuatro analitos (recuperaciones medias del 41% para
diazinn, 16% para fentin, 44% para malatin y 14% para clorpirifos) al realizar la
separacin de fases a -80 C. Aunque los mayores rendimientos se obtuvieron a esta
temperatura, las recuperaciones obtenidas a -20, -30 y -60 C fueron tambin adecuadas.
Sin embargo, a -20 C, la fraccin grasa del extracto no se congela completamente en
una hora, por lo que se requiere un tiempo de separacin ms prolongado,
aproximadamente 2 h.
Establecida la temperatura de trabajo, se ensayaron mezclas de acetona o hexano
con acetonitrilo para ver si mejoraba el rendimiento de la extraccin. Para ello, se
adicionaron 5 mL de aceite de oliva a 25 mL de mezcla extractante (10 mL acetona o
hexano y 15 mL acetonitrilo); tras agitar en vrtex y mantener una hora a -80 C, se
tomaron 10 mL de la fraccin lquida, se concentr en rotavapor, y el residuo se
redisolvi en 2 mL de metanol. En todos los casos, las recuperaciones (entre 1 y 40%)
fueron inferiores a las obtenidas (entre 14 y 45%) utilizando como extractante metanol
en proporcin 1/1.
127
4. Resultados
128
4. Resultados
1,0
(b)
0,8
(a)
0,6
0,4
0,2
0,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-1
0,1
10
1
10
10
10
[Diazinn](ng/mL)
(ng/mL)
[Diazinn]
100
10
3
1000
10
0,001
10-3
1,0
0,01
10-2
0,1
10-1
10
10 1
100
10
10
102
[Fentin] (ng/mL)
[Fentin]
(ng/mL)
10000
104
1,0
(c)
(d)
0,8
1000
103
0,6
0,4
0,2
0,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,1-1
10
10
10
101
100
1000
10
102
103
[Malatin]
(ng/mL)
[Malatin]
(ng/mL)
10000
104
0,001
10-3
0,01
10-2
0,1-1
10
10
10
10
101
[Clorpirifos] (ng/mL)
(ng/mL)
[Clorpirifos]
1002
10
1000
103
Figura 44. Curvas de calibrado en diferentes medios -A (), B () y C ()- para
diazinn (a), fentin (b), malatin (c) y clorpirifos (d)
En la Tabla 40 se muestran los parmetros analticos de los inmunoensayos
desarrollados para los cuatro organofosforados en aceite de oliva utilizando curvas
patrn C (Figura 45). Tanto la sensibilidad como el intervalo de trabajo son similares,
permitiendo detectar fentin, malatin y clorpirifos a niveles inferiores a 20 ng/mL, y
diazinn a 46 ng/mL. Esta metodologa es menos sensible que la descrita por LentzaRizos et al. (255) que, mediante cromatografa (GC-NPD), determina estos compuestos
organofosforados a concentraciones del orden de 5 g/kg. Tsoutsi y Albanis (233)
alcanzan un lmite de deteccin de 5 ng/mL para diazinn y fentin, usando
microextraccin en fase slida seguida de cromatografa gaseosa. Es de destacar que los
dos mtodos cromatogrficos utilizan etapas de preconcentracin (de hasta 20 veces),
que no son necesarias cuando la determinacin se realiza mediante inmunoensayo.
Recientemente, Tsoutsi et al. (249) han usado microextraccin en fase slida en espacio
129
4. Resultados
LD (ng/mL)
46
10
16
17
RD (ng/mL)
137-3398
32-1242
67-1596
52-1953
IC50 (ng/mL)
740
205
419
297
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1e-1-1
10
1e+0
0
10
1e+1
1
10
1e+2
1e+3
102
103
[Analito]
(ng/mL)
[Analito]
1e+4
4
10
1e+5
5
10
1e+66
10
Figura 45. Curvas de calibrado para diazinn (), fentin (), malatin () y
clorpirifos () en aceite de oliva virgen extra
130
4. Resultados
100
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
30
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
6
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
Fentin
Malatin
Clorpirifos
2
100
4
1
<0,2
<0,2
<0,2
1
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
3
1
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
100
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
5
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
0,2
<0,2
<0,2
100
<0,2
<0,2
6
19
12
99
0,4
1
<0,2
25
0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
0,2
<0,2
<0,2
0,4
<0,2
Por otro lado, ninguno de los 29 compuestos ensayados fueron interferentes para
fentin y malatin, ya que la mayora de los valores de reactividad cruzada fueron
<0,2%. En general, el mayor grado de interferencia se encontr para metabolitos de
131
4. Resultados
diazinn (30% para diazinn hidroxi-metabolito) y clorpirifos (99% para clorpirifosoxon), los cuales tambin son txicos.
Estos resultados son similares a los encontrados anteriormente para muestras de
agua, excepto los obtenidos para 2-isopropil-6-metil-4-pirimidinol (diazinn hidroximetabolito) (6 veces mayor), clorpirifos-oxon (2 veces mayor) y clorpirifos-metil (4
veces menor) -presente este ltimo en muchas formulaciones comerciales junto a
clorpirifos-. Esto puede ser debido a las diferentes recuperaciones alcanzadas en el
proceso de extraccin del aceite de oliva.
La bibliografa recoge la presencia de algunos metabolitos de organofosforados
como malaoxon y fentin sulfxido (222) en muestras de aceite de oliva, pero no se han
encontrado datos sobre la presencia de diazinn hidroxi-metabolito y clorpirifos-oxon.
Para comprobar el potencial analtico de la metodologa desarrollada, se extrajeron
y analizaron mediante inmunensayo diferentes muestras de aceite de oliva virgen extra
(libres de organofosforados) dopadas con los cuatro analitos a distintos niveles. La
curva patrn se obtuvo usando un aceite de oliva libre de organofosforados, que se dop
y extrajo siguiendo la metodologa puesta a punto para los ensayos de un solo analito
(seccin 4.8.3.). La obtencin de un nico extracto por muestra y la aplicacin del
ELISA para cada organofosforado, proporcion valores de recuperacin que oscilaron
entre 88% y 120%, como se muestra en la Tabla 42.
100
200
500
800
1000
R Media
Diazinn
Fentin
[Determinada]
120 13
202 20
451 20
850 10
1184 170
120
101
90
106
118
107
[Determinada]
112 16
211 13
599 36
780 63
1074 67
Malatin
Clorpirifos
[Determinada]
112
106
120
96
107
108
119 7
231 21
485 12
854 117
1162 57
119
115
97
107
116
111
[Determinada]
98 4
208 19
485 32
704 16
1027 38
R
98
104
97
88
103
98
132
4. Resultados
Por otro lado, se realizaron calibrados, para cada organofosforado, utilizando como
matriz seis aceites de oliva virgen extra comerciales producidos en diferentes zonas de
Espaa. Como se muestra en la Figura 46, al igual que ocurra para atrazina, las
diferencias entre las distintas curvas son mnimas, lo que indica que el calibrado puede
realizarse independientemente del aceite utilizado para ello, sin que se observe
influencia debida a la matriz. Este interesante resultado podra justificarse debido a que
el aceite de oliva virgen extra es un producto mnimamente manipulado, con
pequesimas variaciones de sus componentes mayoritarios, que podran ser los
determinantes en el comportamiento de esta matriz. Por otro lado, a la vista de los
resultados, el procedimiento de extraccin se muestra muy efectivo, proporcionando
extractos libres de interferencias.
133
1,0
1,0
0,8
0,8
4. Resultados
0,6
0,4
0,2
0,0
0,4
0,2
0,0
1e-1-1
10
1e+0
0
10
1e+11
1e+2
1e+3
10
102
103
[Diazinn]
(ng/mL)
[Diazinn]
(ng/mL)
1e+44
10
1e+5
105
1,0
1,0
0,8
0,8
0,6
0,4
0,2
1e-1-1
1e+00
1e+1
1
1e+22
1e+3
3
1e+4
4
1e+5
5
1e-1-1
1e+00
101
102
103
[Clorpirifos] (ng/mL)
[Clorpirirfos]
(ng/mL)
1e+1
1e+2
1e+3
1e+4
4
1e+5
5
10
0,6
0,0
10
10
10
10
[Fentin] (ng/mL)
[Fentin]
(ng/mL)
10
10
0,6
0,4
0,2
0,0
1e-1
10-1
1e+0
100
1e+1
1e+2
1e+3
101
102
103
[Malatin] (ng/mL)
[Malatin]
(ng/mL)
1e+4
104
1e+5
105
10
10
10
10
S1
S2
S3
S4
S5
S6
Media
D
105
101
104
118
94
96
103
ELISA
F
M
118
112
130
110
121
108
113
110
129
112
118
110
122
110
C
112
98
114
106
114
99
108
D
105
86
96
83
101
113
97
GC-MS
F
M
77
107
87
78
77
80
114
86
88
92
87
121
88
94
C
105
95
104
102
92
106
101
134
4. Resultados
135
4. Resultados
Tabla 45. Procedencia de las muestras de aceite de oliva virgen extra y refinado
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20*
21*
22*
23
24*
25
26
27
28
29
30
31
32*
33*
34-45
Aceite/Procedencia
Mar de Olivas. Jan
Carbonell. Crdoba
La Masa Sumun. Sevilla
Sagres. Portugal
Oli dOr. Viver (Castelln)
Borges variedad picual. Jan
Hacendado. Espaa
Cooperativa de Jan
Cooperativa de Crdoba
Carbonell hojiblanca. Crdoba
Aceites Borges El coupage de Ferrn Adri. Reus (Tarragona)
Cooperativa agrcola de Cheste (Valencia)
Cooperativa Agrcola Sant Bertomeu. La Torre dEn Besora
(Castelln)
Olisone. Espaa.
Monte Olivos. Cooperativa La Pursima Puentegenil. Crdoba
El Corte Ingls seleccin. Sevilla
Capricho andaluz. Cabra (Crdoba)
Maeva de Torres Morente (Granada)
Ybarra. Dos Hermanas (Sevilla)
La Colmena. Jan
Las Cuarenta. Espaa
Auchan. Espaa
Cooperativa de Altura (Castelln)
Consum. Espaa
Carrefour. Espaa
Sierra Negrete. Cooperativa agrcola de Utiel (Valencia)
Cooperativa de La Torre de lEspanyol (Tarragona)
Cooperativa de Camuas (Toledo)
La laguna de Fuentepiedra. Mlaga
Carrioliva. Quintanar de la Orden (Toledo)
La Espaola. Sevilla
La Masa. Sevilla
Koipe. Espaa
Muestras del Laboratorio Agroalimentario de la Generalitat
Valenciana. Almazaras de cooperativas valencianas.
*Mezcla comercial de aceite de oliva virgen extra con aceite de oliva refinado.
136
1,0
1,0
0,8
0,8
4. Resultados
0,6
0,4
0,2
0,0
1e-3
0,4
0,2
0,0
1e-2-2
10
1e-1
1e+0
0
10-1
10
1e+11
10
1e+2
2
10
1e+3
103
[Diazinn]
(ng/mL)
[Diazinn]
(ng/mL)
1e+44
10
1e+5
5
10
1e+66
1e-3-3
10
10
1,0
1,0
0,8
0,8
10-3
0,6
0,6
0,4
0,2
0,0
1e-3
10-3
1e-2-2
10
1e-1
10-1
1e+00
10
1e+11
10
1e+22
10
1e+3
3
10
[Fentin]
(ng/mL)
[Fentin]
(ng/mL)
1e+44
10
1e+5
5
10
1e+66
1e+55
1e+66
10
0,6
0,4
0,2
0,0
1e-2
1e-1
10-2 10-1
1e+0
100
1e+1
101
1e+2
102
1e+3
103
[Malatin]
(ng/mL)
[Malatin]
(ng/mL)
1e+4
104
1e+5
105
1e+6
106
10
10
10
1e-1-1 1e+00
10
1e+1
1e+2
1e+3
1e+4
10
10
Aceite
refinado
Aceite de girasol
girasol refinado
Aceite
refinado
Aceite de maz refinado
Aceite
refinado
Aceite de soja refinado
Aceite de orujo
orujo de oliva
Aceite
Aceite de
de soja
soja yy girasol
Aceite
girasolrefinados
refinados
2% MeOH
Aceite
de oliva virgen extra
Aceite de
de soja
oliva virgen
VE
Aceite
extra
Aceite de
de maz
soja VE
Aceite
virgen extra
Aceite
de maz VE
2%
MeOH
Figura 47. Curvas patrn para los organofosforados estudiados en diferentes tipos
de aceite comestible
4. Resultados
138
4. Resultados
4. Resultados
Tapizado
OVA-D6 5 mg/L
OVA-F1 5 mg/L
BSA-M2 0,5 mg/L
OVA-C5 0,5 mg/L
Bloqueo
0,1% gelatina
0,1% gelatina
1% BSA
0,1% gelatina
Suero
BSA-D6-I (1/8.000)
BSA-F7-I (1/18.000)
KLH-M5-I (1/4.000)
BSA-C2-II (1/12.000)
Diazinn
Fentin
Malatin
Clorpirifos
100
200
500
1.000
2.431
1.225
1.973
932
356
193
298
271
22
4
10
0,4
242
48
136
2,2
140
4. Resultados
Para estudiar la influencia del sistema de marcaje sobre la sensibilidad del ensayo,
se utilizaron distintos marcadores (HRP, AP y oro coloidal) conjugados a anticuerpo
secundario cabra anticonejo, y como substratos TMB, BCIP, CDP-Star y nitrato de
plata/hidroquinona.
La utilizacin de partculas de oro como marcador ha tenido un gran desarrollo en
los ltimos aos. Las partculas de oro pueden fabricarse con diferentes tamaos, se
adsorben sobre todo tipo de protenas formando complejos muy estables, y permiten la
amplificacin de la seal -hacindola visible sin tener que recurrir a microscopa
electrnica- utilizando plata (I) como disolucin de revelado. Sin embargo, al utilizar un
Ab secundario marcado con oro y nitrato de plata/hidroquinona como revelador, no se
obtuvieron curvas de competicin; el precipitado de plata se produca en todos las
zonas, incluso a concentraciones muy altas de analito, problamente debido a la
presencia de materia orgnica dispuesta en una membrana inerte con una gran superficie
activa.
Dado que las ventajas de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos incluyen
una mayor sensibilidad y velocidad (seal generada en pocos segundos y, en algunos
casos, estable por varias horas), se utiliz un anticuerpo secundario marcado con
fosfatasa alcalina (AP) y como revelador el substrato quimiluminiscente CDP-Star. En
este caso, las seales eran muy intensas pero la reproducibilidad de las mismas era muy
baja, por lo que se prescindi de este revelador.
Los mejores resultados se consiguieron al utilizar un anticuerpo secundario
secundario marcado con peroxidasa o con fosfatasa alcalina, utilizando como substratos
TMB y BCIP, respectivamente. Como se aprecia en la Figura 49, la sensibilidad fue
similar en ambos casos, seleccionando HRP como enzima marcadora con el fin de
mantener el mismo trazador que en los inmunoensayos en placa.
En la Figura 50 se muestran las curvas patrn obtenidas mediante ELIFA, para los
cuatro organofosforados estudiados en aceite de oliva.
Los parmetros analticos de estos ensayos, resumidos en la Tabla 48, indican que
la metodologa basada en inmunofiltracin es apta para la determinacin de residuos de
plaguicidas organofosforados en aceite de oliva por debajo de los lmites mximos
legislados, y ms sensible que los ensayos en placa ELISA (ver Tabla 40).
141
4. Resultados
100 1.000
Diazinn
Fentin
HRP/TMB
Malatin
Clorpirifos
Diazinn
Fentin
AP/BCIP
Malatin
Clorpirifos
1,0
Diazinn
Fentin
Malatin
Clorpirifos
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-3
-2
1e-3 10
1e-2
10
-1
1e-1
10
0
1e+0
10
1
1e+1
10
1e+2 10
1e+3
10
[Analito]aceite (ng/mL)
4
1e+4
10
5
1e+5
10
6
1e+6
10
Figura 50. Curvas patrn obtenidas mediante ELIFA para los cuatro organofosforados
extrados de aceite de oliva virgen extra
142
4. Resultados
LD (ng/mL)
1
0,02
0,09
0,04
RD (ng/mL)
3-422
0,14-1850
0,5-800
0,12-130
IC50 (ng/mL)
22
4
10
0,4
100.000
10.000
1.000
100
10
1
0,1
0
ng/mL
Diazinn
en aceite
Fentin
Malatin
Clorpirifos
4. Resultados
(a)
(b)
0
10 ng/mL
1.000 ng/mL
D
10
144
4. Resultados
145
5. Conclusiones
5. Conclusiones
146
5. Conclusiones
147
6. Anexo
6. Anexo
Este anexo recoge parte del trabajo experimental realizado durante la Tesis Doctoral
con el objetivo de mejorar y explorar nuevas alternativas en el mbito de los mtodos
inmunoqumicos. A pesar de que las investigaciones no dieron resultados de utilidad
prctica o no mejoraron las prestaciones obtenidas por otras vas, se considera
interesante exponer el trabajo realizado, que ocup ocho meses de investigacin
resumido en tres pginas.
quantum dots- (329, 330), xidos de europio y otros lantnidos (331), y nanopartculas
148
6. Anexo
hicieron
reaccionar
80
mg
de
nanopartculas
con
mL
de
3-
6. Anexo
6,00E+03
5,50E+03
5,00E+03
4,50E+03
4,00E+03
3,50E+03
3,00E+03
2,50E+03
2,00E+03
1,50E+03
1,00E+03
1,80E+05
1,60E+05
1,40E+05
Partculas sin aminar
Partculas aminadas
1,20E+05
UF
UF
1,00E+05
8,00E+04
6,00E+04
4,00E+04
2,00E+04
400
450
500
550
0,00E+00
600
250
nm
300
350
400
nm
(a)
a)
(b)
b)
150
6. Anexo
por
cromatografa
de
exclusin
molecular.
continuacin,
se
6. Anexo
Se estableci la hiptesis de que los problemas que aparecen al utilizar este tipo de
marcadores se deben al sistema de deteccin utilizado (no es el apropiado), ya que son
necesarias grandes cantidades de conjugado para obtener seales apreciables. La
utilizacin de microscopa de fluorescencia confocal podra mejorar la deteccin, pero
no se dispona de equipos con lseres de longitud de onda apropiada. Adems, otra
posible mejora para la aplicacin de estos marcadores en inmunoensayo consistira en
purificar las nanopartculas conjugadas a protena de las libres.
No hay que olvidar que la aplicacin de este tipo de nanopartculas, as como de los
puntos cunticos, parece tener limitaciones en los inmunoensayos en placa utilizando un
lector convencional, no encontrndose -hasta el momento- ninguna referencia en la
bibliografa. Por otro lado, la necesidad de usar como detectores equipos caros y
sofisticados reduce las ventajas de estos marcadores para su aplicacin en
inmunoensayo. Sin embargo, este tipo de nanopartculas podran ser utilizadas para el
marcaje de antgenos en clulas y tejidos, o la obtencin de imgenes in vivo. Adems,
la sencilla qumica que aqu se describe (derivatizacin y conjugacin) para xido de
europio puede ser aplicada a cualquier otro lntanido, obtenindose marcadores con
diferentes longitudes de onda de excitacin y emisin.
152
7. Bibliografa
7. Bibliografa
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