Medidas de crescimento das amostras

Contagem celular ao microscpio

Neste mtodo de medio do crescimento de microalgas necessrio ter em ateno a
recolha da amostra da cultura, a sua homogeneizao, a cmara de contagem, e o
microscpio utilizado. A contagem celular foi concretizada num microscpio (Olympus BX
50) e utilizou-se um hemacitmetro, tipo de cmara de Neubauer de 0,1 mm de
profundidade. A escolha da cmara de contagem teve em ateno a densidade das culturas,
o tamanho e a forma das clulas ou colnias a serem contadas, a presena e quantidade de
filamentos extracelulares, bainhas, ou mucilagem dissolvida. Este hemacitmero possui
duas cmaras nas quais existe uma grelha de contagem com 9 quadrados de 1 mm,
subdivididos em quadrados de 250 m, de 200 m e 50 m e em rectngulos de 250 x 220
m. O volume total em ambas as cmaras (18 quadrados de 1mm) de 0,0018 ml. Devido a
estas caractersticas, neste hemacitmetro lida-se facilmente com clulas cujo tamanho varia
entre 2 e 30 m e quando a densidade de cultura de 10 4-107 clulas ml-1.
Quando necessrio, as amostras a contar foram fixadas com lugol, de modo a preserv-las
at sua contagem ao microscpio. Antes da contagem, examinaram-se os contedos da
cmara sob baixa ampliao no microscpio com o intuito de verificar se os padres de
distribuio das clulas seriam os satisfatrios. Embora no seja possvel avaliar 20
quando se encontra presente uma distribuio aleatria das clulas,
concebvel determinar quando esta no existe. Uma vez avaliada a
distribuio das clulas no hemacitmetro, a contagem foi efectuada a
uma ampliao de 200x e/ou 400x. O nmero total de clulas
contabilizadas nunca foi inferior a 400 clulas. Os resultados obtidos
foram sempre expressos em nmero de clulas por mililitro. As
contagens ao microscpio foram realizadas diariamente e a taxa de
crescimento foi calculada por regresso linear durante a fase
exponencial de crescimento, de acordo com Guillard (1973):

Concentrao celular
A concentrao celular das culturas foi registada no primeiro e no ltimo
dia dos ensaios utilizando uma cmara de Neubauer. Foi necessrio
realizar uma diluio de acordo com a concentrao da cultura, de
maneira que, por cada campo, contando com 1 mm2, se encontrassem
entre 30 a 300 clulas. A concentrao celular foi obtida atravs da
seguinte frmula:
Concentrao celular (cel/ml) = n clulas contadas x 104 x diluio
Leitura da absorvncia
Baseia-se no uso de densidade optica para avaliar ocrescimento de
microalgas atravs da obstruo fisica da luz pelas clulas. Quanto mais
clulas estiverem presentes na amostra, maior ser a absoro de luz e
menor sera a passagem de luz pela amostra. A densidade ptica das
culturas determinada utilizando-se um espectrofotmetro. Utilizaramse cuvettes de vidro para a leitura da absorvncia efectuada a 540 nm,
comprimento de onda que permite uma boa correspondncia entre o
aumento da densidade ptica e o aumento da densidade populacional da
suspenso celular.
Verificou-se que o acerto do zero no
espectrofotmetro poderia ser feito tanto com o prprio meio de cultura
ou com gua destilada, sendo utilizada esta ltima. Antes de cada
leitura, procedeu-se lavagem da cuvette com gotas da prpria amostra
e homegeneizou-se a amostra algal a ser lida.
Apesar de seu carater simples e pratico, medidas de densidade ptica
permitem obter informaes limitadas das clulas em cultivo. Por
exemplo, clulas mortas e/ou fragmentadas exercem obstruo de luz da
mesma maneira que clulas vivas, sendo impossivel eliminar sua
influencia.
A densidade optica das clulas de microalgas foram determinadas pela leitura da
absorbncia em 684 nm (OD684) usando ultravioleta/ visvel espectofotmetro. O peso seco da
biomassa de microalga foi determinado gravimetricamente. Um volume conhecido de cultura de
microalga foi coletada e seca a 90C por 3h. A velocidade de crescimento () foi calculada de
acordo com a equao = (ln A1 - ln A0) / (T1 T0), onde A1 e A0 so o peso seco da
microalga nos tempos T1 e T0, respectivamente. (21)

Densidade ptica
Para a determinao da densidade ptica das culturas, retirou-se 1 ml de
cultura de cada tubo de ensaio. Em seguida, realizou-se uma diluio de
acordo com a concentrao da cultura. A leitura de absorvncia no
espectrofotmetro deve-se encontrar entre 0 e 1. As leituras foram
obtidas a 540 nm utilizando um espectrofotmetro BOECO S-22 UV/VIS.

Peso seco da amostra

Para determinar o peso das amostras efectuou-se filtrao sob vcuo
atravs de filtros de fibra de vidro tipo Whatman GF/C (47 mm de
dimetro) com poro irregular de 1,2 m. A filtrao foi antecedida pela
secagem dos filtros na estufa por cerca de 24h a 60C e a pesagem dos
mesmos. A necessidade dos filtros serem submetidos a secagem antes
do processo de separao das clulas do meio advm da possibilidade
destes poderem conter humidade. Aps o periodo de secagem,
registaram-se novamente os valores do peso dos filtros possibilitando
determinar o peso seco da amostra algal num determinado volume
filtrado. As culturas foram filtradas a cada dois dias.
The biomass was quantified using dry weight (ash free) taking aliquots of 10 ml volume
which were vacuum-filtered onto nitrocellulose membranes of 0.22 m pore diameter (Millipore
). Previously, the membranes were brought to a constant weight, keeping them at 90 - 100 C
for a period of 24 hours. Once filtered, the samples were dried for 24 hours at 90 - 100 C to
obtain a constant weight and determine their concentration thru gravimetry. As to the nitrate
quantification, this was performed by the brucinesulfamic acid method (APHA, AWWA, WPCF
1992, modified by Urbina (2010)). The inorganic phosphorus quantification was performed thru
the modified method of Taussky and Shorr (1953). For the extraction and quantification of
lipids, a pre-treatment was applied for cell disruption which consisted in subjecting the
microalgae to an agitation with pearls (Urbina, 2010). The extraction was performed using the
method of Bligh and Dyer (1959).

Peso seco
O peso seco (P.S.) foi determinado no primeiro e no ltimo dia de cada
ensaio segundo o protocolo utilizado nas instalaes da Necton S.A. Os
filtros utilizados foram previamente lavados num sistema de filtrao por
vcuo com 10 ml de formiato de amnio a 31,5 g/l, de maneira a retirar
as impurezas existentes. Foram colocados numa caixa de papel de
alumnio prpria e colocados na estufa a 50 :C durante 24 horas.
Passadas 24 horas, os filtros foram colocados no excicador durante 10
minutos e foram pesados em conjunto (filtro mais a caixa de papel de
alumnio).
De cada rplica foram retirados 10 ml de amostra e filtrados, utilizando
os filtros previamente tratados. Aps a filtrao, os filtros foram
novamente lavados com 10 ml da soluo de formiato de amnio,
colocados na estufa com as respectivas caixas de alumnio durante 72
horas e foram novamente pesados. O peso seco em g/l obtido atravs
da diferena entre os pesos registados a dividir pelo volume da amostra.