Instituto de Investigaciones Biotecnolgicas

Universidad Nacional de General San Martn

MICROBIOLOGIA GENERAL
Guia de Trabajos Prcticos
Segundo cuatrimestre de 2010

Profesores a cargo: Dra. Nora In de Iannino

Jefe de Trabajos Prcticos: Dr. Rodrigo Sieira
Ayudantes: Dra. Mara Roset
Dr. Andrs Ciocchini
Dra. Ins Marchesini
Lic. Juan Manuel Spera
Lic. Florencia Iannino
Lic. Lucas Bukata
Lic. Mariela Del Giudice
Lic. Claudia Herrmann
Lic. Soledad Guidoln
Colaboradores: Bqca. Berta Cazzulo
Liliana Sferco
Agustina Chidichino

OBJETIVOS GENERALES
1) Manipulacin general en el laboratorio de microbiologa.
2) Introduccin al mundo microbiolgico: nomenclatura, diferenciacin, observacin.
3) Conocimiento fundamentado de los requerimientos de los microorganismos y de las consecuencias de
su desarrollo en el medio.
4) Introduccin a la metodologa cientfica: planteamiento de objetivos, desarrollo experimental,
elaboracin de conclusiones, bsqueda bibliogrfica, escritura de informes.

CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA

1) Aprobacin de los dos parciales terico/prcticos con nota mayor o igual a cinco. Se podr recuperar
slo uno.
2) Aprobacin de los trabajos prcticos, lo cual estar dado por:
a. 80% de asistencia
b. 80% de parcialitos aprobados. Los parcialitos se tomarn al comienzo de cada trabajo prctico y se
evaluarn con las siguientes notas: D (desaprobado), R (regular), B (bien) y MB (muy bien). Aclaracin:
la acumulacin de dos notas R equivalen a un parcialito desabprobado.
Importante: Se permitir desabprobar slo 2 parcialitos, siendo obligatoria la recuperacin de uno de los
dos.
c. Aprobacin de los informes que debern realizar y entregar al finalizar cada trabajo prctico.
d. Aprobacin monografas.

APROBACION DE LA MATERIA DEL ALUMNO REGULAR

1) En forma promocional con nota mayor o igual a siete en los dos parciales terico/practicos y nota
mayor o igual a siete en los trabajos prcticos (esta nota estar dada por la evaluacin de los parcialitos,
informes, monografas y nota de concepto general).
2) Examen final con nota mayor o igual a cinco.

NORMAS DE SEGURIDAD

Uno de los aspectos bsicos del trabajo en el laboratorio de microbiologa es saber mantener normas de
seguridad mnimas para evitar infecciones con los microorganismos con los que se trabaja.
En el curso propiamente dicho algunos microorganismos utilizados pueden ser potencialmente patgenos,
as mismo se realizarn aislamientos de fuentes naturales pudiendo aparecer algn posible patgeno por
lo que se pide seguir las siguientes reglas:

1) No se puede comer, beber, fumar ni maquillarse en el laboratorio, ni llevarse a la boca ningn

elemento que haya sido utilizado en el laboratorio (biromes, marcadores, dedos, etc.)
2) Es obligatorio asistir al laboratorio con guardapolvo, preferentemente de mangas largas y con puo.
Las personas de pelo largo deben concurrir con el mismo atado y/o recogido.
3) Si un cultivo es volcado, informar inmediatamente al docente con el que se proceder a limpiar la zona
con una solucin bactericida.
3) El material contaminado (tips, pipetas, tubos), se descartar en envases provistos a tal efecto.
4) No volcar los cultivos en las piletas.
5) Una vez finalizada la clase lavarse las manos escrupulosamente con agua y jabn y con algn
desinfectante (lo mismo durante la clase si accidentalmente se toc algn cultivo).

Bibliografa
Microbiology. Prescott-Harley-Klein. Ed. Mc Graw-Hill.
Microbiologa. Brock-Madigan. Ed. Prentice-Hall
Libro de microbiologa disponible en internet: http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Trabajos prcticos y seminarios
Horario: mircoles y viernes de 14 a 17 hs.
Comienzo de trabajos prcticos: 13/8/10
Fecha de entrega de monografas: 17/11/10

T.P. N
1

tema
Normas de seguridad.
Metodologa general de
trabajo. Tcnicas de cultivo.
Esterilidad

fecha
vie 13/8

mie 18/8

Comisin A

-Introduccin
-Terica TP 1
-Placas
-Diluciones seriadas
-Plaqueo de sol. y
org.

Vie 20/8
-----------------

mie 25/8

-----------------Placas
-Diluciones seriadas
-Plaqueo de sol. y
org.

Problemas TP 1
Armado de columna de
Winogradsky (TP 8)

Comisin B

Caractersticas macro y
microscpicas de cultivos
bacterianos. Tinciones.
Microscopa

Asignacin de temas
de monografas
vie 27/8
Terica TP 2

mie 1/9

-Preparacin de
frotis
-Tinciones.
-Observacin con
microscopio.

-----------------

-----------------

-Preparacin de
frotis
-Tinciones.
-Observacin con
microscopio.

vie 3/9

mie 8/9

Crecimiento bacteriano.
Curva de crecimiento.
Recuento de viables

Problemas TP 2
Terica TP 3

vie 10/9

-Curva de
crecimiento con
glucosa

-----------------

.
mie 15/9

-Curva de
crecimiento con
glucosa y lactosa

-----------------

Anlisis de resultados y problemas del TP 3

vie 17/9
4

Aislamiento de bacterias.
Medios de enriquecimiento,
selectivos y difierenciales.
Diversidad metablica

Terica del TP 4

14:00 hs

-Largar cultivos en
medios de
enriquecimiento.

15:30 hs

-----------------

mie
22/9

vie
24/9

14:00 hs
15:30 hs

mie 29/9

Metabolismo bacteriano.
Pruebas bioqumicas y
determinacin de gneros.
Resistencia a antibiticos.

-Pasar a medio
selectivo.

-----------------

-----------------

-Pasar a medio
selectivo.

Anlisis de resultados y problemas del TP 4

Consultas pre-parcial

vie 8/10

PARCIAL TEORICO/PRACTICO

mie 13/10

Terica TP 5.

vie 15/10

vie 22/10

Protozoos. Metodologa
generalo de trabajo. Cultivo.
Microscopa.

-Largar cultivos en
medios de
enriquecimiento.

mie 6/10

mie 20/10

-----------------

-IMViC y Kligler
-Catalasa/Oxidasa
-Antibiticos
-Motilidad
-----------------

-----------------IMViC y Kligler
-Catalasa/Oxidasa
-Antibiticos
-Motilidad

Anlisis de resultados y problemas del TP 5

mie 27/10

Feriado

vie 29/10

TP 6

Gentica bacteriana.
Transformacin. Mutacin.
Transposicin y
complementacin funcional.

mie 3/11

vie 5/11

mie 10/11

vie 12/11

-Conj. Agro pgm

-Conj. Agro wt

-----------------

-----------------

-Estra pgm
-Dilucin y plaqueo wt.
-----------------

-Conj. Agro pgm

-Conj. Agro wt
-----------------

-Estra pgm
-Dilucin y plaqueo wt.

Discusin de resultados y problemas del TP 7

Diversidad microbiana
Interacciones entre
microorganismos que
coexisten en un mismo hbitat

mie 17/11
Columna de Winogradsky (TP 8)
Observacin de resultados.
vie 19/11

COMISIN A

mie 24/11

COMISIN B

vie 26/11

SEGUNDO PARCIAL
TEORICO/PRACTICO

PRESENTACIN DE
MONOGRAFAS

TP N 1 METODOLOGA GENERAL DE TRABAJO

Objetivo 1: Aprendizaje de la tcnicas bsicas que se utilizan para el cultivo de microorganismos.
a) Preparacin de medios de cultivo. Uso de balanzas, medicinde pH.
b) Tcnicas de esterilizacin.
c) Trabajo en condiciones de asepsia. Preparacin de placas dePetri, tubos con medio de cultivo
slido y lquido.
d) Tcnicas de siembra en cultivo lquido y en cultivo slido:estriamiento, puncin, rastrillado,
volcado.
Objetivo 2: Deteccin de contaminantes, presencia de microorganismos en el medio ambiente.
a) Observacin de la presencia de microorganismos en nuestroambiente.
b) Control de trabajo en condiciones de asepsia
c) Control de asepsia.
Desarrollo:
1) Para realizar trabajos en condiciones de asepsia se deber limpiar el area de trabajo (mesada) con la
sustancia desinfectante provista por el docente, acto seguido se deber encender el mechero bunsen.
2) Se prepararn placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45-50C. Volcar el medio en
condiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique. Luego secar las placas invertidas en
estufa a 42C.

3) Se prepararn tubos de ensayo con agar nutritivo fundido por volcacin (10 ml/tubo). Se taparn con la
torunda de algodn, se dejaran enfriar y se secarn en estufa a 42C.

4) Se harn diluciones seriadas de agua previamente autoclavada: 1/10, 1/100, 1/1000, y se sembrarn
0,1ml de cada dilucin en distintas placas de Petri por la tcnica del rastrillado.

5) Con un hisopo se tomarn muestras de distintos lugares: mesada, mano, etc. y se aplicar sobre una
placa de medio nutritivo slido.

f) Se comparar el crecimiento que resulta de apoyar en un medio de cultivo slido la yema del dedo
antes y despus de un lavado con etanol 70%.
Las placas y tubos sembrados se cultivarn 24-48 h a 37C. Se debern observar las colonias
desarrolladas teniendo en cuenta las siguientes caractersticas macroscpicas:

FORMA TAMAO COLOR BORDE ELEVACION SUPERFICIE

CUESTIONARIO T.P. 1
1) Defina los siguientes trminos: Desinfeccin, Desinfectante, Antisepsia, Germicida, Bactericida,
Bacteriosttico, Bacterioltico.
2) Discuta la siguiente afirmacin:
La muerte de una poblacin bacteriana, del mismo modo que el crecimiento de la misma, es por lo
general exponencial o logartmica, es decir, la poblacin se reduce en una fraccin constante a un
intervalo de tiempo constante. Este proceso se representa en el siguiente grfico:

Min. de tratamiento

Por lo tanto, dado que la destruccin de la poblacin es logartmica, es tericamente imposible eliminar a
todos los microoganismos de una poblacin por ms que se incremente la extensin de tiempo usada en el
tratamiento.
3) Describa cmo funciona un autoclave. Qu condiciones se deben cumplir para esterilizar por calor
hmedo? Cuales son las tres cosas que uno debe hacer al operar un autoclave para que el proceso sea
seguro?
4) Qu mtodos usara para esterilizar: pipetas de vidrio y placas de petri, agar nutritivo, soluciones de
antibiticos, paquetes de placas de petri plsticas, solucin de glucosa 2M, solucin de glucosa 0,2M,
interior de una cabina de flujo laminar, aceite mineral, material quirrgico.
5) Qu caractersticas de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la eleccin de un mtodo
de esterilizacin ?.
6) Por qu se requiere mayor tiempo de esterilizacin en horno que en autoclave ?. Cul es el agente
esterilizante en cada caso ?.
7) Cmo decontaminara un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus subtilis y uno
utilizado para crecer Escherichia coli ?.
7) Un tubo conteniendo medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37
C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detect crecimiento de microorganismos.
a) Qu parmetros debera controlar para que el proceso de esterilizacin se lleve a cabo de manera
adecuada?.
b) Una vez solucionado el inconveniente, Cmo determinara si dicho caldo nutritivo est efectivamente
estril?.
8) Cmo realizara un control de esterilizacin y un control de esterilidad ?.

TP N 2
CARACTERSTICAS MACRO Y MICROSCPICAS DEL
DESARROLLO BACTERIANO.

Objetivo: entrenamiento en la preparacin de extendidos y en distintas tcnicas de coloracin.

Observacin de distintas morfologias y agrupamientos bacterianos.

1. Coloracin de Gram.
Gram hall una tcnica basada principalmente en la coloracin de las clulas con cristal violeta. Mediante
esta tcnica, aquellas clulas capaces de mantener el colorante violeta luego de un proceso de
decoloracin son consideradas Gram+ y las que no lo retienen y por lo tanto pueden ser coloreadas por
un segundo colorante de contraste, son Gram-. Dado que se trata de clulas su visualizacin es por
microscopa.
Desarrollo:
A) FIJACION
Se tomar una ansada de cada colonia a analizar crecida en agar nutritivo y se la resuspender en una gota
de agua colocada sobre un portaobjeto limpio, desengrasado y previamente rotulado. Se dejarn secar al
aire estos materiales junto a la llama del mechero y posteriormente se los fijar por calor, pasando el
preparado por encima de la llama SIN QUEMARLOS.
B) TINCION:
1-Cubrir el portaobjeto con la solucin de Cristal Violeta y dejar en contacto 1 minuto.
2-Volcar el colorante y lavar con agua corriente.
3-Cubrir con la solucin de Lugol (1 minuto).
4-Lavar con agua corriente.
5-Decolorar por arrastre con la solucin decolorante(alcohol/acetona). (5 segundos).
6- Lavar con agua para parar la accin del decolorante.
7-Contrastar con la solucin de Safranina por 1 minuto.
8-Lavar suavemente con agua corriente y dejar escurrir el porta en posicin vertical.
9-Una vez seco el material teido, se lo examinar usando aceite de inmersin bajo el microscopio ptico
con el aumento de 100x.
Se debern reconocer las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las distintas bacterias provistas. Se
deber informar el agrupamiento, forma, coloracin segn la siguiente guia:
FORMA: cocos (esfricas), bacilos (bastones, cilindros), cocobacilos (bastones cortos, ovoidales), vibrios
(bacilo en forma de coma), espirilos (bacilos en forma de tirabuzn).
AGRUPAMIENTO: aislado (individual), diplos, tetradas, cadenas, racimos, empalizadas

2. Coloracin de esporas. Tcnica Schaeffer-Fulton.

Esta tcnica permite distinguir las esporas del cuerpo vegetativo del microorganismo y determinar su
localizacin y forma.
Desarrollo:
1) Preparar el extendido del microorganismo y fijar por calor.
2) Cubrir todo el porta con solucin de verde de Malaquita al 5% en agua.
3) Calentar a la llama hasta que emita vapores y seguir el calentamiento durante 3 minutos SIN
PERMITIR QUE SE SEQUE EL COLORANTE. Si esto ocurriera agregar mas sobre el preexistente y no
sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.
4) Lavar con agua y cubrir con solucin de SAFRANINA, dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua ,
secar y observar al objetivo de inmersin
6) INFORMAR: morfologia, color y tipo de espora.

CUESTIONARIO T.P. 2
1) Describa en detalle la composicin y estructura del peptidoglicano, pared Gram (+) y pared Gram (-).
2) En la coloracin de Gram, cul es el colorante de Gram y cul el de contraste? Qu es el mordiente?
3) Usted debe realizar coloracin de gram para una serie de especmenes. Comienza a realizar la
coloracin y en el ltimo paso se da cuenta de que le falta la solucin de safranina. Decide de todos
modos no perder mas tiempo y observa los preparados al microscopio. Puede dar con certeza un informe
distinguiendo cules especmenes son Gram (-) y cules Gram (+)?
4) Qu clase de imgenes proveen y con qu propsitos suelen ser usados los microscpios de campo
claro, de campo oscuro, de contraste de fase, de epifluorescencia, electrnicos de transmisin y
electrnicos de barrido?
5) Por qu en la tincin de endosporas por el mtodo de Schaeffer-Fulton el colorante verde de malaquita
no se pierde en el paso de lavado?
6) Podra utilizar un colorante bsico como primer colorante en la tincin de esporas ?.
7) Por qu no se tien las clulas alcohol -cido resistentes por la coloracin de Gram?.
8) Qu caractersticas debe tener un colorante para ser empleado en una tincin negativa?.
9) Las tinciones de Gram, esporas y Ziehl Neelsen permiten determinar diferencias estructurales en
clulas de distintos gneros. Cules son esas diferencias y cul es el paso de cada coloracin que las
pone en evidencia ?. Qu tipos de colorantes se utilizan en cada caso ?.
10) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio ptico luego de una tincin de Gram y color
rosado al efectuarse una coloracin de esporas. Por qu motivo el cristal violeta en el primer caso y la
safranina en el segundo tien la bacteria de esa manera ?.
10) Indique cual o cuales de las tinciones realizadas en los trabajos prcticos ponen en evidencia
diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente.

11) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta.
a) En una tincin negativa los colorantes utilizados tienen afinidad slo por la pared bacteriana.
b) En la tincin de esporas el verde de malaquita no tie el citoplasma celular porque es removido por los
solventes orgnicos que se utilizan en el paso de decoloracin.
c) Las clulas Gram negativas no se tien con cristal violeta porque el mordiente no puede atravesar la
pared de peptidoglicano.
d) El calentamiento en la coloracin de cido resistencia permite que la fucsina fenolada se combine con
el cido miclico presente en la pared bacteriana.

TP N 3
CURVA DE CRECIMIENTO Y RECUENTO DE VIABLES

Crecimiento Bacteriano
Como todos los seres vivos las bacterias crecen, se multiplican y mueren, pero adems tienen la ventaja
de conservar su viabilidad por largos perodos de tiempo, y luego reiniciar su ciclo celular cuando las
condiciones del medio se revierten favorablemente.
Independientemente del lugar donde se encuentre, una sola clula bacteriana dar lugar a una poblacin a
travs de un crecimiento rpido; sin embargo, este proceso est autolimitado dado que una de las
consecuencias es la alteracin misma del entorno. Del anlisis de los resultados experimentales obtenidos
a partir de cultivos lquidos bacterianos, se pudo obtener la grfica del ciclo de vida. Este consta
bsicamente de cuatro etapas o fases a saber: latencia o fase lag, crecimiento logartmico (tambin
llamado exponencial), fase estacionaria y de muerte.
Se pretende que los alumnos puedan identificar y analizar el crecimiento bacteriano utilizando varias
tcnicas de uso frecuente en el laboratorio microbiolgico.

Objetivos:
1) Analizar el crecimiento bacteriano teniendo en cuenta la densidad ptica y el recuento de colonias del
cultivo a distintos tiempos de incubacin.
2) Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva de crecimiento para cada cultivo.

Desarrollo:
Se trabajar a partir de cultivos de Escherichia coli desarrollados a 37C en medio TB con agitacin .
1) Separar en forma asptica cada 30 minutos una alicuota de 2 ml del cultivo en estudio. (Luego de
tomar la muestra retornar inmediatamente el erlenmeyer a las condiciones de incubacin).
2) Leer la turbidez que presentan las muestras (o sus diluciones) a una longitud de onda de 600 nm
utilizando un espectrofotmetro. Calcular la DO/ml de cultivo.
3) Hacer diluciones seriadas y sembrar de cada una 0,1 ml en una placa de Petri con medio LB. Incubar a
37C una noche y luego hacer un recuento de colonias y calcular el nmero de unidades formadoras de
colonia (UFC)/ml de cultivo. Elegir la placa en donde el nmero de colonias este entre 50 y 200.
La curva de crecimiento bacteriano para cada cultivo se har sobre papel semilogartmico. Se graficarn
las UFC/ml en funcin del tiempo y los datos de absorbancias para cada tiempo.

CUESTIONARIO T.P. 3
1) Calcule la tasa de crecimiento medio (k) y el tiempo de generacin medio (g) de un cultivo que se
incrementa desde 5 x 102 hasta 1 x 109 clulas en 10 hs.
2) Si el tiempo de generacin media para un cultivo es de 180 min. y se inicia el cultivo con 3 x 103
clulas, cuantas bacterias habr despues de 24 hs de cultivo en fase exponencial? Cuntas generaciones
habrn transcurrido?
3) Discuta la siguiente afirmacin: en una colonia todas las clulas crecen a la misma velocidad.
4) Usted necesita obtener un cultivo con 5 x 109 clulas totales. Como conoce la tasa de crecimiento
medio y el tiempo de generacin, realiza sus clculos y se da cuenta de que requiere 12 horas de cultivo
para llegar a dicha masa partiendo de un stock con 103 clulas/ml. Descongela el stock con la semilla
estandarizada e inocula el cultivo, se va a su casa a descansar y a las 12 horas regresa al laboratorio.
Retira el cultivo de la incubadora y estima el nmero de clulas en 2 x 107. Qu es lo que ha ocurrido?
5) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 108 UFC/ml. Qu diluciones debera realizar
para contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilucin ?
6) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : Cmo procedera para obtener 80
colonias en una placa de agar nutritivo ? Indique los volmenes a utilizar.
7) Qu dilucin debera realizar para obtener 2 ml de una suspensin de bacterias que contenga 2 x 105
UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml ?.
8) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la dilucin
10-4. Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una curva de crecimiento:
Cul es la concentracin bacteriana inicial ? Qu diluciones realizara del mismo para contar 100
colonias si sembrara 0,1 ml ?
9) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lcticas viables /ml. Qu
mtodo de recuento utilizara para corroborar ese nmero? Describa el protocolo, condiciones y
materiales que utilizara para realizar dicha determinacin.
10) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes mtodos de recuento de bacterias: i) turbidez, ii)
recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio.
11). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibracin de recuento en
placa vs. turbidez (D.O. leda a 600 nm). A partir de la misma se establece una relacin UFC./ml por
unidad de D.O. de 4 x 107 .
a) Qu ventajas tiene realizar una curva de calibracin de recuento vs. turbidez?
b) Qu diluciones debera realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo sembrada con
0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5.
12) Un investigador dispone de una curva de calibracin de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo nutritivo
Podra utilizar la misma curva para uncultivo de: Bacillus megaterium y otro de Micrococcus luteus?
Justifique su respuesta.
13) A qu se llama crecimiento diauxico? Dibuje una curva de crecimiento diauxica indicando las
distintas fases de crecimiento.
14) a)Explique la causa del crecimiento diauxico de E. coli en un medio de crecimiento que contiene
como fuente de carbono glucosa y lactosa en una relacin 1:3 respectivamente.

b) Correlacione temporalmente el crecimiento de la poblacin bacteriana anterior con los eventos que
ocurren a nivel molecular en la regulacin del opern lac.
15) Cmo interpreta las siguientes curvas de crecimiento de E. coli en un medio de cultivo que contiene
como fuente de carbono glucosa y sorbitol ?

TP N 4
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
DIVERSIDAD METABLICA
Medios de enriquecimiento, selectivos y diferenciales:
Para aislar un microorganismo de la naturaleza se debe conocer previamente los requerimientos
nutricionales del mismo y las condiciones ambientales propicias para su desarrollo.
Los alumnos deberan buscar en la bibliografia las caractersticas metablicas y el hbitat de los
microorganismos que se van a aislar.
En base a los estudios realizados sobre el metabolismo y los requerimientos nutricionales de las bacterias,
se han desarrollado medios de cultivo para facilitar el trabajo en el laboratorio cuando se parte de
materiales que supuestamente tendran ms de una especie bacteriana. As tenemos medios que permiten:
a) favorecer el crecimiento de un microorganismo sobre otros, es decir "enriquecerlo" con respecto a una
especie; b) "seleccionar" el crecimiento de determinadas bacterias, inhibiendo el de otras; y c) poder
"diferenciar" colorimtricamente las distintas especies bacterianas .

Metodologia general de trabajo:

1) Inocular la muestra (agua, tierra, alimentos) en un caldo de enriquecimiento que puede ser selectivo o
no, para favorecer el crecimiento del organismo de interes
2) Incubar a temperatura y tiempo adecuados
3) Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar en medio solido selectivo con el objeto de inhibir la
flora acompaante del microorganismo que se desea aislar. Este medio puede a su vez ser diferencial
(diferencia a una determinada cepa o especie en base a alguna caracteristica de la colonia).
4) Incubar a temperatura y tiempo adecuados.
5) Observar el crecimiento de las colonias y hacer repique a agar nutritivo para realizar coloracion de
Gram. Posteriormente se identificaran los microorganismos en base a pruebas bioquimicas.

Microorganismos a usar: Echerichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus,Streptococcus spp. Lactobacillus spp., Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter spp.

Aislamiento de E. coli
1-Tomar 10 ml de muestra de agua y sembrar caldo Mc Conkey 2X
2-Incubar 48 hs a 37C.
3-Observar crecimiento (formacion de gas en campana de Durham y viraje del indicador a amarillo
indica probable presencia de E. coli).
4-Tomar muestra con el ansa y estriar en agar Mac Conkey y agar EMB 5-Observar colonias con
brillo verde metalico en EMB y rojas en Mac Conkey .

Aislamiento de Staphylococcus aureus

1-Agregrar 10 g de ricota a un erlenmeyer con agua peptonada estril. (1/1000 peptona de caseina en
agua destilada)
2-Agitar e incubar 2 h a temperatura ambiente.
3-Mezclar caldo cerebro-corazon con 13% de NaCl con el agua peptonada con ricota en partes
iguales.
4-Incubar 48h a 37C.
5-Si hay crecimiento, tomar una muestra con ansa y estriar en
agar manitol salado y agar azida.
6-Incubar 48 h a 37C.
5-Observar crecimiento.

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa

1-Sembrar 0,5 ml-1ml de agua en caldo M9 (2X)
2-Incubar 48 h a 42 grados.
3-Si hay crecimiento (turbidez) tomar muestra con el ansa y estriar sobre agar cetrimida.
4-Incubar 48 h a 37 grados.
5-Observar crecimiento de colonias con pigmento verde.

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis

1-Agregar 10 g de arroz a 50ml de PBS esteril
2- Agitar durante 10 min.
3- Calentar a 80 C durante 5 min.
4- Tomar 1ml de sobrenadante y pasarlo a caldo nutritivo.
5-Incubar 48 h a 37C.
6-Estriar en agar Mossel con emulsin de yema de huevo (selectivo y diferencial).
7-Incubar 48 h a 37 C.
8-Observar el crecimiento de colonias con halo rosa-prpura con precipitado blanco espeso (cereusmanitol -,lecitinasa +) y colonias con halo amarillo (subtilis, manitol +,lecitinasa -).

Aislamiento de Lactobacillus spp.

1-Realizar diluciones seriadas de yogurt en Sn fisiologica estril y sembrar 0,1ml de cada una en agar
MRS.
2-Incubar 48h a 37C en microaerobiosis
3-Calcular el recuento de bacterias viables lcticas y observar los distintos fenotipos de colonias
crecidos en agar MRS 2.
4-Seleccionar 2 fenotipos distintos y estriarlos en agar Rogosa.
5-Incubar en condiciones de microaerobiosis a 37C.

Aislamiento de Azotobacter y otras fijadoras de nitrogeno atmosferico.

1-Agregar 10 g de tierra a 10 ml de agua esteril
2-Agitar y dejar decantar
3-Inocular 2 ml a caldo Fred y Waksman
4-Incubar 48 h a 28C con agitacion
5-Si hay crecimiento tomar una muestra con ansa y estriar agar Fred y Waksman

Medios a utilizar:
CALDO NUTRITIVO
Extracto de Carne
3,0 g
Peptona de Carne
5,0 g
Agua destilada c.s.p.
1l
pH= 7,00,2
Para el AGAR NUTRITIVO
agregar 15 g de Agar

CALDO MAC CONKEY

Peptona de Casena
20,0 g
Lactosa
10,0 g
Bilis de Buey desecada 5,0 g
Prpura de Bromocresol 0,01 g
Agua destilada c.s.p.
1l
pH= 7,40,2

AGAR-AZIDA:
Brain Heart Infusion
Azida sodica
Agar
Agua c.s.p.

AGAR MAC CONKEY

Peptona de Casena
Peptona de Carne
Cloruro de Sodio
Lactosa
Sales biliares
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua c.s.p.
pH= 7,10,1

37 g
0,3 g
15 g
1l

17,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
1,5 g
0,03 g
0,001 g
13,5 g
1l

CALDO CEREBRO-CORAZON
Infusin de cerebro
12,5 g
Infusin de corazn
5,0 g
Proteosa Peptona
10,0 g
D(+) Glucosa
2,0 g
NaCl
5,0 g
Di- Sodio hidrogenofosfato
2,5 g
Agua c.s.p. 1 l

CALDO TIOGLICOLATO
Peptona de Casena
Extracto de Levadura
L(+) Cisteina
D(+) Glucosa
NaCl
Tioglicolato de Sodio
Resarzurina sdica
Agua c.s.p.

CALDO M9 2X
NH4Cl
1,0 g
Na2HPO4
6,0 g
K2HPO4
3,0 g
NaCl
0,5 g
Glicerol o Asparragina 5,0 g
Agua c.s.p.
1l
Sulfato de Magnesio 1M 1ml
Cloruro de Calcio 0,01 M 10ml
(AUTOCLAVAR APARTE)

CALDO MRS (de Mann, Rogosa y Sharpe)

Peptona Universal
10,0 g
Extracto de Carne
5,0 g
Extracto de Levadura
5,0 g
D(+) Glucosa
20,0 g
Di-potasio hidrogenofosfato
2,0 g
Tween 80
1,0 g
Di amonio hidrogenocitrato
2,0 g
Acetato de sodio
5,0 g
Sulfato de Magnesio
0,1 g
Sulfato de Manganeso
0,05 g
Agua c.s.p.
1l

AGAR CETRIMIDA:
Peptona de Gelatina
MgCl2
Cetrimida
glicerina
SO4K2
Agar
Agua c.s.p.

CALDO LB (Luria, Bertani)

Triptona
Extracto de Levadura
NaCl
Agua c.s.p.
Para el AGAR LB agregar 12 g de AGAR.

20 g
1,4 g
0,3 g
10 ml
10 g
13,6 g
1l

15,0 g
5,0 g
0,5 g
5,5 g
2,5 g
0,5 g
0,001 g
1l

10,0 g
5,0 g
10,0 g
1l

CALDO TERRIFIC
Triptona
12,0 g
Extracto de Levadura
24,0 g
Glicerol
4 ml
Agua c.s.p.
0,9 l
Luego de autoclavar, dejar enfriar a 60C, agregar
100 ml de una Sn autoclavada de 2,31 g de
KH2PO4
y 12,54 g de K2HPO4.

AGAR MOSSEL
Peptona de Carne
10,0 g
Extracto de Carne
1,0 g
D(-)Manitol
10,0 g
NaCl
10,0 g
Rojo Fenol
0,025 g
Agar
12,0 g
Agua c.s.p.
0.9 l
Luego de autoclavar agregar 100 ml de
EMULSION DE YEMA DE HUEVO ESTERIL
AL 50% y 0,1/0,001 Polimixina B

AGAR EMB (EOSINA-METILEN BLUE)

Peptona de Carne
10,0 g
Di potasio hidrogeno fosfato
2,0 g
Lactosa
10,0 g
Eosina Yellow
0,4 g
Azul de Metileno
0,065 g
Agar
15 g
Agua c.s.p.
1l
pH=7,00,2

AGAR MANITOL SALADO- ROJO FENOL

Peptona de Carne
10, 0 g
Extracto de Carne
1,0 g
NaCl
75,0 g
D(-)Manitol
10,0 g
Rojo Fenol
0,025 g
Agar
12,0 g
Agua c.s.p
1l
pH=7,40,1

AGAR ALMIDON
Extracto de Carne
Peptona
Almidon soluble
Agar
Agua c.s.p
pH=7,20,1

AGAR HIERRO-2 AZUCARES DE KLIGLER

Extracto de Carne
3.0g
Extracto de Levadura
3,.0 g
Peptona
15.0 g
Proteosa Peptona
5,0 g
Lactosa
10.0 g
Glucosa
1,0 g
Sulfato Ferroso
0,2 g
NaCl
5.0 g
Tiosulfato de Sodio
0,3 g
Rojo Fenol
0,024
g
Agar
12,0 g
Agua c.s.p.
1l
pH=7,4

3,0 g
5,0 g
2,0 g
25,0 g
1l

AGAR ROGOSA
Peptona de Casena
Extracto de Levadura
D(+)Glucosa
Potasio di Hidrogeno fosfato
Citrato de Amonio
Tween 80
Acetato de Sodio
Sulfato de Magnesio
Sulfato de Manganeso
Sulfato de Hierro III
Agar
Agua c.s.p.
pH=5.50,1

10,0 g
5,0 g
20,0 g
6.0 g
2,0 g
1,0 g
15,0 g
0,575 g
0,12 g
0,034 g
15,0 g
1l

CALDO Fred y Waksman

Manitol
SO4Mn
PO4HK2
FeCl3 6 H2O
SO4Mg. 7H20
CaCO3
NaCl
Agua c.s.p.
Para el Agar agregar 15 g de Agar.

10 g
trazas
0,5 g
trazas
0,2 g
3g
0,2 g
1l

MEDIO MINIMO CON AMILOSA

K2HPO4
NaH2PO4. H2O
NH4Cl
MgSO4. 7 H2O
KCl
CaCl2
Cl3Fe
Amilosa
Agua c.s.p.

3g
1,14g
1g
0,3 g
0,15 g
0,01g
trazas
2g
1l

CUESTIONARIO T.P. 4
1) Defina los siguientes conceptos: medio definido, medio complejo, medio diferencial, medio de
enriquecimiento, medio selectivo, cultivo puro.
2) A cul de estas categorias corresponden los medios descriptos en la gua de T. P.: medio definido,
medio complejo, medio diferencial, medio de enriquecimiento, medio selectivo.
3) Qu funcin cumple la emulsin de yema de huevo en el agar Mossel, las sales biliares en el agar Mac
Conkey, la azida sdica en el agar Azida y el cetiltrimetilammonium bromide en el agar Cetrimida?

4) Describa los pasos y la composicin de los medios que utilizara para aislar un microorganismo capaz
de utilizar benceno como fuente de carbono y energa. Donde recogera las muestras?
5) Dados los siguientes elementos nutricionales: glucosa, peptonas, extracto de carne, bases nitrogenadas,
NH4Cl, Na2HPO4, KCl, MgCl2, NaCl, FeCl3, CuCl2, CoCl2
a) Cuales elegira para formular un medio de enriquecimiento y un medio mnimo?.
b) En el caso del medio de enriquecimiento, indique la funcin de cada elemento elegido. Qu otro tipo
de compuestos agregara para obtener un medio de enriquecimiento selectivo para gram negativos?
6) Disee un protocolo para aislar cuatro microorganismos, presentes en una muestra de agua, que reunen
las siguientes caractersticas:
Microorganismo A: Aerobio estricto, forma esporas, bacilo Gram positivo, glucosa positivo,
licuefaccin de la gelatina positivo.
Microorganismo B: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo.
Microorganismo C: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo, lactosa
positivo.
Microorganismo D: Aerobio estricto, bacilo Gram negativo, glucosa positivo.
7) Contando unicamente con el equipo de laboratorio (microscopio, autoclave, mechero, ansa, material de
vidrio) y las siguientes drogas: agar, manitol, asparragina, peptona, sales biliares, cloruro de sodio, agua
destilada y colorantes para efectuar tinciones diferenciales, esquematice la marcha analtica para obtener
cultivos puros a partir de una mezcla de microorganismos que incluye Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
8) Qu tipos de medios son el agar manitol salado y el agar Mossel?. Para qu sirven cada uno de sus
constituyentes?. Podra reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro?.
9) Disee un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la maltosa
con produccin de cido de los que no lo hacen.
10) Discuta las siguientes afirmaciones:
a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento previo.
b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio lquido pues hay libre competencia por los
nutrientes.

c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio lquido.

d-La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro.
11) La composicin del caldo nutritivo es: extracto de carne, peptona y cloruro de sodio en agua a pH 7.
La composicin del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, prpura de bromocresol y
cloruro de sodio en agua a pH 7. Cul es la funcin de cada uno de los componentes en cada medio?.
12) Cul de los siguientes medios utilizara para enriquecer selectivamente en un microorganismo
respirador anaerbico, metabolismo no fermentativo, Gram negativo ?. Medio A: medio basal mnimo,
glucosa, NH4Cl, tioglicolato de sodio.
Medio B: medio basal mnimo, glucosa, NO3Na, tioglicolato de sodio.
13) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus son:
glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH 5,5). Explique
cul es la funcin de cada uno de ellos y por qu la incubacin se realiz en anaerobiosis.
14) Discuta los siguientes enunciados y justifique:
a) Cualquiera de los siguientes medios podra ser utilizado para diferenciar aquellos microorganismos
capaces de fermentar la lactosa:

Medio 1

Medio 2

Medio 3

Medio 4

Peptona carne

Peptona carne

NH4Cl

NH4Cl

Lactosa

Extracto carne

Lactosa

Lactosa

Rojo fenol

Lactosa

Rojo fenol

Glucosa

Agua

Rojo fenol

Agua

Rojo fenol

Agar

Agua

Agar

Agua
Agar

b) Especies del gnero Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar Mc Conkey.
c) Bacillus cereus y Staphylococcus aureus pueden ser diferenciados en una placa de agar Mossel al cual
no se le adicion yema de huevo ni polimixina B
15) En el estudio de la esporulacin de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se observaron al
microscopio bacilos con esporas terminales caractersticas de Bacillus subtilis. Disee un medio de
cultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

TP N 5
PRUEBAS BIOQUMICAS
La utilizacin de medios selectivos y diferenciales, las tinciones de Gram, caractersticas de las colonias y
motilidad en el estudio de una determinada bacteria nos brinda una gran informacin sobre el gnero
bacteriano con el que se est trabajando.
Una vez aislada una bacteria determinada, se le pueden realizar una serie de pruebas que evalan su
actividad bioqumica. Esto permite hacer una identificacin final de la especie en cuestin, es decir se
estudian ciertos sistemas enzimticos que son nicos de cada especie y que sirven como marcadodres de
identificacin.
En el laboratorio, esos sistemas enzimticos se detectan inoculando la colonia bacteriana bien aislada y
fresca (24-48 hs de crecimiento) en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos especficos e
indicadores qumicos para detectar cambios de pH o presencia de subprocuctos especficos.

Objetivos: a) Identificar distintas especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. b)

Diferenciar distintas especies de Pseudomonas. c) La diferenciacin entre Estafilococos y Estreptococos.

Desarrollo:
Se sometern cultivos (de 24-48 hs), de las distintas colonias aisladas a distintas pruebas bioqumicas

1) Prueba de la Oxidasa
Esta prueba sirve para detreminar la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones de
microorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus,
Staphylococcus y Micrococcus (-) de Pseudomonas y Aeromonas (+).
Se debe partir de cultivos puros de bacterias crecidos en agar nutritivo 18-24 h
Metodologa:
A) Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.
B) Aplicar la colonia sobre el disco embebido en el reactivo de Kovacs para Oxidasa
(naftol+dimetilparafenilendiamina) extendiendo bien el material..
C)-Esperar 5-10 seg y observar la coloracin
Prueba Positiva: la tira vira a color azul por oxidacin del compuesto a azul de indofenol
Prueba Negativa: no hay modificacin

2) Prueba de la Catalasa
Esta prueba es para detectar presencia de la enzima catalasa enpreparaciones de microorganismos.
Diferencia Streptococcus (-),Clostridium (-), de Staphylococcus (+), Bacillus (+) y Micrococcus(+).
Metodologa:
A) Colocar una gota de agua en un portaobjeto limpio.
B) Colocar una ansada de la colonia a probar sobre la gota y mezclar (no dejar secar).
C) Agregar 2 gotas de Agua oxigenada.

Resultado positivo: formacin de burbujas debido a laproduccin de O2 a partir del H2O2 por accin de
la enzima.

3) Prueba del agar hierro-dos azucares de Kligler

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especifico
incorporado a un medio de crecimiento bsico asi como la produccion de gas y acido sulfhidrico.
Se suele utilizar para la identificacion de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae.
Metodologa:
1- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncion y por estra en el mismo tubo de
agar hierro de Kligler.
2- Incubar a 37C durante 18-24 h
3- Observar entre las 18 h y las 24 h de cultivo (ni antes ni despues)
Resultados:
El uso de un hidrato de carbono implica la liberacion al medio de productos acidos capaces de ser
detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo en cuestion es incapaz de usar el H de C,
consume entonces las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el mismo. Al interpretar
losd datos de la prueba debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
A)Utilizacion del hidrato de carbono:
*Si el microorganismo en estudio solo fermenta glucosa
i)
en superficie:reaccion alcalina, color rojo
ii)
en profundidad: reaccion acida, color amarillo
*Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa:
i)
en superficie: reaccion acida, color amarillo
ii)
en profuindidad: reaccion acida, color amarillo
*Si el microorganismo no es capaz de fermentar glucosa ni lactosa (no enterico)
i)
en superficie: reaccion alcalina, color rojo
ii)
en profundidad: si es aerobio entonces no hay crecimiento ni cambio de color; si es
facultativo entonces hay reaccion alcalina y color rojo
* Si el microorganismo no es capaz de fermentar lactosa pero si de oxidarla
i)
en superficie: reaccion acida en tiempos cortos (color amarillo) luego reaccion
alcalina y color rojo.
ii)
en profundidad: no hay crecimiento ni cambio de color.
B) Produccion de gas

C) Produccion de SH2

Si el microorganismo en estudio es aerogenico, la produccion de H2 y CO2

se manifiestan por la formacion de burbujas y/o el desprendimiento de del
agar del fondo del tubo, dejando un area clara
Si el microorganismo en anaerogenico, entonces no hay liberacion de gases
Si el microorganismo produce este acido, el mismo reaccionara con el hierro
formando un precipitado de SFe insoluble (color negro)
Si no produce el acido no habra reaccion

4) Pruebas del IMViC (INDOL-ROJO METILO-Voges Proskauer-Citrato)

Estas cuatro pruebas son muy utiles para distinguir bacterias coliformes entre si.

Produccin de INDOL
Mide la capacidad del microorganismo de producir indil a partir de triptofano por accin de la
enzima triptofanasa.
Metodologa:
1) Inocular tubos con agua de triptona con una ansada de cultivo puro crecido 18-24 h en
agar nutritivo. Dejar un tubo sin inocular como testigo.
2) Incubar a 37 por 48 h.
3) Colocar sobre el tubo unas gotas de reactivo del indol de Kovacs (alcohol amlico,
paradibenzaldehido acido). Dejar reposar hasta aparicin de anillo rojo en superficie.
prueba positiva: formacin de anillo rojo en fase alcoholica (compuesto quinnico derivado del
indol)
prueba negativa: anillo amarillo en superficie.

VOGES PROSKAUER y Rojo de Metilo

Estas dos pruebas permiten detectar el tipo de fermentacin (butilengliclica o acido mixta) que
realiza el microorganismo. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de
algunos organismos de producir acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de la frementacin
butilengliclica de la glucosa. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+). Escherichia coli y
otras especies de Klebsiella (-). La prueba del Rojo Metilo sirve para comprobar la capacidad de
un organismo de producir y mantener estables los productos terminales acidos d ela
fermentacin (cido mixta) de la glucosa. Escherichia coli (+) y Klebsiella, Enterobacter (-).
Metodologa:
1- Inocular tubos conteniendo caldo MR-VP con una ansada de cultivo fresco
crecido en agar nutritivo.
2- Incubar a 37 por 48 h
3- Dividir el contenido del tubo en dos partes iguales
4- Para determinar presencia de acetona (Voges) agregar a 1 ml de cultivo 0.6 ml
de Reactivo de Barrit y 0,2 ml de KOH al 40%.
5- Agitar suavemente y dejar reposar 5-10 min.
Prueba positiva: color rosado-rojo en la superficie que se intensificar al cabo de unas horas
(presencia de acetona).
Prueba negativa: sin cambio de color (amarillo) en la superficie.
6-Para detreminar Rojo Metilo, agregar al segundo tubo unas 5 gotas de indicador rojo de metilo
al 0,1%.
Prueba positiva: si el cultivo continua siendo de color rojo, entonces el pH esta por debajo de
4,4. Hay fermentacin cido-mixta.
Prueba negativa: color amarillo en la superficie, pH=6.

Aprovechamiento de Citrato (Medio Citrato de Simmons)

Esta prueba permite determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como nica
fuente de carbono.
Salmonella, Arizona, Citrobacter,Klebsiella y Enterobacter (+)
E. coli, Shigella, Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-)
Metodologa:
1-Inocular placas con agar citrato de Simmons con una ansada de cultivo fresco crcido en
agar nutritivo.
2-Incubar a 37C por 48 h
3-Observar si hay desarrollo de colonias.

5) Prueba de motilidad.
Este ensayo permite detectar la presencia de flagelo en el microorganismo que se estudia.
Cada tipo de microorganismo aislado se le har la prueba de motilidad, sembrndolas POR PUNCION en
un medio slido blando con agar al 0.4% a fin de detectar las bacterias con motilidad positiva y negativa.
Se utilizaran cepas controles.

6) Sensibilidad a antibiticos
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por ciertos microorganismos que son activas contra
otros microorganismos. Distintos antibiticos tienen distinta forma de accin sobre distintos componentes
de los microorganismos (pared celular, sntesis de protenas, sntesis de ARN, etc). A su vez, los
microorganismos crean mecanismos de resistencia a los antibiticos que tambin pueden ser de diverso
tipo (alteracin de la permeabilidad al mismo, alteracon del blanco, desarrollo de vas alternativas,
inactivacin del antibitico)
Objetivo: Se determinar sensibilidad a antibiticos de los distintos microorganismos aislados en las
clases anteriores. Se utilizar el sistema de monodiscos.
Metodologa:
Se mezclan 0,1 ml de cultivo bacteriano de 24 hs en caldo nutritivo, con 3 ml de agar blandonutritivo (0,7% de agar) mantenido a 40C. Se vuelca la mezcla en placas, previamente preparadas
y solidificadas de agar nutritivo (1,5%de agar). Se deja solidificar y luego se coloca, sobre la
superficie de cada placa, los discos de papel de filtro estriles embebidos en los diferentes
antibiticos a ensayar.
Se incuban las placas a 37 28C segn de donde provino el aislamiento.
La clase siguiente se determinar el grado de sensibilidad de cada microorganismo usado,
midiendo el dimetro de los halos de inhibicin.

CUESTIONARIO T. P. 5
1) Defina el concepto de especie bacteriana. En qu difiere del concepto de especie animal?
2) Mencione tres tecnicas clasicas utilizadas para clasificar bacterias.
3) Como cree que afectara a la clasificacin bacteriana la adquisicin de plsmidos, transposones o
profagos?

4) Es til la prueba de la catalasa para distinguir entre que dos generos bacterianos?

5) Qu permiten diferenciar las pruebas de fermentacin?

6) Para qu se utiliza el test del IMViC?
7) Para el test MR:
Qu proceso esta siendo evaluado?
Qu indicador se utiliza?
Qu color indica un resultado positivo?
6) Para el test VP:
Qu proceso esta siendo evaluada?
Qu indicador se utiliza?
Qu color indica un resultado positivo?
Qu relacion existe entre MR y VP?
8) Para la prueba del citrato
Qu proceso se detecta?
Qu indica un resultado positivo?
9) Los productos terminales de la degradacion del trp son indol y pirvico. Por qu se evalua la
presencia de indol en vez de pirvico como indicador de actividad triptofanasa?

10) Diga si es verdadero o falso

a) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizan
fermentacin cido-mixta de aquellos que realizan fermentacin butilengliclica.
b) Las pruebas bioqumicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en cualquiera de los
siguientes medios:
i) Extracto de carne, peptona de carne, agua.
ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua.
11) Qu resultados espera obtener en las pruebas bioqumicas de agar hierro de Kligler y
oxido/fermentacin de lactosa como nica fuente de carbono, para microorganismos con las siguientes
caractersticas metablicas:?.
a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono
b) Anaerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbono
c) Anaerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono

12) A partir de una muestra de agua del Ro de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5 microorganismos
(A, B, C, D, E). A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro de Kligler, Rojo de Metilo y
Voges Proskahuer, obtenindose los siguientes resultados:

Kligler Rojo de Metilo Voges Proskahuer

A Ac/Ac con gas +
B Alc/SC sin gas C Alc/Ac sin gas +
D Alc/Ac con gas -+
E Ac/Ac con gas -+
A partir de los resultados obtenidos: a) Qu caractersticas metablicas puede inferir para cada uno de
los microorganismos aislados ?.
b) De qu otra forma podra determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los cinco
microorganismos ?.
13).Discuta las siguientes afirmaciones;
a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos cidos generados por la
fermentacin de la lactosa.
b) Si en la prueba de O/F tanto en el tubo abierto como en el cerrado se observ crecimiento con viraje
del indicador al amarillo (cido) indica que el microorganismo oxid y ferment la glucosa del medio.
c).Los resultados de las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer a diferencia de la prueba de agar
hierro Kligler son independientes del tiempo de lectura.
d) La aparicin de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reduccin del nitrato se
considera positiva.
e) Para el enriquecimiento de Staphylococcus aureus es suficiente incubar la muestra 2 horas en agua
peptonada.
14) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminacin con
Pseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioqumicas y los resultados esperados de las
mismas que le permitiran comprobar que se trata de estos dos microorganismos.

ANTIBIOTICOS
1) Disee un protocolo para determinar la concentracin inhibitoria mnima de un antibitico para un
determinado microorganismo. Este protocolo es aplicable en el caso de un bacteriosttico, un
bactericida ltico y un bactericida no ltico?
2) Para obtener un cesped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa conteniendo: agar,
glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel embebidos con diferentes
cantidades de un determinado antibitico. Luego de 48 horas de incubacin se observa un halo de
inhibicin alrededor del disco que contiene 5 g de antibitico. Cuando se hace lo mismo pero utilizando
un medio que contiene agar, triptona y extracto de levadura, se observa un halo de inhibicin del mismo
tamao que el anterior recin alrededor del papel que contiene 50 g del antibitico. Discuta al menos
dos posibles explicaciones para estos resultados.
3) Disee un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un compuesto
con actividad antibitica. Cmo determinara si dicho compuesto es bactericida o bacteriosttico ?.
4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en estado de
crecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentracin de penicilina en ambos cultivos Que
resultados esperara obtener ?. Grafique y explique.
5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37 C, tomando alcuotas a
distintos tiempos para medir nmero de clulas viables y D.O. A los 120 minutos (fase log) se agregan a
cada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c) agua. A los 240 minutos, los cultivos se
centrifugan a baja velocidad, se resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se contina la
incubacin. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (nmero de clulas viables y
D. O.). Justifique.
6) Qu efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriosttico y un antibitico de
accin sobre sntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial ?.
7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibicin 3 veces mayor para el
antibitico A que para el antibitico B. Qu conclusin se puede extraer de esta prueba ?. Justifique.
8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por sntesis qumica con presunta actividad antimicrobiana para
bacterias gram negativas.
a) Cmo determinara cual de las tres presenta mayor actividad?.
b) Qu parmetros debera tener en cuenta en el ensayo experimental?.
c) Cmo determinara su mecanismo de accin?.
9) a) A qu se debe la aparicin de colonias dentro de la zona de inhibicin del crecimiento en un ensayo
de concentracin inhibitoria mnima?

b) Qu resultados esperara obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas colonias en
relacin a las que crecen por fuera del halo de inhibicin? Cmo la calculara?

T.P. 6

TP N7
GENETICA BACTERIANA
La transferencia de material gentico en bacterias se da bsicamente mediante tres procesos conocidos
como: transformacin, transduccin y conjugacin.
En la transformacin, las bacterias permiten la entrada de cidos nucleicos directamente del medio
externo; cuando esto sucede se dice que las bacterias son competentes. En la naturaleza, bajo ciertas
condiciones, algunos microorganismos puedan alcanzar el estado de competencia e incorporar material
gentico extrao, por ejemplo: Bacillus spp. (bacilo Gram positivo capaz de esporular), Haemophilus spp.
(cocobacilo Gram negativo) y Neisseria spp. (bacilo Gram negativo). Sin embargo, en el laboratorio se
pueden tratar las clulas de un cultivo bacteriano para que sean competentes. El mtodo ms comn es el
del tratamiento con Cloruro de Calcio, este compuesto qumico acta a nivel de la membrana en Gram
negativos facilitando la entrada del cido nucleico. Tambin se puede lograr el mismo objetivo mediante
un shock elctrico, en este caso se deben procesar las clulas de un cultivo bacteriano para que sean
electrocompetentes y disponer de un aparato llamado electroporador.

Comisin A y B
Objetivos:
Da 2
1)
2)
3)
4)

Transformar clulas competentes de Escherichia coli con un plsmido recombinante.

Transformar las mismas clulas competentes pero con el plsmido vector.
Hacer los controles necesarios (se discutirn en el prctico).
Preparar las placas de Petri con los medios y reactivos que se necesitarn.

Da 3
5) Discutir los resultados obtenidos experimentalmente.
6) Discutir problemas tericos relacionados al trabajo prctico.
Desarrollo:

Transformacin
2) Tomar del freezer un tubo eppendorf conteniendo las clulas competentes y descongelar en hielo.
3) Agregarle el plsmido.
4) Dejar 30 min. en hielo.
5) Poner el tubo 45 seg. en un bao de agua de 42 grados C (sin agitar).
6) Volver al hielo y mantener 2 min.
7) Pasar el contenido del tubo eppendorf a un tubo de ensayo conteniendo 0.9 ml del medio SOC (a
temperatura ambiente).
8) Incubar 45-60 min. a 37grados C, con agitacin.
9) Tomar 100l del cultivo e inocular esparciendo en una placa de LB con los reactivos necesarios para
seleccionar a las transformantes. Incluir los controles adecuados. (Guardar el resto del cultivo).
10) Incubar las placas 18 hrs. a 37 grados C.

CAMBIOS GENTICOS
El genoma de una bacteria puede sufrir cambios debidos a mutaciones o a la incorporacin de un ADN
exgeno, muchas veces trayendo como consecuencia un cambio en el fenotipo de la bacteria. Mutacin:
Se le llama as al cambio heredable en la secuencia de bases del cido nucleico del organismo.
La incorporacin del ADN exgeno dentro de una bacteria puede a su vez ser por transduccin
(transporte de ADN por bacterifagos), transformacin (incorporacin de fragmentos de ADN a bacterias
competentes) o por conjugacin (transferencia de ADN entre dos bacterias por contacto fsico entre ellas).

Objetivo:
Produccin de cambios en el genotipo de una bacteria por:
a) conjugacin y complementacin funcional
b) transposicin y generacin de mutantes por insercin
Desarrollo:

Comisin A
a) Complementacin funcional de una mutante por conjugacin biparental
Bacteria receptora: cultivo de la mutante pgm de Agrobacterium tumefaciens, carente de la enzima
fosfoglucomutasa. Esta mutante es incapaz de transformar Glu-6-P en Glu-1-P, por lo tanto es incapaz de
generar ADP-Glu y UDP-Glu, los dadores de glucosas activadas para la sntesis de todos los polisacridos
estructurales y de reserva que contengan glucosa. Esta mutante es pleiotrpica y por carecer del
exopolisacrido tiene un fenotipo DARK al iluminar con UV placas conteniendo calcofluor. Esta mutante
es resistente al antibitico Kanamicina.
Bacteria donadora: un cultivo de Escherichia coli S17.1, que contiene el plsmido pCC15, el cual lleva la
secuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens. Esta cepa es resistente al antibitico Carbenicilina,
dicha resistencia es portada en el plsmido pCC15. PROCEDIMIENTO. Se toman 1 ml de cada cultivo
lquido (dadora y receptora) y se centrifugan en un mismo tubo Eppendorff. Una vez centrifugados se
lava con 1 ml de medio LB.
Se centrifuga nuevamente, se resuspende en 30 l de LB y se deposita sobre una placa de LB slido, sin
antibiticos. Se incuba a 28o C por una noche.
Al da siguiente se plaquea por rastrillado la mezcla de conjugacinen el medio selectivo: Medio LBKanamicina (50 g/ml)-Carbenicilina (100 g/ml)-Calcoflor 0,02%.Se plaquean tambin en el mismo
medio, la cepa receptora ydonadora por separado como control.Incubar 48 hs a 28 C.
Observar la reversin del fenotipo DARK a BRIGHT al iluminar la placa con luz UV.

Comisin B:

b)Mutacin por insercin del transposn Tn5.

Un cultivo silvestre de Agrobacterium tumefaciens ser sometido a conjugacin con la cepa E. coli S17.1
pir portando el vector suicida pUTminiTn5Km.
Este paso de conjugacin permitir movilizar el vector pUTminiTn5 Km desde E. coli a A. tumefaciens.
Dado que el vector pUTminiTn5 Km es SUICIDA, es decir, es incapaz de replicar autonomamente en
cualquier contexto gentico excepto cuando esta presente el gen pir, el vector no podr soportar
replicacin en A. tumefaciens y se perder en las sucesivas divisiones de la bacteria. Sin embargo el
transposn miniTn5 podr transponer hacia el genoma de A. tumefaciens antes que el vector que lo porta
se pierda. Este evento de transposicin lo podremos evidenciar facilmente dado que el miniTn5 porta un
gen marcador que confiere resistencia a kanamicina. En consecuencia todas las colonias de A.
tumefaciens capaces de crecer en placas conteniendo kanamicina son potenciales receptoras del
transposn. Para contraseleccionar las E. coli dadoras se agregar cloranfenicol dado que esta cepa es
sensible y la A. tumefaciens receptora es naturalmente resistente.
PROCEDIMEINTO
-Tomar 1 ml de cultivo lquido de A. tumefaciens (silvestre, fenotipo Bright) y 1ml de E. coli S17.1 pir
pUTminiTn5Km y mezclarlos en tubo eppendorf.
-Centrifugar 10 min.
-Eliminar el sobrenadante y lavar con 1ml de medio LB fresco. Volver a centrifugar.
-Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 35 l de LB fresco.
-Tomar el material resuspendido y colocarlo en el centro de una placa de LB. Incubar a 28 C toda la
noche.
-Levantar el botn bacteriano y plaquear por rastrillado en medio de seleccin conteniendo LBKanamicina 50g/ml-Cloramfenicol (20 g/ml)-Calcofluor 0,02%. Como control plaquear en el mismo
medio selectivo la cepa dadora y la receptora.
-Incubar a 28 C grados 48 hs.
-Observar la aparicin de colonias de A. tumefaciens resistentes a kanamicina. Observar la presencia de
colonias mutantes DARK.