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20131

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

OBJETIVOS
Determinar por el nmero ms probable de coliformes totales y fecales
por la tcnica de tubos mltiples. Recuento de bacterias hetertrofas.
Realizar un anlisis microbiolgico a una muestra de agua de la laguna
terciaria de CITRAR.
Verificar si el agua es apta para riego de de plantas.

FUNDAMENTO TEORICO
El grupo coliforme, presentan mayormente en el sistema digestivo de los
animales como tambin en vegetales (semillas) y esparcidas por el suelo,
adems, pueden utilizarse como indicadores de contaminacin del agua. El
anlisis que se realizo, determino la presencia y ausencia de coliformes fecales
y totales en las tres muestras diferentes de agua, como son: Agua residual,
agua de pozo y agua mineral; a partir de cultivar estos grupos de
microorganismos en agares especficos con implementos adecuados para su
identificacin. En la primera muestra mencionada, se obtuvo que el total de
muestras analizadas por dilucin, presenten grupos coliforme, mas no se
observo lo mismo en las otras muestras de agua mineral y de pozo. La
determinacin de grupos coliforme es una forma de identificar el grado de
contaminacin
por
excretas
existente
en
el
agua.
Grupo coliforme, coliformes fecales, coliformes totales, agar, dilucin,
inoculacin, incubacin.
El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas caractersticas
biolgicas - qumicas especificas, estas caractersticas, propias de cada
organismo que integra este grupo muestran que:Son organismos aerobios o
anaerobios facultativosSon gran negativosProducen gasFermentan la lactosa
a 35C a 48hEstas caractersticas son las relevantes de todos los miembros del
grupo coliforme, la bacteria principal de este grupo es la Escherichia Coli.
Dela cual deriva el nombre del grupo en general. Estos microorganismos se
encuentran de forma continua y general en el sistema digestivo animal,
especficamente en el intestino, por ende, es muy obvio encontrarlos en zonas
donde haya heces y en restos fecales de animales. A estos se les llaman:
Coliformes fecales, que al igual que los coliformes totales, forman parte del
grupo coliforme. Coliformes fecales < coliformes totales = grupo coliforme.
Estos microorganismos tienen una continua relacin con el medioambiente,
puesto que, en los lugares donde habita cualquier tipo de animal, existe
coliformes, entonces estarn expuestos a diferentes alteraciones producidas
por estas bacterias, como: intoxicaciones y enfermedades digestivas
(mayormente).Por otra parte, las bacterias coliformes que la lluvia arrastra, por
el suelo, usualmente quedan atrapadas por las rocas y a medida que el agua
pasa por las rocas llega a los sistemas de agua subterrnea, sin embargo, los
pozos que no estn bien construidos, son una puerta abierta para que estas
bacterias contaminen el agua que se bebe.
El usar este tipo de anlisis por coliformes resulta mucho mas sencillo y
econmico, a comparacin con el de buscar microorganismos especficos. Para
la deteccin de estos microorganismos, se utilizan medios de cultivos

20131

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

especficos, en los cuales se les inocula una parte de la muestra a analizar,


estos medios garantizan los requerimientos nutricionales del grupo coliforme.
Adems, para analizar estos coliformes se plantearon tres fases, la fase
presuntiva, la fase confirmativa y la fase complementaria, cada una de ella con
una funcin especfica en la identificacin y aislamiento de microorganismos
del grupo coliforme delas dems bacterias que estn presentes en la muestra.

MEDIOS UTILIZADOS EN EL EXPERIMENTO:


LAURIL SULFATO CALDO
Medio recomendado por A.P.H.A. para deteccin y recuento de coliformes en
aguas, aguas residuales y alimentos.

Fundamento
Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los
microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos.
La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un
sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la
flora
acompaante.
Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se
evidencia al utilizar las campanas Durham.

Frmula (en gramos por litro)


Triptosa

20.0

Lactosa

5.0

Cloruro de sodio

5.0

Lauril
sodio

sulfato

Fosfato dipotsico
Fosfato
monopotsico

de 0.1

Instrucciones
Suspender 35,6 g del polvo en 1
litro de agua destilada. Dejar
reposar 5 minutos. Calentar a
ebullicin hasta la disolucin
total.
Distribuir
en
tubos
conteniendo
tubos
de
fermentacin.
Esterilizar
en
autoclave durante 15 minutos a
121C.

2.75
2.75

pH final: 6.8 0.2


Siembra

Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero ms Probable:

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a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10
ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.

Nmero
de tubos

Volumen
de la
muestra

Volumen
de
medio

Concentraci
n
del medio

10 ml

10 ml

Doble

1 ml

10 ml

Simple

0.1 ml

10 ml

Simple

b.- Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar


diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en
medio de cultivo simple concentracin.

Nmero
de
tubos

Dilucin
dela
muestra

Volume
Volume
Concentraci
n de la n
de n
muestra medio
del medio

10-1

1 ml

10 ml

Simple

10-2

1 ml

10 ml

Simple

10-3

1 ml

10 ml

Simple

Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.
Resultados
Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.

Microorganismos

Crecimiento

Enterobacter
aerogenes

Bueno
excelente

a +

Escherichia coli ATCC Bueno


25922
excelente

a +

Salmonella
typhimurium

a -

Bueno
ATCC excelente

Produccin
de gas

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14028
Staphylococcus
aureus ATCC 25923

Inhibido

Inhibido

El resultado del nmero ms probable se expresa por 100 ml para muestras


fluidas y por gramo para muestras slidas.
Caractersticas del medio
Medio preparado: agar claro a claramente opalesco .

CALDO VERDE BRILLANTE BILIS


Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales,
por
la
tcnica
del
nmero
ms
probable.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram
negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con
produccin de cido y gas.
Frmula (en gramos por litro)
Bilis de buey
20.0
deshidratada
Lactosa
10.0
Peptona
10.0
Verde brillante
0.0133

Instrucciones
Suspender 40 g del polvo deshidratado
por litro de agua destilada. Disolver y
distribuir 10 ml por tubo con
campanita de Durham. Preparar
adems, el medio a doble
concentracin. Esterilizar en autoclave
a 121C durante 15 minutos.
pH final: 7.2 0.2

Siembra
a.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por
triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple
concentracin.
Nmero
de tubos
3
3
3

Volumen
de la
muestra
10 ml
1 ml
0.1 ml

Volumen
de medio
10 ml
10 ml
10 ml

Concentraci
n
del medio
Doble
Simple
Simple

b.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras slidas (alimentos,


cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar
cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin.

Nmer
o

Diluci
n dela

Volume
n de la

Volume
n de

Concentrac
in
3

20131

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de
tubos
3
3
3

muestr
a
10-1
10-2
10-3

muestr
a
1 ml
1 ml
1 ml

medio

del medio

10 ml
10 ml
10 ml

Simple
Simple
Simple

c.- Para anlisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test
presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2%
Caldo Mac Conkey Caldo Lauril Sulfato, utilizando la tcnica del NMP), o a
partir de colonias presentes en diferentes medios, que se presume sean
coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2%
caldo fresco, incubando a 45 +/- 0.5 C y otra en Agua Triptona con incubacin
a 35-37 C, para detectar la produccin de indol.
Incubacin
a- Para de coliformes totales: a 35-37 C durante 24 horas.
b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 C durante 24 horas.
Resultados
-Positivo: presencia de gas.
Con el nmero de tubos positivos, calcular el nmero ms probable. El
resultado se expresa por gramos 100 ml de producto
-Negativo: ausencia de gas.
Microorganismos

Crecimiento

Gas

Indol#

Escherichia coli ATCC 25922

+*

+*

Enterobacter spp.

-*

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

+*

-*

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Bacterias no fermentadores de lactosa

Variable

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde esmeralda, transparente

E. C. MEDIO
Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales.Fundamento
El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias
lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran
parte de la flora acompaante. Este caldo es recomendado por el Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975), y por Hajna y
Perry (1943), para el recuento de coliformes en alimentos.
Frmula (en gramos por litro)
Triptena

20.0

Instrucciones
Suspender 37,4 g del medio en un litro de

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Lactosa

5.0

Sales biliares N 3

1.9

Fosfato dipotsico

4.0

Fosfato monopotsico

1.5

Cloruro de sodio

5.0

agua destilada. Calentar hasta su total


disolucin. Distribuir en tubos de ensayo
que contengan campanitas de Durham.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos
a 121C.

pH final: 6.9 0.2

Siembra
Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Ms Probable:
a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10
ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.
Nmero
de tubos

Volumen
de la
muestra

Volumen
de medio

Concentraci
n
del medio

10 ml

10 ml

Doble

1 ml

10 ml

Simple

0.1 ml

10 ml

Simple

b- Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar


diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en
medio de cultivo simple concentracin.
Nmero
de tubos

Dilucin
dela
muestra

Volumen
de la
muestra

Volumen
de medio

Concentraci
n
del medio
Simple

10-1

1 ml

10 ml

10-2

1 ml

10 ml

Simple

10-3

1 ml

10 ml

Simple

Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C
Resultados
Se consideran resultados positivos el crecimiento bacteriano y produccin de
gas.
Microorganismos

Crecimiento

Produccin de gas

20131

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Enterobacter aerogenes

Bueno a
excelente

Escherichia coli ATCC 25922

Bueno a
excelente

Salmonella typhimurium ATCC


14028

Bueno a
excelente

Staphylococcus aureus ATCC


25923

Inhibido

Inhibido

El resultado del nmero ms probable se expresa por 100 ml para muestras


fluidas y por gramo para muestras slidas.

METODOLOGA

Materiales a usarse en los experimentos

Placas Petri
ensayo

Tubos de

20131

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Mechero Bunsen
analtica

Balanza

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Asa de Siembra

Tripode

Malla de Asbesto

Bao Mara

12

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Pipeta

Erlemeyer

Reactivos usados en los experimento

Nombre del reactivo


Muestra de Agua de CITRAR
Caldo Lauril Sulfato de doble
concentracin.
Caldo Lauril Sulfato de simple
concentracin.
Agua peptonada
Caldo Brilla
Caldo EC.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA: Determinacion del Nmero ms
probable de Coliformes Totales y Coliformes fecales para la tcnica de Tubos
Multiples. Recuento de Bacterias Heterotrofas
12

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Agua de CITRAR
MUESTRA DE

Diluciones sucesivas
Agregar 10 ml a cada tubo

10-2

10-3

10-4

Agregar 1 ml a cada tubo

10
mL

Caldo Lauril sulfato


(doble
concentracin)

10-1

Agua Peptonada

Caldo Lauril simple concentracin (Por


Triplicado)
Incubar 24 2horas a 35 0.5 C

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFASO MICROORGANISMOS


AEROBIOS MESOFILOS VIABLES
12

10-5

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

MUESTRA DE AGUA

Agua de CITRAR
Diluir 10 ml a cada tubo de ensayo

90ml

10-1

90ml

10-2

90ml

10-3

90ml

90ml

10-4

10-5

Agregar el Agar TSA, Homogenizar


15-20 ml
Incubar a 35C x 48 horas
Invertir las Placas

CONTINUACION DE LOS PROCEDIMIENTOS:

LUNES
Sembrar 2 asadas

Gas (-)
Prueba
Negativa

Gas (-)
Prueba
Negativa
12

Caldo EC

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

PRUEBA
CONFIRMATIVA
Tubos Positivos
(produccin de
gasy turbidez)

Tubos Positivos
(produccin de
gas)

10 mL
Caldo Brilla

Incubar
44,5 0,2
C
24 2
horas

Incubar
35 0,5
C
48 3
horas

GAS (+)
Calcular valor NMP
de los nmeros de
tubos positivos en la

TABLA
(NPM/100mL)

GAS (+)
Calcular valor NMP de
los nmeros de tubos

positivos en la TABLA
(NPM/100mL)

Recuento de
bacterias
hetertrofas de las
placas con Agar TSA.

OBSERVACIONES/RESULTADOS

12

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Si hay formacin de gas se procede la la siguiente etapa sino se deja


incubar 24 horas ms (si a las 24 horas no forma gas a los 48 horas se
observa).

Tubos positivos
o

Caldo LST de doble concentracin.

Los tres tubos sembrados son positivos con crecimiento de organismos,


turbidez del medio, formacin de gas y sedimentacin.
o

Caldo LST de simple concentracin.

Los tres tubos sembrados son positivos con crecimiento de organismos,


turbidez del medio, formacin de gas y sedimentacin.
o

Dilucin 10-1:

Tres tubos positivos con presencia de gas, crecimiento de organismos, turbidez


del medio y sedimentacin.
o Dilucin 10-2:
o

10-2 A: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio, presencia


de gas y poca sedimentacin.
10-2 B: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio, presencia
de gas y poca sedimentacin.
10-2 C: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio y presencia
de gas.
Dilucin 10-3:

10-3 A: Presencia de gas y turbidez del medio


10-3 B: Crecimiento de microorganismos, turbidez del medio sin
presencia de gas
- 10-3 C: Crecimiento de microorganismos, turbidez del medio sin
presencia de gas
o Dilucin 10-4:
- 10-4 A: Poca turbidez del medio sin presencia de gas
- 10-4 B: Poca turbidez del medio sin presencia de gas
- 10-4 C: Mayor crecimiento de microorganismos turbidez del medio sin
presencia de gas
o Dilucin 10-5:
- Sin crecimiento ni turbidez del medio, todos tubos negativos.
Recuento de bacterias hetertrofas
-

10

: Incontable

12

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

10

10

10

10

: Incontable
: 92 colonias
: 44 colonias
: 31 colonias

Caractersticas de las colonias: Amarillentas con halo color cremoso, otras


blancas, forma irregular.
PLACAS RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Incontable

Incontable

92

44

31

Del tubo 10-3: 92 x 103


Del tubo 10-4: 44 x 103
Del tubo 10-5: 31 x 103
Como la relacin de estas diluciones consecutivas es menor que 2 se
realiza el promedio.
Resultado: 56x103 UFC x gr

DISCUSION Y CONCLUSIONES
Tal y como se esperaba se pudo lograr esta vez un buen resultado en el
NMP debido a que esta vez si se realizo un buen trabajo.
No es apta para el consumo ya que presenta demasiados coliformes
totales y fecales.
No es apta para el riego de plantas ya que se pasa del lmite permisible
de coliformes.
Debe de tratarse ms estas aguas para que sean aptas tanto para el
riego como para el consumo humano.

RECOMENDACIONES
A la hora de sembrar es preferible estar cerca del mechero de bunsen
para as poder evitar alguna contaminacin a la muestra.
Realizar de forma correcta las siembras, para evitar errores en los
resultados.

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2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Seguir las indicaciones del profesor encargado del curso para que el
experimento sea un xito.
A la hora de las diluciones se debe tener cuidado con no confundir las
pipetas utilizadas en cada dilucin.
Manejar con cuidado la muestra ya que es muy contaminada, evitar
tener contacto con ella.

BIBLIOGRAFIA
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo ll,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.
Alonso Urmeneta y otros. Manual Prctico de Microbiologa.
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo l,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.

ANEXOS
Galera

12

2013

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

Muestras de agua de CITRAR rotulado de


dilucin y agar

10

de las concentraciones.

Sembrando de tubos positivos en caldo Brilla.


Concentracin).

10

Homogenizacin de la placa petri con


TSA.

Crecimiento en Caldo LST (simple

12

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