Submdulo: Identificar Microorganismos con base en tcnicas

bacteriolgicas
CBTis 137

PRCTICA # 2
TCNICAS DE TINCIN
Objetivo
El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms
frecuentes.
Generalidades
La coloracin es el proceso de teir artificialmente los
microorganismos con colorantes o reactivos para facilitar su estudio
microscpico forma, agrupacin y estructuras)
Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos
bencnicos y grupos cromforos ( agrupacin de tomos que da color
a ciertos compuestos) y auxocromos ( sustituyentes como el grupo
oxidrilo o el amino que mejoran las caractersticas de absorcin del
cromforo)
En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes
de varias formas como:
a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus
caractersticas de tincin, por ejemplo, si son o no alcohol-cido
resistentes, si son Gram positivas o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas
bacterias y as poder estudiar selectivamente a los
microorganismos que si crecen.
TINCIN DE BACTERIAS
La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes
bsicos como el cristal, azul de metileno y fucsina bsica, pero
relativamente mal con colorantes cidos como la eosina.
Un colorante bsico es aquel constituido por un agrupamiento
de tomos orgnicos con carga positiva que ser la parte activa del
colorante ya que tendr afinidad por los cidos nuclicos. Un
colorante cido es aquel que se encuentra constituido por tomos
orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el
citoplasma.
TIPOS DE TINCIN
1. Tincin simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve
para hacer ms fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar
ninguna caracterstica en especial. Una tincin simple se lleva a
cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco y fijado al
calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y
se lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o
usar papel secante para que quede listo para observarse.
2. Tincin negativa. Este mtodo de tincin utiliza colorantes
neutros o cidos ya que tienen poca afinidad por la clula
QFB Mtra. Antonia Zmano Garza

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bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo

en el que estn las bacterias pero la clula queda incolora y
transparente, as pues las bacterias aparecen como pequeas
reas iluminadas en un fondo oscuro. La tincin acdica con
nigrosina, o neutral ( con tinta china) son las ms usadas.
3. Tincin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras
tanto fsica como qumicamente, por lo cual su reaccin ante
algunos colorantes tambin ser diferente dando lugar as a
grupos tintoreales caractersticos. Entre estos grupos estn los
que se originan por la tincin descubierta por Hans Christian
Gram, esta tincin divide a las bacterias en Gram positivas o
Gram negativas lo cual no solo sirve para diferenciarlas sino
an para elegir la terapia adecuada en algunos casos. Existen
otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiologa clnica
como la de Ziehl- Neelsen.
4. Tincin estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que
de acuerdo a su afinidad se utilizan para teir y detectar ciertas
estructuras de la clula bacteriana como son las esporas, los
flagelos y las cpsulas.
TINCIN SIMPLE
MATERIAL
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Azul de metileno de Leffler
Cepa de Escherichia coli
TCNICA
1. Preparar un frotis de E. coli de acuerdo a las indicaciones de la
figura 1 y fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un
minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersin.
TINCIN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
4 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%
Nigrosina o tinta china
Puente de tincin
Cepa de Klebsiella pneumoniae
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TCNICA
1. Hacer una suspensin ligera en solucin salina de K.
pneumoniae y mezclar una gota de esta suspensin con una
pequea gota de nigrosina o tinta china en el borde central del
portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho
del primer portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.
4. Observe con el objetivo de inmersin.
TINCIN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Escherichia coli) y de Gram
Cristal violeta
Safranina

Puente de tincin
Cepas de Gram negativos (
positivos (Staphylococcus aureus).
Yodo de Gram
Etanol al 95%

TCNICA
1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de
S. aureus y uno con una mezcla de ambos microorganismos.
2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teir con cristal violeta por un minuto.
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un
minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el
portaobjetos sobre la charola de tincin y aada goteando el
etanol, dejando que corra por todo el frotis. Para un frotis
delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la accin decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y
dejar secar el frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersin.
TINCIN DE ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Papel filtro
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Lmpara de alcohol
Cepa de Bacillus subtilis
cido actico al 5%
Azul de metileno de Leffler
TNICA
1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la
figura 1.
2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara
de alcohol hasta la emisin de vapores. Es importante que su
puente de tincin est bien nivelado para que la fucsina no
se escurra y el frotis no se seque al calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos
4. Lavar con agua corriente
5. Decolorar con cido actico al 5% hasta que el frotis tome un
ligero color rosa
6. Lavar con agua corriente
7. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Leffler
8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y
observar con el objetivo de inmersin

FIGURA 1
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO

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Presentacin de resultados
1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:
a) Tipo de tincin
b) Nombre de la bacteria
c) Caracterstica observada
2. Conteste el cuestionario
3. Conclusiones
4. Bibliografa

QFB Mtra. Antonia Zmano Garza