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LAVRAS-MG
2004
Orientadora
Profa. PhD Ana Tereza de Mendona Viveiros
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2004
UFLA
UFLA
PUC-MG.
Dedico
AGRADECIMENTOS
Profa .PhD Ana Tereza de Mendona Viveiros, pela orientao e
apoio.
direo da Escola Agrotcnica Federal de Machado (E.A.F.M.), pela
minha liberao para este estudo e disponibilizao de suas instalaes,
equipamento e transporte para que se realizasse este trabalho.
Ao Prof. Dr. Luis David Solis Murgas, por disponibilizar o Laboratrio de
Fisiologia e Farmacologia.
Ao Prof. Dr. Rilke Tadeu Fonseca Freitas e ao Prof. Dr. Daniel Furtado, pela
ajuda estatstica durante a elaborao do projeto.
minha amiga Martha Janeth Prieto Guevara, pelo apoio e companheirismo
desde os primeiros momentos deste curso, assim como pela participao em
todas a fases desta pesquisa.
minha irm, Juveli Morais e minha cunhada, Roselene N. Morais,
pela ajuda, apoio e o grande carinho dispensado a mim e a meu filho, em todos
os momentos deste trabalho.
Aos colegas Alexandre Nizio Maria, Alexmiliano V. Oliveira e Alssio
B. Miliorini, pela ajuda recebida.
A Paulo Antnio Maciel e Jos Benedito Incio, pela ajuda na realizao dos
trabalho na Escola Agrotecnica Federal de Machado.
empresa Minitub do Brasil, pela doao das palhetas usadas no
experimento de congelamento de smen.
A todos aqueles que contriburam para a realizao deste trabalho.
MUI T O OB R I GADO!!
SUMRIO
P gina
LISTA DE TABELAS.................................................................. ................. ....i
LISTA DE FIGURAS................................................................... ............... .....iii
RESUMO .......................................................................................................... iv
ABSTRACT........................................................................................................v
1 INTRODUO ............................................................................................01
2 OBJETIVOS .................................................................................................03
2.1 Objetivo geral..............................................................................................03
2.2 Objetivos especficos ..................................................................................03
3 REVISO DE LITERATURA. .....................................................................04
3.1 Leporinus macrocephalus ...........................................................................04
3.2 Biologia reprodutiva dos peixes .................................................................05
3.3 Reproduo em cativeiro.............................................................................08
3.4 Preservao de smen de peixe ...................................................................09
3.4.1 Solues ativadoras da motilidade espermtica e diluidores de smen ...10
3.4.2 Agentes crioprotetores .............................................................................12
3.4.3 Resfriamento do smen ............................................................................14
3.4.4 Congelamento de smen ..........................................................................15
3.4.5 Descongelamento .....................................................................................17
4 MATERIAL E MTODOS ..........................................................................18
4.1 Local do estudo ...........................................................................................18
4.2 Origem, captura e seleo dos reprodutores................................................18
4.3 Tratamento hormonal e coleta do smen.....................................................21
4.4 Caractersticas seminais. .............................................................................21
4.5 Experimento I - Solues ativadoras da motilidade espermtica e diluidores
de smen de smen durante o resfriamento.................................................23
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
11
TABELA 2
15
TABELA 3
32
33
35
37
Motilidade
espermtica
expressa
em
porcentagem (mdia desvio padro), do
smen de piau-au, diludo em diferentes
solues e incubado a 5C - 8C por at 48
horas...................................................................
39
40
TABELA 4
TABELA 5
TABELA 6
TABELA 7
TABELA 8
TABELA 9
TABELA 10
42
43
ii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
04
06
20
22
27
33
36
iii
RESUMO
MORAES, Gilson Ferreira. Resfriamento e congelamento do
smen de piau-au Leporinus macrocephalus. 2004. 68 p.
Dissertao (Mestrado em Aqicultura) Universidade
Federal de Lavras, Lavras, MG..*
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de preservao
de smen do piau-au (Leporinus macrocephalus) atravs do processo de
resfriamento e congelamento. Os trabalhos foram realizados na Escola
Agrotcnica Federal de Machado, Machado-MG. A taxa de motilidade
espermtica foi usada como medida para avaliar a qualidade do smen. No
experimento I foram avaliadas diversas solues diluidoras e ativadoras da
motlidade espermtica comumente usadas em peixe, alm de solues de NaCl e
NaHCO3 em concentraes entre 25 e 200 mM. No experimento II foram
testados DMSO, etilenoglicol, glicerol e metanol como agentes crioprotetores
durante o resfriamento do smen. No experimento III amostras de smen foram
congeladas aps diluio em Kurokura (NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM, CaCl2
1,4 mM, NaHCO3 2,4 mM) e NaCl 200 mM associados a 5 e 10% de
etilenoglicol e Kurokura associado a 5, 10 e 15% de metanol. A melhor soluo
ativadora da motilidade espermtica foi NaCl 25 mM. Solues salinas de
kurokura, NaCl 200 mM e Ginsburg fish Ringer (NaCl 123,2 mM, KCl 3,75
mM, CaCl2 3,0 mM, NaHCO3 2,65 mM) mantiveram a viabilidade espermtica
durante 48 horas de resfriamento. Taxas de motilidade acima de 80% foram
obtidas nas amostras diludas em Kurokura associado ou no ao metanol. Todas
as amostras de smen congelado apresentaram baixas taxas de motilidade aps o
descongelamento. A maior taxa de motilidade (8%) foi observada em amostras
diludas em Kurokura com 5% de metanol.Smen de piau-au diludo em
soluo de Kurokura associada ou no ao metanol, mantm alta taxa de
motilidade espermtica aps resfriamento por 48 horas. As baixas taxas de
motilidade espermtica encontradas no smen aps descongelamento, mostram a
necessidade de realizao de novos testes com outros diluidores e crioprotetores.
iv
ABSTRACT
MORAES, Gilson Ferreira. Semen cool storage and cryopreservation of
piau-au Leporinus macrocephalus. 2004. 68 p.
MSc Thesis
(Aquaculture) Federal University of Lavras, Lavras, MG.*
The aim of this research was to develop a cool storage and
cryopreservation protocol for piau-au (Leporinus macrocephalus) semen.
Sperm motility rate was used to access sperm quality after treatments. On
experiment I, several solutions commonly used as extenders or sperm motility
activators of fish semen, and NaCl and NaHCO3 at 25 and 200 mM were tested.
On experiment II, DMSO, ethylene glycol, glycerol and methanol were tested as
cryoprotectants during cool storage. On experiment III, semen samples were
frozen after dilution on Kurokura solution (NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM, CaCl2
1,4 mM, NaHCO3 2,4 mM) or NaCl 200 mM combined with 5 or 10% ethylene
glycol, and Kurokura combined with 5, 10 or 15% methanol. NaCl 25 mM
induced the highest motility rate and was used as sperm activator afterwards.
Kurokura solution, NaCl 200 mM and Ginsburg fish Ringer (NaCl 123,2 mM,
KCl 3,75 mM, CaCl2 3,0 mM, NaHCO3 2,65 mM) maintained sperm viability
during 48 hours of cooling storage. Semen diluted on Kurokura combined or not
with methanol produced motility rates above 80% after activation. All frozenthawed semen samples showed very low motility rates. The highest motility rate
(8%) was obtained with samples diluted in Kurokura solution and 5% methanol.
Piau-au semen diluted in Kurokura solution maintain high sperm motility after
48-hour cooling. Due to the very low sperm motility after thawing, it is
necessary to further investigate the effect of other cryoprotectants and extenders
on cryopreservation of piau-au semen.
Priscila Rosa Vieira Logato UFLA, Luis David Solis Murgas - UFLA
1 INTRODUO
A constante interveno do homem no ambiente natural influencia
diretamente o hbitat de algumas espcies de peixes, principalmente aquelas que
realizam migraes durante o perodo reprodutivo, conhecidas por espcies de
piracema. A construo de grandes barragens, a poluio das guas, a pesca
predatria e a preferncia do consumidor por algumas espcies tm
proporcionado um declnio das populaes de peixes nos ambientes naturais.
Nesse contexto, a preservao de material gentico em espcies nativas por
congelamento assume um papel importante. Alm disso, o desenvolvimento de
tcnicas de preservao de smen proporciona melhoria no manejo reprodutivo,
pois a reproduo artificial de peixe em cativeiro, principalmente as espcies de
piracema, no tarefa fcil, j que, em cativeiro, estes peixes no sofrem os
estimulos ambientais necessrios para a sua reproduo.
A preservao de smen apresenta aplicaes prticas e cientficas. No
meio prtico, a preservao de smen pode melhorar o aproveitamento das
instalaes dentro das estaes de reproduo, reduzindo o estoque de machos,
eliminando a assincronia no amadurecimento dos gametas entre machos e
fmeas durante o perodo reprodutivo e auxiliando a recuperao de espcie
silvestres ameaadas de extino. No meio cientfico, pode-se citar o
fornecimento de material gentico para identificao de populaes, permitindo
estudos de melhoramento gentico e facilitando trocas e transportes de material
gentico entre instituies atuantes na rea.
O resfriamento de smen uma tcnica de preservao relativamente
simples, feito por meio de refrigerao a 4C 8C, por perodos que variam de
dias at a algumas semanas.
A criopreservao, por outro lado, uma tcnica bastante complexa e
refinada e, embora conserve o smen a -196C por tempo indeterminado, a
tcnica que mais causa danos aos espermatozides, como excessiva desidratao
e o rompimento da membrana, causado pela formao de cristais de gelo nos
meios intra e extracelular.
A escolha do mtodo de conservao do smen (resfriamento ou
criopreservao), do diluente e do crioprotetor depende da sensibilidade
espermtica queles agentes qumicos, do uso destinado ao smen e do
equipamento disponvel. Aps o trmino da preservao, os espermatozides
devem ter integridade das membranas, apresentar uma boa motilidade e ter
capacidade de fecundao.
O piau-au (Leporinus macrocephalus) foi escolhido para este estudo
por se tratar de uma espcie nativa de grande interesse comercial que, quando
mantida em cativeiro, apresenta problemas reprodutivos, tais como a baixa
produo de smen nos meses de piracema e a assincronia na maturao gonadal
entre machos e fmeas.
2 OBJETIVOS
3 REVISO DE LITERATURA
3.1 Leporinus macrocephalus
Famlia: Anostomidae ;
Subfamlia: Characiformes;
Gnero: Leporinus (SPIX, 1829)
Espcie: Leporinus macrocephalus ( Garavello & Britisk , 1988 )
Nome popular: Piau-au, Piaussu, Piauu, Piavuu.
3.2
3.3
Reproduo em cativeiro
As espcies de peixes que se reproduzem em guas paradas podem
3.4
3.4.1
10
Sol. Diluidora
NaCl (mM)
NaCl (mM)
50
150
50
150
50
200
25
150
50
150
50
100 e 150
50
200
75
100 e 150
Espcie
11
3.4.2
Agentes crioprotetores
Existem dois grupos de crioprotetores: os permeveis e
os
12
permeabilidade
dos
crioprotetores
pela
membrana
dos
13
3.4.3
Resfriamento do smen
Por ser um mtodo bastante simples de preservao de smen, o
14
Espcie
(horas)
(%)
14
10
12
25
Piapara (L.elongatus)
30,5
18
25
12
42
20
24
Piau-trs-pintas (L frederic)
34
20
40
3.4.4
Congelamento de smen
O smen de peixe a ser congelado necessita ser previamente diludo em
15
16
3.4.5
Descongelamento
A velocidade de congelamento , teoricamente, semelhante velocidade
17
18
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 Local do estudo
O presente trabalho foi realizado entre os meses de outubro de 2003 e
janeiro de 2004, no Setor de Piscicultura da Escola Agrotcnica Federal de
Machado, Machado,MG (E.A.F.M.)(Figura 2A). O municpio possui uma
topografia montanhosa, sua altitude mxima atinge 1.310 metros e a mnima 835
metros, estando a sede do municpio a 871 metros. A temperatura mdia anual
de 21,2C, com mdia mxima de 27 e mdia mnima de 14,2; o ndice
pluviomtrico no ano de 2001 foi de 1.824 mm. Machado situa-se na Bacia do
Rio Grande, fazendo parte das terras alagadas pela represa de Furnas. Seu
complexo hdrico formado pelos rios Dourado, Machado, So Tom e Sapuca,
alm dos crregos de Coroado, Jacutinga e Ouvidor.
19
L/min. Aps a extruso do smen, os reprodutores receberam tratamento antisptico e foram devolvidos aos viveiros de alvenaria.
20
4.3
21
22
23
c)
d)
Ohta (Ohta and Izawa, 1996 ) : NaCl 143,3 mM, KCl 15,2 mM,
CaCl2 1,3 mM, MgCl2 1,6 mM, ( pH 8,2)
e) Kurokura (KuroKura et al, 1984) : NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM,
CaCl2 1,4 mM, NaHCO3 2,4 mM, (pH 7,6)
Segunda fase - Foram testadas as seguintes solues como diluidoras do
smen :
a) Ginsburg fish Ringer I (G.F.R.I) (Adaptado de Ginsburg, 1963): NaCl
138,88 mM, KCl 4,19 mM, CaCl2 3,37 Mm; NaHCO3 2,97 mM, pH 7,6
b) Ginsburg fish Ringer II (G.F.R.II) (Viveiros et al, 2000): NaCl 123,2
mM, KCl 3,75 mM, CaCl2 3,0 mM, NaHCO3 2,65 mM, pH 7,6
c) Ginsburg fish Ringer III (G.F.R.III) (Ginsburg, 1963): NaCl 111,11
mM, KCl 3,35 mM, CaCl2 2,70 mM, NaHCO3 2,38 mM, pH 7,6
d) Extender II (Verreth, 1999): NaCl 76,92 mM; KCl 83,15mM;
MgCl26H20 0,787 mM;
283mOsm/L.
24
mM, pH 7,8;
Em cada fase foi usado o smen de trs peixes. Uma alquota de smen
foi diluda 1:6 (smen : diluidor) e mantida em geladeira a temperatura entre 5C
e 8 C. A taxa de motilidade foi avaliada 0; 0,5; 1; 2; 12; 24 e 48 horas aps a
diluio, seguindo-se a metodologia do experimento Ia, proporcionando uma
diluio final de 1:42 (smen:soluo diluidora+ativadora).
25
fazer
uma
diluio
maior,
na
proporo
de
1:100
26
27
Caractersticas seminais
A anlise de volume de smen e de concentrao espermtica foi feita em
relao ao peso dos doadores. Para isso, foi aplicado um teste de correlao de
Pearson, com o objetivo de se determinar uma possvel correlao entre as
variveis peso do doador, concentrao espermtica e volume de smen.
Experimento Ia e Ib - Foi usado um delineamento em bloco
inteiramente casualizado (DBC), em que o bloco controla a variao entre o
smen dos diferentes peixes . As mdias foram comparadas pelo teste de ScottKnott, 5% de significncia.
28
29
30
31
5 RESULTADOS
Freqncia
absoluta (n)
4
Freqncia
percentual
8,51
Sptz
x109mL-1
4,91
Volume
(mL)
0,13
[980 - 1820)
40
85,11
4,80
0.22
[1820-2660)
6,38
3,50
0.79
Total
47
100
Mdia 4,4
Sptz: espermatozoides
32
Varivel
Concentrao
Volume de smen
Peso
-0,072 ns
0,597 *
33
34
78 16
61 10
50
62 16
74 8
75
29 6
81 2
100
15 8
12 2
125
63
52
150
22
00
NaCl
NaHCO3
c
200
00d
00f
Mdias com letra igual na coluna no diferem entre si pelo teste Scott-Knot
p<0,05.
a-f
35
90
Tx.
(%Mot
) ilid
ade
80
70
NaHCO3
60
NaCl
50
40
30
20
10
0
25
50
75
100
125
150
200
(mM)
36
Motilidade (%)
gua destilada
47 7
gua in natura
51 5
NaHCO3 50 mM
78 9
NaHCO3 75 mM
82 4
NaCl 25 mM
87 4 a
a-c
Mdias com letras iguais no diferem entre si, pelo teste Scott-Knott p<
0.05
Experimento Ic primeira fase - As taxas de motilidade espermtica
aps ativao do smen diluido nas diferentes solues testadas mantiveram-se
prximas aquela observada no controle at duas horas aps incubao. Aps
doze horas, houve uma queda na taxa de motilidade espermtica no smen
diluido nas duas solues de NHCO3. Aps 48 horas de incubao, ainda foi
observado nas amostras diludas em NaCl 200 mM e Kurokura, taxas de
motilidade espermtica de 59% e 33%, respectivamente (Tabela 7).
Experimento Ic segunda fase - Os diluidores testados nessa fase
apresentaram comportamento semelhante aos testados na primeira fase deste
experimento em relao ao tempo de incubao. At 2 horas aps a incubao,
no houve efeito do tempo em cada diluidor, exceto para o smen diludo em
extender II. O smen diluido no extender II apresentou taxa de motilidade
espermtica bastante reduzida desde o primeiro momento de incubao. As
amostras diludas em Ginsburg fish Ringer II apresentaram as maiores taxas de
37
motilidade espermtica (44%), aps 48 horas de incubao, como pode ser visto
na Tabela 7.
38
TABELA 7. Motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro), do smen de piau-au, diludo
em diferentes solues e incubado a 5C- 8C por at 48 horas.Experimento Ic 1 e 2 fase.
Diluidor
0,5
12
24
48
1 Fase
39
Controle
87 3
aA
77 10
bB
83 4
aA
86 5 a A
NaHCO3 200mM
80 9
bA
82 11
aA
84 5
aA
81 13
NaHCO3 150 mM
86 8
aA
88 3
aA
91 4
aA
91 5
NaCl 200mM
82 4
aA
84 9
aA
86 3
aA
75 3
bB
78 7
bB
82 5
Kurokura
82 2
aA
81 4
bA
84 5
aA
73 26
bB
59 19
cC
22
cD
88
cB
00
dB
00
cB
aA
76
cB
00
dB
00
cB
89 7
aA
87 6
aA
85 4
aA
85 5
aA
84 7
aA
73 12
aA
87 5
aA
81 7
aA
83 7
aA
bB
aA
59 7
52
33 4
aB
cC
bB
2 Fase
Controle
84 5 a A
84 3 a A
83 3 a A
86 4 a A
26 5 c B
8 2 c C
1 1 dC
76 8 a A
80 9 a A
86 6 a A
83 3 a A
39 18 b B
14 15 b C
7 5 cC
80 7 a A
76 8 a A
77 9 b A
84 7 a A
69 8 a A
56 8 a B
44 11a C
82 4 a A
80 10 a A
79 12 b A
80 10 a A
43 9 b B
17 23 b C
9 9 cC
Extender II
19 4 b A
22 7 b A
21 3 c A
21 7 b A
29 6 c A
20 8 b A
18 3 b A
a-d. A-D
Mdias com a mesma letra (maiscula na linha, minscula na coluna) no diferem entre si dentro de cada fase
pelo teste scott-Knott p<0,05.
TABELA 8. Taxa de motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro) do smen de piauau, incubado entre 5-8C com diluidores acrescidos de 10% de crioprotetor por at 48 horas.(Exp.IIa)
Solues
Diluidor
Crioprotetor
Controle
---------
91 8
aA
87 5
DMSO
88 5
aA
69 17
bB
68 12
bB
75
Glicerol
70 17
bA
63 11
cA
62 10
bA
Etilenoglicol
80 27
aA
74 12
bA
68 17
bB
Metanol
90 9
aA
74 19
DMSO
73 5
bA
39 9
Glicerol
73 5
bA
72 10
Etilenoglicol
76 11
Metanol
82 4
DMSO
NaCl 200mM
40
Ginsburg
fish Ringer
Kurokura
a-d. A-D
0,05)
0,5
bA
1
aA
bB
dB
bA
86 5
24
aA
48
01
bC
cC
00
bC
35
cB
00
bB
00
cC
10
bC
17 10
bB
77 14
aB
35
cC
00
bC
19 12
dC
00
cD
10
bD
35
cB
00
bB
10
cC
00
bC
80 0
aA
46 7
dB
50 13
cB
aA
79 4
aA
81 8
aA
21 32
73 9
bA
60 7
cB
68 8
bA
00
cC
10
bC
Glicerol
54 9
cA
30 0
eB
20 13
00
cD
10
bD
Etilenoglicol
84 7
aA
73 7
bB
84 8
35
cC
00
bC
dC
aA
bB
23 30
aB
Metanol
92 6 a A
88 4 a A
92 4 a A
63 10 a B
14 12 a C
Mdias com mesma letra (minscula na coluna, maiscula na linha) no diferem entre si (Scott-Knott p <
41
TABELA 9. Taxa de motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro) de smen de piauacu, incubado entre 5C-8C com diluidores acrescido de um crioprotetorpor at 48 horas.(Exp.IIb)
Solues
Diluidor
Controle --------Metanol
NaCl
200mM
42
Etilenoglico
l
Metanol
Kurokura
Etilenoglico
l
a-e. A-D
% Crioprot.
--------0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
87 6
87 5
82 8
88 4
86 5
89 3
80 9
78 8
76 5
86 5
87 5
90 3
85 16
88 4
83 5
86 5
68 16
0,5
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
84 7
82 4
81 10
84 5
79 6
76 19
72 7
69 10
61 6
78 8
89 3
79 14
81 12
81 13
87 5
84 5
60 14
1
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
90 1
73 13
74 12
73 15
61 20
79 9
77 10
78 15
44 27
87 5
88 4
81 14
84 7
84 5
85 5
77 7
59 10
aA
aA
aA
aA
bB
aA
aA
aA
cA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
bB
24
48
42 24 cB
31 6 dB
42 16 cB
40 9 cB
20 20 dC
54 26 bB
27 25 dB
2 2 eB
1 0 eB
70 16 aB
82 4 aA
83 5 aA
83 5 aA
76 21 aA
72 7 aA
44 9 cB
1 0 eB
23 20 cC
4 4 dC
14 7 cC
20 9 cC
3 2 dC
12 11 cC
1 2 dC
0 0 dB
1 0 dB
67 13 aB
80 0 aA
56 34 bB
78 4 aA
76 10 aA
50 12 bB
1 0 dC
1 0 dB
Mdias com mesma letra (minscula na coluna, maiscula na linha) no diferem entre si (Scott-Knott P < 0,05)
Crioprotetor
Etilenoglicol
Kurokura
Metanol
NaCl
Etilenoglicol
Crioprotetor (%)
5%
Motilidade (%)
4 6 b
10%
0 0
5%
8 3
10%
0 0
15%
0 0
5%
0 0
10%
0 0 c
a-c
Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si, pelo teste
Scott-Knott p<0,05.
43
6 DISCUSSO
44
45
46
47
um
ambiente
favorvel
sobrevivncia
dos
48
49
50
51
52
7 CONCLUSES
para ser resfriado (5C-8C) por 48 horas e manter boa qualidade, o smen
de piau-au dever ser diludo em Kurokura;
as
baixas
taxas
de
motilidade
espermtica
observadas
aps
53
8 REFERNCIAS BLIBIOGRAFICAS
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55
56
57
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Sade. Universidade Federal de So Carlos, 1999.
58
59
60
ANEXOS
ANEXO 1. Anlise de varincia do efeito de solues de NaCl e NaHCO3
sobre a taxa de motilidade espermtica (exp.Ia)............................ 62
ANEXO 2. Anlise de varincia do efeito de solues ativadoras da
motilidade espermtica (Exp. Ib).................................................. 63
ANEXO 3. Anlise de varincia do efeito de solues diluidoras do smen.
(Exp. Ic 1a fase).............................................................................. 64
ANEXO 4 Anlise de varincia do efeito de solues diluidoras do smen.
(Exp. Ic 2a fase).............................................................................. 65
ANEXO 5. Anlise de varincia do efeito de solues diluidoras acrescida
de 10% de crioprotetores (Exp.IIa)............................................... 66
ANEXO 6. Anlise de varincia do efeito de solues diluidoras acrescidas
de crioprotetores na preservao do smen (Exp. IIb).................. 67
ANEXO 7. Anlise de varincia do efeito de solues crioprotetoras no
congelamento do smen (Exp. III)................................................ 68
61
ANEXO I
ANLISE DE VARIANCIA DO EFEITO DE SOLUES DE NaCL
E NaHCO3 SOBRE A TAXA DE MOTILIDADE ESPERMTICA (EXP. IA)
NaCl
---------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
---------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
196.761905
2.942
0.0912
TRAT.
6
2861.777778
42.794
0.0000
erro
12
66.873016
---------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
20
18366.666667
---------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
29.56
Mdia geral:
27.6666667
Nmero de observaes:
21
---------------------------------------------------------------------------------------------NaHCO3
---------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
---------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
1220.333333
5.657
0.0186
TRAT.
6
3179.269841
14.738
0.0001
erro
12
215.722222
-----------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
20
24104.952381
-----------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
43.26
Mdia geral:
33.9523810
Nmero de observaes:
21
------------------------------------------------------------------------------------------------
62
ANEXO 2
ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES ATIVADORAS
DA MOTILIDADE ESPERMTICA (EXP. Ib)
------------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
120.555556
7.041
0.0025
TRAT
4
2500.555556
15.712
0.0000
erro
38
59.152047
------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
44
18291.111111
------------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
19.28
Mdia geral:
65.4444444
Nmero de observaes:
45
-------------------------------------------------------------------------------------------------
63
ANEXO 3
ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORAS DO
SMEN (EXP. IC 1a FASE)
------------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
1886.637566
7.402
0.0081
TEMPO
6
36556.227513
143.426
0.0000
erro 1
12
254.878307
TRAT
5
11021.839153
250.411
0.0000
TEMPO*TRAT 30
3723.357672
84.593
0.0000
erro 2
322
14172.851852
44.
015068
------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 377
407151.957672
------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) =
24.40
CV 2 (%) =
10.14
Mdia geral:
65.4179894
Nmero de observaes:
378
-------------------------------------------------------------------------------------------------
64
ANEXO 4
ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORAS
DO SMEN (EXP. IC 2a FASE)
---------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
--------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
6291.622222
3.251
0.0744
TEMPO
6
32030.980952
16.550
0.0000
erro 1
12
1935.433333
TRAT
4
27892.869841
16.436
0.0000
TEMPO*TRAT 24
3545.999471
2.090
0.0027
erro 2
266
1697.012531
---------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
314
876075.130159
---------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) =
82.60
CV 2 (%) =
77.34
Mdia geral:
53.2634921
Nmero de observaes:
315
----------------------------------------------------------------------------------------------
65
ANEXO 5
ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORAS
ACRESCIDAS DE 10% DE CRIOPROTETORES (EXP.IIa)
------------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
3
076.977117
1.823
0.1711
TRAT
12
7606.543875
12.876
0.0000
erro 1
23
590.769168
TEMPO
4
47960.494017
1817.335
0.0000
TRAT*TEMPO
48
1107.281054
13.600
0.0000
erro 2
494
81.416194
------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
584
793308.215385
------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) =
54.55
CV 2 (%) =
20.25
Mdia geral:
44.5589744
Nmero de observaes:
585
-------------------------------------------------------------------------------------------------
66
ANEXO 6
ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLES DILUIDORAS
ACRESCIDAS DE CRIOPROTETORES NA PRESERVAO DO SMEN
(EXP. IIb)
------------------------------------------------------------------------------------------------FV
GL
QM
Fc
Pr>Fc
------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO
2
4696.236601
6.527
0.0042
TRAT
16
10856.666340
15.090
0.0000
erro 1
32
719.468546
TEMPO
4
89507.341830
137.626
0.0000
erro 2
8
650.367320
TEMPO*TRAT
64
1987.534191
25.035
0.0000
erro 3
638
79.388776
------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
764
747206.661438
------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) =
43.03
CV 2 (%) =
40.91
CV 3 (%) =
14.29
Mdia geral:
62.3359477
Nmero de observaes:
765
-------------------------------------------------------------------------------------------------
67
ANEXO 7
ANLISE
DE
VARINCIA
DO
EFEITO
DE
SOLUES
CRIOPROTETORAS NO CONGELAMENTO DO SMEN (EXP. VI)
------------------------------------------------------------------------------------------------FV .
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
------------------------------------------------------------------------------------------------Repetio .
2
75.523810
37.761905
6.961
0.0020
Trat
6
579.269841
96.544974 17.798
0.0000
erro
54
292.920635
5.424456
-----------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
62
947.714286
-----------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
128.71
Mdia geral:
1.8095238
Nmero de observaes:
63
------------------------------------------------------------------------------------------------
68
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